A KÖZPONTI ÉLELMISZER-TUDOMÁNYI KUTATÓINTÉZET AZ M TA ÉLELM ISZER-TUDOMÁNYI KOM PLEX BIZOTTSÁGA és a MAGYAR ÉLELMISZER-TUDOMÁNYI ÉS TECHNOLÓGIAI EGYESÜLET közös rendezésében 2010. február 26-án tartandó
338.
TUDOMÁNYOS KOLLOKVIUM előadásainak rövid kivonata 311. füzet
Budapest
Mikotoxinok állat-, illetve humán-egészségügyi vonatkozásai A takarmány- és az élelmiszertermelés, feldolgozás, tárolás és forgalmazás szinte minden fázisában számolni kell a penészgombák és az általuk termelt mikotoxinok jelenlétével. Jelentős gazdasági kárt okoznak a növény- és állattenyésztésben, valamint az élelmiszeriparban. Emellett nagyon jelentős a káros állat- és humánegészségügyi, valamint élelmiszerminőségi és biztonsági következményük. Elsősorban a gabonafélék fertőződnek penészgombával és szennyeződnek ezáltal mikotoxinokkal. De a legkülönbözőbb takarmány és élelmiszer alapanyagokban is kimutathatóak. A gabonafélék nagyarányú szennyezettsége azért is különösen érdekes Magyarországon, mert ezek képezik az abrakevő állatok (sertés, ló, baromfi) takarmányának alapját, a humán táplálkozásban a fő energiaforrás, amelyből a hazai lakosság meglehetősen sokat fogyaszt. Ezért ezek a növények hazánk vetésterületének is jentős hányadát foglalják el. Mivel a mikotoxinok – egyelőre – nem kiiktathatók a táplálékláncból, mindenképpen fontos megismerni ezek tulajdonságait, előfordulásukat, valamint káros hatásaikat. Az állati szervezetben (vagy az emberben) kifejtett káros hatásuk mértékét több tényező befolyásolja. A toxin részéről: kémiai szerkezete, koncentrációja, az expozíció időtartama. A szervezet részéről: a szervezet ellenálló képessége (pl. táplálóanyag-ellátása), életkor, ivar, stresszorok, stb. A mikotoxinok állategészségügyi hatásainak szakirodalma nagyon széleskörű. A legtöbb mikotoxin esetében a hatások jól ismertek, a hatásmechanizmus is nagyrészt feltárt. A takarmány magas vagy közepes szennyezettsége esetén az adott toxinra jellemző klinikai tünetek alakulnak ki, amelyek az állatok elhullásához vezethetnek. Ezek a klinikai, kórbonctani tünetek nagyon változatosak a toxin hatásmechanizmusától és dózisától függően. Az egyes mikotoxinok okozta kórképek viszonylag jól ismertek. Nagyobb probléma az, hogy a takarmányokban több mikotoxin együttes jelenlétével kell számolnunk, ezek kölcsönhatása még nem teljesen feltárt. Gyakoribb az alacsony dózisú expozíció, azaz az idült mikotoxikózis, amely termelés csökkenésben, szaporodásbiológiai zavarokban, csökkent termék minőségben, vagy csökkent ellenállóképességben nyilvánul meg. Olyan esetekben, amikor az érintett állatállomány ellenállóképessége jó, a mikotoxinok koncentrációja kicsi, és az állatok rövid ideig fogyasztják azt, előfordulhat, hogy a toxin nem okoz termelés csökkenést vagy egyéb hatást, bár megfelelő analitikai eljárással kimutatható a takarmányból. Az ember mikotoxikózisairól aránylag keveset tudunk, annak ellenére, hogy már évszázadokkal korábban leírtak súlyos „járványokat”. A penészes élelmiszerek fogyasztásának betegséget okozó hatásai azonban már régóta ismertek. Az emberre extrapolálható állatkísérletek és az eddig megismert ok-okozati összefüggések feltárásai alapján a mikotoxinok főbb egészség károsító hatásai a következők: rákkeltő, carcinogén hatás (aflatoxin, ochratoxin A, fumonizinek, patulin), fejlődési rendellenességet okozó, teratogén hatás (zearalenon, ochratoxin A), a reprodukcióra kifejtett káros hatás (zearalenon, trichotecének), az ellenálló képesség csökkenése, immunszuppresszív hatás (trichotecének), idegrendszert károsító hatás (ochratoxin A, fumonizinek, trichotecének). Akut mikotoxikózisok emberben ritkán, inkább a gazdaságilag elmaradott országokban fordulnak elő. Gyakoribb a kis dózisú, hosszan tartó toxinhatás (szubakut, krónikus toxikózis), amelynek felismerése és beazonosítása nagyon nehéz. Szinte lehetetlen egzakt módon, pontosan meghatározni az eltérő területeken élő, eltérő szociális helyzetben lévő és táplálkozási szokásokkal rendelkező lakosság napi toxinfelvételét, és az ok-okozati összefüggés bizonyítása is nagyon nehéz.
