2
Transmisní (prozařovací) elektronová mikroskopie
Doc. MUDr. Danuše Šubrtová, CSc. Ústav histologie a embryologie Lékařská fakulta v Hradci Králové Univerzita Karlova v Praze
2012
3
OBSAH SLOVO ÚVODEM .……………………………………………………………... 4 1 SVĚTELNÝ A TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP (principy, technická řešení, porovnání světelné a transmisní elektronové mikroskopie, rozměry pozorovatelných struktur) …..…………… 5 1.1 Světelný mikroskop ………………………………………………….............. 5 1.1.1 Princip a technické řešení světelného mikroskopu ………………………… 5 1.1.2 Obraz ve světelném mikroskopu …………………………………………… 8 1.2 Transmisní (prozařovací) elektronový mikroskop – TEM ……………….. 9 1.2.1 Několik dat …………………………………………………………………. 9 1.2.2 Princip TEM ………………………………………………………………. 10 1.2.3 Technické řešení TEM …………………………………………………….. 14 1.2.4 Optimální využití TEM, inovace …………………………………………... 17 1.3 Porovnání světelné a transmisní elektronové mikroskopie …..………….. 23 1.4 Rozměry struktur pozorovatelných v mikroskopu .……….……………… 24 2 ZPRACOVÁNÍ BIOLOGICKÝCH OBJEKTŮ PRO TRANSMISNÍ ELEKTRONOVOU MIKROSKOPII, TECHNIKA POLOTENKÝCH A ULTRATENKÝCH ŘEZŮ ……………... 27 2.1 Odběr biologického materiálu, fixace, dehydratace a zalití pro transmisní elektronovou mikroskopii ..………………………………. 27 2.1.1 Základní kroky při zpracování biologického materiálu …………………… 27 2.1.2 Přehled pracovního postupu při běžném zpracování tkání ………………... 28 2.2. Technika polotenkých a ultratenkých řezů ……………………………..... 2.2.1 Ultramikrotom. Řezání polotenkých a ultratenkých řezů ………………..... 2.2.2 Barvení polotenkých řezů …………………………………………………. 2.2.3 Kontrastování ultratenkých řezů …………………………………………... 2.2.4 Parafinový a polotenký epoxidový řez pro světelnou mikroskopii ………...
32 32 33 33 39
3 OBRAZ V TEM, POZOROVÁNÍ A SNÍMKOVÁNÍ ULTRATENKÝCH ŘEZŮ, INTERPRETACE OBRAZU .……………………………………….... 40 3.1 Obraz v transmisním elektronovém mikroskopu ……………………....... 40 3.2 Pozorování a snímkování ultratenkých řezů ……………………………... 42 3.3 Interpretace obrazu …………………………….………………………….. 42 4 LITERATURA .………………………………………………………………..... 45 PODĚKOVÁNÍ …………………………………………………………………. 47
4
SLOVO ÚVODEM Metoda transmisní (prozařovací) elektronové mikroskopie má již po řadu let široké uplatnění ve výzkumu a výuce biologicko-medicínských oborů a v lékařské diagnostice. Předložený text s obrazovým doprovodem je určen posluchačům magisterského a doktorského studia lékařství a zájemcům o mikroskopické techniky. Po stručných informacích o světelné mikroskopii (pro následující porovnání s transmisní elektronovou mikroskopií) je čtenář seznamován s principy a technickým řešením transmisního elektronového mikroskopu (TEM), s rutinní metodou zpracování biologického materiálu pro TEM, s problematikou tvorby obrazu v TEM a s některými problémy při interpretaci výsledného obrazu. Práci doplňují tabulky rozměrů vybraných biologických objektů. Autorce této práce nebylo bohužel dopřáno uskutečnit zamýšlené pozdější rozšíření práce.
5
1 SVĚTELNÝ A TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP (principy, technická řešení, porovnání světelné a transmisní elektronové mikroskopie, rozměry pozorovatelných struktur)
1.1 SVĚTELNÝ MIKROSKOP 1.1.1 Princip a technické řešení světelného mikroskopu (obr. 1, obr. 2) Běžný (konvenční) světelný mikroskop, používaný v cytologii a histologii, je prozařovacího typu. To znamená, že biologický objekt – tenký mikroskopický preparát (v histologii nejčastěji nátěr buněk nebo parafinový histologický řez tloušťky 5 až 10 μm) – je studován v procházejícím světle. O zvláštních typech světelných mikroskopů pojednávají např. publikace [17] a [25]. Běžným zdrojem viditelného světla, které ozařuje objekt, je žárovka. Kondenzor (soustava skleněných čoček) soustřeďuje paprsky světla na rovinu preparátu. Ty paprsky, jež prostoupí jemnými strukturami preparátu, dále procházejí (a lomí se) objektivem. Vznikne skutečný, převrácený a zvětšený obraz preparátu. Dalšího zvětšení obrazu dosahuje okulár, optické zařízení určené pro oko pozorovatele (schéma zobrazování světelným mikroskopem je na obr. 1). Optiku světelného mikroskopu, tj. okulár a objektiv (či více objektivů o různých zvětšeních, které jsou instalovány ve světelném mikroskopu), tvoří stejně jako u kondenzoru soustavy skleněných čoček. Rozlišovací schopnost mikroskopu je dána především použitým objektivem. Posuzujeme ji podle nejmenší vzdálenosti dvou míst preparátu, která ještě od sebe rozeznáme [10]. Při rozlišovací schopnosti světelného mikroskopu cca 0,2 μm je možné docílit hodnot zvětšení mikroskopu (s dobrým obrazem) 1000 až 1500 [22]. V technikách mikroskopie pracujeme s níže uvedenými rozměry. Je proto třeba si uvědomit: 1 mikrometr (1 μm) = 0,001 mm = 10–6 m 1 nanometr (1 nm) = 0,001 μm = 10–6 mm = 10–9 m.
6
Obr. 1: Schéma zobrazování světelným mikroskopem F1 a F1' – ohniska objektivu, F2 a F2' – ohniska okuláru Předmět (preparát) je před předmětovým ohniskem objektivu, obraz předmětu (skutečný, převrácený a zvětšený) je v předmětové ohniskové rovině okuláru; okulár za těchto podmínek zobrazí předmět v nekonečnu, takže pozorování se děje bez akomodace oka [7], [10].
7
Obr. 2: Světelný mikroskop Olympus CX21 1 – okuláry 2 – binokulární hlava 3 – revolverový měnič objektivů 4 – objektivy 5 – stolek mikroskopu 6 – mechanismus pro upevnění preparátu 7 – šrouby křížového posuvu stolku (pro posuv preparátu) 8 – kondenzor s irisovou clonou 9 – makrošroub a mikrošroub (pro zaostřování obrazu) 10 – zdroj světla 11 – báze stativu
8
1.1.2 Obraz ve světelném mikroskopu Nebarvené buňky a tkáně obsahují složky, které se téměř neliší lomivostí světla, popř. průhledností, a proto jejich obraz v mikroskopu (strukturální čili refrakční obraz) není buď dostatečně výrazný, nebo není dosažitelný vůbec. Jiná situace vzniká v obarveném světelně mikroskopickém preparátu. Určité složky buněk a tkání pohltí určitá barviva tak, že tyto složky pak jsou jasně vidět v tzv. absorpčním obraze. V současné histologické technice převládá právě absorpční obraz barvených preparátů. Někdy je možné i u barvených preparátů s výhodou využít jak absorpce barev, tak lomu a interference světla. Oddálíme-li kondenzor od preparátu nebo zúžíme otvor irisové clony kondenzoru, můžeme za pomoci refrakčního obrazu lépe pozorovat např. příčné žíhání v myofibrilách kosterní svalové tkáně.
9
1.2 TRANSMISNÍ (PROZAŘOVACÍ) ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP – TEM 1.2.1 Několik dat ([4], [13] aj.)
J. J. Thomson (1897) – objev elektronu.
L. de Broglie (1924) – hypotéza o vlnových vlastnostech částic.
H. Busch (1926) – teorie o působení osově symetrických magnetických nebo elektrických polí jako čoček na elektrony nebo jiné nabité částice.
D. Gábor (1927) – první magnetická elektronová čočka v železném plášti.
M. Knoll a E. Ruska (1931) – první konstrukce elektronového mikroskopu.
L. Marton (1934) – použití elektronového mikroskopu pro biologické vzorky.
K rozvoji výroby československých elektronových mikroskopů došlo v 50. letech 20. století. Roku 1958 získal československý stolní elektronový mikroskop zlatou medaili na světové výstavě v Bruselu.
Firma Delong Instruments (ČR) vyvinula stolní elektronový mikroskop LVEM5 s urychlovacím napětím (odst. 1.2.3) 5 kV. Tento mikroskop sestává ze dvou mikroskopů, elektronového a světelného. Celková hodnota zvětšení mikroskopu LVEM5 v režimu TEM je až 150 000, jeho rozlišovací schopnost je 2,5 nm (r. 2008, [28]; viz též odst. 1.2.4).
