5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Isolasi Bakteri Flora mikroba atau mikroorganisme yang terdapat dilingkungan pada umumnya merupakan populasi campuran. Pemisahan bakteri diperlukan untuk. mengetahui jenis, ciri – ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun karakteristik. Teknik pemisahan tersebut dinamakan isolasi yang disertai dengan pemurnian (Soeroso, 1999). Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh biakan yang tidak tercampur dengan jenis lainnya atau biakan murni (Gandjar dkk., 1992). Biakan murni diperlukan untuk mempelajari sifat – sifat biokimia dan morfologi biakan tersebut (Cappucino & Sherman, 2002). Teknik kultur untuk mendapatkan isolat murni terbagi menjadi tiga macam teknik, yaitu : a. Metode poure plate (penuangan) Metode pour plate merupakan metode untuk memperoleh biakan murni dari populasi campuran mikroorganisme dengan cara mengencerkan specimen yang kemudian dituangkan kedalam cawan steril dan diikuti dengan menuangkan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan (pada suhu ±500C) (Hadioetomo, 1983). Tujuan dari metode ini adalah untuk menentukan perkiriaan jumlah bakteri hidup dalam cairan atau spesimen. Hasil perhitungan bakteri dinyatakan dalam koloni (Irianto, 2012).
5 Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
6
b. Metode steak (cawan gores) Metode steak merupakan cara untuk mengisolasi bakteri dengan cara menggores permukaan medium dengan menggunakan jarum ose . Penggoresan bertujuan untuk membuat garis sebanyak mungkin pada permukaan medium agar bakteri yang tumbuh pada garis – garis terakhir berupa koloni yang terpisah – pisah (Irianto, 2012). c. Metode spread plate (penyebaran) Isolasi dengan penyebaran serupa dengan isolasi bakteri pada penuangan. Hal yang membedakan adalah pada saat penuangan suspensi sampel kedalam medium Isolasi diawali dengan pengenceran sampel pada setiap penuangan. Medium yang telah dipersiapkan dituangkan kedalam cawan petri steril. Tunggu hingga medium memadat, setelah itu tuangkan suspense sampel kedalam cawan petri yang telah berisi medium yang memadat. Penyebaran suspensi sampel dilakukan dengan menyebarkan suspense dengan batang Drugalsky yang telah dipanaskan terlebih dahulu (Waluyo, 2007) 2.2 Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri merupakan kelanjutan dari kegiatan isolasi bakteri. Identifikasi adalah suatu kegiatan untuk mengelompokkan makhluk hidup ke dalam suatu kelompok tertentu berdasarkan karakteristik persamaan dan perbedaan yang dimiliki oleh masing – masing makhluk hidup. Identifikasi mikroorganisme yang baru diisolasi memerlukan perincian, deskripsi, dan perbandingan yang cukup dengan deskripsi, dan perbandingan yang cukup
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
7
dengan deskripsi yang telah dipublikasikan untuk jasad – jasad renik lain yang serupa (Pelczar & Chan, 2008). Karakteristik yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dapat dilakukan dengan mmengamati karakteristik makroskopis, dan uji biokimia bakteri. Karakteristik makroskopis bakteri dilakukan dengan mengamati bentuk koloni yaitu berbentuk bulat tak teratur, seperti akar dan filament. Tipe koloni bakteri terdiri dari tipe koloni utuh, halus, berombak, dankal, dan berombak dalam. Warna dari koloni bakteri yang tumbuh terdiri dari kuning, merah, dan putih. Elevasi koloni bakteri terdiri dari rata, cembung rendah, dan cembung tinggi. Struktur permukaan koloni bakteri yakni halus dan kasar. Ukuran koloni bakteri dilakukan dengan mengukur