Kovács Melinda Kaposvári Egyetem, Állattudományi Kar
3
Mikotoxin szennyezés csökkentésének lehetőségei szántóföldön A búza fuzáriumos fertőzése tipikus szántóföldi probléma, ezért megelőzését is ott kell elvégezni. A betegség nem annyira a termésveszteség miatt kiemelkedően fontos, hanem a gombák által okozott számos, igen mérgező toxin termelése révén, amely emberre, állatra bizonyítottan káros, olyannyira, hogy az EU az emberi táplálkozásra kötelezően betartandó határértékeket rendelt el. A szegedi fuzárium kutatás 1970-ben kezdődött, a mai napig folyamatos. Mára a magyar mezőgazdasági kutatás nemzetközileg egyik legsikeresebb ága, de a megoldásra váró problémák nagyobbik fele előttünk van. Ha abból indulunk ki, hogy hosszú évtizedekig csak némi agrotechnikai segítség állt rendelkezésre, mára sokkal több lehetőségünk van. 1. Rezisztencianemesítés. Tavaszi jellegű rezisztenciaforrásokat átalakítottunk őszivé és sokkal jobb agronómiai formákká, így már rendelkezünk jó vagy kiváló ellenállóságú törzsekkel, amelyek már fajtaelőállítási programban is sikerrel felhasználhatók. Őszi búzákból is sikerült jó ellenállóságú törzseket előállítani, amelyek a fentieket nem érik el, de agronómiai tulajdonságaik jobbak. Ebbe a csoportba tartozik 9/2009-es törzsünk, amelyet 2009-ben jelentettünk be állami fajtakísérletekbe. 2. Az amerikai és más adatokkal szemben, köszönhetően a jobb vizsgálati módszertannak kiderült, hogy a toxintermelés igen szoros összefüggésben van a szemfertőzöttséggel, azaz a toxinszabályozás legfontosabb eszköze az ellenálló képesség növelése, az összefüggés gyakran az r=0. 90 körüli értéket mutat. Vagyis a következetes betegségellenállóságra való szelekció egyben alacsony élelmiszerbiztonsági kockázatot jelent. Ennek kidolgoztuk módszertanát, ma működik egy kiterjedt nemesítési és azt megalapozó rezisztenciakutatási és molekuláris technikákat is használó genetikai kutatási program. 3. A betegséggel szemben jó vagy kiváló ellenállóság búza előállítása több évtizedes program. A fajtajelöltek vizsgálata tízszeres, kiaknázható különbséget mutatott éveken át. Ezért a tulajdonság fajtaminősítésben való szűrése fontos, és csak azáltal, hogy a fogékony fajtajelöltek elismerését megtagadjuk, az élelmiszerbiztonságot már legalább 50%-kal javítottuk. 4. A korábban nagyrészt hatástalan fungicid használatot korszerűsítettük, ma nagyüzemben 70-75%-os toxintartalom csökkenést tudunk elérni. Ehhez jó fungicideket kell alkalmazni, a kalászokat oldalról kell permetezni, és a kivitelezést az előírásoknak megfelelően, és preventíven kell elvégezni. Így már ma is lényegesen csökkenthető a kockázat. Hozzáteszem, az ellenállóbb fajtákon a fungicidek is sokkal nagyobb biztonsággal szorítják a toxinszennyezést határérték alá. 5. A kukorica elővetemény igen fontos kockázati tényező. Ezt a szármaradványok leforgatásával lényegesen csökkenteni lehet. Ekkor a fungicidkezelést kötelező megelőző jelleggel beiktatni. A ma rendelkezésre álló lehetőségek sokkal nagyobbak, mint évekkel ezelőtt voltak, így az élelmiszerbiztonság lényegesen növelhető. Reméljük, hogy a gazdatársadalom ezeket alkalmazni is fogja, hiszen mindenkinek közös érdeke a piacképes egészséges termék előállítása és forgalmazása. Mesterházy Ákos Gabonakutató Nonprofit Kft.
