Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
UJI DAYA HIDUP DAN KEMURNIAN BAKTERI YANG DIAWETKAN DENGAN METODE KERING BEKU AGUS WAHYUDIN Balai Besar Penelitian I'eteriner, J1. R .E Alartadinata No . 30 PO BOX 151 Bogor
RINGKASAN Dalam mempertahankan keberadaan bakteri pada umumnya dilakukan pengawetan . Pada dasarnya sernua prinsip metode pengawetan adalah sama yaitu memberi penekanan pada faktor-faktor penunjang kegiatan metabolisme mikroba seperti udara atau gas dan air. Bakteri Pasteurella multocida, Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter calcolacepticus, Pseudomonas aeroginosa dan Aeromonas hidrophylla yang diawetkan dengan metode kering beku mampu bertahan dalam penyimpanan selama 16 hingga 22 tahun, tanpa mengalami perubahan daya hidup demikian juga kemurnian bakteri dapat dipertahankan . Pengawetan bakteri dengan metode kering beku cukup efektif dan efisien karena mampu mempertahankan daya hidup dan kemurnian sifat-sifat bakteri serta penanganan hasil awetan tidak memerlukan perlakuan khusus dalam proses penyimpanan maupun dalam pendistribusian . Metode kering beku yaitu suatu proses penguapan dan penarikan kadar air dengan sistem sublimasi menggunakan mesin pengering-bekuan (Freeze Drver). Pengawetan dengan metode ini telah dilakukan di Balitvet Culture Collection dengan menggunakan 7,5% Glukose dalam Fetal Calf Serum sebagai medium preservan. Produk awetan yang dihasilkan dengan metode kering beku berada didalam ampul hatppa udara sehingga terlindung dari pencemaran dan aman bagi Iingkungan sekitarnya . Kata kunci : Daya hidup, kemurnian . bakteri, pengawetan . pengering bekuan . PEN DAHULUAN Berbagai macam metode pengawetan bakteri banyak dilakukan dan dipilih atas ketersediaan dasar kesukaan, tujuan, peralatan serta sumber daya manusia (SDM) . Dalam menentu-kan metode mi disamping mempertimhangkan akan kemampuan daya tahan awetan juga mempertahankan sifat-sifat mikroba agar tidak mutasi . Ada beberapa metode yang cukup mudah dilakukan seperti metode pemindah-biakan, tetapi metode ini hanya cocok untuk tujuan pengawetan dalam Bakteri dipindah jangka waktu pendek . biakkan ke media baru secara periodik sgsuai dengan daya tahan media selama beberapa minggu atau bulan (COWAN, 1974) . Disamping mempunyai kelemahan yaitu mudah terkontaminasi dan besar kemungkinan terjadi mutasi juga banyak menyita tenaga dan biaya (SUGIAWAN, 2000) . Metode lain seperti penyimpanan nitrogen cair cukup menjamin dalam terhindarnya dari mutasi mikroba awetan dapat digunakan untuk tujuan dan atau lama pengawetan jangka waktu tahunan, namun metode ini memerlukan
Pusat Penelittan dan Pengembangan Peternakan
biaya banyak yaitu harus menyediakan nitrogen cair secara terus menerus . Pengawetan metode pengering bekuan adalah suatu metode untuk tujuan pengawetan jangka waktu lama dan sangat cocok untuk dipakai di laboratorium koleksi biakan seperti di Balitvet Culture Collection (BCC) . Metode ini sangat efektif dan efisien karena mampu mempertahankan sifat-sifat bakteri dan penanganan hasil awetan tidak memerlukan perlakuan khusus . Metode pengering bekuan adalah suatu metode yang berteknologi tinggi tetapi cukup mudah dilaksanakan . Infestasi awal yaitu pengadaan peralatan mesin pengering bekuan cukup mahal, tetapi akan dikatakan hemat bila membandingkan dengan hasil produksinya . Dalam makalah ini menerangkan pengujian terhadap daya hidup bakteri yang diawetkan dengan metode kering beku yang disimpan dalam jangka lama dan pasca proses kering beku, dengan tujuan untuk membuktikan bahwa metode pengering bekuan dapat menyimpan bakteri tertentu dalam jangka lama.