diameter koloni bakteri yang tumbuh (Cappucino & Sherman, 1987). Karakteristik mikroskopis bakteri terdiri dari bentuk sel, ukuran sel, dan pewarnaan. Bentuk sel bakteri meliputi basil, kokus, dan spiral dengan masing – masing kombinasinya. Pengukuran sel bakteri secara mikroskopis dilakukan menggunakan micrometer. Pewarnaan yang dilakukan meliputi pewarnaan Gram dan pewarnaan endospore (Soeroso, 1999; Carg, 2005). Uji biokimia diperlukan untuk memperkuat data – data yang telah diperoleh. Beberapa uji biokimia yang dapat diterapkan yaitu uji katalase, uji oksidase, uji reduksi nitrat, uji fermentasi karbohidrat, uji methyl red, dan uji voges proskauer (Barrow & Feltham, 1993; Irianto, 2006). 2.2.1 Ukuran Bakteri
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
8
Menurut Pelczar & Chan (2008) ukuran bakteri sangat kecil, umumnya bentuk tubuh bakteri dapat dilihan dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x atau lebih. Satuan ukuran tubuh bakteri dapat dinyatakan dalam mikrometer atau mikron. Satu mikron (µ) ama dengan 1/1000 milimeter (mm). Panjang tubuh bakteri antara 1 – 2 µ, dan lebar tubuhnya antara 1 – 1,5 µ. Bakteri bentuk cocus memilikidiameter 1 µ. Bakteri berbentuk spiral memiliki ukuran lebar 0,5 µ.- 1 µ., panjang 2 µ.-5 µ.dan kadang kadang panjangnya ada yang mencapai 10 µ. Bakteri berbentuk koma (vibrio) (Pelczar & Chan., 2008). 2.2.2
Bentuk Bakteri Bentuk morfologi bakteri dapat dibagi menjadi 3 bagian, antara lain: a. Basil Bentuk sel bakteri basil adalah seperti batang pendek, agak silindris. Bentuk basil meliputi sebagian besar bakteri. Ujung beberapa basilus ada yang tampak persegi, ada yang bundar, da nada pula yang meruncing, atau lancip seperti cerutu. Basilus juga ada yang saling melekat satu dengan yang lainnya dan adaa yang saling lepas (Pelczar & Chan, 2008). Basil dapat dibedakan menjadi beberapa kelompok berdasarkan jumlah koloni, yaitu : monobasil yakni satu sel bakteri yang bentuknya satu batang tunggal, diplobasil yaitu sel bakteri berbentuk batang yang
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
9
bergandeng dua – dua, dan stereobasil yaitu sel bakteri berbentuk batang yang bergandeng memanjang membentuk rantai (Irianto, 2012). b. Cocus Bentuk sel bakteri ini bulat seperti bola- bola kecil. Golongan bakteri ini tidak sebanyak bakteri basil. Bakteri kokus dibedakan menjadi beberapa kelompok, yakni : monokokus adalah sel bakteri bola tunggal, diplokokus adalah sel bakteri bola bergandeng dua – dua, sarkina adalah sel bakteri yang berbentuk bola berkelompok empat – empat menyerupai kubus, streptokokus adalah sel bakteri yang berbentuk bola panjang membentuk rantai, dan stafilokokus adalah sel bakteri yang memiliki bentuk sekelompok sel tidak teratur sehingga mirip dompolan buah anggur (Irianto, 2012). c. Spiral Bentuk sel bakteri yang melilit atau berbengkok – bengkok dinamakan spirilium. Golongan ini tidak banyak dibandingkan dengan basil dan kokus. Ada tiga macam bentuk spiral, yakni : spiral yaitu sel bakteri bentuknya seperti spiral dan tubuhnya kaku, vibrio yaitu berbentuk seperti koma dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna, dan spirochete yaitu sel bakteri yang berbentuk spiral dan tubuhnya lentur (Irianto, 2012).
2.2.3 Pewarnaan Bakteri
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
10
Sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka untuk melakukan pengamatan dibawah mikroskop diperlukan pewarnaan mikroorganisme
dengan
mikroorganisme
pada
menggunakan dasarnya
adalah
pewarna.