4
Lehetőségek a takarmánynövények és a takarmányok mikotoxin szennyezettségének csökkentésére A takarmánynövényeket szennyező mikotoxinok veszélyforrások úgy a gazdasági- és társállatok takarmányozásában, mint a humán fogyasztók számára ezért számos próbálkozás történt a mikotoxinok által előidézett állat- és humán egészségügyi kockázatok csökkentésére egyrészt megelőző jelleggel, másrészt a takarmányokkal vagy az élelmiszerekkel felvett mikotoxinok bélcsatornából történő felszívódásának mérséklésére. A gabona magvak tárolása során a nedvesség tartalom és a hőmérséklet szabályozását tekintik hatékony módszernek, kiegészítve ezt a mikotoxinokat termelő penészek növekedését és szaporodását gátló, elsősorban szerves savakkal történő kezeléssel. További lehetőség a gabona magvak tárolása és feldolgozása során a szállító és tároló rendszerek folyamatos és rendszeres fertőtlenítése nátrium-hipoklorittal, a betárolás előtt tört szemek kiválogatásával, a pelyvalevelek eltávolításával, hőkezeléssel, vagy a kémiai eljárások közül kalcium-klorid vagy nátrium-bikarbonát oldattal történő mosással. A gazdasági állatok takarmányozásában próbálkozások történtek továbbá a takarmányok egyes táplálóanyagainak, így fehérje vagy aminosav (Met, Phe) tartalmának növelésével, valamint nukleotidok nagy mennyiségben való adagolásával védekezni egyes mikotoxinok kedvezőtlen hatásai ellen. Egyes vizsgálatok szerint az egyszeresen telítetlen zsírsavakban gazdag olíva olaj is kedvező hatású lehet egyes mikotoxinok ellen. Annak ismeretében, hogy számos mikotoxin, így például az AFB1, a T-2 toxin vagy az ochratoxin oxigén szabadgyök termelést indukál a szervezetben felmerült a természetes (E- és C-vitamin, szelén, karotinoidok) vagy szintetikus (BHT, liponsav) adagolásának lehetősége is. Emellett néhány természetes növényi komponens, mint például a fenolos vegyületek, a kumarin, a klorofill és ennek származékai is kedvező hatású lehet egyes mikotoxinok toxikus hatásainak mérséklésében. A takarmányiparban széles körben alkalmaznak mikotoxin kötő vegyületeket, amelyek hatása azon alapul, hogy nagy aktív felülettel rendelkeznek. A nagy aktív felülethez az egyes mikotoxin kötő vegyület azon sajátossága is társul, hogy olyan funkciós csoportokkal rendelkeznek, amelyek felületi töltéseik révén képesek egyes, főképp poláros jellegű, vegyületek megkötésére. A mikotoxinok közül azonban ilyen jelleggel főképp csak az aflatoxinok rendelkeznek, így az egyéb mikotoxinok megkötése ilyen vegyületekkel csak mérsékelt. Takarmányozási szempontból az is lényeges probléma, hogy egyes táplálóanyagok, így például egyes vitaminok vagy mikroelemek szintén poláros karakterűek, emiatt az adott mikotoxin kötő anyagok ezek egy részét is megkötik a bélcsatornában, ennek révén potenciális vitamin vagy mikroelem hiányt idézve elő. A gazdasági állatok bélcsatornájának egyes szakaszaiban a kémhatás jelentős mértékben eltérő, amely szintén befolyásolja a mikotoxin kötő vegyületek adszorpciós kapacitását. Emiatt előfordulhat, hogy a gyomor savanyú kémhatásán megkötődött mikotoxin a vékonybél közel semleges kémhatásán a kötésből felszabadul, így a vékonybél hámsejteken keresztül felszívódhat. A jelenleg ismert mikotoxin kötő anyagok közé szervetlen és szerves vegyületek is tartoznak. A szervetlen vegyületek között jól ismertek a szilícium polimerek, így például egyes agyagásványok (kaolin, szepiolit, zeolit, bentonit stb.) és az aktív szén. A szerves mikotoxin kötő vegyületek közé pedig a nagy rosttartalmú takarmányok, az élesztősejtfal kivonatok, pontosabban azok β-D-glükánjai, valamint egyes huminsav származékok tartoznak. A mikotoxin kötő vegyületek hatása azonban zömében csak in vitro rendszerekben és a legtöbb esetben csak az aflatoxin esetében bizonyított.
