Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira – co mají společné? Seminář ku příležitosti 105. výročí narození a 40. výročí úmrtí prof. Otto Jírovce
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP a
Česká parazitologická společnost www.parazitologie.cz
Lékařský dům Koordinátor: RNDr. Libor Mikeš, PhD.
3. dubna 2012
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP a Česká parazitologická společnost pořádají odborný seminář na téma
Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira – co mají společné? Seminář ku příležitosti 105. výročí narození a 40. výročí úmrtí prof. Otto Jírovce dne 3. dubna 2012 ve 13:30 hodin ve velké posluchárně Lékařského domu ČLS JEP, Sokolská 31, Praha 2
Program: Doc. RNDr. Josef Chalupský, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze): Osobnost profesora Jírovce Toxoplasma v dobách Jírovcových RNDr. Petr Kodym, CSc. (SZÚ Praha): Toxoplasma od profesora Jírovce po současnost Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc. (PaÚ AVČR a Katedra parazitologie PřF JU České Budějovice): Od intersticální plasmocytární pneumonie a Pneumocystis carinii k Pneumocystis jirovecii pneumonii RNDr. Eva Nohýnková, PhD. (Klinika infekčních a tropických nemocí 1. LF UK v Praze a FN Na Bulovce): Pneumocystis – možnosti a úskalí diagnostiky
Přestávka s občerstvením (cca 15:00-15:30) MVDr. Zuzana Čermáková, PhD. (Ústav klinické mikrobiologie FN a LF UK v Praze Hradec Králové): Leptospiry, leptospirózy – pokroky v diagnostice Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze): Trichomonas vaginalis: přínos profesora Jírovce a jeho následovníků RNDr. Ivan Čepička, PhD. (Katedra zoologie PřF UK v Praze): Trichomonády v respiračním traktu člověka Předpokládané zakončení semináře v cca 16:45. Koordinátor semináře a editor sborníku: RNDr. Libor Mikeš, PhD. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze a ČPS) © Česká parazitologická společnost Seminář má charakter postgraduálního vzdělávání a je garantován ČLK jako akce kontinuálního vzdělávání. Seminář bude ohodnocen kredity ČLS, KVVOPZ ČR a Společností SML - obor mikrobiologický laborant – účastníci obdrží potvrzení o účasti. 1
2
OSOBNOST PROFESORA JÍROVCE, TOXOPLASMA V DOBÁCH JÍROVCOVÝCH Doc. RNDr. Josef Chalupský, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze) e-mail:
[email protected] Přednáška byla pojata jako bezprostřední, osobní zavzpomínání na profesora Otto Jírovce. Jak to umožnilo dlouholeté pobývání v jeho blízkosti. Nelze z ní tedy zde pořídit nějaký souhrn. Nicméně alespoň něco. Vyzdvižena byla Jírovcova jedinečná zásluha na poválečném vybudování zcela nového, samostatného oboru - parazitologie. De novo, a to nejen po stránce odborné a vědecké, ale též vlastního a promyšleného vybudování podoby pracoviště. Protože parazitologie byla tehdy zaměřena především směrem k humánní medicině, zřízena byla vyšetřovací a diagnostická laboratoř hojně navštěvovaná pacienty a parazitologie si získala záhy zasloužené renomé v lékařské veřejnosti. Vzniklo tak zárodečné líhniště budoucích parazitologů. Což přetrvává. Vždyť na lékařské fakultě se parazitologie dodnes nepřednáší. Připomenuto bylo Jírovcovo zaujetí a zápal pro obor a poznání vůbec. Bylo mu to vrozené. Nikdy jsme jej neviděli lelkovat. Mohl tím být pro nás vzorem. Ale také i v něčem jiném. Byl nefalšovaným ctitelem lidské rovnosti. Za všech okolností vždy světlým bodem, kolem kterého se vše otáčelo. Protože je o něm dnes zejména pro mladší známo málo, uvádíme jeho hlavní životopisná data. Otto Jírovec se narodil 31. ledna 1907 v Praze. Maturoval v roce 1924 na vinohradském gymnáziu. V r. 1929 skončil doktorátem studium na Přírodovědecké fakultě UK prací o trypanosomách bez kinetoplastu. V letech 1925-29 byl již demonstrátorem na zoologickém ústavu PřFUK a 1930-32 tam působil jako nehonorovaný asistent. Rok potom učil na břeclavském gymnáziu, ale v r. 1933 se po smrti doc. Hahna vrátil na uvolněné místo do Prahy. V r. 1938 se stal docentem s habilitační prací o mikrosporidiích a r. 1948 profesorem. V roce 1952 se stal členem korespondentem ČSAV a r. 1955 akademikem. V roce 1953 dostal společně s plzeňským patologem doc. Vaňkem státní cenu za odhalení původce intersticiální pneumonie kojenců Pneumocystis carinii. Zveřejnil 278 vědeckých prací a 250 populárních článků. Dále 11 knih. Asi první je jeho populární spolu s manželkou vydaná „Parasiti člověka“. Nejznámější jsou „Zoologická technika“ (vyšla ve třech vydáních), „Parasitologie pro lékaře“ (dvě vydání česká a jedno německé), „Parasitologie pro zvěrolékaře“ a ve spoluautorství „Protozoologie“ a obrazový atlas „Život pod drobnohledem“ (vydaný též ve čtyřech světových jazycích - úplný soupis jeho prací lze nalézt ve Věstníku Čs. zoologické společnosti 36, 300, 1972). Otto Jírovec zemřel 7. března 1972.
3
Portrét p. prof. Otto Jírovce
Někdy na přelomu čtyřicátých a padesátých let se narodilo na Karlově dítko, které bylo postiženo tím věhlasným hydrocefalem. Ascitickou tekutinu v neurocraniu mělo plnou tachyzoitů Toxoplasma gondii. Podařilo se je přeočkovat na myšky a vznikl tak domácí kmen, který byl na nich po desítky let na parazitologii udržován. Umožnilo to podle Frenkelova vzoru (1948) vyrábět u nás z vlastních zdrojů testovací látku „Toxoplasmin“. Tzv. intradermálním testem (IDT) tu byli vyšetřováni pacienti, přicházející s podezřením, že by příčinou jejich potíží mohla být toxoplamosa . Ale nejen v Praze. Zásluhou Jírovcovou a Jindřicha Jíry vzniklo opět vyhlášené pracoviště, které později dovolilo přejít na diagnostiku imunofluorescenční. Výsledky IDT v jeden čas naznačovaly možnou souvislost mezi toxoplasmosou a mongoloidismem.
4
TOXOPLASMA OD PROFESORA JÍROVCE PO SOUČASNOST RNDr. Petr Kodym, CSc. (Národní referenční laboratoř pro toxoplasmózu, CEM, Státní zdravotní ústav, Praha) email:
[email protected] Profesor Otto Jírovec (1907-1972), český světově významný průkopník parazitologie, se toxoplasmózou zabýval od roku 1954. S četnými spolupracovníky vydal o této infekci na 50 publikací. V Jírovcově čase byla Toxoplasma gondii tajuplným parazitem. Velice dobře bylo známo stadium tachyzoitů, které se dařilo kultivovat na myších, jakož i tkáňové cysty s bradyzoity. Nebylo pochyb o tom, že Toxoplasma gondii může být nebezpečným lidským patogenem. První známý případ kongenitální a současně i oční toxoplasmózy popsal Janků (1923), od 50. let se vědělo, že toxoplasma způsobuje lymfadenopatie. Byla zaznamenána široká plejáda hostitelů, stále však nebyl znám kompletní životní cyklus a nebylo jasné, jak se infikují lidé. Bylo zjevné, že tkáňové cysty objevené například ve vepřovém mase nejsou všechno. Jírovec (1960) píše: „Jakou cestou se tento velký počet lidí infikuje toxoplasmami, není dosud exaktně známo; připouští se většinou perorální, intranasální, vzácněji intrakonjunktivální a perkutánní infekce“. Vše se vyjasnilo až na sklonku života profesora Jírovce: roli kočky jakožto definitivního hostitele odhalil Hutchinson (1965) a teprve Dubey, Miller a Frenkel (1970) popsali stadium oocysty. Navzdory těmto poměrně vážným mezerám ve znalostech o biologii Toxoplasma gondii fungovala poměrně dobře diagnostika a terapie humánní toxoplasmózy. Například v plodové vodě bylo možné prokázat toxoplasmy isolačním pokusem na laboratorním zvířeti. Základem laboratorní diagnostiky však byly titrační sérologické metody – především Sabinův-Feldmanův „dye test“ (SFT), který, ačkoliv jej provádí už jen pár vybraných laboratoří, dodnes platí za zlatý standard stanovení antitoxoplasmických protilátek a z titru SFT se odvozují mezinárodní jednotky IgG. Vyjádřením titrů SFT, NIFR a KFR se dá obsah protilátek v séru kvantifikovat mnohem lépe než v moderních jednobodových testech, což umožňuje sledovat dynamiku protilátek a i poměrně dobře určovat fázi infekce bez znalosti obsahu antitoxoplasmických IgM či IgA nebo bez stanovení avidity IgG. Sérologické testy jsou základem diagnostiky toxoplasmózy i v současnosti. Nejoblíbenější metoda profesora Jírovce – intradermální test – se vzhledem k obtížné kvantifikovatelnosti hodí k diagnostice akutní toxoplasmózy méně; jelikož je však založen na buněčné imunitě, má vynikající předpoklady stát se ideální metodou pro vyšetřování populace v rámci epidemiologických studií. Vzhledem k tomu, že Ústav sér a očkovacích látek byl z důvodu údajné potenciální rizikovosti nucen zastavit výrobu antigenu toxoplasminu - na přelomu 80. a 90. let minulého století, intradermální test pro své studie již 5
nikdo nepoužije. Porovnání diagnostických testů v časech profesora Jírovce a v současnosti přináší tabulka 1. Tab. 1: Základní testy používané k diagnostice toxoplasmózy v minulosti a současnosti Používán od 1966
V časech prof. Jírovce
V 21. století
Používána
Používána v NRL
PCR – stanovení DNA Toxoplasma gondii Kožní (intradermální) test (IDT)
1990
nebyla
1948
Hlavní test specifické buněčné imunity
Metoda přímého průkazu T. gondii v plodové vodě Není povolen
Sabinův-Feldmanův „dye test“ (SFT) Komplementfixační reakce (KFR)
1948
Základní sérologický test Základní sérologický test
„Zlatý standard“, v ČR se momentálně neprovádí Základní sérologický test