K největším světovým výrobcům transmisních elektronových mikroskopů patří firmy JEOL, Hitachi a FEI.
10
1.2.2 Princip transmisního elektronového mikroskopu (obr. 3 až obr. 5) Ze zákonitostí optiky vyplývá, že rozlišovací schopnost objektivu světelného mikroskopu je tím vyšší, čím kratší je vlnová délka světla použitého v jeho osvětlovací soustavě. V optice korpuskulárního (částicového) záření platí stejné zákony jako v optice vlnového záření, jehož vlnová délka souhlasí s délkou příslušné tzv. de Broglieovy vlny (vlnové vlastnosti mají všechny mikročástice v souhlase s hypotézou, kterou vyslovil L. de Broglie) [10]. Délka λ této vlny je dána vztahem
λ
,
kde = 6,626.10–34 J s je Planckova konstanta, hmotnost částice při její rychlosti (blíže v [10]). Tato vlnová délka je u elektronů – při snadno dosažitelných rychlostech – nepatrným zlomkem vlnové délky viditelného světla. Užitím elektronového záření je tak možné dosáhnout podstatného zvětšení rozlišovací schopnosti mikroskopu; této skutečnosti využívá elektronová mikroskopie. Transmisní elektronový mikroskop splňuje podobně jako běžný světelný mikroskop princip prozařovacího mikroskopu. Místo viditelného světla je tu zobrazujícím prostředkem elektronové záření ve vhodném svazku urychlených elektronů. V potřebném vakuu emituje (v častém provedení TEM – obr. 4) žhavená wolframová katoda elektrony (jev termoemise), které jsou urychleny v elektrickém poli mezi katodou (v tzv. Wehneltově válci) a anodou a soustředěny kondenzorovou čočkou (čočkami) na preparát. Při průchodu elektronů preparátem dochází k jevům, které jsou důležité pro tvorbu obrazu v transmisním elektronovém mikroskopu (viz odst. 3.1). Následující objektiv vytváří zvětšený obraz preparátu. Dalšího zvětšení se dociluje pomocí projektivu (projektivů). (Schéma funkce tří čoček v zobrazovací soustavě TEM je na obr. 3.) Po dopadu na fluorescenční stínítko je výsledný obraz transformován v obraz viditelný okem. Obraz preparátu lze zachytit metodami fotografie; výsledkem je elektronogram. Uvedený typ termoemisní katody je v běžném provedení z wolframového vlákna, které je tvarováno do písmene V; obměnou je katoda s přivařeným zahroceným vláknem v ohybu tvarovaného vlákna. K dalším používaným katodám patří katoda z krystalu hexaboridu lanthanu (LaB6), jejíž emisní parametry převyšují parametry klasických wolframových katod. Pro práci v tzv. Schottkyho režimu je vhodná hrotová wolframová katoda typu ZrO/W(100), která je aktivována zirkoniem a kyslíkem. O katodách více v [18], [30] a [32]. Odchýlit urychlené elektrony z jejich původních drah není možné pomocí skleněných čoček, lze to však uskutečnit v magnetickém nebo elektrostatickém poli (popř. v kombinaci obou polí [11]) elektronových čoček. V elektronových mikroskopech se nejčastěji používají magnetické čočky s potřebným nehomogenním rotačně symetrickým magnetickým polem [12] k požadované fokusaci urychlených elektronů. Na elektron, který se pohybuje rychlostí , působí v tomto poli síla daná vektorovou rovnicí
F
e(
B),
kde e je náboj elektronu a B magnetická indukce. Dráhy elektronů při jejich pohybu od předmětu k obrazu (v prostoru uvedeného magnetického pole kolem optické osy čočky) jsou
11 prostorovými křivkami. Problematika elektronové optiky je podrobně řešena v [4], [12] a [30]. Schéma magnetické čočky je na obr. 5: Cívka, kterou protéká budicí proud, je uzavřena do feromagnetického pláště; magnetické pole se uzavírá mezi tzv. pólovými nástavci. Dokonalost magnetického pole čočky závisí především na kvalitě provedení pólových nástavců. Poloha ohnisek magnetických čoček – ohniskové vzdálenosti – se mění se změnami velikosti budicího proudu čoček nebo urychlovacího napětí (viz odst. 1.2.3). Při těchto změnách se mění i velikost úhlu otočení obrazu vzhledem k předmětu; toho se využívá k centrování soustavy magnetických čoček (podrobně v [3] a [9]). Magnetické čočky mají obdobné vady jako čočky skleněné. O rozlišovací schopnosti transmisního elektronového mikroskopu rozhoduje především kvalita objektivu, která je podstatně ovlivněna jeho sférickou vadou a osovým astigmatismem. Další významnější vadou (vzhledem k rozlišovací schopnosti TEM) je chromatická vada. Stručně nyní tyto vady popíšeme. Sférická vada: Vstupuje-li do čočky z předmětového bodu na optické ose široký monochromatický svazek elektronů, elektrony procházející okrajovými oblastmi čočky jsou vychylovány blíže k čočce (čím dále od optické osy vstupují do čočky, tím blíže k čočce jsou vychylovány) než elektrony úzkého svazku v paraxiálním prostoru čočky. Nesbíhají se tedy všechny dráhy širokého svazku elektronů (z tohoto bodu) po průchodu čočkou v jediném bodě optické osy. Osový astigmatismus: Tato vada vzniká především proto, že pólové nástavce čočky (viz obr. 5) nejsou ideálně rotačně symetrické (rozměrově i z hlediska stejnorodosti materiálu). Magnetické pole čočky není vlivem této závady osově symetrické. Projev osového astigmatismu lze pozorovat např. na změnách tvaru Fresnelova ohybového jevu (viz odst. 3.1, obr. 20). O osovém astigmatismu podrobněji v práci [30]. Chromatická vada: K této vadě vede nestabilita urychlovacího napětí a budicího proudu čočky, nestejná energie emitovaných elektronů a ztráta energie urychlených elektronů při jejich průchodu preparátem (viz odst. 3.1). Uvedené faktory způsobují změny ohniskové vzdálenosti čočky. Zobrazení bodu na optické ose není vlivem zmíněných vad opět bodové. O problematice vad magnetických čoček pojednávají např. práce [4] a [30]. Rozlišovací schopnost transmisního elektronového mikroskopu: Kvalitní transmisní elektronové mikroskopy mají rozlišovací schopnost podstatně vyšší, než jaké lze dosáhnout při vyšetřování biologických vzorků. Např. v TEM (200 kV) s rozlišovací schopností asi 0,27 nm je pro získání dostatečného kontrastu nutno provést rozostření (viz tzv. fázový kontrast – odst. 3.1), kterým se rozlišovací schopnost může snížit až na 1–2 nm [32]. Hodnoty zvětšení transmisního elektronového mikroskopu: V biologických vědách se pro studium detailů nejčastěji používají hodnoty zvětšení kolem 30 000, méně již do 60 000 až 100 000.
12
Obr. 3: Schéma funkce tří čoček v zobrazovací soustavě TEM při velkém zvětšení (clony neznázorněny) Pozn.: Ke znázornění postupu zvětšování obrazu v zobrazovací soustavě transmisního elektronového mikroskopu jsou použity paprsky jako ve světelné optice. Obraz za každou magnetickou čočkou je vůči předmětu otočen o určitý úhel (v závislosti na budicím proudu čočky a urychlovacím napětí – viz odst. 1.2.2).
13
Obr. 4: Schéma elektronové trysky (blíže viz odst. 1.2.3) 1 – wolframová katoda 2 – Wehneltův válec 3 – anoda 5 – křižiště
4 – elektronový svazek
O elektronových tryskách podrobně pojednávají publikace [18] a [30].
Obr. 5: Schéma magnetické čočky 1 – feromagnetický plášť 2 – vinutí cívky nástavce
3 – nemagnetická vložka
Magnetickým čočkám je věnována publikace [11].