Mézes Miklós Szent István Egyetem, Takarmányozástani Tanszék
5
Fuzárium toxinok kockázatbecslése A gabonát - különösen esős, szeles időben – gyakran támadja meg fuzárium fertőzés. Egyes fuzárium penészgomba fajok méreganyagokat (fuzáriumtoxinokat) termelnek, melyek károsíthatják az emberek, illetve állatok egészségét, és a haszonállatoknál növekedési, szaporodási zavarokhoz is vezethetnek. A gabonák értékének csökkentésével, valamint az állatállomány megbetegítésével gazdasági károkhoz is vezetnek. Ezért a fuzárium toxinok kiemelt figyelmet érdemelnek. A toxin döntően gabonamagvak (a kukorica és a búza) és az azokból előállított termékek fogyasztása során kerül be az emberi szervezetbe. Helyes mezőgazdasági gyakorlattal a Fusarium gombák általi fertőzés, és a toxintermelés bizonyos mértékig megelőzhető, csökkenthető. A gabonákban és gabonakészítményekben a fusariumtoxin (zearalenon, fumonizinek, trichotecének) szennyezés megelőzéséről és csökkentéséről az Európai Unió ajánlást adott ki (2006/583/EK bizottsági ajánlás) mely a védekezés általános elveit tartalmazza a termesztés, betakarítás és tárolás során. Erre, és a hazai tapasztalatokra alapozva a Magyar Élelmiszerbiztonsági Hivatal tájékoztató anyagot készített a fuzáriumtoxinok bevitelének csökkentése érdekében. A Magyar Élelmiszer-biztonsági Hivatal kérésére az MgSzH 2008-ban felmérési céllal vizsgálta a kereskedelmi forgalomban levő feldolgozott gabonaipari termékek (lisztek, korpák, gabonapelyhek) fuzárium tartalmát. Ennek során összesen 302 liszt-, korpa- és gabonapehely-mintában 16 féle mikotoxin jelenlétét keresték egy rendkívül érzékeny módszerrel. A fuzárium toxinok közül egyedül a dezoxinivalenol (DON) tekintetében találtak számottevő szennyezettséget, mely a határértéket a minták 2%-ában haladta meg. A DON más országokban is hasonlóképpen jelen van a gabonákban. Uniós felmérés szerint több mint 11000 minta búzaminta vizsgálata során a minták több mint feléből ki lehetett mutatni valamilyen mennyiségben. A DON a Fusarium gombafajok (pl. Fusarium culmorum, Fusarium graminearum) által termelt mikotoxin, gabonafélekben és feldolgozott gabona termékekben (kenyér, maláta, sör) van/lehet jelen. Nagyon stabil vegyület, a tárolás/őrlés és élelmiszer feldolgozás/főzés során nem bomlik le, hő hatásának ellenáll. Nagy mennyiségű DON bevitel, hányással, hasmenéssel járó panaszokat, állatoknál a takarmány visszautasítását váltja ki. Állatkísérletekben fokozta a fertőzések iránti fogékonyságot. A szervezetből hamar kiürül, kis mennyiségű fogyasztásánál nem észleltek hosszú távú, késői hatást. Rákkeltő, vagy hormonszerű hatást DON esetében nem igazoltak. A biztonságosan fogyasztható mennyiséget tudományos kockázatbecsléssel állapítják meg nemzetközi szervezetek. A legtöbb mikotoxin esetében (az aflatoxin kivételével) megállapítható olyan alacsony szennyezettség, amely még nem vált ki semmiféle egészségi elváltozást. Ezt a szintet még elosztják egy biztonsági faktorral (a fajok és egyedek közti eltérő érzékenység miatt), tehát az eltűrhető bevitel az állatkísérletekben ártalmatlannak bizonyuló szint század, vagy annál is kevesebb része. Ezt nevezik elviselhető, vagy eltűrhető napi beviteli szintnek (TDI, Tolerable Daily Intake). Állatkísérletes toxikológiai vizsgálatok eredményei alapján a 100-szoros biztonsági faktorral számított tolerálható napi beviteli (TDI) érték 1 µg/ttkg. Az előadás ismerteti a MÉBIH kockázatbecslésének eredményét a hazai lakosság DON bevitelére vonatkozóan, valamint kitér az eseménnyel kapcsolatos kommunikációra is.