269
Ternu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
MATERI DAN METODE 3.
Materi Biakan bakteri Bakteri yang diuji sebanyak 9 biakan, semua biakan tersebut berasal dari unit produksi BCC yaitu : Pasteurella inultocida, sebanyak 5 biakan yang disimpan dalam suhu -20° C . Staphvlococcus
epidermidis,
sebanyak I biakan yang disimpan dalam suhu ruangan . Acinetobacter
calcolacepticus,
sebanyak 1 biakan yang disimpan dalam suhu ruangan . Pseudomonas aeroginosa, sebanyak I biakan yang disimpan dalam suhu ruangan . Aeromonas hidrophvlla . s e banyak I biakan yang disimpan dalam suhu ruangan . Media 1.
Media Agar darah (AD)
Dibuat dengan menimbang 40 gram base (Oxoid, lnggris) yang dilarutkan dalam I liter air suling, lalu di steril pada suhu 121'C selama 15 menit . Setelah itu dinginkan hingga mencapai suhu 40°C tambahkan darah domba segar sebanyak 50 nil, selanjutnya sebanyak 20 ml dituangkan kedalam cawan petri biarkan hingga membeku, cawan petri yang berisi AD disimpan dalam pendingin sebelum digunakan . Dalam I liter media AD dapat dibuat sebanyak 50 cawan Petri . Blood agar
2 . Media dalam
Preservan
7,5%
Glukosa
Fetal Calf Serum (FCS)
Pertama dibuat larutan 15 gram Glukose dalam 100 nil air suling lalu disteril pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah itu didinginkan . Selanjutnya pada larutan Glukose ditambahkan 100 nil FCS yang disteril dengan melalui saringan inillipore berpori 0,22 pm, kemudian dikocok hingga Campuran larutan bercampur merata . tersebut dikemas kedalam botol masingmasing berisi 2 ml, disimpan pada suhu 20°C dan siap digunakan .
Media Serum broth
Pertama kali dibuat yaitu melarutkan 0,80 gram Nutrient broth (Difco, Amerika) dalam 100 ml air suling lalu disteril pada suhu 121 ° C selama 15 menit . Selanjutnya setelah Nutrient broth dingin tambahkan serum steril sebanyak 5% lalu dikemas dalam hotel, masing masing botol diisi sebanyak 2 ml kemudian simpan dalam suhu 5°C dan siap untuk digunakan . 4.
Perangkat identifikasi komersial Api® 20NE(BIOMERIEUX, Perancis)
Perangkat identifikasi (Kit) ini berbentuk strip dengan lubang-lubang berisi bahan kering untuk uji biokimia digunakan untuk uji bakteri Gram negatip . 5.
NaCI fisiologis
Sebanyak 0,85 gram NaCl (Merck) dilarutkan dalam 100 ml air suling lalu dikernas dalam botol masing masing diisi sebanyak 2 ml . Selanjutnya disteril pada suhu 12 IT selama 15 menit . 6.
0,5 Mac Farland opacity tube
Pertama kali dibuat dengan melarutkan 100 µl BaC1 2 1% dalam 9,9 ml H 2 SO 4 I%. Selanjutnya dari larutan tersebut diambil sebanyak 5 ml lalu ditambahkan kedalam 5 ml H 2 SO 4 1% aduk hingga merata, disimpan pada suhu 5 ° C dan siap digunakan sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri . Alat Biosafety Cabinet Purifier Class 11 (LABCONCO, Amerika) . Mesin Pengering bekuan (Edwards Freeze Dryer, lnggris) . Ampoule constrictor (Edwards, lnggris) . Tangkai karet berlubang tempat ampul (LABCONCO, Amerika) . Pengelas' ampul (Edwards Flame master hand torch flame, Inggris) . Vacuum tester (Edwards ST200K MKII, Inggris) .