4 a 5 – pólové
14
1.2.3 Technické řešení transmisního elektronového mikroskopu (obr. 6 až obr. 11) Jako příklad technického řešení TEM uvádíme československý transmisní (prozařovací) elektronový mikroskop TESLA BS 500 (obr. 6) – [8], s nímž pracujeme v našem ústavu; je proto výhodné využít ho k popisu technického řešení i k názornému předvedení ve výuce. Zaručená bodová rozlišovací schopnost tohoto mikroskopu je 0,7 nm a maximální hodnota zvětšení 100 000. Funkce kondenzorů, objektivu a projektivů v tomto mikroskopu zastávají magnetické čočky. Základní princip činnosti současných transmisních elektronových mikroskopů zůstává stejný, jejich užitné parametry jsou však pochopitelně lepší a uživatelský komfort je vyšší (blíže viz odst. 1.2.4). Ve srovnání s běžným světelným mikroskopem jsou části TEM orientovány v obráceném směru (obr. 7). Vlastní zdroj elektronů, tj. žhavená wolframová katoda, se nachází v horní části mikroskopu. Fluorescenční stínítko k pozorování obrazu je naopak umístěno v dolní části. Katoda a elektronový svazek potřebují pro svou činnost patřičnou úroveň vakua. Proto se ve vakuu nacházejí veškeré technické prvky elektronového mikroskopu a k nezbytnému vybavení elektronového mikroskopu patří vakuový systém. Transmisní elektronový mikroskop TESLA BS 500 může pracovat ve třech různých režimech. Tvorba obrazu při práci ve světlém poli je popsána v odst. 3.1. Při zobrazování v temném poli (používá se výjimečně) se tvorby obrazu nezúčastňují elektrony, které projdou preparátem bez významného odchýlení. Třetím režimem je elektronová difrakce (mikrodifrakce), která se používá při studiu krystalů (detailně v [32]). Popis druhého a třetího režimu je mimo rámec této práce. a) Osvětlovací soustava Osvětlovací soustavu TEM TESLA BS 500 tvoří tzv. elektronová tryska a dva kondenzory. Elektronová tryska je zdrojem elektronů, které jsou uspořádány do elektronového svazku s potřebnými vlastnostmi. Sestává z výše uvedených součástí – katody, Wehneltova válce a anody (viz obr. 4; umístění v TEM je na obr. 7, katoda v držáku na obr. 8). Optické vlastnosti elektronové trysky jsou určovány emisními vlastnostmi katody, potenciály, tvarem a vzájemnými vzdálenostmi zmíněných součástí. Vysokofrekvenčně žhavená katoda je zhotovena z wolframového vlákna tvarovaného do písmene V; elektrony vystupují z jejího hrotu. Hrot katody musí být ustaven s přesností ± 0,1 mm (pod lupou) do osy otvoru Wehneltova válce; toto ustavení významně ovlivňuje směr emitovaného svazku elektronů. Předepsané osové vzdálenosti hrotu katody od otvoru Wehneltova válce se dociluje sestavením katody s držákem v přípravku (obr. 9). Pod Wehneltovým válcem je umístěna uzemněná anoda s centrálním otvorem pro průchod elektronového svazku. K urychlení pohybu elektronů slouží vysoké napětí, které je přiloženo mezi katodu a anodu, tzv. urychlovací napětí. Pro práci s TEM TESLA BS 500 lze velikost urychlovacího napětí vybrat ze dvou hodnot (60 kV nebo 90 kV). Wehneltův válec (fokusační elektroda) má vůči katodě záporné napětí, které (spolu s vhodným tvarem válce) ovlivňuje elektrické pole elektronové trysky tak, že se působením tohoto pole elektronový svazek zužuje a před kruhovým otvorem v anodě vytváří křižiště
15 (nejužší místo svazku – viz obr. 4). Křižiště je u termoemise považováno za reálný zdroj elektronů v mikroskopu (z křižiště již elektrony vystupují přímočaře) [18]. První kondenzor osvětlovací soustavy vytváří zmenšený obraz křižiště, který se druhým kondenzorem promítá na preparát (umístění kondenzorů v TEM viz obr. 7). Vhodnými změnami ohniskových vzdáleností kondenzorů lze měnit průměr osvětlovacího svazku, průměr osvětlené plochy preparátu a hodnotu tzv. úhlové apertury osvětlení (tj. polovičního úhlu, pod nímž elektrony dopadají na preparát – [2] a [3]). Díky kondenzorům se elektronovými paprsky ozáří jen velmi malé políčko prohlíženého preparátu a zajistí se tak ochrana preparátu před rychlým nadměrným přehřátím větší plochy. Preparát vystavený bombardování elektrony se totiž zahřívá, poněvadž část energie, kterou elektrony ztrácejí při průchodu preparátem, se v tomto preparátu mění na energii tepelnou. Kondenzory jsou doplněny clonami, které odřezávají okrajovou část elektronového svazku. Mechanismus clony druhého kondenzoru umožňuje zvolit clonu o vhodné velikosti otvoru (umístění mechanismu této clony viz obr. 7); touto clonou je určena maximální úhlová apertura osvětlení. Osvětlovací soustavu TEM TESLA BS 500 doplňuje vychylovací zařízení elektronového svazku (detailně v [8]). b) Prostor preparátu Během práce musí být v tubusu elektronového mikroskopu předepsané vakuum, které není možno porušit zaváděním preparátů zvnějšku. Preparát – ultratenké řezy na nosné síťce – se tudíž do stolku nacházejícího se v tubusu umístí cestou vakuové propusti. Technické řešení propusti ukazuje obr. 10. Síťka s řezy se vloží do čepičky držáku preparátu a čepička se nasadí na těleso držáku (obr. 11). Držák s preparátem se pak uzavře do malého zavzdušněného pomocného prostoru – komory preparátu (obr. 10). Komora je oddělena od tubusu TEM uzávěrem. Z komory se vyčerpá vzduch a poté lze uzávěr otevřít. Držák s preparátem se za pomoci táhla přesune do tubusu a vloží se do příslušného otvoru ve stolku preparátu. Stolek je spojen se dvěma mikroposuvy, které umožňují posuv preparátu ve dvou na sebe kolmých směrech. Je možný i rotační pohyb stolku v obou směrech. Antikontaminační adaptér mikroskopu (obr. 7) umožňuje zchladit bezprostřední okolí preparátu a omezit kontaminaci ultratenkých řezů v tubusu TEM uhlíkem. Podrobný popis zařízení je mimo rámec této práce. c) Zobrazovací soustava Zobrazovací soustavu TEM TESLA BS 500 tvoří objektiv, pomocný projektiv a hlavní projektiv (jejich umístění v TEM je označeno na obr. 7). Nejdůležitější částí zobrazovací soustavy je objektiv, který vytváří základní obraz objektu. Vlastnosti objektivu jsou rozhodující pro dosažitelnou rozlišovací schopnost transmisního elektronového mikroskopu. Významnou vadou objektivu je jeho sférická vada, která je příčinou omezení rozlišovací schopnosti. Velikost této vady je v podstatě dána ohniskovou vzdáleností objektivu [3]; její
16 vliv lze omezit clonou s otvorem malého průměru. V současné době již existují korektory sférické vady čoček [32]. Další významnou vadou je osový astigmatismus objektivu, který se koriguje elektronovou čočkou, tzv. stigmátorem (blíže v [3], [8], [11] a [30]). Dalšími dvěma stigmátory se koriguje astigmatismus pomocného projektivu a druhého kondenzoru osvětlovací soustavy. Nepříznivý vliv chromatické vady roste s rostoucí tloušťkou preparátu, kdy se zvětšuje podíl nepružně rozptýlených elektronů (viz odst. 3.1). Problematikou korekce optických vad magnetických čoček se zabývají např. práce [30] a [32], konkrétní aplikace pro TEM TESLA BS 500 je popsána v [8]. Pomocný projektiv, který je zařazen mezi objektiv a hlavní projektiv, přispívá k velkému konečnému zvětšení mikroskopu (má i další využití – blíže ve [3], pro TEM TESLA BS 500 v [8]). Hlavní projektiv vytváří konečný zvětšený elektronový obraz objektu a promítá jej na fluorescenční stínítko, které je umístěné naspodu tubusu TEM (obr. 6 a obr. 7). Zobrazovací soustavu TEM TESLA BS 500 doplňuje aperturní clona objektivu (ovlivňující tvorbu kontrastu obrazu – viz odst. 3.1) a selekční clona (užívaná při difrakci – popsáno v [3] a [8]; je použitelná i pro zlepšení kontrastu obrazu). Mechanismus těchto clon umožňuje vybrat clonu s potřebnou velikostí otvoru (umístění mechanismů clon viz obr. 7). d) Komora se stínítkem V transmisním elektronovém mikroskopu badatel nepozoruje obraz preparátu přímo (jako je tomu ve světelném mikroskopu), nýbrž nepřímo na fluorescenčním stínítku (obr. 6 a obr. 7). Jemná vrstva luminoforu, zpravidla sirníku zinečnatého, transformuje elektronový obraz, který není lidskému oku dostupný, na obraz viditelný. Současně je použití stínítka i výhodou, neboť jeho rozlišovací schopnost je lepší než rozlišovací schopnost oka. V kombinaci s binokulární lupou je užitek ještě větší. e) Zařízení pro fotografickou dokumentaci Původně byla pro záznam obrazu umístěna pod stínítkem TEM TESLA BS 500 kazeta s fotografickými deskami (s potřebnou citlivostí na elektronové záření). Nyní je mikroskop opatřen digitální kamerou (obr. 6, obr. 7), která snímá obraz ze scintilačního detektoru na CCD čip. Obrazová data jsou odesílána do počítače; výsledný obraz lze prohlížet na monitoru počítače, vyhodnocovat, dále zpracovávat, archivovat a tisknout. f) Vakuová soustava Vakuová soustava TEM TESLA BS 500 je dvoustupňová. Dvě rotační vývěvy připravují vstupní úroveň vakua („předvakuum“) pro práci difúzní olejové vývěvy, jejíž pracovní vakuum má hodnotu cca 6,7.10–3 Pa.