Szeitzné Szabó Mária Magyar Élelmiszer-biztonsági Hivatal
6
Aspergillus mikotoxinok: újabb kihívások az élelmiszerbiztonság és a humán egészségügy területén Az Aspergillus fajok számos mikotoxint képesek termelni, melyek súlyos élelmiszerbiztonság problémát jelentenek világszerte. A legfontosabb Aspergillus mikotoxinok az aflatoxinok, az ochratoxinok, a patulin és újabb kutatási eredmények szerint a fumonizinek. Az aflatoxinok a hazai éghajlati viszonyok között általában nem okoznak határérték feletti szennyezést a magyar élelmiszerekben, inkább importált mezőgazdasági termékekben mutathatók ki. A közelmúltban azonban Észak-Olaszországban és Romániában is határérték feletti aflatoxin szennyeződést mértek kukoricatételekben, amit az éghajlatváltozással illetve a globális felmelegedéssel hoztak összefüggésbe. A közelmúltban tisztáztuk, hogy a számos aflatoxin-termelőként leírt gombafaj közül valójában csak mintegy tucatnyi Aspergillus faj képes ezt a toxint előállítani. Néhány új aflatoxin-termelő Aspergillus fajt is leírtunk, melyek közül az A. minisclerotigenes világszerte elterjedt, és képes mind G, mind B típusú aflatoxinokat termelni. Ezt a fajt klinikai mintákból is azonosítottuk Európában. A többi újonnan leírt faj endémikus, földimogyoróültetvényekről származó mintákban mutattuk ki jelenlétüket Argentínában ill. az USA-ban (A. arachidicola, A. pseudocaelatus, A. pseudonomius). Az ochratoxinok esetében a főként gabonaféléket szennyező Penicillium verrucosum Európa északi részein okoz problémákat, de az ochratoxin-termelő melegkedvelő Aspergillus fajok (A. ochraceus, A. westerdijkiae) tömeges megjelenése is várható a közeljövőben gabonaféléken, amennyiben a globális felmelegedés tovább tart. Kávéval kapcsolatos vizsgálataink alapján kiderült, hogy a fő ochratoxin termelő faj nem az A. ochraceus, hanem fekete Aspergillus fajok és a közelmúltban leírt A. westerdijkiae. Utóbbi faj beltéri levegőben is nagy százalékban fordul elő. Ugyanakkor vizsgálataink alapján iráni pisztácia minták ochratoxin szennyeződéséért az A. ochraceus és A. melleus a felelősek; ezekben a mintákban sem ochratoxin-termelő fekete Aspergillus fajokat, sem A. westerdijkiae-t nem tudtunk kimutatni. Hazai szőlőn már kimutattuk ochratoxin-termelő fekete Aspergillus fajok jelenlétét, és ezt a mikotoxint hazai borokban is detektáltuk, bár határérték alatti mennyiségekben. Ezen fajok Dél-Európa szőlőültetvényein okoznak gyakran határérték feletti ochratoxin-szennyezést, megjelenésük hazánkban feltehetőleg szintén a klímaváltozás eredménye. A fumonizinekről korábban úgy gondolták, hogy csak Fusarium fajok képesek előállítani. A közelmúltban kimutattuk a fumonizin bioszintézis génkluszter jelenlétét Aspergillus niger törzsek genomjában, és bizonyított, hogy ez a faj képes fumonizinek termelésére magas cukortartalmú tápközegekben. Vizsgálataink alapján az ilyen tulajdonságokkal bíró szárított gyümölcsök (mazsola, füge, datolya) fumonizinekkel szennyezettek, ami újabb egészségügyi kockázatot jelent a fogyasztók számára. A kontaminációért felelős izolátumok vizsgálataink alapján az A. niger és az A. awamori fajokba sorolhatók. Mind a mazsolaminták, mind a gombaextraktumok számos fumonizin izomert tartalmaztak a korábban A. niger-ből leírt fumonizin B2 és B4 mellett. Egyes mazsolamintákban 40 ppm feletti össz-fumonizin