Metode
2 70
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Kegiatan dilakukan di laboratorium unit produksi BCC . Bakteri dalam kemasan ampul kering beku dicatat identitasnya mulai dari nomor ampul, tanggal kering beku dan nama bakteri . Selanjutnya kondisi fisik ampul diperiksa dan dibersihkan bagian Iuarnya dengan alkohol 70% . Membuka ampul dilakukan didalam ruang Biosafety Cabinet yang benar-benar aman dan secara hati-hati karena isi ampul hampa udara. Buat keratan melingkar dengan gergaji ampul atau kikir dibagian tengah atas sumbat kapas ampul . Balut ampul dengan kain kasa (kertas tissue) dibagian yang dikerat tadi, lalu ampul dipatahkan . Sebelum patahan ujung ampul yang runcing dilepaskan, tunggu sebentar supaya terjadi keseimbangan tekanan udara secara perlahan-lahan kedalam ampul melewati penyaringan sumbat kapas . Sumbat kapas diambil dengan pinset yang steril dan bersamaan dengan patahan ujung ampul, dimasukkan kedalam bejana berisi desinfektan . Bagian ampul yang terbuka didekatkan pada nyala api, kemudian medium cair Serum broth kira-kira 0,5 ml kedalam ampul segera dimasukkan menggunakan pipet pasteur steril . Aduk dengan baik hingga bakteri tarot dan usahakan tidak terbentuk gelembung udara . Suspensi isi ampul dipindahkan kedalam medium AD yang disiapkan dalam cawan petri lalu diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam . diinkubasi, bakteri Setelah diidentifikasi mulai dari pertumbuhan atau daya hidup, gambaran koloni, gambaran set yang dilihat dari basil pewarnaan Grain (COWAN . 1974) selanjutnya uji reaksi biokimia . Terhadap bakteri kelompok Gram negatip dibuat suspensi dengan kekeruhan mengacu pada 0, 5 Mac Farland opacity tube lalu diuji reaksi biokimia menggunakan perangkat uji komersial dengan nama Api"20NE (BIOMERIEUX, Perancis) dan terhadap bakteri kelompok Gram positip diidentitkasi menggunakan metode COWAN (1974) . bakteri yang berdaya hidup baik adalah yang mampu turn huh atau hidup pada media penumbuh awal yaitu media AD . Kemurnian diuji dengan identitikasi mulai dari melihat gambaran koloni, reaksi Grain, bentuk set dan reaksi biokimia hasil yang
Pusat Penelitian clan Pengennbangan Peternakan
diperoleh harus sama atau sesuai dengan data sebelumnya maka bakteri tersebut dinilai murni . Bakteri murni diperbanyak untuk diawetkan kembali dengan metode pengering bekuan yang tahapannya mengacu pada tahapan metode kering beku yang ditulis oleh Sugiawan (2000) dan dimodifikasi sesuai dengan alat yang dipakai yaitu terdiri dari dua tahap . Tahap pertama biakan bakteri segar berumur 24 jam yang tumbuh pada media AD diambil lalu dilarutkan dalam media preservan . Sebanyak 200 il larutan bakteri dimasukkan kedalam ampul kaca steril yang berdiameter 5 mm dan panjang 10 cm dan tebal 0,5 mm . Ampul yang berisi bakteri disumbat dengan kapas steril, kapas yang masuk kedalarn ampul panjangnya 1cm . Kapas yang berada diluar ampul dipotong rata dengan permukaan lubang ampul menggunakan gunting steril, dengan menggunakan batang besi steril, kapas didorong kedalam ampul hingga kapas berada pada posisi 4 cm diatas dasar ampul . Letakkan ampul didalam lubang piringan alat sentrifus, selanjutnya piringan yang telah diisi ampul dipasangkan pada alat sentrifus yang berada diatas mesin pembeku pada mesin pengering beku lalu ditutup . Kemudian hidupkan mesin pembeku, tunggu hingga suhu dalam ruang mesin pembeku mencapai suhu -40 °C . Setelah suhu tercapai hidupkan mesin sentrifus selanjutnya buka katup gas ballast yang berada pada pompa penghisap lalu hidupkan pompa hisap . Bakteri dalam ampul sudah membeku lalu mesin sentrifus dimatikan . Biarkan mesin hidup hingga bakteri dalam ampul mengering, proses sublimasi ini berjalan selama semalam . Setelah bakteri kering, matikan semua mesin selanjutnya ampul dikeluarkan dari mesin pengering beku . Tahap kedua lalu diker_jakan yaitu membuat bentuk lekukan pada ampul dengan alat Ampoule constrictor (Edwards, Inggris) agar memudahkan dalam pemotongan dengan alat penyembur api . Sebelum ampul dibentuk hidupkan mesin pengering beku, setelah suhu mencapai -40 °C, ampul yang sudah dibentuk Iekukkan dipasang pada lubang karet yang berada diatas mesin pengering beku kemudian tutup katup gas ballast pada pompa penghisap .