Nepřímá imunofluorescenční reakce (NIFR)
1961
Používána
Používána
ELISA IgG
cca. 1980
Nebyla
Základní sérologický test
ELISA IgM
cca. 1988
Nebyla
Základní sérologický test
1991
Nebyl
Významný u těhotných žen
Diagnostický test Isolace toxoplasem na laboratorní myši
Test avidity IgG
1942
V oblasti terapie toxoplasmózy nenastala od časů profesora Jírovce žádná významná změna. Dosud nebyl do klinické praxe zaveden žádný lék, který by byl proti tachyzoitům účinnější než kombinace pyrimethaminu a sulphadiazinu, preparát účinný proti bradyzoitům se dosud marně hledá. Vedle problémů diagnostiky považoval profesor Jírovec za důležitou otázku „jaké jsou účinky chronické respektive klinicky bezpříznakové toxoplasmové infekce na zdravotní stav člověka?“ Zaujala jej především i dnes aktuální problematika možné souvislosti toxoplasmózy se vznikem psychiatrických nemocí, která se koneckonců vzhledem k lokalizaci cyst Toxoplasma gondii v mozku sama nabízí. Jeho studie provedená na celkem 1 683 pacientech psychiatrických léčeben v Dobřanech, Pezinku, Havlíčkově Brodě a Praze-Bohnicích má dodnes zásadní výpovědní hodnotu, v současnosti se ztěží může někomu podařit takto rozsáhlý soubor vyšetřit. Do studie byly zařazeny osoby se schizofrenními (954) a maniodepresivními (48) 6
psychózami, involučně depresivními stavy (103), různými psychózami a narkomaniemi (53), oligofrenií (235), psychopatiemi (93), epilepsií (152) a lues CNS (56). Prevalence toxoplasmózy, s výjimkou maniodepresivních psychóz (pouhých 27%) a involučně depresivních stavů (53%) kolísala mezi 42,7 % (epilepsie) a 47,1 % (psychózy a narkomanie). Autoři odstranili vliv možného bias jako je věk či délka pobytu v léčebně. Závěr je jednoznačný: „Jsme proto toho názoru, že toxoplasmóza při etiologii různých psychických onemocnění nehraje prakticky žádnou roli. U jednotlivých onemocnění jsme našli přibližně stejná nebo velmi podobná čísla pozitivity jako Kozar, ta však odpovídají normě promořenosti našeho obyvatelstva“ (Jírovec, 1971 A). Zajímavá otázka zní: bylo v časech profesora Jírovce u nás více toxoplasmózy? Studie provedená IDT v průběhu 8 let na úctyhodných 15 972 občanech Československa vykázala prevalenci 37,7% (Jírovec, 1971 B). To je více, než nám vyšlo z posledních sérologických přehledů (90. léta 20. století), ale méně, než se v soudobých pramenech uvádělo pro Vídeň nebo Francii. Autor však uvádí, že čísla mohou být zvýšena výběrem testovaných osob, z nichž většina pochází z venkovských oblastí. Prevalence výrazně stoupá s věkem: zatímco v kategorii do 5 let je jen 4,6%, do 10 let 14,4% a do 15 let 20,7%, je ve věku 16-20 let 30,5%, 21-30 let 36,5% a 31-40 let 51,2 % positivních. S ještě vyšším věkem již prevalence příliš nenarůstá: 4150 let 54,5%, 51-60 let 56 % a přes 60 let 51,6%. Na odlišnostech v prevalenci může mít vliv i odlišná citlivost diagnostických testů - tehdejšího IDT a dnešního KFR. Jedině nové vyšetření větších souborů běžné populace by mohlo ukázat, zda toxoplasmózy skutečně ubývá; to je však v současnosti velice těžko proveditelné. A co se změnilo od dob prof. Jírovce v parazitologii jakožto oboru? Vedle metod výzkumu i mnoho dalších věcí, snad ještě zásadnějších. Například špičkového vědce formátu profesora Jírovce zajímala v první řadě diagnostika (mnoho jeho prací je věnováno metodice IDT a dalších testů), klinika a terapie sledované infekce, byl v neustálém kontaktu s praxí. Dnes je to bohužel jinak. „Vědečtí“ a „praktičtí“ parazitologové se od sebe neustále vzdalují a čím dál tím méně nacházejí společnou řeč. Dnešního čtenáře Jírovcových prací asi překvapí, že jsou většinou v němčině. Obzvláště v německé a rakouské literatuře jsou také hojně citovány. A jakožto pracovník Státního zdravotního ústavu (SZÚ) si na závěr neodpustím drobnou poznámku: je známo, že v době Protektorátu, kdy byly zavřeny české vysoké školy, se profesor Otto Jírovec uchýlil do SZÚ, kde pracoval až do osvobození Prahy. Jeho pozdějším pokračovatelem v SZÚ byl parazitolog Dr. O. Havlík a přes něj již vede přímá linie ke vzniku Národní referenční laboratoře pro toxoplasmózu.
7
LITERATURA Dubey, J.P.: Miller, N.L: Frenkel, J.K.(1970): Characterization of the new fecal form of Toxoplasma gondii. J. Parasitol. 56:447 Hutchinson, W.M (1965): Experimental transmission of Toxoplasma gondii. Nature 206 :961 Janků J. (1923) Pathogenesa a pathologická anatomie tak nazvaného vrozeného kolobomu žluté skvrny v oku normálně velkém a mikrophthalmickém s nálezem parasitů v sítnici. Časopis lékařův českých 62 (39):1021-1027; 62 (40):1054-1059; 62 (41):1081-1085; 62 (42):1111-1115; 62 (43) 1138-1144. Jírovec, O (1960): Parasitologie für Ärzte. VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 684 pp. Jírovec, O (1971 A): Toxoplasminteste bei Patienten in vier psychiatrischen Heilanstalten. In: Kirchoff, H., Langer, H.: Toxoplasmose. Praktische Fragen und Ergebnisse. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, : 14-16 Jírovec, O (1971 B): Resultate des Toxoplasmintestes bei sog. Normaler Bevölkerung der Tschechoslowakei. In: Kirchoff, H., Langer, H.: Toxoplasmose. Praktische Fragen und Ergebnisse. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, : 10-11
OD INTERSTICÁLNÍ PLASMOCYTÁRNÍ PNEUMONIE A PNEUMOCYSTIS CARINII K PNEUMOCYSTIS JIROVECII PNEUMONII Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc. (Parazitologický ústav, Biologické centrum AVČR, České Budějovice a Katedra parazitologie Přírodovědecké fakulty Jihočeské Univerzity, České Budějovice) e-mail:
[email protected]
Souhrn Pneumocystis spp. (PNC) (s velkou řadou hostitelsky specifických druhů) je kvasinka (Fungi: Ascomycota), kolonizující povrch pneumocytů typu I, které vystýlají plicní alveoly savců. Výskyt těchto kvasinek v plicích savců je zcela běžný a mimo dosud 5 řádně taxonomicky popsaných druhů jich zřejmě existují v jednotlivých savčích hostitelích stovky či tisíce. Lidské infekce jsou působeny druhem Pneumocystis jirovecii Frenkel, 1976 (PJ), jehož je člověk jediným hostitelem. Druhové jméno parazita připomíná zásadní úlohu profesora Otto Jírovce ((1907-1972) a jeho spolupracovníků v rozpoznání, že pneumocystis je častým a závažným parazitem člověka (1951/1952) vyvolávající specifický typ pneumonie (intersticiální plasmocytární pneumonie), dnes známý jako “pneumocystis jirovecii peumonie” nebo 8
pneumocystová pneumonie – PNP. Záludnost infekce tímto patogenem spočívá v tom, že pneumocysty žijící v alveolu se chovají jako neškodní komenzálové, pokud jsou kontrolovány imunitním systéme hostitele, ale v případě selhání hostitelské imunity dojde k masivnímu namnožení organizmu v plicních alveolech hostitele, jejich zaplnění s až fatálními následky. Závislost výskytu Pneumocystis jirovecii pneumonie na imunodeficitu hostitele definuje PNP jako “immunodeficiency-dependent disease” – IDD.
Historie objevu Organizmus byl objeven náhodou v r. 1909 brazilským parazitologem Carlos Chagasem v plicích morčat uměle nakažených Trypanosoma cruzi, původcem jihoamerické Chagasovy choroby. Carlos Chagas nalezl v plicích morčat drobná kulovitá cystická stadia (5 µm) s osmi jádry, která mylně zařadil do vývojového cyklu trypanosomy. Tato stadia, o nichž dnes víme, že to jsou askospory Pneumocystis, pak sehrála klíčovou roli při další identifikaci organizmu. Chagasovo přesvědčení, že tato cystická stadia patří k americké trypanosomatóze posílilo to, že je v r. 1911 nalezl v plicích člověka zemřelého na Chagasovu chorobu. Později bylo to, co Chagas popsal, nalezeno v plicích krys, ale bez nákazy T. cruzi (Carini 1910). A další nález téhož v plicích divokých potkanů v Paříži vedl konečně k uznání samostatnosti organizmu a jeho popisu jako Pneumocystis carini Delanoe et Delanoe, 1912. V roce 1942 byl organizmus nalezen v patologickém materiálu plic několika lidí a zvířat v Holandsku (van der Meer a Brugg). Holandští patologové nalezený organizmus správně určili jako Pneumocystis, nerozeznali ale jeho patologický potenciál a bohužel, díky probíhající světové válce, jejich nález nevzbudil patřičnou odezvu. Je to teprve publikace přednosty Šiklova Ústavu patologie Lékařské fakulty UK v Plzni, prof. Josefa Vaňka z roku 1951, oznamující nález Pneumocystis v alveolárním exudátu zemřelých dětí, která zahajuje dodnes trvající periodu celosvětového zájmu o tohoto kolonizátora savčích plic a příležitostného patogena. Otto Jírovec, profesor parazitologie Přírodovědecké fakulty UK v Praze, vstupuje do historie pneumocystis tím, že identifikuje organizmus na patologickém materiálu prof. Vaňka jako Pneumocystis carinii a v další spolupráci s ním a s pediatrem Lukešem tito autoři identifikují v r. 1952 Pneumocystis jako původce epidemicky se vyskytujícího onemocnění kojenců (“nedonošenců a oslabených dětí”) známého klinikům a patologům jako intersticiální plasmocytární pneumonie. Toto onemocnění se vyskytovalo v Evropě ve stovkách až tisícovkách případů přibližně mezi léty 1920 a 1960, vrcholilo v létech 1955-59. Dnes přetrvává v izolovaných případech a drobných nosokomálních epidemiích, nikoliv však jen u kojenců, ale v populaci obecně. Jeho původce a patologické agens nebyl až do objevu Vaňka a Jírovce identifikován.