szennyezettséget észleltünk, míg az átlag szennyezettség 2-5 ppm között volt. Fumonizineket kimutattunk iráni és tunéziai füge és datolya mintákban is. Mivel fumonizinekre csak kukorica-alapú termékek esetében állapítottak meg egészségügyi határértékeket, szükség van ezen magas cukortartalmú termékek beható toxikológiai vizsgálatára, és megfelelő határértékek bevezetésére a fogyasztók (különösen a gyermekek) védelme érdekében. Klinikai A. niger és A. awamori izolátumok esetében bizonyítottuk, hogy “ex vivo” körülmények között képesek fumonizineket termelni, melyeknek szerepük lehet a patogenitásban. Emellett ezen fajok tömeges megjelenését észleltük beltéri levegőben, amit szintén a klímaváltozás idézhetett elő. Varga János Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és Informatikai Kar, Mikrobiológiai Tanszék
7
Aflatoxinok hatásmechanizmusának vizsgálata BioAréna rendszerben A toxikus hatásokat indukáló mikotoxinok penészgombák másodlagos anyagcseretermékei. Az eddig ismert körülbelül 400 mikotoxin közül kevesebb, mint 20 rendelkezik komoly egészségügyi kockázattal. Ezek közé tartozik az általunk vizsgált teratogén, mutagén és karcinogén tulajdonságokat mutató 4 fő aflatoxin (B1, B2, G1 és G2) is. Ezen mikotoxinok metabolitjait nagyrészt feltérképezték, de hatásuk mechanizmusa egyértelműen nem tisztázott. A mikotoxinok hatásmechanizmusát a bioautográfián alapuló, azaz rétegrendszerű kromatográfiás elválasztást és azt követő mikrobiológiai detektálást magában foglaló, de kölcsönhatási reakciókat is alkalmazó BioAréna rendszerben vizsgáltuk, melynek során Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psm) babkórokozó baktériummal szemben mutatott ölőhatásukat tanulmányoztuk. Mivel a formaldehid (HCHO) nélkülözhetetlen sejtösszetevő, elsősorban kötött formában van jelen az élő szervezetben s főleg metilezési-demetilezési reakciók során keletkezhet, ezért elsősorban a HCHO és reakciótermékeinek szerepét vizsgáltuk az aflatoxinok hatásmechanizmusánál. A szintén normális sejtösszetevő hidrogén-peroxiddal (H2O2) reakcióba lépve szingulett oxigén (1O2) és gerjesztett HCHO keletkezik, majd az 1O2 oxidálva a vizet, dihidrogén-trioxidon keresztül ózon (O3) képződik. Ezen reaktív molekulák (HCHO, 1O2, O3) alapvető szerepet játszanak a biológiai rendszerekben, de nagymértékű felszabadulásuk káros lehet. A BioAréna rendszerben kimutatható a HCHO és a H2O2 is. A mikotoxinok jelenlétében több HCHO keletkezett, mely a demetilezési potenciál növekedése által a kötött formákból szabadulhatott fel, mint pl. az aflatoxinok O-metil csoportjából is, melyet az FT-Raman spektroszkópiás eredmények is alátámasztanak. A H2O2 mennyisége csökkent a mikotoxinok foltjában, ami feltételezi, hogy részt vett valamilyen reakcióban. A mikotoxinok antibakteriális-toxikus hatása általában az adagolt HCHO-befogók ill. -redukálók (L-arginin, redukált glutation, szelenit ionok, dimedon és L(+)-aszkorbinsav) dózisától függően csökkent, míg a HCHOprekurzorok (NG-monometil-L-arginin, Nε-monometil-L-lizin), valamint a HCHO-t generáló, mobilizáló Cu(II) ionok adagolásával nőtt. Az O3 eltávolítására alkalmas anyagok jelenlétében szintén csökkent a mikotoxinok baktérium ellenes hatása. Ezen eredmények alátámasztják a HCHO és reakciótermékeinek meghatározó szerepét a négy fő aflatoxin antibakteriális-toxikus hatásában.