27 1
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Peulanian 2006
selanjutnya pompa dihidupkan biarkan mesin hidup selama 2 jam . Dalam keadaan mesin hidup kondisi dalam ampul hampa udara, dalam kondisi ini ampul dipotong tepat pada lekukannya dengan cara membakar ampul dengan alat pengelas ampul (Edwards Flame master hand torch flame, Inggris) . Ampul berisi biakan bakteri kemudian kehampaannya diuji dengan alat vacuum tester (Edwards ST200K MKII, Inggris) kemudian bakteri kering dalam ampul sebanyak 10% dari jumlah produksi dibuka kemudian diuji kemurnian, bakteri murni selanjutnya diberi label kemudian dikoleksi di laboratorium BCC dan jika
bakteri tercemar maka bakteri hasil kering beku dimusnahkan . HASIL DAN PEMBAHASAN Dari data pada tabel I diperoleh hasil bahwa bakteri yang diawetkan dengan metode kering beku mampu bertahan dalam penyimpanan selama 16 hingga 22 tahun, tanpa mengalami perubahan daya hidup demikian juga kemurnian bakteri dapat dipertahankan . Bakteri yang diuji sebanyak 9 biakan, yaitu terdiri I biakan mati dan 8 biakan masih hidup dan murni, hasil dapat dilihat pada tabel 1 .
Tabel 1 . Hasil uji daya hidup dan kemurnian hakteri yang diawetkan dengan metode kering beku dan disimpan dalam jangka lama . No I 2 3 4 5 6 7 8 9
Kode Biakan _ BCC B2205 BCC B0717 BCC 131979 BCC B0001 BCC B2205 BCC B 1993 BCC B 1624 BCC B0003 BCC B0005
Nama Biakan Pasteurella multocida Staphylococcus epidermidis Acinetobacter calcolacepticus
Pasteurella multocida Pasteurella multocida Pseudomonas aeroginosa Aeromonas hidrophvlla Pasteuurella anrltocida Pasteurella multocida
TANGGAL kering beku buka ampul 25 .10 .88 17 .01 .06 25 .10 .88 17 .01 .06 10 .84 12 .01 .06 25 .10 .88 17 .01 .06 02 .02 .90 20 .02 .06 10 .84 1 1 .04 .05 22 .01 .86 11 .05 .05 20 .05 .85 01 .06 .06 20 .05 .85 01 .06 .06
Masa Simpan 18 thn 18 thn 22 thn 18 thn 16 thn 22 thn 20 thn 21 thn 21 thn
Hasil Uji hm * hm hm mati hrn hm hm hm hm
Keterangan : hm = hidup dan murni Bakteri yang diawetkan dengan metode pengering bekuan selama dalam penyimpanan tidak memerlukan perlakuan khusus seperti pada metode lain misalnya pada metode subkultur secara periodik bakteri dipindah biakkan ke media baru, karena media tahan selama heherapa minggu sampai satu bulan (COWAN 1974) . Bakteri kering beku akan terjaga dari pencemaran selama penyimpanan, sedangkan pada metode subkultur bakteri rentan terhadap pencemaran . Walaupun metode kering beku merupakan metode yang efektif tetapi masih ditemukan kematian pada bakteri, kejadian tersebut disebabkan oleh kebocoran ampul yang retak pada bagian yang di bakar atau
272
dipotong sehingga kadar air naik . Kadar air yang baik untuk menekan metabolisme adalah 1-2% (LAPAGE et al., 1970) dan dari bahan ampul yang tidak haik kandungan gelasnya sehingga pada waktu ampul dibentuk lekukan dengan cara dibakar memerlukan waktu yang lama, sebaiknya ampul dibuat dari bahan neutral glass (ROWE. 1978) dan dari sisa deterjen waktu ampul dicuci . Hasil uji kemurnian dan daya hidup bakteri pasca proses kering beku yang dikoleksi di unit produksi BCC diterangkan dalam Tabel 2 . Proses pengawetan dengan metode kering beku tidak merubah daya hidup dan kemurnian biakan bakteri yang diuji .