17
1.2.4 Optimální využití transmisního elektronového mikroskopu, inovace Pro optimální využití transmisního elektronového mikroskopu je velmi důležité umístit mikroskop podle požadavků výrobce do prostředí bez vážných rušivých vlivů, jimiž jsou především magnetická střídavá pole (pocházející např. z elektrické instalace) a vibrace (např. vlivem blízké dopravy). Tyto a další negativní faktory (k nimž patří mj. osový astigmatismus objektivu, případná nestabilita urychlovacího napětí a budicích proudů, provozní nečistoty v prostoru mikroskopu) ovlivňují dosažitelnou rozlišovací schopnost transmisního elektronového mikroskopu. Hledání zdrojů závad nebývá snadné (zvláště při současném působení několika negativních faktorů). Více o této problematice v [3] a [9], o seřizování transmisního elektronového mikroskopu TESLA BS 500 a jeho provozu v [8]. Kvalitní elektronogram je výsledkem dokonalého zvládnutí problematiky zkoumaného biologického objektu, přípravy preparátu a práce s transmisním elektronovým mikroskopem. Ve srovnání se staršími přístroji se současné transmisní elektronové mikroskopy vyznačují mj. vyšší rozlišovací schopností, vyšším uživatelským komfortem a širší nabídkou různých provozních režimů. Uvádíme několik inovací, které se na tomto pokroku podílejí: Byly vyvinuty další typy katod, rozšířilo se využití výše uvedených katod z krystalu hexaboridu lanthanu (o katodách detailně v práci [18]). Zvětšuje se počet čoček v osvětlovací i zobrazovací soustavě (tři až čtyři kondenzory v osvětlovací soustavě, až osm čoček v zobrazovací soustavě [30]); to rozšiřuje možnosti mikroskopu v různých režimech činnosti. Byl vyvinut korektor sférické vady magnetických čoček; u transmisního elektronového mikroskopu se umisťuje za objektiv [32]. Odstraňování nepružně rozptýlených elektronů (odst. 3.1) pomocí tzv. energiového filtru ([21], [30] a [32]) přispívá ke spolehlivější interpretaci obrazu. Rostoucí kvalita snímacích kamer umožňuje dokonalejší záznam obrazu. Pokrok v oblasti počítačů přispívá k výraznému zlepšení uživatelského komfortu. Některé funkce mikroskopu jsou počítačem řízeny; usnadňuje se tak uvedení mikroskopu do chodu, jeho vlastní provoz i záznam a následné zpracování experimentálních dat. Velmi zajímavým řešením elektronového mikroskopu je transmisní elektronový mikroskop LVEM5 (uvedený v odst. 1.2.1) s urychlovacím napětím 5 kV. Elektronová tryska mikroskopu má katodu typu ZrO/W(100) s životností přes 2 000 hodin. Pro vytvoření magnetického pole kondenzoru a objektivu jsou zde použity permanentní magnety, projektiv je elektrostatickou čočkou [28]. U biologických nebo polymerních preparátů s hustotou kolem 1 g/cm3 se při tomto urychlovacím napětí dosahuje vysokého kontrastu obrazu. U vhodných preparátů lze vynechat kontrastování pomocí těžkých kovů (podle [32]).
18
Obr. 6: Transmisní elektronový mikroskop TESLA BS 500 (celkový pohled) 1 – vysokonapěťový kabel 2 – tubus mikroskopu 3 – komora s fluorescenčním stínítkem 4 – binokulár 5 – digitální kamera MegaView III G2 6 – levý ovládací panel (mj.): ovládání urychlovacího napětí, žhavení vlákna katody, regulace proudu elektronového svazku, ovládání kondenzorů 7 – pravý ovládací panel (mj.): tlačítko zdroje pro čočky, ovládání vakua, ovládání objektivu (zaostřování preparátu), změny zvětšení mikroskopu 8 – zdroj 9 – násobič Na monitoru počítače je zastižen obraz UT řezu, pořízený digitální kamerou.
19
Obr. 7: Části transmisního elektronového mikroskopu TESLA BS 500 1 – vysokonapěťový kabel 2 – těleso katody 3 – těleso anody 4 – kondenzor 1 5 – kondenzor 2 6 – mechanismus clony v kondenzoru 2 7 – okénko komory preparátu 8 – ovladač otočného stolku preparátu 9a, 9b – posuvy křížového stolku preparátu 10 – vakuová propust preparátu 11 – táhlo výměny preparátu 12 – mechanismus aperturní clony objektivu 13 – objektiv 14 – mechanismus selekční clony 15 – pomocný a hlavní projektiv 16a, 16b – dvojitý převod posuvu preparátu 17 – binokulár 18 – komora s fluorescenčním stínítkem 19 – digitální kamera MegaView III G2 20a, 20b – část levého a pravého ovládacího panelu 21 – antikontaminační adaptér
20
Obr. 8: Držák katody s wolframovou katodou pro TEM (TESLA BS 500) (Skutečný vnější průměr držáku je 26 mm.)
Obr. 9: Wolframová katoda s držákem katody v sestavovacím přípravku pro TEM (TESLA BS 500)
21
Obr. 10: Komora preparátu, objektiv a aperturní clona objektivu TEM (TESLA BS 500) 1 – komora preparátu 2 – okénko komory preparátu 3 – ovladač otočného stolku preparátu 4 – vakuová propust preparátu 5 – mechanismus aperturní clony objektivu 6 – objektiv 7a, 7b – centrování horního pólového nástavce objektivu
22
Obr. 11: Držák preparátu pro TEM (TESLA BS 500) Shora dolů: držák pro tři preparáty (nosné síťky s UT řezy), čepička preparátového držáku a preparát – nosná síťka s UT řezy.
23
1.3 POROVNÁNÍ SVĚTELNÉ A TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÉ MIKROSKOPIE (tab. 1) Tab. 1 konvenční světelná mikroskopie
transmisní elektronová mikroskopie
zdroj záření
elektrická žárovka
elektronová tryska
záření
viditelné světlo
elektronové
zobrazovací soustava – optika (tj. objektiv a okulár/projektiv)
skleněné čočky
elektronové čočky
prostředí v mikroskopu
vzduch
potřebná úroveň vakua
pozorování obrazu
přímé (vizuální)
nepřímé (lupou na fluorescenčním stínítku)
preparáty
parafinové řezy – trvanlivé
UT řezy – nestabilní (při bombardování elektrony)
tloušťka 5–10 μm (polotenké epoxidové řezy – pouze 0,5 až 1 μm)
vhodná tloušťka pro UT řezy: pod 100 nm [26] (obvykle od 40 až 60 nm [13])
řezy jsou umístěny na podložním skle
řezy jsou umístěny na nosné síťce
rozlišovací schopnost mikroskopu (pro biologické preparáty)
0,2 μm
cca 5 nm [26] (popř. méně – viz odst. 1.2.2)
hodnota zvětšení mikroskopu (pro biologické preparáty)
1 000 (1500 [22])
pro UT řezy se používá do maxima cca 60 000 (běžně užívaná: 5 000–30 000)
24
1.4 ROZMĚRY STRUKTUR POZOROVATELNÝCH V MIKROSKOPU (tab. 2, tab. 3) Vzhledem k rozlišovací schopnosti světelného a transmisního elektronového mikroskopu lze zobecnit, že struktury, které můžeme pozorovat ve světelném mikroskopu, mají rozměr v mikrometrech [μm], zatímco transmisnímu elektronovému mikroskopu odpovídá velikost struktur v nanometrech [nm]. Nejmenší struktury rozlišitelné ve světelném mikroskopu jsou velikosti mitochondrií, lyzosomů či jaterního žlučového kanalikulu (kapiláry). Většinou je však nepostihneme v parafinových, nýbrž v mnohem tenčích epoxidových řezech. Větší hodnoty zvětšení transmisního elektronového mikroskopu umožňují v dostatečně tenkých rutinních UT řezech (a při dobrém kontrastu) rozlišit trilaminární charakter buněčných membrán, póry v obalu jádra, ribosomy, synaptické váčky, mikrotubuly (např. neurotubuly v neuronech) a cytoplazmatická intermediální filamenta. Některé struktury – ve světelném mikroskopu kupř. erytrocyt, malý lymfocyt, tuková buňka běžné velikosti, vlákno kosterního svalu, v transmisním elektronovém mikroskopu pinocytární váčky, ribosomy, intermediální filamenta – mají zhruba konstantní velikost. Můžeme jich při prohlížení s výhodou použít ve funkci „měřítka“ za účelem posuzování velikosti okolních struktur.