Móricz M. Ágnes1, Ott Péter1, Horváthné Otta Klára2, Tyihák Ernő1 1 Magyar Tudományos Akadémia Növényvédelmi Kutatóintézet 2 Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet
8
Mikotoxinok meghatározása OWLS alapú jelölésmentes immunszenzorral A mikotoxinok vizsgálatára már számos analitikai eljárás került kidolgozására. Ezek a technikák rendszerint bonyolult minta előkészítést igényelnek, ezért az utóbbi időben egyre nagyobb az igény a nagyérzékenységű, gyors analitikai méréstechnikák iránt. Antigén – antitest reakción alapuló ELISA tesztek, immunaffinitású kolonnák és liposzómák rögzítésével készített nitrocellulóz tesztcsík kifejlesztésére került sor. Munkánk során mikotoxinok meghatározására alkalmas optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia (OWLS) detektáláson alapuló immunanalitikai eljárást fejlesztettünk ki a leggyakrabban előforduló mikotoxinok, az aflatoxin, ochratoxin, deoxynivalenol és zearalenon kimutatására, az immunszenzorokat különböző gabonák és fűszerek vizsgálatára alkalmaztuk. Az OWLS olyan szenzortechnika, amely az optikai hullámvezető felületén, mint határfelületen, molekuláris szinten végbemenő affinitáson alapuló folyamatok valósidejű, jelölésmentes vizsgálatára alkalmas. A hullámvezető felületén megfelelően funkcionalizált réteget kialakítva a mérendő immunanyagra specifikus molekula rögzítésével biztosítható a szenzor nagyfokú szelektivitása. A vizsgálandó toxinok meghatározásához esetenként előállítottuk az antigének fehérjékhez (BSA, OVA) kötött immunogénjeit, majd az immunogénekkel nyulakat immunizáltunk. A poliklonális antitestet tisztítottuk, ellenőriztük és ezeket alkalmaztuk a szenzor kialakításához. A nem-kompetitív (direkt) szenzor esetében a toxin detektálására a specifikus antitestet glutáraldehiddel (2,5%) rögzítettük a szenzor felszínén, így a toxinok a rögzített antitest molekulákhoz kötődve, közvetlenül detektálhatók. Mivel a mérendő toxinok molekula tömege igen kicsi a rögzített antitest méretéhez képest (kb.180 kD), a mért jel pedig a tömegváltozással arányos, ezért kompetitív eljárást dolgoztunk ki a kimutatási határ csökkentése érdekében. Az indirekt mérések során a hullámvezető felületén a kimutatandó toxin molekula fehérjével képzett konjugátumát rögzítettük glutáraldehiddel (2,5%). A toxint tartalmazó standardokat, ill. mintákat ismert mennyiségű antitestet tartalmazó szérummal kevertük össze, és rövid inkubálási idő után mértük. A szabadon maradt antitest molekulák kapcsolódtak a szenzor felületén kötött antigén-konjugátummal, lényegesen nagyobb tömegváltozást előidézve, mint a direkt mérés esetében. A jel ebben az esetben fordítottan arányos a mintákban levő toxin koncentrációjával. A módszerek optimalizálása után a gabona- és fűszerminták előkészítésének, a mintamátrix hatását vizsgáltuk spikolt minták segítségével. Mérési eredményeink alapján az acetonitril-víz eleggyel készített kivonat volt a vizsgálatokhoz alkalmas, az eredményeket referencia eljárással hasonlítottuk össze.
Adányiné Kisbocskói Nóra, Majerné Baranyi Krisztina Központi Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet, Analitikai Osztály
9