9
Onemocnění má relativně vyhraněný klinický projev (horečka, suchý kašel, rychlý nástup dyspnoe a hypoxie) a charakeristický patologický nález (infiltrace plicních alveol “pěnovitou hmotou” = masa pneumocyst, mezi kterými se vyskytují cystovitá eliptická či kulatá stadia s 8mi jádry). Je další zásluhou Vaňka a Jírovce, že identifikovali přítomnost Pneumocystis ve fotografiích doprovázejících původní popis intersticiální plasmocytární pneumonie jako patologické jednotky (Ammich 1938, Benecke 1938) a tak definitivně potvrdili, že se jedná o pneumocystózu. Impakt publikací Vaňka, Jírovce a Lukeše identifikující Pneumocystis jako etiologické agens kojenecké plasmocytární pneumonie byl obrovský: jen v prvé dekádě následující objev Pneumocystis jako lidského patogena bylo publikováno ve střední Evropě 111 prací věnovaných Pneumocystis. Zvýšil se zájem lékařské veřejnosti o toto onemocnění (během 4 let se na území Československa bylo zaznamenáno kolem 2000 případů kojenecké intersticiální pneumonie). V databázi prof. Jírovce představují publikace věnované Pneumocystis celou pětinu, v současnosti vychází ročně kolem 500-700 prací věnovaných nejrůznějším aspektům PNC a PNP (databáze SCOPUS). Pneumocystis je dnes nejběžnějším oportunistickým patogenem lidí s imunodeficitem (HIV, hematologické malignity, stav po orgánových transplantacích, nádorová onemocnění, immunosupresivní terapie, terapie antimetabolity a j.) a je organizmem citlivě signalizující stav imunitní nedostatečnosti. Co ve stručnosti víme o PNC dnes, po 60ti letech co se ukázalo, že to je to potencíálně závažný patogen, nejen lidí ale savců obecně? Systematická příslušnost Původně byla Pneumocystis považována za protozoon a byla řazena do blízkosti kokcidií (Aragao 1913, Chagas 1913). O příslušnosti k prvokům nepochyboval ani Otto Jírovec a tento názor se naposled objevuje v jeho Lékařské parazitologii vydané v r. 1977. Ovšem, ihned po identifikaci Pneumocystis jako lidského patogena, řada mykologů (Csillag, Giese) vyslovila názor, že PNC je příslušník říše hub, Fungi. Zprvu, byl tento názor podporován málo závažnými argumenty (barvicí vlastnosti PNC v histologickém materiálu, skutečnost, že v plicích se běžně vyskytují vdechnuté kvasinky). Později byl názor, že PNC je houbový organizmus podpořen zjištěním, že cystická stadia PNC jsou ultrastrukturálně identická s asky (vřecky) kvasinek (Vávra a Kučera 1970). Molekulární biologie přinesla definitivní rozsudek. Fylogeneze rRNA genů, sekvenční analýza mitochondriálních genů, disjunkce genů thymidylát syntázy a dihydrofolát reduktázy, přítomnost houbám specifického elongačního faktoru EF-3 a j. (Edman a spol. 1989, Stringer et al. 1989 a řada dalších autorů) jasně potvrzuje, že PNC je kvasinka. Její dnešní taxonomické zařazení je následující: rod Pneumocystis, čeleď Pneumocystidaceae, řád Pneumocystidales, třída Pneumocystidomycetes, podkmen Taphrinomycotina (to jsou primitivní ascomycety, pravděpodobně jejich bazální skupina), kmen Ascomycota, říše Fungi. 10
Pneumocystis tak patří mezi vřeckovýtrusné houby a její nejbližší příbuzná je běžná, volně žijící kvasinka Schizosaccharomyces pombe. Přesto, jak je uvedeno dále, PNC nemá stadia mimo savčí organizmus. Baterie molekulárně biologických a biochemických důkazů, že PNC je kvasinka vybavená životním cyklem zahrnujícím meiosu a tvorbu askospor, je dnes nezpochybnitelná. Na druhé straně, detailní výzkum tohoto organizmu přináší důkazy i o některých specifických vlastnostech PNC, zřejmě reflektujících parazitární způsob života. Tou nejdůležitější je přítomnost cholesterolu jako lipidické složky buněčných membrán na rozdíl od ergosterolu, typické buněčné komponentě hub. Tato vlastnost zakládá rezistenci PNC na antimykotika inhibující biosyntézu ergosterolu. Vegetativní buňky pnumocyst v elektronovém mikroskopu se příliš nepodobají kvasinkám, mají nepravidelný tvar, tenkou stěnu, která vybíhá v množství výběžků splétajících se navzájem a s výběžky membrán pneumocytů. Tato schopnost tvořit kompaktní kolonie, dovoluje pneumocystám zaplnit vzdušný prostor alveolu. Jedna či více PNC, kolik druhů? Mimo krysy (potkany) a člověka je PNC nalézána běžně v plicích prakticky všech savců včetně některých jejich primitivních forem (např. klokani). Až do r. 1976 byly všechny nálezy označovány jako Pneumocystis carinii z prostého důvodu, že morfologický obraz organizmu ve světelném a elektronovém mikroskopu neposkytuje možnost spolehlivě rozlišit PNC z jednotlivých hostitelů. V roce 1976 americký patolog J.K. Frenkel snesl řadu argumentů pro odlišnost krysí a lidské PNC (antigenní odlišnost, klinický průběh onemocnění, morfologické odlišnosti) a lidskou formu PNC označil jako Pneumocystis jiroveci a to v uznání zásluh Otto Jírovce. Popis z roku 1976 byl proveden podle Mezinárodních pravidel zoologické nomenklatury (ICZN) (jiroveci s jedním i), popis byl v r. 1999 inovován dle pravidel botanické nomenklatury (ICBN). Dle tohoto kódu je správný název organizmu Pneumocystis jirovecii Frenkel, 1976 (jiroveci, dvě ii). V literatuře se ovšem stále ještě objevuje i P. jiroveci, což je chybné. Sekvenční analýza řady genů dovoluje srovnání PNC z různých hostitelů. Ukazuje se, že PNC z jednotlivých hostitelů jsou hostitelsky přísně specifické druhy s řadou vnitřních genotypů. To znamená, že potenciálně existují stovky druhů PNC, protože jeden hostitel může být nositelem i několika, pro hostitelský druh specifických pneumocyst. Plicní alveoly jednoho druhu hostitele mohou být tedy kolonizovány několika molekulárně biologicky dobře podpořenými druhy PNC a to dokonce současně. Při této kohabitaci však nedochází k výměně genetického materiálu. V souladu s pravidly taxonomie bylo zatím popsáno 5 druhů PNC: P. carinii a P. wakefialdiae v potkanech, P. jirovecii v člověku, P. murina v laboratorních hlodavcích, P. oryctolagi v králících. Řada dalších PNC figuruje v literatuře jako druhy bez řádného popisu (např. P. soricina z rejsků, P. equina z koňů, nebo jsou zmiňovány v literatuře jako tzv. speciální formy, např. P. carinii f. sp. mustelae z fretky, P.carinii f.sp. suis z prasete. 11
Jsou to rozhodně dobré druhy, jen čekající na řádný popis. PNC je evidentně soubor fylogeneticky starých organizmů, které se vyvíjely společně se svými hostiteli a jsou k ním extrémně úzce adaptovány. To je také zřejmě důvodem, proč se zatím nepodařila dlouhodobá kultivace PNC v umělém mediu a proč imunosuprimovaný potkan či mladý králík těsně po odstavu (který spontánně prodělává krátkou episodu pneumocystózy) jsou vlastně jedinými laboratorními modely pneumocystózy. Specifický savčí oportunista – existují volně žijící stadia? Molekulárně biologické metody umožňují nalézat PNC volně v přírodě, kde její DNA je nalézána na vzduchových filtrech nebo ve vodě. To a systematická příslušnost PNC k volně žijícím kvasinkám zavdalo podnět ke spekulacím, že PNC má někde v přírodě další část životního cyklu. Recentní analýzy proteomu však ukazují, že PNC má nápadně chudou výbavu enzymů pro syntézu aminokyselin (pouze 2! ve srovnání s minimálně 54 enzymy volně žijící S. pombe) a že tedy musí získávat aminokyseliny z prostředí plicního alveolu. S největší pravděpodobností tedy PNC může existovat pouze jako intraalveolární oportunista (Hauser a spol. 2010). PNC je rovněž závislá na získávání hostitelského cholesterolu a velkých množství Sadenosyl methioninu (AdoMet).
Životní cyklus Zahrnuje binární dělení, sexuální cyklus zahrnující kopulaci dvou haploidních buněk (PNC exprimují sexuální feromon) s následující meiózou (navozující opět haploidní stav) během tvorby spory (asku) s 8mi haploidními askosporami uvnitř. Askospory jsou pak vykašlávány a zprostředkují vzdušnou cestou infekci nového hostitele. V plicích se PNC zřejmě šíří z alveolu do alveolu prostřednictvím tvorby biofilmu z agregovaných buněk a vyloučené extracelulární matrix. Stěna asků, kterými životní cyklus kulminuje, obsahuje beta-1,3-D-glukan jako základní strukturální polysacharid. Ten hraje důležitou úlohu v zánětlivé reakci organizmu vyvolané PNC a hladina sérových protilátek proti tomuto glukanu se dá využít jako perspektivní diagnostická metoda reflektující množství PNC v plicích. Ačkoliv přítomnost sérových protilátek v populaci je vysoká (sérologická pozitivita dětí vůči P. jirovecii dosahuje ve věku 2-3 roky 70-90%), vše nasvědčuje tomu, že PNC je v plicích imunokompetentních hostitelů (včetně člověka) přítomna jen přechodně, v podobě občasných, krátkodobých infekcí. Trvalejší kolonizace je pak vždy známkou hostitelského imunodeficitu.
Extrapulmonární pneumocystóza Ačkoliv je PNC v podstatě parazit lokalizovaný v dutině plicního alveolu, ojediněle jsou nalézána drobná a izolovaná ložiska PNC v mimoplicní lokalizaci. Histologická zjištění pak 12
podporuje molekulárně biologická detekce PNC ve tkáních imunosuprimovaných potkanů: v případě silných nákaz v plicích může PNC diseminovat do různých dalších orgánů (játra, ledviny, slezina, mezenteriální mízní uzliny) (Golab 2009). Z klinického hlediska jsou ale tyto lokalizace pravděpodobně bezvýznamné. Antigenní variabilita K významným zjištěním patří to, že PNC je schopna měnit povrchové antigeny svých buněk. Buňky PNC jsou pokryty glykoproteinem A (=MSG – „major surface glycoprotein“), který hraje roli v přichycení PNC k buňkám hostitele. U krysí P. carinii zahrnuje genová rodina MSG asi kolem 70-80 genů exprimovaných jednotlivě z expresního místa blízko chromozomových telomer. Tyto geny kódují izoformy povrchového proteinu MSG (exprimována je vždy jen jedna izofoma MSG); tím se zvyšuje fenotypová variabilita, což pravděpodobně pomáhá úniku před imunitní reakcí hostitele. Podobné geny jsou i u dalších druhů PNC, včetně P. jirovecii. Tento systém antigenního převleku se podobá tomu, co používají africké trypanosomy pro dlouhodobé přežívání v hostiteli - s tím rozdílem, že repertoár genových variant je u PNC nepoměrně nižší ( u P. carini asi 73 variantních genů oproti až tisícům u T. brucei). Díky genetické rekombinaci však množství povrchových antigenních variant PNC podstatně vzrůstá. Antigenní variabilita umožnující částečný únik před reakcí imunitního systému hostitele může mít zásadní význam pro krátkodobé přežívání organizmu v hostiteli, dokončení životního cyklu a vytvoření stadií pro přenos na nového hostitele. Závěr Co je tedy PNC? Je to komenzál savčích plic, oportunista využívající poklesu hostitelských obranných reakcí (specificky poklesu CD4+ lymfocytů pod 200/mm3), je to patogen? PNC má za různých okolností daných specifickými podmínkami v hostiteli všechny tyto vlastnosti. Americký patolog Frenkel, který popsal P. jirovecii, navrhl, aby tímto organizmem působená pneumonie, v literatuře dnes bežně označovaná jako P. jirovecii pneumonie, byla specificky označena jako tzv. IDD choroba („immunodeficiency dependent disease“). Tedy choroba postihující jedince s buď nedozrálým imunitním systémem, nebo se sekundárním imunodeficitem. To nejlépe vystihuje podstatu PNP . Vrátíme-li se pod tímto aspektem k epidemii dětské pneumocystózy, která probíhala v Evropě od r. 1920 do přibližně 1960, a jejíž zkoumání Otto Jírovcem a jeho spolupracovníky otevřelo cestu k tomu, co známe o PNC dnes, naskýtá se otázka: co bylo podstatou imunodeficitu či nevyzrálosti imunitního systému tisíců onemocnělých dětí v oné době? Není úplně jisté, že to byl důsledek podvýživy během války, PNC probíhala i v zemích kde tomu jistě tak nebylo (Švýcarsko). Byly to speciální podmínky v pediatrických zařízeních té doby a způsoby zacházení s kojenci (proteinová 13