25
Tab. 2: Přibližné rozměry vybraných buněk a dalších tkáňových struktur pozorovatelných ve světelném mikroskopu ([19], [22], [29] aj.)
d – délka p – průměr t – tloušťka oocyt (ve zralém Graafově folikulu před ovulací) hepatocyt malá zrnitá buňka kůry mozečku pyramidová buňka mozkové kůry (tělo) Betzova pyramidová buňka mozkové kůry (tělo) unilokulární (bílá) tuková buňka běžně při obezitě plazmatická buňka erytrocyt malý lymfocyt (krevní nátěr) trombocyt (krevní nátěr) megakaryocyt osteoklast hladká svalová buňka (např. malá krevní céva) hladká svalová buňka (děloha za těhotenství) kardiomyocyt vlákno kosterního svalu myofibrila kosterního svalového vlákna buněčné jádro všeobecně (je-li kulovitého či oválného tvaru) kolagenní vlákno retikulární vlákno elastické vlákno řasinka buňky respiračního epitelu bičík spermie žlučová kapilára v játrech krevní kapilára (lumen) ledvinové tělísko Meissnerovo tělísko (kůže) bazální membrána epitelů *
p p p p p p p p p p p p p d p d d p p p p p p p d d p p p p t
[μm]
120–150 20–30 5 10–50 až 100 50–70 až 200 10–20 7,5 6–10 2–4 35–150 až 150 20 5–6 až 500 80–100 10–20 50–60 1–2 5–10 1–20 0,5–2 1–10 5–10 100 1–2 7–10 200 150 50
* Rutinním barvením (kupř. HE) ji nelze znázornit. Technikou PAS či impregnací solí stříbra se znázorní její lamina reticularis. Imunohistochemicky je možno zviditelnit komponenty bazální laminy (např. laminin, kolagen typ IV).
26
Tab. 3: Přibližné rozměry vybraných buněčných a mezibuněčných struktur pozorovatelných v TEM ([22], [24], [29] aj.)
d – délka p – průměr t – tloušťka š – šířka
plazmalema nukleární pór mitochondrie primární lyzosom sekundární lyzosom ribosom zrna glykogenu (jsou větší a tmavší než ribosomy) pinocytární váček mikrotubuly intermediální filamenta (neurofilamenta, desmin, vimentin, cytokeratiny) synaptické váčky mikroklky kartáčového lemu enterocytu výstelka plicního alveolu (pneumocyty typu I - nejtenčí část) mezibuněčná štěrbina v epitelech (všeobecně) mezibuněčná štěrbina v neuropilu CNS synaptická štěrbina mezibuněčná štěrbina v oblasti desmosomu fibrila kolagenního vlákna fibrila retikulárního vlákna periodicita žíhání ve fibrile kolagenního a retikulárního vlákna bazální lamina epitelů - komponenty: lamina densa lamina lucida lamina reticularis bazální membrána v ledvinovém tělísku (endotel - podocyt)
[nm]
t p d p p p p
7.5–10 9 500–2 000 50–500 200–2 000 15–25 20–40
p p p
80 25 10
p d t
40–60 1 000 25
š š š š p p
20 20 20–30 30 75 35 67
t t t
30–100 50 a méně variabilní 300–350
27
2 ZPRACOVÁNÍ BIOLOGICKÝCH OBJEKTŮ PRO TRANSMISNÍ ELEKTRONOVOU MIKROSKOPII, TECHNIKA POLOTENKÝCH A ULTRATENKÝCH ŘEZŮ
2.1 ODBĚR BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU, FIXACE, ODVODNĚNÍ A ZALITÍ PRO TRANSMISNÍ ELEKTRONOVOU MIKROSKOPII (obr. 12, obr. 13) Zpracování biologického materiálu musí být maximálně šetrné, aby se poměry v preparátu co nejvíce blížily stavu zaživa. V následujícím popisu se věnujeme chemickému zpracování biologického materiálu (detailně např. v práci [13]). Stručný přehled způsobů přípravy biologických vzorků je uveden v [32].
2.1.1 Základní kroky při zpracování biologického materiálu a) Odběr materiálu V medicíně se nejčastěji v transmisním elektronovém mikroskopu vyšetřují buňky nebo tkáně. Odběr je má zastihnout živé nebo krátce po smrti. S biologickým materiálem je nutno pracovat rychle a šetrně. Buňky v suspenzi se před dalším zpracováním podrobí šetrnému centrifugování. Z tkání je třeba připravit velmi malé (maximálně 1 mm3) tkáňové bločky. b) Chemická fixace Chemická fixace vede k rychlému usmrcení buněk. Denaturací bílkovin stabilizuje a konzervuje tvar, strukturu a obsah buněk (tkání), brání degradačním procesům (autolýze) a připravuje objekt k dalšímu zpracování. Buňky (tkáně) mají po fixaci vykazovat pokud možno minimální posmrtné změny (artefakty). V transmisní elektronové mikroskopii se k fixaci nejčastěji používají [26]: 1) Aldehydy
Glutaraldehyd (v koncentraci 100–600 mmol/l) – výborně fixuje bílkoviny a proteiny, špatně reaguje např. s lipidy; pomalu proniká do tkáně (nevýhoda).
Formaldehyd (v koncentraci 330–1300 mmol/l); roztok se vždy připravuje těsně před užitím, z čistého polymeru, tj. paraformaldehydu) – proniká rychleji do tkáně než glutaraldehyd, bílkoviny však stabilizuje hůře.
2)
Oxid osmičelý (v koncentraci 40–80 mmol/l) – stabilizuje lipidy (dobré znázornění membrán) a zvyšuje kontrast preparátu; nemá však schopnost kvalitně fixovat bílkoviny, a proto se užívá jako druhotná fixační látka po aldehydové fixaci tkáně.
28 Kvalita fixace závisí na osmolalitě a pH fixačních roztoků, na jejich teplotě a na koncentraci fixační látky (tato se řídí druhem fixovaného objektu: izolované buňky, suspenze, tkáň; fixace perfúzní a imerzní; odtud rozmezí koncentračních látek uvedená výše). K udržení pH jsou primární fixační látka (aldehyd) a rovněž oxid osmičelý užívaný k sekundární fixaci (postfixaci) rozpuštěny v tlumivém roztoku (např. fosforečnanovém). Také roztok užívaný k promývání (vypírání) objektů je tlumivý. Rovněž významná je délka fixace, která je různá pro různé druhy fixovaného materiálu. c) Odvodnění Z buněk (tkání) se šetrně odstraní voda, která v biologickém materiálu tvoří největší podíl. Až poté bude možno materiál prosytit zalévací látkou – médiem (zalévací média se ve velké většině nemísí s vodou). Při následném zalévání do nepolárních, s vodou se nemísících zalévacích látek se k odvodnění nejčastěji používá etanol nebo aceton [13]. Po odvodnění etanolem se tkáně převedou do zalévací hmoty (epoxidové pryskyřice) přes propylenoxid. Propylenoxid se velmi dobře mísí s etanolem a epoxidovými pryskyřicemi a používá se jako ideální přechodné médium mezi odvodněním a zaléváním tkání. d) Zalévání Až po zalití do příslušného média (nejčastěji jde o epoxidové pryskyřice) a následné polymeraci zalévacího média je možné objekt řezat na ultratenké (UT) řezy – řezy o tloušťce menší než 100 nm. Zalévací médium musí zachovat veškeré detaily v ultrastruktuře buněk (tkání). Protože zůstává i po nařezání součástí UT řezu, musí být stabilní ve vakuu a při průchodu elektronového svazku. Nesmí pohlcovat ani vychylovat elektrony procházející řezem. Pro účely kontrastování UT řezů vykazuje zalévací médium dostatečnou prostupnost pro kontrastující roztoky.
2.1.2 Přehled pracovního postupu při běžném zpracování tkání Rámcově je uveden postup přípravy polymerizovaných bloků se zalitou lidskou, popř. živočišnou tkání, který běžně užíváme v naší laboratoři. 1. den Šetrný odběr materiálu (např. excize), úprava materiálu (v prostředí kapky fixačního roztoku) na kostky či hranolky (tkáňové bloky), u nichž největší objem má být maximálně 1 mm3. Umístění bloků do nádobky s fixačním roztokem (při tzv. imerzní fixaci). Primární fixace: roztok glutaraldehydu a paraformaldehydu (ve směsi) ve fosforečnanovém pufru (tlumivém roztoku) ( pH 7,2–7,5 ) – 4 hodiny při pokojové teplotě. Promývání v pracím pufru. Sekundární fixace (postfixace): roztok oxidu osmičelého ve fosforečnanovém pufru – 1,5 až 2 hodiny při pokojové teplotě.