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Tabel 2 . Hasil uji kemurnian dan daya hidup bakteri pasca proses kering beku sebelurn dikoleksi . No
I
2 3
Kode . I3iakan BCC B 1624 BCC B1979 BCC B0717
205
4
B2
5
B1993 BCC B0003 BCC B 0005
6 7
Nama Biakan
TANGGAL buka kering beku ampul
Hasil Uji
Tindakan
Aeromonashidrophylla
12 .01 .06
16.01 .06
murni
koleksi
Acinetobacter calcolacepticus
24 .01 .06
26.01 .06
murni
koleksi
Staphylococcus epidermidis
08 .02 .06
13 .02 .06
murni
koleksi
Pasteurella multocida
07 .03 .06
09 .03 .06
murni
koleksi
Pseudomonas aeroginosa
17 .05 .06
22 .05 .06
murni
koleksi
Pasteurella multocida
06 .06 .06
12 .06 .06
murni
koleksi
Pasteurella multocida
06 .06 .06
12 .06 .06
murni
koleksi
KESIMPULAN DAN SARAN Dapat diambil kesimpulan bahwa pengawetan biakan bakteri dengan metode kering beku sangat haik karena terhukti dapat menahan daya hidup dan kemurnian, dan efisien karena tidak memerlukan perawatan khusus. Biakan yang diawetkan dengan metode kering beku dapat bertahan dalam jangka lama . Kemasan ampul bakteri kering beku terbuat dari bahan kaca maka perlu dijaga agar tidak retak pada waktu penyimpanan dengan cara membungkusnya dengan kapas atau dimasukkan kedalam wadah yang anti pecah . Walaupun biakan yang dimiliki merupakan biakan yang selalu digunakan di laboratorium, sebaiknya biakan tersebut dijaga kelestariannya dengan .pengawetan kering beku . UCAPAN TERIMAKASIH Penulis menyampaikan terimakasih kepada Drh . Siti Chotiah yang telah kan ijin, dukungan dan memberi bimbingannya dan kepada sdr . Sukatma terimakasih atas kerjasamanya .
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
DAFTAR BACAAN Anonimous . 1983 . Edward High Vacuum . Edward EF4 Modulyo Freeze Dry Instruction . Manor Royal, Crawley, Sussex, England . Anonimous, 2001 . Kit Identification system for non-pastidious, non enteric Gram'sapi ® 20NE, negative rods . BIOMERIEUX, France . Cowan, S .T . 1974 . Cowan and Steel's . Manual of Identification of Medical Bacteriology 2nd ed . Cambridge University Press, Cambridge . Rowe TWG and JW Snowman . 1978 . Edwards Freeze-Drying Handbook Edwards High Vacuum, Crawley, Sussex, England . Lapage, S .P ., J .E . Shelton, T .G . Mitchell, and Method in A .R . Marckenzic, 1970 . Microbiology . Acad Press, London . Sugiawan,W . 2000 . Teknik Pengawetan Bakteri, Khamir dan Kapang dengan Metode (Freeze Dry). Pengering Bekuan Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Peneliti . Pusat Penelitian Peternakan, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Departemen Pertanian . Bogor, 5 September 2000 . HIm :29-39 .
273