podvýživa, nahromadění jedinců vnímavých k nákaze, špatné hygienické podmínky mohou vést k endemii dětské pneumocystózy – Shiraz, Iran- in Frenkel 1999)? Jako zajímavost uveďme, že američtí pediatři se domnívají, že v Evropě tehdy proběhla epidemie neznámého retrovirového onemocnění, která predisponovala děti pro rozvoj PNP. Epidemiologická data tomu nasvědčují, chybí jedině důkaz, že takový virus skutečně existoval (Goldman A.S. et al. 2005. What Caused the Epidemics of Pneumocystis Pneumonia in European Premature Infants in the Mid-20th Century? Pediatrics 115, 725-736). Doplňkové informace Pneumocystis Genome Project at http://pgp.cchmc.org/ Cushion, M.T., Stringer, J.R. Stealth and Opportunism: Alternative lifestyles of species in the fungal genus Pneumocystis. (2010) Annual Review of Microbiology, 64, pp. 431-452. Cushion, M.T., Collins, M.S, Linke, M.J. Biofilm formation by Pneumocystis spp. (2009) Eukaryotic Cell, 8 (2), pp. 197-206. Finkelman, M.A. Pneumocystis jirovecii infection: Cell wall (1→3)-β-D-glucan biology and diagnostic utility. (2010) Critical Reviews in Microbiology, 36 (4), pp. 271-281. Frenkel J.J. Pneumocystis pneumonia, an Immunodeficiency-Dependent Disease (IDD): A Critical Historical Overview. (1999). J.Eukaryot. Microbiol. 46(5), 89S-92S Vaněk, J. (1951). Atypická intersticiální pneumonie dětí, vyvolaná Pneumocystis carinii. Čas. Lék. Čes. 90, 1121-1124. Vaněk, J., Jírovec, O. (1952). Parasitaere Pneumonie, „Interstitielle“ Plasmazellenpneumonie der Fruehgeborenen verursacht durch Pneumocystis carinii. Zbl. Bakt. Abt. I. Orig. 158, 120127. Vaněk, J., Jírovec, O., Lukeš, J. (1953). Interstitial Plasma Cell Pneumonia in Infants. Annales Pediatrici 188, 120-127. van der Meer MG, Brug SL. 1942. Infection a Pneumocystis chez l’homme et chez les animaux. Ann. Soc. Belge Med. Trop. 22:301–9
14
PNEUMOCYSTIS – MOŽNOSTI A ÚSKALÍ DIAGNOSTIKY RNDr. Eva Nohýnková, PhD., Mgr. Ivana Zicklerová (Oddělení tropické medicíny Nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK v Praze) e-mail:
[email protected] Odhalení Pneumocystis jirovecii (původně carinii) jako původce atypické plazmocytární intersticiální pneumonie kojenců, která mezi roky 1920 – 1960 byla v Evropě zodpovědná za 2030% úmrtnost dětí v kojeneckém věku, patří mezi nejvýznamnější objevy prof. Otto Jírovce. V současné době tvoří kojenci pouze velmi malý segment pacientů s pneumocystovou pneumonií. Klinicky manifestní nákaza P. jirovecii však zůstává celosvětově závažným onemocněním imunokompromitovaných osob. Klasifikace pneumocystové pneumonie Pneumocystová pneumonie (Pjp) je oportunní nákaza epidemiologicky řazená do specifické skupiny pneumonií u imunokompromitovaných osob (pneumonia in immunocompromised hosts - PIIH). Obecně je pneumonie akutní zánětlivé onemocnění, které postihuje respirační bronchioly, alveoly a plicní intersticium (viz slovníček). Podle rozložení zánětlivé reakce v plicní tkáni patří Pjp mezi intersticiální pneumonie: zánětlivý exudát se nachází v plicním intersticiu. Hustý, nehnisavý zánětlivý infiltrát lokalizovaný v interalveolárních septech je tvořen lymfocyty a plasmocyty: odtud zařazení mezi lymfoplasmocytární pneumonie. Pro Pjp je charakteristické zaplnění alveolů surfaktantem navázaným na pneumocysty adherující k výstelce alveolů. Tím je snížena kapacita alveolu pro výměnu plynů. Historie pneumocystové pneumonie a skladba pacientů Epidemie atypické intersticiální pneumonie kojenců, později popsané díky průkazu původce jako pneumocystová (Vaněk a Jírovec, 1952), začala plíživě sporadickými případy v Německu v letech 1920-1940, postupně postihla několik tisíc dětí v řadě evropských zemí včetně Československa a kulminovala mezi roky 1955-1959. Rizikovým faktorem byla nízká porodní váha. Na začátku 60. let došlo k náhlému a rychlému ústupu počtu případů u dětí a v následujících letech byla Pjp považovaná za velmi vzácnou infekci, která souvisí s imunitní nedostatečností: ojedinělé případy se vyskytovaly sporadicky většinou u dospělých pacientů s nádorovým onemocněním krve. Na počátku 80. let - v souvislosti s nástupem pandemie nákazy virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) - se situace zásadně mění. Dochází ke strmému nárůstu počtu případů Pjp, která se stává hlavní infekční komplikací osob nakažených virem HIV. V té době a v letech následujících je pneumocystová pneumonie v popředí příčin úmrtí pacientů s AIDS. Ke změně 15
dochází koncem 80. let, kdy se jako součást péče o HIV+ pacienty zavádí v rozvinutých zemích profylaktické podávání léků proti nákaze P. jirovecii. To vede o 10 let později k prvnímu výraznějšímu snížení počtu případů Pjp v této skupině nemocných. Další snížení nastává ke konci 90. let po zavedení vysoce účinné antiretrovirové léčby (highly active anti-retroviral treatment - HAART), která brání poklesu pomocných CD4+ T lymfocytů pod kritickou hladinu, při níž se manifestují oportunní infekce (200 buněk/µl krve). Avšak i přes významnou redukci počtu případů během poslední dekády zůstává pneumocystová pneumonie závažnou oportunní infekcí HIV+ osob. Na její aktuálnosti se ale stále častěji podílejí pacienti, kteří nejsou nakaženi virem HIV, ale kterým jsou dlouhodobě podávány léky tlumící imunitu (imunosupresiva) buď jako součást léčby základního onemocnění nebo jako součást předtransplantační přípravy a posttransplantační péče (Reid et al. 2011; Striuk et al. 2011). Spektrum imunosupresivních léků a jejich aplikace neustále roste. K pacientům se zvýšeným rizikem pneumocystové pneumonie jsou tak v současnosti řazeni příjemci solidních orgánů, zejména ledvin a srdce, příjemci kostní dřeně, pacienti s nádorovými onemocněními krve, především lymfoproliferativními, a s některými typy solidních tumorů. Do této rizikové skupiny patří rovněž pacienti se systémovými autoimunitními onemocněními. Důkazem je skladba nemocných s Pjp potvrzenou průkazem P. jirovecii v naší laboratoři (Tab. 1). Ze 147 pacientů téměř 84% byli imunokompromitovaní nemocní s neinfekčním základním onemocněním. Zatímco u HIV+ osob koreluje riziko rozvoje Pjp s poklesem počtu CD4+ T lymfocytů, u jiných typů imunodeficitu jakýkoliv laboratorní korelát chybí. Tab. 1. Pacienti s pneumocystovou pneumonií podle skupinových diagnóz základní nemoci a) Název skupiny Infekční a parazitární nemoci Novotvary Nemoci krve a imunity Nemoci endokrinní a metabolické Nemoci oběhové soustavy Nemoci dýchací soustavy Nemoci trávicí soustavy Nemoci svalové a kosterní soustavy Nemoci močové a pohlavní soustavy
Kód b) Počet pacientů A-B 24 C-D 55 D 9 E 2 I 7 J 28 e) K 2 M 6 N
14
Převažující základní onemocnění
HIV c) lymfom, leukémie, myelom aplastická anémie, SCID d)
ischemická choroba, (transplantace srdce) jaterní selhání systémový lupus erythematosus, Wegenerova granulomatóza selhání ledvin, (transplantace ledvin)
tabulka zahrnuje údaje Oddělení tropické medicíny Fakultní nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK z období XII. 2002 – III. 2012 skupinový kód podle Mezinárodní klasifikace nemocí c) 23 pacientů HIV+ (16 s nově zjištěnou HIV nákazou) d) vrozený těžký kombinovaný imunodeficit T a B lymfocytů (severe combined immunodeficiency) e) uveden je počet pacientů, u kterých není známa základní diagnóza a)
b)
Historie laboratorní diagnostiky pneumocystové pneumonie Laboratorní diagnostika pneumocystové pneumonie je založena na přímém průkazu původce v plicních sekretech nebo tkáních. Během epidemie dětské intersticiální pneumonie, do začátku 60. let minulého století, bylo hlavní diagnostickou metodou histologické vyšetření plicní 16
tkáně odebrané post mortem. K mikroskopickému průkazu Pneumocystis v sekčním materiálu sloužila řada barvících technik (např. impregnace dle Grocotta prokazující cysty, Gomoriho trichrom aj. Obr. 1), které se používají doposud. Od poloviny šedesátých let, kdy došlo k výraznému poklesu incidence Pjp, byly sporadické případy diagnostikovány již intra vitam díky pokroku v bronchoskopii, který umožnil omezený odběr materiálu z dolních cest dýchacích za života pacienta. Základní diagnostickou metodou pro průkaz původce zůstala mikroskopie. Od 80. let se stala rutinní bronchoskopickou technikou bronchoalveolární laváž (BAL) (Hunninghake et al. 1979). Frakcionovaný výplach periferní oblasti dýchacích cest 100-200 ml teplého fyziologického roztoku umožňuje postupnou aspirací získat 50-100 ml bronchoalveolární tekutiny (BAT), která obsahuje materiál přímo z míst patologického působení pneumocyst (Střičková, Kolaříková 2004). BAT byla zprvu, a je stále, používána k mikroskopickému průkazu P. jirovecii. Od 90. let, kdy doktorka Wakefieldová zavedla PCR do diagnostiky Pjp (Wakefield et al. 1990), i jako materiál pro izolaci DNA. Přes vysokou citlivost vyšetření BAT pro průkaz P. jirovecii (uvádí se až 100%) její odběr není možný u všech pacientů s podezřením na Pjp, neboť se jedná o invazivní zákrok. Jako alternativa k BAL byl zaveden odběr indukovaného sputa (Turner et al. 2003). Současné možnosti laboratorní diagnostiky pneumocystové pneumonie Základem diagnostiky Pjp je odběr materiálu na základě podezření vysloveného na podkladě klinického obrazu a zobrazovacího vyšetření. Laboratorní diagnostika Pjp je založena na přímém průkazu původce. Nepřímý průkaz sérových protilátek se neprovádí. Pro přímý záchyt P. jirovecii jsou používány obě výše zmiňované metody (1) mikroskopie a/nebo (2) PCR. Všeobecně akceptovaný diagnostický algoritmus ale neexistuje. Mikroskopický průkaz a jeho úskalí Tradiční mikroskopické metody, které jsou založeny na morfologické identifikaci vývojových stádií pneumocyst po obarvení (pro identifikaci cyst lze použít stříbření dle Grocotta, Gram-Weigertovo barvení či barvení toluidinovou modří, pro identifikaci trofických stádií se používá barvení dle Giemsa-Romanowski) jsou vysoce specifické, avšak jejich citlivost jednoznačně závisí na druhu vyšetřovaného materiálu a kvalitě jeho odběru. Pro mikroskopický průkaz lze použít sputum, indukované sputum (obojí po solubilizaci), tracheální aspirát a BAT. Záchytností se ale liší: od nejvyšší v bronchoalveolární tekutině (80 – 95%; stav pacienta nemusí umožnit odběr) po nejnižší v neindukovaném sputu (~ 25%) (neplatí absolutně). Toto omezení neřeší ani metody založené na nepřímé imunofluorescenci s použitím specifické protilátky (např. komerční kit Monofluo fy Bio-Rad), jejichž výhoda spočívá ve snadnějším nalezení pneumocyst na preparátě. Nevýhodou je, že prokazují pouze cysty P. jirovecii a neumožňují případný nález 17