29 Proplach vychlazeným roztokem octanu sodného. Kontrastování tkáně v bloku: roztok octanu uranylu – 30 minut (za chladu a ve tmě). Proplach vychlazeným roztokem octanu sodného. Proplach v roztoku sacharózy (za chladu), poté ponechání přes noc v chladu v roztoku sacharózy. 2. den Odvodnění tkáňových bloků vzestupnou etanolovou řadou, tj. v sérii vodných roztoků etanolu o jeho zvyšující se koncentraci (při třech použitých roztocích je první a druhý roztok vychlazený, třetí má pokojovou teplotu), potom v bezvodém (absolutním) etanolu o pokojové teplotě. Prosycení propylenoxidem při pokojové teplotě. Prosycení ve směsi propylenoxidu a ED (E – Epon 812, D – Durcupan ACM). Prosycování čistou směsí ED přes noc. 3. den Přenesení tkáňových bloků do forem a vlastní zalití do směsi ED (s akcelerátorem – urychlí proces polymerace). Polymerace v termostatu při teplotě 58–60 ºC po dobu 48 až 72 hodin.
30
Obr. 12: Tkáňové bloky pro transmisní elektronovou mikroskopii ve fixačním roztoku
31
Obr. 13: Parafinový blok pro světelnou mikroskopii a epoxidové bloky pro transmisní elektronovou mikroskopii Během osmifikace (postfixace) došlo ke zčernání tkáně. Povšimněte si zejména epoxidového bloku ve tvaru hranolu (zcela vpravo). Čelní část tohoto bloku byla dodatečně tzv. trimováním upravena do tvaru pyramidy, čímž byla připravena pro polotenké (popř. ultratenké) řezání.
32
2.2 TECHNIKA POLOTENKÝCH A ULTRATENKÝCH ŘEZŮ 2.2.1 Ultramikrotom. Řezání polotenkých a ultratenkých řezů (obr. 14 až obr. 17) Pro řezání (krájení) ultratenkých řezů slouží ultramikrotomy. Konstrukčně jsou řešeny buď na termodilatačním nebo mechanickém principu posunu objektu (epoxidového bloku s tkání) směrem k noži. Ultrotome Nova (LKB, Švédsko) v naší laboratoři (viz obr. 14 a obr. 15) je typický představitel termodilatačního typu přístroje. Držák s objektem se pomocí dilatace ohřívané tyče ultramikrotomu postupně o určitou dráhu (jež představuje tloušťku řezu) posouvá směrem k noži. Objekt se při řezání pohybuje shora dolů a zpět, při zpětném pohybu však nesmí narážet na nůž. Ten se proto v této fázi od objektu nepatrně odklání a hned poté se vrací na původní místo. Nože pro ultramikrotom jsou skleněné, popř. velmi drahé diamantové (obr. 16). Skleněné nože se lámou na přístroji Knife Maker LKB (Švédsko). Výchozím materiálem je pás z tvrdého skla, z nějž se zprvu odlomí čtverce a posléze (lomem čtverce v diagonále) nože trojúhelníkového tvaru. Posouzení kvality ostří nože přesahuje rámec této práce. Nůž se pak opatří vaničkou (zhotovenou např. z kovové pásky). V diamantovém noži představuje ostří technický diamant, vsazený do trojúhelníkové plastové báze, jejíž součástí je i vanička. Tento nůž poskytuje velmi kvalitní ultratenké řezy. Před vlastním krájením se vanička nože až po ostří nože naplní destilovanou vodou. Na její hladinu se pak splavují ultratenké řezy, které v ideálním případě během krájení vytvářejí na vodní hladině souvislý řetězec (pásku) řezů. Ultramikrotom je vybaven difúzním osvětlením a binokulárním mikroskopem. Čelní plochu objektu (s aktuálně krájenou tkání), ostří nože, hladinu vody ve vaničce (na níž je díky osvětlení patrný stříbrný reflex) a kvalitu řezů je tak možno během krájení bedlivě sledovat. Interferencí světelných vln (odražené povrchem řezů s odraženou rozhraním řezů a vodní hladiny) vznikají barevné reflexy, které slouží k odhadu tloušťky řezů. Nejtenčí řezy jsou šedé (tloušťky méně než 60 nm) a stříbrné (60–90 nm), poté následují zlaté řezy (90–150 nm). Řezy purpurové, eventuálně jiných barev, již nejsou pro transmisní elektronovou mikroskopii vhodné. Dosáhne-li se krájením takového počtu řezů v pásce, který lze umístit na nosnou síťku (obvykle pokrytou podložní blankou), zastaví se chod ultramikrotomu. Síťka (viz obr. 17) se uchopí za okraj hrotem pinzety. Poté se opatrně ponoří pod hladinu vody ve vaničce, přemístí se pod pásku řezů a spolu s ní se vyjme nad hladinu. Po obarvení (kontrastování) bude možno v elektronovém mikroskopu pozorovat jen tu část plochy ultratenkých řezů, která leží nad otvory v síťce. Objekt – epoxidový blok, v němž je zalita tkáň, je potřebí pro krájení ultratenkých řezů určitým způsobem připravit. Obvykle je také nutné předem rozhodnout, která část tkáně bude pro pozorování v elektronovém mikroskopu důležitá. Především je třeba ručně žiletkou z čela bloku odstranit nadbytečnou pryskyřici, aby se obnažila zalitá tkáň. Po stranách tkáně se pak čelní část bloku ořeže do tvaru pyramidy (tzv. trimování) tak, aby čelo bloku získalo tvar malého pravidelného lichoběžníku. Až potom se přistoupí ke krájení, přičemž jako první se (zatím pouze suchým nožem) ukrojí tzv. polotenké řezy (tloušťky 0,5–1 μm) – obr. 17. Řezy
33 se obarví např. roztokem toluidinové modři (viz odst. 2.2.2). Po zamontování se řezy prohlédnou ve světelném mikroskopu a určí se to místo ve tkáni, z něhož se budou dál krájet ultratenké řezy. Čelní ploška bloku se pak novým trimováním upraví do žádoucí, tentokrát značně menší velikosti, pro ultratenké krájení. Pro krájení polotenkých řezů se obvykle používá skleněný nůž a diamantový nůž je vyhrazen pro ultratenké krájení. Existují však též diamantové nože určené pro přípravu polotenkých řezů (obr. 16). Podrobné informace k problematice tohoto odstavce lze nalézt např. v [13].
2.2.2 Barvení polotenkých řezů Polotenké řezy poskytují daleko jemnější a podrobnější obraz než řezy parafinové. Pro barvení roztokem toluidinové modři (toluidinová modř ve vodném roztoku boraxu) se polotenké řezy pomocí pinzety či drátěného očka přenesou na kapku destilované vody na podložním sklíčku. Po vysušení se řezy za tepla obarví (a potom zbaví zbytků barviva). Tento postup a další způsoby barvení detailně popisuje práce [13].
2.2.3 Kontrastování ultratenkých řezů (obr. 18) Ke zvýšení kontrastu obrazu (viz odst. 3.1) ultratenkých řezů v transmisním elektronovém mikroskopu se nejčastěji používají sloučeniny uranu a olova (tzv. těžkých kovů), které se navážou na tkáňové struktury v UT řezu. Tento proces se nazývá kontrastování. Obvykle se řezy, které jsou již přichyceny na síťku, nejprve několik minut kontrastují na kapce roztoku octanu uranylu, po opláchnutí podobně na kapce roztoku citrátu olovnatého. O kontrastování blíže v [13] a [20].
34
Obr. 14: Ultramikrotom (Ultrotome Nova firmy LKB, Švédsko) – celkový pohled 1 – objekt (epoxidový blok s tkání) upevněný v držáku bloku 2 – rameno 3 – nůž s vaničkou 4 – stolek nože 5a, b – ruční ovládání posuvu nože („makro“ posuv) 6 – šroub „mikro“ posuvu nože 7 – plnička s destilovanou vodou pro vaničku nože 8 – okuláry světelného mikroskopu 9 – šroub pro zaostřování obrazu v mikroskopu Řídicí jednotka ultramikrotomu není na obrázku zachycena.
35
Obr. 15: Ultramikrotom (Ultrotome Nova) – detail Ve stolku nože je upevněný skleněný nůž s vaničkou. Objekt, tj. epoxidový blok fixovaný v držáku bloku, má předem upravenou řeznou (čelní) plochu tak, aby se zalitá tkáň nacházela v hrotu pyramidy. 1 – čelo bloku 2 – držák bloku 3 – hlava pro nastavení držáku bloku 4 – rameno 5 – nůž 6 – vanička nože 7 – stolek nože
36
Obr. 16: Nože pro zhotovování řezů: skleněný nůž s vaničkou, diamantový nůž pro polotenké řezy a diamantový nůž pro ultratenké řezy
37
Obr. 17: Parafinový řez a polotenké řezy pro pozorování ve světelném mikroskopu. Síťka s ultratenkými řezy (nad měřítkem). Příklady sítěk pro TEM (ve zvětšení vlevo) Síťka slouží místo podložního skla jako podložka pro UT řezy, umožňuje jejich prohlížení v TEM; buď je, nebo není na svém povrchu opatřena formvarovou blankou či formvarovou blankou s uhlíkem, na blance jsou položeny UT řezy. Epoxidová pryskyřice v řezu zůstane – pro elektronový svazek je prostupná.
38
Obr. 18: Kontrastování ultratenkých řezů na kapkách roztoků octanu uranylu (dole) a citrátu olovnatého (nahoře) Podložka se dvěma kapkami roztoků pro kontrastování, na obou po jedné síťce s UT řezy. Probíhá kontrastování octanem uranylu (žlutým roztokem – dole) a citrátem olovnatým (nahoře).
39
2.2.4 Parafinový a polotenký epoxidový řez pro světelnou mikroskopii (obr. 19a, obr. 19b)
Obr. 19a, obr. 19b: Mikrofotografie řezů pro světelnou mikroskopii. Obr. 19a – malá potní žláza člověka, parafinový řez, barvení HE; 1 – sekreční tubulus 2 – vývod šipky – myoepitelové buňky. Obr. 19b – sekreční tubulus malé potní žlázy, polotenký epoxidový řez, barvení toluidinovou modří; 1 – sekreční buňky 2 – myoepitelové buňky
40
3 OBRAZ V TRANSMISNÍM ELEKTRONOVÉM MIKROSKOPU, POZOROVÁNÍ A SNÍMKOVÁNÍ ULTRATENKÝCH ŘEZŮ, INTERPRETACE OBRAZU (obr. 20, obr. 21) 3.1 OBRAZ V TRANSMISNÍM ELEKTRONOVÉM MIKROSKOPU Interakce urychlených elektronů elektronového svazku s preparátem vedou k řadě jevů, které slouží jako zdroje informací o zkoumaném objektu; patří k nim rozptyl elektronů v preparátu, rentgenové záření, sekundární elektrony aj. (podrobně např. v práci [31]). V transmisním elektronovém mikroskopu je využíván zmíněný rozptyl elektronů, který za vhodných podmínek vede k tzv. rozptylovému kontrastu obrazu dostatečné kvality. (O tzv. fázovém kontrastu viz níže.) Dále je zjednodušeně popsán rozptyl elektronů v preparátu a vznik rozptylového kontrastu obrazu v transmisním elektronovém mikroskopu (o problematice rozptylu elektronů pojednává detailně práce [30]). Část elektronů může projít preparátem bez ovlivnění jeho atomy. Jiné elektrony procházející preparátem jsou interakcemi s atomy preparátu (atomovými jádry i elektrony) v různé míře ovlivněny a odchylují se o určitý úhel ze své původní dráhy – dochází k rozptylu elektronů v preparátu. Zmíněný úhel je tím větší, čím blíže jádru atomu se nachází dráha elektronu. Ty elektrony, které prolétávají preparátem v blízkosti jader, jsou rozptylovány tzv. pružně: pohybují se dál téměř beze ztráty energie a od původního směru se odchýlí o poměrně velký úhel. Materiály s nízkým atomovým číslem rozptylují pružně méně elektronů než materiály s vysokým atomovým číslem [3]. U tzv. nepružného rozptylu, který se soustřeďuje do oblasti menších úhlů rozptylu, dochází při interakci elektronů svazku s atomy preparátu k excitacím, při nichž tyto elektrony ztratí část své energie (detailně v [30]). Za dalšího chodu tubusem mikroskopu jsou více odchýlené elektrony ze silněji rozptylujících částí preparátu zachyceny clonou objektivu (za předpokladu, že jsou rozptýleny do úhlu většího, než je úhel odpovídající zvolenému otvoru clony), nedopadnou tudíž na stínítko mikroskopu, a tím se nezúčastní tvorby obrazu. Příslušné části preparátu jsou pak na stínítku tmavší než okolí – vytvoří se rozptylový kontrast obrazu. Určitý kontrast obrazu vznikne na stínítku i tehdy, není-li použita clona objektivu (je projevem sférické vady objektivu při průchodu rozdílně rozptýlených elektronů objektivem). Bez clony objektivu však elektrony, které by clonou neprošly, vytvářejí na stínítku tzv. difúzní pozadí; kontrast obrazu se tak snižuje [3]. Nepružně rozptýlené elektrony, které se zúčastní tvorby obrazu, zvětší vlivem ztráty energie chromatickou vadu čoček, což ovlivňuje rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu; počet těchto elektronů roste s rostoucí tloušťkou preparátu [3]. K odstraňování nepružně rozptýlených elektronů jsou některé elektronové mikroskopy vybaveny energiovým filtrem ([32], podrobně v [21] a [30]). Vliv absorpce elektronů preparátem na kontrast obrazu je za normálních podmínek zanedbatelný [3]. U biologických preparátů se rozptylový kontrast zvyšuje pomocí sloučenin těžkých kovů (viz odst. 2.2.3).
41 Kontrast obrazu se výrazně zvýší podstatným zmenšením otvoru clony objektivu (problémy však způsobuje její rychlé znečišťování [9]). Ultratenký řez přibližně stálé tlouštky, který poměrně málo rozptyluje elektrony, vykazuje při snižování urychlovacího napětí stálý růst kontrastu obrazu. Jako výhodné se proto ukazuje používat co nejnižší urychlovací napětí a současně clonu objektivu [3]. Superpozice elektronových vln v obrazové rovině vede k interferenčním jevům a způsobuje fázový kontrast, který závisí na rozostření, sférické vadě, úhlové apertuře objektivu a konkrétních podmínkách osvětlení (blíže v [30]). (Úhlová apertura objektivu je v prvním přiblížení dána poměrem poloměru otvoru clony objektivu k jeho ohniskové vzdálenosti.) Fázový kontrast může v různé míře přispívat k celkovému kontrastu obrazu. Fázový kontrast se při malé úhlové apertuře osvětlení projevuje již při mírném rozostření. Za těchto podmínek se u obrazu objektu, který je při správném zaostření bez struktury, objevuje jak při podostření, tak i nadostření zrnitá struktura [3]. (Při podostření je ohnisková vzdálenost objektivu větší než potřebná pro správné zaostření, při nadostření je menší než potřebná pro správné zaostření.) Tento jev (např. u podložních fólií a ultratenkých řezů) by mohl být omylem zaměňován s vlastní strukturou zkoumaného objektu. U objektů s vlastní strukturou, která způsobuje rozptyl elektronů, nelze rozlišit rozptylový kontrast od kontrastu fázového. V této situaci je prospěšné pořizovat fokusační série [3]. Falešné struktury se při nesprávném zaostření mohou objevit mj. u periodických objektů (např. u lamelek myelinu se při určitém rozostření zobrazí dvojnásobný počet lamelek o poloviční rozteči než při správném zaostření). Malá úhlová apertura osvětlení způsobuje např. také zvětšení tloušťky a granulaci membrán v UT řezech; jde o optický jev, který vytváří tuto zdánlivou větší tloušťku a zdánlivou strukturu objektu [3]. Zmíněné jevy je nutno při interpretaci snímků brát v úvahu. Ukázky fokusačních sérií jsou např. v [4] a [30]. Fázového kontrastu lze s výhodou využít při snímkování jemných struktur v ultratenkém řezu, kde nepotřebujeme zvlášť vysoké rozlišení (a kde se neobáváme vzniku falešné struktury na snímku): při mírném podostření se kontrast obrazu zvětší (rozlišení však bude horší než při správném zaostření) [3]. Na ostrých neprůsvitných hranách vznikají při rozostření Fresnelovy ohybové jevy. Za normálních pracovních podmínek (při úhlové apertuře osvětlení kolem 10-3 rad) se při podostření objeví na hraně zobrazeného objektu světlý ohybový jev, při nadostření tmavé maximum blízko jeho hrany [3] (znázorněno na obr. 20). Je-li objektiv (po korekci osového astigmatismu) správně zaostřen, musí ohybový jev zmizet. Snímky s Fresnelovými ohybovými jevy lze nalézt např. v [4], [6], [31] a [32]. Kontrast obrazu je při správném zaostření minimální. Fresnelovy ohybové jevy jsou tedy pomůckou pro zaostření obrazu. Pokud v preparátu nejsou kontrastní detaily, na nichž by bylo možné pozorovat Fresnelovy ohybové jevy, je zaostřování obtížné (to se týká zejména ultratenkých řezů). Proto se doporučuje buď přidávat do preparátu kontrastní částice, nebo používat podložní fólie s otvory, na nichž se zaostřuje [3]. Fresnelovy ohybové jevy jsou také praktickou pomůckou při korekci osového astigmatismu objektivu. Korekce se provádí pomocí obrazu pokud možno kruhového otvoru v blance [3]. Na okraji obrazu tohoto otvoru se při určitých ohniskových vzdálenostech objektivu projevuje osový astigmatismus odchylkami od pravidelnosti světlého i tmavého ohybového jevu (viz
42 znázornění na obr. 20 a snímky např. v [31]). Korekce osového astigmatismu objektivu stigmátorem s užitím Fresnelových ohybových jevů je podrobně řešena v práci [3].