jiných patogenů. Výsledek mikroskopického vyšetření může být rovněž negativně ovlivněn profylaktickým podáváním kotrimoxazolu nebo zahájením terapie před odběrem materiálu na vyšetření. Negativní výsledek mikroskopického vyšetření proto nevylučuje pneumocystovou pneumonii. Průkaz pomocí PCR a jeho úskalí Od roku 1990 se PCR jako diagnostická metoda pro průkaz Pjp rychle rozšířila. Jako výchozí materiál lze použít sputum, indukované sputum, výplach dutiny ústní kloktáním fyziologického roztoku (oral wash), tracheální aspirát, hrudní punktát, hrudní výpotek, výplach bronchů, BAT, případně materiál získaný z kanyly. Přestože chybí konsensus, pro izolaci DNA je obvykle používán komerční kit fy QIAGEN (QIAmp DNA Kit). Amplifikován je obvykle, ale ne vždy, gen pro mtLSU rRNA. Značná variabilita je ve vlastním uspořádání reakce. V současnosti je diagnostickými laboratořemi ve světě i u nás používána řada modifikací, často typu in-house, počínajíc jednokrokovou kvalitativní PCR až po kvantitativní real-time PCR. Při srovnání PCR a mikroskopie vychází PCR v jakémkoliv uspořádání jako citlivější metoda. Na našem pracovišti jsme v letech 2002 až 2012 vyšetřili materiál na průkaz pneumocystové pneumonie celkem od 1727 pacientů. Ve všech případech šlo o imunokompromitované nemocné s důvodným podezřením na Pjp na základě klinického obrazu a rentgenového nálezu. U 147 pacientů byla metodou jednokrokové PCR prokázána nákaza P. jirovecii, ale pouze u 61 (41.5%) byla nákaza současně prokázána i mikroskopicky. Tato často uváděná diskrepance může mít řadu příčin od falešné pozitivity PCR po nízkou citlivost vyšetřovaného materiálu. Minimálně se ukazuje, na základě srovnání, že profylaktické podávání kotrimoxazolu mikroskopický záchyt negativně ovlivňuje. Rovněž je zřejmé, že mikroskopické a PCR vyšetření je třeba provádět souběžně u každého pacienta. Kdo laboratorní diagnostiku pneumocystové pneumonie v ČR provádí Současná situace je poměrně nepřehledná. Mikroskopická vyšetření provádějí některá mikrobiologická pracoviště, zejména velkých a fakultních nemocnic (po zařazení Pneumocystis mezi houby častěji mykologické než parazitologické laboratoře), některá z nich včetně PCR. Vyšetření pouze pomocí PCR provádějí některé molekulárně biologické laboratoře. Žádný ucelený přehled ale není k dispozici. Literatura -Carmona E, Limper AH (2011). Update on the diagnosis and treatment of Pneumocystis pneumonia. Ther Adv Respir Dis 5:41-59
18
-Hunninghake GW, Gadek JE, Kawanami O, Ferrans VJ, Cyst RG (1979). Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol 97:149-206 -Khot PD, Fredricks DN (2009). PCR-based diagnosis of human fungal infections. Expert Rev Anti Infect Ther 7:1201-1221 -Reid AB, Chen SCA, Worth LJ (2011). Pneumocystis jirovecii pneumonia in non-HIV-infected patiens: new risks and diagnostic tools. Curr Opin Infect Dis 24:534-544 -Struijk GH, Gijsen AF, Yong SL, Zwinderman AH, Geerlings SE, Lettinga KD, van Donselaarvan der Pant KA, ten Berge IJ, Bemelman FJ (2011). Risk of Pneumocystis jiroveci pneumonia in patiens long after renal transplantation. Nephrol Dial Transplant 26:3391-Střičková J, Kolaříková R (2004). Standardní postup při provádění bronchoalveolární laváže (BAL) a vyšetřování bronchoalveolární tekutiny (BAT). Stud Pneumol Phtiseol 64:235-239 T-urner D, Schwarz Y, Yust I (2003). Induced sputum for diagnosing Pneumocystis carinii pneumonia in HIV patiens: new data, new issues. Eur Respir J 21:204-208 -Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER et al. (1990). Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. The Lancet 336:451-453 Slovníček Respirační bronchioly – terminální větve bronchiálního stromu, z nichž odstupují alveoly Alveoly (plicní sklípky) - tenkostěnné váčky velikosti 200 µm. Alveolární výstelka (respirační epitel) se skládá ze 2 typů buněk: (1) ploché, velmi tenké (25 nm) membranózní pneumocyty I. typu tvoří 97% výstelky, (2) ovoidní pneumocyty II. typu přítomné solitérně ve výstelce produkují surfaktant; proliferují a diferencují se na pneumocyty I. typu (obnova výstelky) Plicní intersticium – vazivo zevně od alveolů mezi bazální membránou alveolární výstelky a bazální membránou plicních endotelií Surfaktant – vazký komplexní sekret složený z lipidů a proteinů, syntetizovaný pneumocyty II. typu a sekretovaný do lumen alveolů
19
LEPTOSPIRY, LEPTOSPIRÓZY – POKROKY V DIAGNOSTICE MVDr. Zuzana Čermáková, Ph.D., Mgr. Petra Kučerová, Mgr. Ota Pavliš (Ústav klinické mikrobiologie, UK v Praze, LF a FN v Hradci Králové, Centrum biologické ochrany Těchonín, ÚVZÚ Praha) e-mail:
[email protected] Leptospiróza je celosvětově rozšířená zoonóza s prevalencí 0,1-100/100 000 obyvatel. Výskyt je výrazně vyšší v oblastech s teplým a vlhkým klimatem, ale i v Evropě se onemocnění vyskytuje. V České republice je uváděna prevalence 0,4/100 000; předpokládá se, že je ve skutečnosti o něco vyšší. Na vyšší výskyt leptospirózy mají vliv především dva fenomény – povodně a přemnožení hlodavců, ojedinělé případy zaznamenáváme po rizikovém chování. Po povodních bývají i v Evropě a občas také v České republice vyšší lokální výskyty leptospirózy. Počet vyšetřených pacientů a incidence leptospirózy v jednotlivých letech (2002-2009) v krajích: Královéhradecký (HK), Pardubický (PA) a část kraje Vysočina (počet obyvatel cca 1 115 000):
Počet vyšetřených pacientů
Počet pozitivních pacientů
Incidence (počet případů na 100 000 obyvatel)
2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
1 012 773 681 763 523 408
21
1,83 (povodně v ČR)
11
0,96
9
0,78
25
2,17 (lokální povodně – HK, PA)
6
0,52
9
0,78
285
2
0,17
368
6
0,52
celkem
4813
89
-
Rok
K přenosu onemocnění dochází obvykle kontaktem s močí rezervoárových zvířat (hlodavci, hmyzožravci, drobní savci, domácí zvířata) a k rizikovým aktivitám patří např.vodní sporty, práce v povodněmi postiženém území, práce, při kterých dochází ke kontaktu s rezervoárovými zvířaty nebo jejich exkrementy (úklid sklepů, práce v zemědělství) atd. Inkubační doba onemocnění je obvykle 1- 4 týdny a klinické příznaky se pohybují od mírných „chřipkovitých“, jako jsou bolesti hlavy, únava a zvýšená teplota, až po těžkou hepatorenální insuficienci, která může být spojena s pneumonií až respiračním selháváním.
20
Soubor pacientů s prokázanou leptospirózou – klinické příznaky dle ošetřujících lékařů: Klinické příznaky Horečka Bolesti hlavy Jaterní léze Déletrvající zvýšená teplota Bolesti svalů Bolesti kloubů Nausea, zvracení, průjem Alterace mentálního stavu Renální příznaky Respirační symptomy Meningeální symptomy Hepatorenálním selhávání Krvácivost Hepatosplenomegálie Icterus Kardiální příznaky Oligurie Urtikárie Konjuncitivitida, světloplachost Uveitis
% 91,6 69,4 58,3 38,8 44,4 47,2 47,2 33,3 41,6 30,5 30,5 22,2 13,9 13,9 16,7 13,9 16,7 5,6 13,9 8,3
Možnosti laboratorní diagnostiky 1. nepřímá diagnostika 1.1. nepřímá diagnostika – průkaz protilátek metodou (MAL, MAT) Za „zlatý standard“ je v laboratorní diagnostice leptospir nepřímými metodami považován mikroaglutinační test (MAL, MAT) s živými laboratorními kmeny leptospir. Vzhledem ke skutečnosti, že detekovatelné množství protilátek je infikovaným hostitelem tvořeno asi po 7 -10 dnech, je tento test velmi vhodný k následnému konfirmačnímu vyšetření a určení sérovaru, ovšem v diagnostice akutního onemocnění hraje zanedbatelnou úlohu. Principem je hodinová až dvouhodinová inkubace živých laboratorních kmenů s naředěným sérem susp.pacienta. Odečet je prováděn mikroskopicky v temném poli – zpravidla hodnocen + až +++, za viditelnou reakci je považována aglutinace více než 30% bakteriálních buněk v zorném poli. Za pozitivní titr je považováno ředění 1:400 a více. Z výše uvedených informací vidíme, že úloha MAT v diagnostice akutní formy onemocnění byla vždy problematická, neboť nejenže protilátková odpověď nemocného hostitele nastupuje po typickém „diagnostickém okně“, ale také hranice titru 1:400 je pro účel diagnostiky
21
akutní fáze diskutabilní, protože onemocnění i reakce se vyvíjejí a čím časnější přesnou diagnostiku provedeme, tím nižší je sice titr, ale podstatně je větší benefit pro pacienta. 1.2. nepřímá diagnostika – EIA test (Serion) K dispozici je v různých zemích několik EIA testů (Německo – Serion, Indie – Panbio…) Díky podpoře grantového oddělení Armády České Republiky (AČR) jsme v rámci projektu POV 907 980 – „Leptospiróza“ – vyhodnocení rizika a nové možnosti detekce, testovali EIA soupravu firmy Serion na 1598 vzorcích krevních sér příslušníků AČR a pacientů. EIA souprava detekuje IgM a IgG protilátky, ale je založena na detekci rodově specifických protilátek (antigen L.biflexa), protože existuje velké množství patogenních sérovarů a je obtížné EIA test připravit. Zřejmě vzhledem k této skutečnosti má nízkou specificitu a pro diagnostiku akutní formy leptospirózy i konfirmační vyšetření je dle našeho názoru prakticky nepoužitelná. V následující tabulce je uveden soubor testovaných sér od 45 pacientů FN Hradec Králové, na kterém jsme rovněž soupravu vyzkoušeli a v tabulce č. 2 senzitivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota v naší studii a srovnání s dalšími autory. Pro testování uvedených parametrů jsme použili soubor sér s MAT a klinicky konfirmovanou leptospirózou, negativní séra, 5 krevních sér od pacientů s infekcí Treponema pallidum, séra pacientů se sérologicky a klinicky konfirmovanou boreliózou a deset sér s protilátkami proti některým infekčním agens (a pacientů se sclerosis multiplex), u nichž bývají zkřížené reakce v EIA testech na průkaz protilátek proti boréliím:
22
Číslo pacienta v souboru
Výsledky klinické a sérologické konfirmace
Pohlaví
Věk
1. 2. 3 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂
40 28 62 66 48 50 60 25 53 32
Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira + Leptospira +
11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.
♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♂ ♀ ♀
56 22 21 37 43 35 19 75 50 54
Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira -
21 22. 23 24. 25.
♂ ♂ ♂ ♂ ♂
25 28 45 32 36
26.
♂
82
Další sérologicky prokázané infekce
Výsledek MAT patogenní leptospiry
Výsledek MAT L. biflexa Patoc
Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Hraniční Pozitivní
1 : 800 1 : 200 1 : 200 1 : 400 1 : 800 1 : 400 1 : 400 1 : 200 1 : 200 1 : 400
-
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní
Tr. Pallium + Tr. Pallium + Tr. Pallium + Tr. Pallium + Tr. Pallium +
-
Borellia +
-
CMV + HBS AB + CMV +
Výsledek ELISA IgG
Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní
Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Pozitivní
Negativní Nd Nd Nd Nd Negativní Negativní Negativní Nd Negativní
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Pozitivní
Pozitivní Negativní Negativní Negativní Negativní Pozitivní Pozitivní Pozitivní Negativní Negativní
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní
Negativní 1 : 200 hraniční Nd Negativní Nd
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní
Pozitivní Pozitivní Negativní Pozitivní Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
23
pozitivní hraniční hraniční pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní hraniční hraniční pozitivní
Výsledek ELISA IgM
Výsledky klinické a sérologické konfirmace
Číslo pacienta
Pohlaví
Věk
27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35.
♀ ♀ ♂ ♂ ♀ ♀ ♂ ♀ ♀
45 40 66 48 41 50 44 50 66
Borrelia + Borellia + Borellia + Borellia + Borellia + Borellia + Borellia + Borellia + Borellia +
36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45.
♂ ♀ ♂ ♀ ♀ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀
61 59 44 42 35 21 28 18 59 50
CMV +, HSV + RS + CMV + RS + CMV + HSV+, Chlamydia + CMV + Chlamydia + Chlamydia +
souboru
Vysvětlivky: BBG - IgG protilátky proti borréliím CMV - cytomegalovirus HAVG - IgG protilátky proti viru hepatitidy A HBS AB- protilátky proti australskému antigenu HSVG - IgG protilátky proti herpes simplex viru KEG - IgG protilátky proti viru klíšťové encefalitidy RS - roztroušená skleróza
Další sérologicky prokázané Infekce KEG + HAVG VCAG, VZVG Chlamydia + HSVG VZV+ VCAG VCAG BBG BBG
Výsledek MAT patogenní leptospiry
Výsledek MAT L. biflexa Patoc
Výsledek ELISA IgM
Výsledek ELISA IgG
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní
Negativní Negativní Negativní Nd Nd Nd 1 : 200 Negativní Negativní
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní
Pozitivní Pozitivní Pozitivní Negativní Negativní Negativní Pozitivní Pozitivní Pozitivní
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní
Nd Nd Nd 1 : 100 Nd Nd Nd Negativní Negativní Negativní
Negativní Negativní Negativní Pozitivní Pozitivní Negativní Negativní Pozitivní Negativní Negativní
Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Pozitivní Pozitivní
VCAG- IgG protilátky proti viru varicelly VZVG- IgG protilátky proti varicella zoster viru Nd - nevyšetřeno
24
Porovnání výsledků diagnostické senzitivity, specificity, PPV, NPV soupravy SERION ELISA classic IgM/IgG s dalšími studiemi:
Naše studie (2011)
Honarmand a kol. (2010) Panwala a kol. (2011) Effler a kol. (2002)
IgM (%)
IgG (%)
IgM (%)
IgG (%)
IgM (%)
IgM (%)
100,0
100,0
100
84,0
96,2
43
Specificita
88,6
54,3
43,0
77,0
88,1
98
PPV
71,4
38,5
37,0
55,0
88,4
86
NPV
100,0
100,0
100,0
94,0
96,7
85
Senzitivita
2. přímý průkaz původce 2.1. kultivační průkaz – tekutá média, polotuhá média, kultivace je zdlouhavá (generační čas v hodinách), nesterilní biologický materiál (moč) přerůstají rychle se množící bakterie… metoda je zastaralá tam, kde je možné využít PCR. 2.2. – mikroskopie v temném poli – rovněž se již nepoužívá, pokud je k dispozici průkaz DNA. 2.3. průkaz DNA patogenních leptospir metodou PCR Na našem pracovišti (pracovištích) jsou k dispozici prakticky 2 typy průkazu DNA patogenních leptospir: A) Průkaz DNA patogenních leptospir ve dvou standardních PCR reakcích. První PCR (In-house) je pro průkaz 7 genetických druhů patogenních leptospir, primery G1/G2 (z oblasti genu SecY) a pro průkaz DNA L.kirschneri (L. grippotyphosa) je nutné použít druhou PCR s odlišnými primery B641/ B64-2 (oblast genu pro chromosom 9). Využíváme již osm let, mez detekce cca 2,5 – 10 leptospir, konfirmační vyšetření metodou MAT – dourčení infikujícího sérovaru z epidemiologických důvodů. B) Průkaz DNA patogenních leptospir PCR metodou – detekce genu lipL32, kódujícího povrchový lipoprotein LipL32, který je přítomen pouze u patogenních leptospir. Real time PCR (In-house), používáme od roku 2010, mez detekce 2,5 – 10 bakterií. V rámci projektu AČR POV 907 980 jsme měli možnost vyšetřit 267 laboratorních kmenů (odpovídá 260 sérotypů) patogenních a nepatogenních leptospir ze sbírky Royal Tropical Institute, WHO/FAO/OIE and National Collaborating Centre for Reference and Resaerch on Leptospirosis, Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam, The Netherlands. 25
Testování potvrdilo možnost využití nově zavedené PCR diagnostiky (Real time PCR pro LipL32 gen) patogenních leptospir v laboratorní praxi – kmeny certifikované Institutem jako patogenní byly PCR pozitivní a kmeny certifikované jako nepatogenní byly uvedenou metodou negativní. Metodu jsme zavedli do rutinního laboratorního provozu v dubnu 2010 a do prosince roku 2011 bylo vyšetřeno 216 pacientů s podezřením na akutní leptospirózu, z toho bylo 8 osob vyhodnoceno jako pozitivní (3,70%).
Praktické využití PCR metod pro diagnostiku leptospirózy je velmi citlivé na preanalytickou fázi vyšetření: 2.4. Doporučení k odběru biologických materiálů Leptospira je bakterie dobře citlivá na většinu antibiotik a proto po zahájení účinné antibiotické terapie relativně rychle mizí pozitivita v PCR, neboť bakterie se rozpadají a imunitní systém likviduje jejich zbytky, včetně DNA. Je nutné odebírat vzorky biologických materiálů co nejdříve po vyslovení podezření na leptospirózu, nejlépe před započetím antibiotické terapie, popř. do 24 – maximálně do 48 hodin po jejím zahájení (po 48 hodinách však signál v PCR může být negativní, ačkoliv v organismu leptospiróza probíhá, nejdéle bývá pozitivní reakce z moči). 2.6. Časová posloupnost odběrů biologických vzorků: I)
V prvních dnech odebíráme především nesrážlivou krev (EDTA, citrát). NIKDY NE heparin (inhibuje PCR reakci)!!!.
II)
Ve druhém týdnu (cca 5-7 dní od počátku klinických příznaků) odebíráme pokud možno moč i nesrážlivou krev (EDTA, citrát). Při meningeálních příznacích lze vyšetřit DNA patogenních leptospir z likvoru.
III)
Po více než 7-10 dnech od počátku klinických příznaků (bez účinné ATB terapie) pak lze prokázat DNA patogenních leptospir především v moči.
IV)
Dle našich zkušeností při ATB terapii přetrvává pozitivní nález nejdéle v moči – cca 48 hodin.
2.7.
Uchování biologického materiálu: 3) Materiál (nesrážlivá krev, plazma, moč, likvor) je nutno uchovávat v chladničce, při 4 °C, a pokud možno do 24 hodin dopravit na pracoviště, kde je prováděno vyšetřování vzorků metodou PCR nebo provést izolaci DNA. 26
4) Uhynulá zvířata – orgány ze zvířat (především ledviny) lze vyšetřovat, ovšem je zapotřebí, aby materiál byl odebrán čerstvý – do několika hodin po úhynu, neboť bakterie rodu leptospira jsou velmi citlivé na změny pH ( především ke kyselému pH), a rychle v kadáverech hynou a rozkládají se.
Literatura 1. Gravekamp C., Van de Kemp H., Franzen M., Carrington D., Schoone G.J., Van Eys G.J., et al., Detection of Seven of Pathogenic Leptospires by PCR Using Two Sets of Primers, J. Gen. Microbiol., 1993, 139, 1691-1700
2. Levett P.N., Morey R.E., Galloway R.L., Turner D.E., Steigerwalt A.G., Mayer L.W., Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR, J. Med. Microbiol., 2005, 54, 45-49 Práce byly podporovány projektem obranného výzkumu AČR: POV 907 980 – „Leptospiróza“ – vyhodnocení rizika a nové možnosti detekce.