3.2 POZOROVÁNÍ A SNÍMKOVÁNÍ ULTRATENKÝCH ŘEZŮ V transmisním elektronovém mikroskopu pozorujeme preparát nepřímo (ve srovnání se světelným mikroskopem). Oči musí být adaptovány na nízké intenzity světla. Pozorovat a fotografovat je nutno přiměřeně rychle, aby nedošlo k poškození preparátu přehříváním. (O působení elektronů na preparát a o kontaminaci preparátu pojednávají např. publikace [3], [9] a [30].) „Skutečným“ preparátem pro badatele je elektronogram, který může být bez časového omezení podrobně studován.
3.3 INTERPRETACE OBRAZU Předpokladem správné interpretace elektronmikroskopického obrazu v biologii je podrobná znalost obecné ultrastrukturální cytologie a světelně mikroskopické i ultrastrukturální morfologie daného objektu. Nebezpečí chybné interpretace struktur preparátu s ohledem na možnost výskytu artefaktů (vzniklých např. při chemické přípravě biologického objektu) je velké; teprve mnohaletá praxe umožňuje samostatné hodnocení elektronmikroskopických nálezů. Vložena je ukázka elektronogramu (obr. 21) a jeho interpretace. Další dostupné příklady může čtenář nalézt např. v pracích [13], [14], [23] a [29].
43
Obr 20: Znázornění Fresnelova jevu Kresby znázorňují Fresnelův jev na obraze kruhového otvoru v uhlíkové blance. Vlevo je Fresnelův jev při nadostření bez osového astigmatismu čočky, vpravo příklad deformace Fresnelova jevu při nadostření vlivem osového astigmatismu čočky.
44
Obr. 21: Snímek (elektronogram) ultratenkého řezu, pořízený v TEM digitální kamerou. Buněčná kultura myšího feochromocytomu: N – buněčné jádro šipky – nukleární póry r – ribosomy m – mitochondrie g – sekreční granulum s elektrondenzním středem gER – granulární endoplazmatické retikulum IS – mezibuněčný prostor
45
4 LITERATURA
[1] WOLF, J. Mikroskopická technika (optická i elektronová pro biologické účely). 2. vyd. Praha: Státní zdravotnické nakladatelství, 1954 [2] DELONG, A. a DRAHOŠ, V. Praktická elektronová Nakladatelství Československé akademie věd, 1958
mikroskopie.
Praha:
[3] BARTL, P., DELONG, A., DRAHOŠ, V., HRIVŇÁK, I. a ROSENBERG, M. Metody elektronové mikroskopie. Praha: Nakladatelství Československé akademie věd, 1964 [4] HALL, C. E. Introduction McGraw-Hill, 1966
to
Electron
Microscopy.
2nd
ed.
New
York:
[5] HORÁKOVÁ, K. a KALAFUT, F. Okná do mikrosveta. Bratislava: Alfa, 1972 [6] EDINGTON, J. W. The Operation and Calibration of the Electron Microscope. (Philips Technical Library: Monographs in Practical Electron Microscopy in Materials Science, 1.) London and Basingstoke: THE MACMILLAN PRESS, 1974 [7] ŠANTAVÝ, I., HOUŠKA, A. a LIŠKA, M. Fyzika II: Kmity, vlnění, optika, atomistika. 3. vyd. Praha: SNTL – Nakladatelství technické literatury, 1978 [8] TESLA. Instrukční knížka pro transmisní elektronový mikroskop TESLA BS 500. TESLA Brno, [b. r.] [9]
KALINA, T. a POKORNÝ, V. Základy elektronové mikroskopie pro biology. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1979
[10] HORÁK, Z. a KRUPKA, F. Fyzika. 3. vyd. Praha: SNTL – Nakladatelství technické literatury, 1981 [11] HAWKES, P. W., ed. Magnetic Electron Lenses. Berlin: Springer-Verlag, 1982 [12] DELONG, A. a MUSIL, V. Elektronová a iontová technika. Brno: Ediční středisko VUT Brno, 1987 [13] MRÁZ, P. a POLÓNYI, J. Metódy elektrónovej mikroskopie živočíšnych tkanív. Bratislava: Veda, Vydavateľstvo Slovenskej akadémie vied, 1988 [14] ŠUBRTOVÁ, D. Ultrastruktura epidermis laboratorního potkana v normě a po perkutánním podání organofosfátu. In: Supplementum Sborníku vědeckých prací Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové, Hradec Králové: Univerzita Karlova (Praha), Lékařská fakulta (Hradec Králové), 1989, 32(3), 221–312 [15] GLAUERT, A. M. Fixation, Dehydration and Embedding of Biological Specimens. (Glauert, A. M. [series ed.]: Practical Methods in Electron Microscopy, Vol. 3, Part I.) 8th ed. Amsterdam: North-Holland Publishing Company, 1991
46 [16] HORKÝ D. et al. Návody do praktických cvičení z histologie a základy histologické techniky. Brno: Masarykova univerzita, 1993 [17] SLAYTER, E. M. a SLAYTER, H. S. Light and Electron Microscopy. 2nd ed. New York: Cambridge University Press, 1994 [18] ECKERTOVÁ, L. a FRANK, L., ed. Metody analýzy povrchů: Elektronová mikroskopie a difrakce. Praha: Academia, 1996 [19] GARTNER, L. P. a HIATT, J. L. Color Textbook of Histology. 2nd ed. Philadelphia: W. B. Saunders, 2001 [20] NEBESÁŘOVÁ, J. Elektronová mikoskopie pro biology, 2002. Dostupné z: http://www.paru.cas.cz/lem/book/index.html [21] FULTZ, B. a HOWE, J. M. Transmission Electron Microscopy and Diffractometry of Materials. 2nd ed. Berlin: Springer-Verlag 2002 [22] JUNQUEIRA, L. C. U. a CARNEIRO, J. Basic Histology: Text & Atlas. 10th ed. New York: McGraw-Hill, 2003 [23] ŠPAČEK, J. Atlas of Ultrastructural Neurocytology, 2004. Dostupné z: http://synapses.clm.utexas.edu/atlas/contents.stm [24] STEVENS, A. a LOWE, J. S. Elsevier/Mosby, 2005 (reprint 2006)
Human
Histology.
3rd ed.
Philadelphia:
[25] JIRKOVSKÁ, M. Histologická technika. Praha: Galén, 2006 [26] HORKÝ, D. a ČECH, S. Základy histologické techniky pro zdravotní laboranty. Brno: Masarykova univerzita, 2007 [27] KUO, J., ed. Electron Microscopy, Methods and Protocols. (Walker, J. M. [series ed.]: Methods in Molecular Biology 369.) 2nd ed. Totowa (New Jersey): Humana Press, 2007 [28]
DELONG INSTRUMENTS. LVTEM5. 2008. Dostupné z: http://www.dicomps.com/uploads/file/LVEM5_En.pdf
[29]
OVALLE, W. K. a NAHIRNEY, P. C. Netter's Essential Histology. Philadelphia: Saunders/Elsevier, 2008
[30] REIMER, L. a KOHL, H. Transmission Electron Microscopy: Physics of Image Formation. 5th ed. New York: Springer, 2008 [31] WILLIAMS, D. B. a CARTER, C. B. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science (Part 1:Basics). 2nd ed. New York: Springer, 2009 [32] KARLÍK, M. Úvod do transmisní elektronové mikroskopie. Praha: České vysoké učení technické v Praze, 2011
47
Poděkování Jsem zavázán díky prof. MUDr. Josefu Špačkovi, DrSc., který se na mou prosbu ujal poslední počítačové podoby práce autorky a provedl recenzi této práce, text na několika místech doplnil a uskutečnil velkou část redakčních úprav. Jménem zesnulé autorky této práce děkuji paní Zoře Komárkové, MUDr. Damiánu Šimčíkovi (tehdy studentovi lékařské fakulty) a pánům Nathanu a Oliveru Šimčíkovým za technickou spolupráci. Zdeněk Šubrt, autorčin manžel