TRICHOMONAS VAGINALIS: PŘÍNOS PROFESORA JÍROVCE A JEHO NÁSLEDOVNÍKŮ Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze) e-mail:
[email protected]
Jednou z oblastí, kde poznatky profesora Jírovce dosáhly mezinárodního významu, je i výzkum původce urogenitální trichomonózy, prvoka Trichomonas vaginalis. Touto problematikou se zabýval v období 1939-1956. Jeho výzkum byl zaměřen na druhovou identitu původce poševní trichomonózy, jeho patogenitu, způsob přenosu a dynamiku infekce, klasifikaci mikrobních obrazů poševních a lokální chemoterapii trichomonózy. Výsledky, kterých na tomto poli spolu se svými spolupracovníky dosáhl, byly pak shrnuty v konfrontaci s poznatky z jiných laboratoří v kritickém review, které publikoval společně s dr. M. Petrů v Advances of Parasitology v roce 1968 (Vol. 9:117-188). Přestože pařížský anatom A.F. Donné roku 1836 nalezl a popsal druh Trichomonas vaginalis v poševním výtoku ženy trpící zánětem pochvy a Höhne roku 1916 formálně stanovil 27
trichomonádovou kolpitis jako klinickou jednotku, přetrvávaly kontraverze o patogenitě a zvláště o přenosu této infekce až do padesátých let minulého století. Pověry o možnosti získat tuto infekci při koupání, o možnosti přenosu infekce pomocí rezistentních stádií (cyst) nebo o zanesení střevních trichomonád do vagíny dlouhodobě přežívaly v podvědomí lékařů i v odborné literatuře. V letech 1939-42, kdy po zavření českých vysokých škol pracoval prof. Jírovec ve Státním zdravotním ústavu, publikoval ve spolupráci s gynekology a mikrobiology několik prací, které podaly přesvědčivé důkazy o identitě druhu Trichomonas vaginalis a jeho odlišnosti od dalších trichonád nalézaných ve střevě (Pentatrichomonas hominis) nebo ústní dutině člověka (Trichomonas tenax). Ukázal také, že trichomonády nevytvářejí rezistentní cysty umožňující dlouhodobé přežívání v nepříznivých podmínkách a že sexuální styk je přirozenou a za normálních podmínek jedinou cestou infekce. Společně s profesorem Peterem a dalšími gynekology pak sledovali výskyt trichomonád u různých věkových skupin žen a ve vztahu k estrogenizaci poševní sliznice. Sledovali dále dynamiku trichomonádové infekce a ukázali, že po akutní fázi zpravidla přechází do fáze chronické až latentní, nedochází však k její spontánní eliminaci a může pod vlivem různých podmětů exacerbovat. Společně s Peterem a Málkem pak navrhli klasifikaci mikrobních poševních obrazů (I-VI), která umožňuje orientační morfologické posouzení stavu poševní sliznice a biocenózy ve vztahu k infekčním agens (1947-1950). Toto hodnocení bere v úvahu množství a typ epitelových buněk, množství leukocytů, přítomnost nebo nepřítomnost Döderleinova laktobacila nebo jiných bakterií a morfologicky identifikovatelných patogénů (Trichomonas, Candida). Tato klasifikace v kombinaci s kultivačním vyšetřením a specifickými diagnostickými testy se používá dodnes. Peter a Jírovec také navrhli kombinované lokální léčivo proti poševní trichomonóze (1946,1947) obsahující složky bakteriostatické (sulfathiazol), trichomonocidní (carbazon nebo jodchinoliny), mykocidní (kyselina boritá) a laktózu pro stimulaci Döderleinova lactobacila. Na tomto základě vyrábělo účinné léky několik firem pod názvy Triflocid, Fluocid (Spofa), Viozol (Ciba), Tricolpon (Organon) aj., které byly v klinickém použití až do zavedení metronidazolu a dalších 5-nitroimidazolů vhodných k perorální léčbě po roce 1960. V roce 1952 založil profesor Jírovec laboratoř klinické parazitologie Fakultní nemocnice I, která byla po dlouhou dobu v areálu parazitologického pracoviště PřF UK. Diagnostika trichomonózy byla nedílnou součástí této laboratoře a prováděla se v ní i ambulantní vyšetření a odběry materiálu od pacientek s podezřením na trichomonózu nebo vaginální mykózy. Přítomnost této laboratoře tak stimulovala parazitology dalších generací k výzkumu trichomonád. V letech 1962-1965 jsem pracoval jako postgraduální student („vědecký aspirant“) v Protozoologické laboratoři ČSAV založené profesorem Jírovcem. Tato laboratoř byla posléze 28
začleněna pod jiným vedením do Parazitologického ústavu ČSAV, profesor Jírovec však zůstal mým školitelem. Tématem mé disertační práce byla srovnávací studie o trichomonádách se zvláštním zřetelem na druhy patogenní pro lidi a zvířata, včetně Trichomonas vaginalis. Zabýval jsem se kultivačními technikami, axenizací a klonováním kultur a jejich kryoprezervací, což byla v té době novinka. Podstatnou částí disertace bylo i testování virulence izolátů trichomonád na myších a tkáňových kulturách. V roce 1966 mi nabídl profesor B. M. Honigberg, známý americký protozoolog a znalec trichomonád, postdoktorské stipendium v jeho laboratoři na Universitě státu Massachusetts. Vzhledem k příznivému období v předjaří „Pražského jara“ bylo mi povoleno nabídku přijmout a v roce 1967 do USA vycestovat. Hlavní náplní mé práce v USA bylo studium virulence trichomonád a jejich interakce s buněčnými kulturami. Po návratu v roce 1969 mi nabídl profesor Jírovec místo v Zoologickém ústavu Přírodovědecké fakulty, jehož byl tehdy ředitelem. Tuto nabídku jsem bez váhání přijal a stal jsem se tak jeho posledním asistentem, bohužel jen na krátkou dobu, protože v roce 1972 zemřel. Krátce po návratu z USA jsem zamýšlel pokračovat ve studiu patogenity Trichomonas vaginalis a jako základ tohoto výzkumu jsme společně s mými tehdejšími studentkami (H. Nedvědová a M. Dohnalová) a ve spolupráci s Laboratoří klinické parazitologie (dr. M. Vojtěchovská, dr. E. Kunzová) a 1. gynekologickou klinikou (dr. M. Zavadil, dr. I. Karásková) Fakultní nemocnice I testovali soubor čerstvých izolátů T. vaginalis různými virulenčními testy na myších a porovnávali tyto výsledky s klinickým nálezem a histopatologickým vyšetřením biopsie z děložního hrdla pacientek. Tyto výsledky byly později doplněny pokusy na tkáňových kulturách a elektronovou mikroskopií trichomonád z experimentálních infekcí, které potvrdili ameboidní transformaci trichomonád po kontaktu s hostitelskou tkání. Soubor 25 charakterizovaných kmenů trichomonád z této studie je uložen v kryobance katedry parazitologie PřF UK a předpokládám, že ještě poslouží k dalšímu výzkumu patogenity trichomonád. Hlavní směr výzkumu trichomonád na PřF UK se však obrátil jiným směrem. Na začátku sedmdesátých let minulého století jsme se sblížili s biochemiky Jiřím a Apolenou Čerkasovovými a společně s našimi studenty jsme se vydali na vzrušující cestu objevování a biochemické charakterizace nových buněčných organel trichomonád, hydrogenosomů. Při této práci postupně vznikala neformální skupina, sdružující studenty dvou různých kateder, fyziologie a parazitologie a stipendisty z Parazitologického ústavu ČSAV, která se stala základem dnešní Laboratoře biochemické a molekulární parazitologie. Prioritním výsledkem této éry bylo zjištění, že hlavní metabolická dráha hydrogenosomů produkuje ATP a přispívá tak k energetické bilanci buňky. Jako model pro tyto biochemické experimenty jsme používali především druh Tritrichomonas foetus, původce bovinní trichomonózy. K T. vaginalis jsme se však vrátili v souvislosti se studiem rezistence k metronidazolu. Ukázalo se totiž, že účinek metronidazolu na trichomonády je aktivován v hydrogenosomech, kde působí jako preferenční 29
akceptor elektronů generovaných při metabolismu pyruvátu nebo malátu, jejichž přenos na nitroskupinu léčiva vede k uvolňování cytotoxických radikálů. Potlačení nebo odpojení hydrogenosomálního metabolismu tak vede k navození rezistence k 5-nitroimidazolovým léčivům. V letech 1988 až 2002 jsme uveřejnili řadu publikací zaměřených na biochemické vlastnosti rezistentních kmenů, rozdíly mezi aerobním a anaerobním typem rezistence, navození rezistence in vitro a monitorování změn, které vývoj rezistence provázejí i na standardizaci testů pro detekci rezistence klinických izolátů T. vaginalis. Studium trichomonád na PřF UK pokračuje i v současnosti. Členové týmu Laboratoře molekulární a biochemické parazitologie, kterou dnes vede prof. Jan Tachezy, se podíleli na genomovém projektu Trichomonas vaginalis a využívají poznatků tohoto projektu k hlubšímu pochopení molekulárních zákonitostí funkce buňky trichomonád. Tradice výzkumu iniciovaného profesorem Jírovcem tedy žije i v postgenomické éře.
TRICHOMONÁDY V RESPIRAČNÍM TRAKTU ČLOVĚKA RNDr. Ivan Čepička, PhD. (Katedra zoologie PřF UK v Praze) e-mail:
[email protected]
Co jsou trichomonády Trichomonády (kmen Parabasalia) jsou významná skupina bičíkatých prvoků. Většina z přibližně 450 dosud popsaných druhů trichomonád jsou kooperativní symbionti termitů, několik desítek druhů žije jako střevní komenzálové obratlovců. Je známo i několik volně žijících druhů. Pouze několik zástupců trichomonád je patogenních pro člověka a domácí zvířata, obvykle jsou to druhy, které unikly ze střeva do jiných orgánů. Většina druhů trichomonád včetně všech druhů nalezených v člověku netvoří cysty ani jiná odolná stádia a trofozoiti ve volném prostředí poměrně rychle umírají. Pro přenos mezi hostiteli je proto obvykle důležitý blízký kontakt.
Lidské trichomonády Nepočítáme-li nálezy v plicích a pleurální dutině (viz dále), bylo u člověka nalezeno pět druhů trichomonád. Nejznámějším a nejvýznamnějším druhem je parazit urogenitálního traktu Trichomonas vaginalis způsobující lidskou urogenitální trichomonózu. Mezi lidmi se přenáší téměř výhradně pohlavním stykem. Příbuzný druh T. tenax žije v ústní dutině. Jeho význam pro 30
člověka je nejasný, pravděpodobně půjde o komenzála. Častěji se vyskytuje u osob se sníženou zubní hygienou a u pacientů s chronickou periodontitidou. Mezi lidmi se přenáší slinami. Z lidského tlustého střeva byly popsány tři druhy trichomonád. Trichomitus fecalis nemá žádný význam, protože byl nalezen pouze jednou a není o něm téměř nic známo. Pentatrichomonas hominis je pravděpodobně komenzál a kromě člověka se vyskytuje v tlustém střevu celé řady dalších savců. Konečně Dientamoeba fragilis je zvláštní měňavkovitá trichomonáda, která ztratila bičíky. Pro lidi je patogenní a způsobuje průjmovitá onemocnění. Přenos střevních trichomonád se děje fekálně-orální cestou, u D. fragilis se spekuluje i o roli roupa dětského. Nálezy trichomonád v lidském respiračním traktu Ačkoli dolní cesty dýchací nejsou typickým místem výskytu trichomonád, během posledních zhruba padesáti let byla publikována pestrá sbírka několika desítek nálezů trichomonád v plicích a hrudním empyému. Dříve byly tyto nálezy celkem logicky přisuzovány druhu Trichomonas tenax žijícímu normálně v ústní dutině. S rozvojem diagnostiky se však ukázalo, že trichomonády izolované z lidských dolních cest dýchacích náleží nejméně do sedmi druhů. Kromě Trichomonas tenax se jedná o Trichomonas vaginalis, Pentatrichomonas hominis, Tetratrichomonas gallinarum, Tetratrichomonas sp. „LP“, Tritrichomonas foetus a Lophomonas blattarum. Nálezy těchto druhů byly poměrně nečekané, protože se o většině z nich dříve soudilo, že se jimi člověk nemůže vůbec nakazit. Smejkalová et al. (2012) však zjistili, že primáti, mezi které člověk patří, ve svém tlustém střevu hostí široké spektrum střevních trichomonád jiných živočichů. O druhu Trichomonas vaginalis se dlouho soudilo, že nemůže dlouhodobě přežívat mimo urogenitální trakt. Dnes je však známo více jak deset případů nákazy dýchacího traktu člověka (viz Carter a Whithaus 2008). Jak již bylo zmíněno, Pentatrichomonas hominis je střevní komenzál člověka a dalších savců včetně hospodářských zvířat, člověk se tedy s infekcí může běžně setkat. Nákaza respiračního traktu druhem P. hominis je však velmi vzácná, např. Jongwutiwes et al. (2000) našli tento druh v pleurální efuzi. Tetratrichomonas gallinarum je běžný střevní komenzál ptáků včetně drůbeže. Všechny známé případy lidské nákazy tímto druhem pocházejí z Estonska a byly izolovány z ústní dutiny nebo průdušek (Kutisova et al. 2005). Dosud nepopsaný druh Tetratrichomonas sp. „LP“ byl nalezen v hrudním empyému jediné pacientky (Mantini et al. 2009). O tomto druhu není známo téměř nic, ani to, od kterých hostitelů se člověk může nakazit. Tritrichomonas foetus je veterinárně významný původce bovinní urogenitální trichomonózy. Kromě urogenitálního traktu skotu se vyskytuje v trávicím traktu a nosní dutině (!) prasat a v posledních letech se ukazuje, že je to běžný střevní parazit koček způsobující průjmovité onemocnění. Tento druh byl jednou nalezen v plicích pacientky s pneumocystovou pneumonií (Duboucher et al. 2006a). Druh Lophomonas blattarum je 31
specializovaný symbiont zadního střeva švábů. I přesto byl opakovaně nalezen ve sputu astmatických a imunosuprimovaných pacientů (viz Martínez-Girón a Doganci 2010). Způsob infekce Ačkoli o vstupu trichomonád do dolních cest dýchacích můžeme pouze spekulovat, je velmi pravděpodobné, že obvykle je nejprve infikována ústní dutina. Do dolních cest dýchacích se trichomonády nejsnáze dostanou vdechnutím orofaryngeálního sekretu. Hematogenní diseminace z jiných orgánů je u druhů nalezených v člověku nepravděpodobná, zdokumentován byl příklad pravděpodobného rozsevu Pentatrichomonas hominis ze subfrenického a jaterního abscesu do hrudní dutiny (Hersh 1985). Protože Trichomonas tenax se přirozeně vyskytuje v ústní dutině, nákaza je dlouhodobá a je to celosvětově rozšířený a poměrně běžný organismus, je to logicky i nejčastější trichomonáda nalézaná v lidských plicích. Trichomonády druhu T. vaginalis se do ústní dutiny dostane prostřednictvím orálně-genitálního styku, novorozenci se nakazí od matky při porodu, obzvláště v případech předčasné ruptury amnia (viz Carter a Whithaus 2008). Způsob nákazy ostatními druhy trichomonád nalezených v lidských plicích je nejistý. Všechno to jsou komenzálové zadního střeva různých živočichů, lze tedy očekávat fekálně-orální přenos s následnou kolonizací ústní dutiny. Dolní cesty dýchací mohou být zřejmě infikovány i přímo, vdechnutím částeček fekálií obsahujících trofozoity. U druhu Pentatrichomonas hominis, který jediný z těchto druhů je znám i z lidského tlustého střeva, lze uvažovat i o orálně-análním přenosu, podobně jako např. u Giardia intestinalis nebo Cryptosporidium parvum. U lidských nákaz druhem Tetratrichomonas gallinarum byl hledán zdroj infekce u různých druhů drůbeže, bylo však zjištěno, že lidské izoláty představují samostatné genotypy a zdroj infekce nebyl identifikován (Cepicka et al. 2005).
Patologie Role trichomonád v respiračních onemocněních je dosud zcela neznámá. Přitom mohou být trichomonády poměrně běžné v plicích nebo pleurální dutině pacientů s různě závažnými respiračními chorobami. Duboucher et al. (2007a, b) našli trichomonády u 60 % pacientů trpících pneumocystovou pneumonií (u těžkých infekcí byla prevalence trichomonád dokonce 100 %) a u 30 % pacientů s ARDS (syndrom akutní dechové tísně dospělých). Protože jsou trichomonády mikroaerofilní, je vznik mikrooxického prostředí v postižených plicích kritickou podmínkou pro možnost infekce. Stejně důležitá pro přežívání a množení trichomonád v plicích a pleurální dutině je přítomnost bakterií, kterými se trichomonády živí. Zdá se tedy, že ve většině případů jsou trichomonády spíše oportunisti kolonizující již oslabené plíce. Podobně, většina nálezů trichomonád v pleurální efuzi (od roku 1966 zdokumentováno na 17 pacientech) byla 32
z pacientů oslabených nádorovými onemocněními, imunosupresivní terapií nebo alkoholismem (viz Leterrier et al 2012). Není jisté, zda jsou trichomonády schopné zhoršovat stav pacienta popř. zpomalovat zotavení, např. mechanismem tvorby lézí. Diagnostika Základní diagnostickou metodou pro výskyt trichomonád v respiračním traktu člověka je mikroskopické vyšetření tekutin (bronchoalveolární tekutina, sputum, pleurální výpotek). Trofozoiti trichomonád jsou pohybliví a dobře patrní již v nativním preparátu. Přitom je potřeba dávat pozor na záměnu s uvolněnými buňkami obrveného epitelu (viz Martínez-Girón et al. 2011; Qiang et al. 2011). Buňky druhu Trichomonas tenax však v plicích procházejí améboidní transformací, kdy ztratí bičíky a další struktury typické pro trichomonády a adherují k epitelu (Duboucher et al. 2006b). Protože buňky druhu Trichomonas vaginalis procházejí obdobnou transformací v prostředí urogenitálního traktu, lze očekávat, že se podobně chovají i v prostředí plic. V nativních preparátech proto nemusí být pohyb trofozoitů patrný. Vhodná jsou různá barvení, nejčastěji se používá barvení dle May-Grünwald-Giemsa, kdy lze oválná jádra trichomonád poměrně dobře odlišit od jader buněk hostitele. Pomocí této metody však prakticky není možná spolehlivá determinace přítomných trichomonád. I když jednotlivé druhy trichomonád (včetně blízce příbuzných Trichomonas vaginalis a Trichomonas tenax) lze od sebe při vhodném barvení morfologicky dobře odlišit, v současné době to zvládne pouze několik specialistů. Byly vyvinuty i imunohistochemické a FISH metody (Duboucher et al. 2007) pro detekci trichomonád, ty však dosud nejsou příliš rozšířené a vzhledem k obrovskému spektru nepříbuzných trichomonád infikujících lidský respirační trakt je jejich použití problematické. V úvahu přicházejí i kultivační metody, ale jejich použití je opět limitováno faktem, že se jednotlivé druhy trichomonád liší kultivačními nároky. Nejlepší diagnostická metoda je založena na PCR a sekvenční analýze ITS regionu nebo SSU rDNA, pomocí které lze nejenom potvrdit přítomnost i malého počtu buněk trichomonád ve vzorku, ale lze také přesně určit zjištěné trichomonády (např. Jongwutiwes et al. 2000; Cepicka et al. 2006). Je navíc natolik univerzální, že do budoucna zaručuje i identifikaci druhů, které dosud nebyly v člověku nalezeny. Problém je, že tato metoda dosud nebyla plošně zavedena. I když se nálezy trichomonád v lidském respiračním traktu rychle množí, je zjevné, že většina infekcí projde nepovšimnuta. Přestože je patogenní potenciál plicních trichomonád dosud nejasný, měla by být jejich diferenciální diagnostika zvažována u pacientů trpících závažnými respiračními onemocněními a pacienti pozitivní na trichomonády by měli být přeléčeni.
33
Terapie Lékem první volby při léčení plicních infekcí trichomonádami je metronidazol nebo tinidazol (viz Martínez-Gíron et al. 2008). Z terapeutického hlediska nezáleží na konkrétním druhu trichomonády, všechny druhy jsou citlivé na obě látky. I když dosud nebyly hlášeny případy rezistence plicních trichomonád na metronidazol, jsou známy rezistentní kmeny druhu Trichomonas vaginalis izolované z urogenitálního traktu. Pacientky nakažené rezistentními kmeny se podařilo vyléčit buď zvýšenou dávkou metronidazolu, anebo změnou terapie na ornidazol nebo tinidazol (viz Kulda 2002; Bachmann et al. 2011). Jiné léčebné postupy nepřinesly jednoznačné výsledky. Literatura Bachmann LH, Hobbs MM, Seña AC, Sobel DJ, Schwebke JR, krieger JN, McClelland RS, Workowski KA (2011) Trichomonas vaginalis genital infections: progress and challenges. Clin Infect Dis 53: S160-S172 Carter JE, Whithaus KC (2008) Neonatal respiratory tract involvement by Trichomonas vaginalis: a case report and review of the literature. Am J Trop Med Hyg 78: 17-19 Cepicka I, Kutišová K, Tachezy J, Kulda J, Flegr J (2005) Cryptic species within the Tetratrichomonas gallinarum species complex revealed by molecular polymorphism. Veter Parasitol 128: 11-21 Cepicka I, Hampl V, Kulda J, Flegr J (2006) New evolutionary lineages, unexpected diversity, and host specificity in the parabasalid genus Tetratrichomonas. Mol Phylogenet Evol 39: 542-551 Duboucher C, Caby S, Dufernez F, Chabé M, Gantois N, Delgado-Viscogliosi P, Billy C, Barré E, Torabi E, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2006a) Molecular identification of Tritrichomonas foetus-like organisms as coinfecting agents of human Pneumocystis pneumonia. J Clin Microbiol 44: 1165-1168. Duboucher C, Caby S, Pierce RJ, Capron M, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2006b) Trichomonads as superinfecting agents in Pneumocystis pneumonia and acute respiratory distress syndrome. J Eukaryot Microbiol 53: S95-S97 Duboucher C, Boggia R, Morel G, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2007a) Pneumocystis pneumonia: immunosuppression, Pneumocystis jirovecii…and the thir man. Nat Rev Microbiol 5: 966 Duboucher C, Barbier C, Beltramini A, Rona M, Ricome JL, Morel G, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2007b) Pulmonary superinfection by trichomonads in the course of acute respiratory distress syndrome. Lung 185: 295-301 Hersh SM (1985) Pulmonary trichomoniasis and Trichomonas tenax. J. Med Microbiol 20: 1-10 34
Kulda J (2002) Rezistence Trichomonas vaginalis k metronidazolu a její význam. In: Kulda J, Pazdiora E (Eds.) Trichomonóza. Sborník pro Seminář v Lékařském domě České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně. Pp. 16-17 Kutisova K, Kulda J, Cepicka I, Flegr J, Koudela B, Teras J, Tachezy J (2005) Tetratrichomonads from the oral cavity and respiratory tract of humans. Parasitology 131: 309-319 Jongwutiwes S, Silachamroon U, Putaporntip C (2000) Pentatrichomonas hominis in empyema thoracis. Trans R Soc Trop Med Hyg 94: 185-186 Leterrier M, Morio F, Renard B, Poirier AS, Miegeville M, Chambreuil G (2012) Trichomonads in pleural effusion: case report, literature review and utility of PCR for species identification. New Microbiol 35: 83-87 Mantini C, Souppart L, Noël C, Duong TH, Mornet M, Carroger G, Dupont P, Masseret E, Goustille J, Capron M, Duboucher C, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2009) Molecular characterization of a new Tetratrichomonas species in a patient with empyema. J Clin Microbiol 47: 2336-2339 Martínez-Gíron R, Esteban JG, Ribas A, Doganci L (2008) Protozoa in respiratory pathology: a review. Eur Respir J 32: 1354-1370 Martínez-Girón R, Doganci L (2010) Lophomonas blattarum: a bronchopulmonary pathogen. Acta Cytol 54: 1050-1051 Martínez-Girón R, van Woerden HC, Doganci L (2011) Lophomonas misidentification in bronchoalveolar lavages. Intern Med 50: 2721 Qiang H, Xiuju C, Jianghua C (2011) Authors reply to Lophomonas misidentification in bronchoalveolar lavages. Intern Med 50: 2723 Smejkalová P, Petrželková KJ, Pomajbíková K, Modrý D, Čepička I (2012) Extensive diversity of intestinal trichomonads of non-human primates. Parasitology 139: 92-102
35