Pewarnaan
prosedur
mewarnai
mikroorganisme menggunakan zat warna yang dappat menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme. Sebelum dilakukan pewarnaan, mikroorganisme harus difiksasi terlebih dahulu agar terikat pada kaca objek. Tanpa adanya fiksasi akan mengakibatkan zat warna yang diberikan pada mikroorganisme tidak melekat karena luntur setelah pencucian zat warna dengan air mengalir (Brown, 2005). Pewarnaan yang sering digunakan dalam mengidentifikasi bakteri adalah pewarnaan Gram. Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan yaitu Gram negatif dan Gram positif. Prinsip pewarnaan Gram tergantung dengan reaksi dindig sel bakteri terhadap tinta safranin dan krista violet. Bakteri yang telah diuji dengan pewarnaan berwarna ungu menunjukkan Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah menunjukkan Gram negatif (Brown, 2005). 2.3 Probiotik Menurut Fuller (1987) probiotik merupakan makanan tambahan (suplemen) berupa sel – sel mikroba hidup, yang memiliki pengaruh menguntungkan
bagi
hewan
inang
yang mengkonsumsinya
melalui
penyeimbangan flora mikroba intestinalnya. Definisi ini ditunjukkan pada
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
11
hewan terestrial dan manusia dengan menekan bahwa probiotik merupakan mikroba hidup yang diberikan melalui makanan. Definisi Fuller dalam aplikasinya pada akuakulture perlu peninjauan kembali, karena karakter lingkungan perairan berbeda dengan terestrial. Flora normal mikroba intestinum hewan air terbentuk akibat interaksi konstan dengan lingkungan. Bakteri yang hadir dalam lingkungan akuatik mempengaruhi komposisi mikroba intestinum ikan dan sebaliknya (Cahill, 1990). Gatesoupe (2000) mendefinisikan probiotik sebagai sel – sel mikroba yang diberikan dengan cara tertentu agar masuk kedalam saluran gastrointestinal dan tetap hidup dengan tujuan memperbaiki kesehatan. Menurut Salminen et al., (1999) dalam buku Probiotik Akuakultur yang ditulis oleh Irianto (2003) probiotik merupakan segala bentuk preparasi sel mikroba (tidak selalu hidup) atau komponen sel – sel mikroba yang memiliki pengaruh menguntungkan bagi kesehatan dan kehidupan inang. Berdasarkan pengertian tersebut probiotik tidak selalu terkait dengan pangan dan probiotik tidak harus dalam bentuk sel hidup. Moriarty (1998) melakukan penelitian dengan menambahkan bakteri ke dalam tangki atau kolam ikan, kemudian bakteri tersebut mampu memodifikasi komposisi bakteri pada air dan sedimen. Berdasarkan definisi – defenisi tersebut dapat di re-definisikan probiotik adalah suplementasi sel mikroba utuh (tidak harus hidup) atau komponen sel mikroba pada pakan atau lingkungan hidupnya, yang menguntungkan inang (Irianto, 2003).
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
12
2.3.1 Karakteristik Probiotik Menurut Fuller (1987), probiotik harus memiliki karakteristik sebagai berikut : 1. Menguntungkan inang. 2. Mampu hidup (tidak harus tumbuh) di intestinum. 3. Dapat disiapkan sebagai produksi sel hidup pada skala industri. 4. Dapat terjaga stabilitas dan sintasan untuk waktu lama pada penyimpanan maupun dilapangan. Menurut Feliatra dkk (2004) pemilihan mikroorganisme probiotik atas berdasarkan syarat – syarat sebagai berikut : a. Tidak bersifat pathogen atau mengganggu inang, tidak bersifat pathogen bagi konsumen (mausia dan hewan lain). b. Tidak mengganggu keseimbangan ekosistem setempat. c. Mikroba dapat dan mudah dipeliharaan diperbanyak. d. Dapat hidup dan bertahan serta berkembangbiak didalam organ pencernaan. e. Dapat
dipelihara
dalam
media
yang
memungkinkan
untuk
diintroduksikaan dalam organ pencernaan. f. Dapat hidup dan berkembang air wadah pemeliharaan.
2.3.2
Mekanisme Kerja Bakteri Probiotik
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
13
Mekanisme probiotik melindungi atau memperbaiki kondisi inangnya antara lain dengan menghambat pertumbuhan bakteri patogen melalui beberapa cara antara lain dengan (Simadibrata, 2010) : 1. Memproduksi substansi-substansi penghambat. Bakteri probiotik mampu memproduksi zat-zat penghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun negatif. Zat-zat ini termasuk asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, reuterin yang mampu menghambat tidak hanya bakteri hidup namun juga produksi toksin. 2. Menghambat perlekatan bakteri patogen dengan berkompetisi di tempat perlekatan permukaan mukosa saluran cerna diduga juga merupakan salah satu cara probiotik menghambat invasi dari bakteri patogen. 3. Kompetisi nutrisi. Bakteri-bakteri yang menguntungkan (probiotik) akan berkompetisi dengan bakteri patogen dalam hal memperebutkan nutrisi dalam saluran cerna.
Probiotik menghambat
dianggap
kolonisasi
menguntungkan
intestinum
oleh
untuk mikroba
inangnya yang
karena
merugikan,
memproduksi senyawa – senyawa anti mikroba, serta kompetisi terhadap nutrien dan ruang didalam organ pencernaan (Irianto, 2003). Pendapat lain tentang keuntungan probiotik ialah dapat memperbaiki nutrisi dengan memproduksi vitamin – vitamin, detoksisikasi pangan, serta melalui aktivitas enzimatis (Fuller & Turvy, 1971; Parker, 1974; Roach & Tannock, 1980; Fuller, 1992; Smoragiewicz et al., 1993). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa beragam mikroba yang menguntungkan memiliki kemampuan mensintesis biotin (Sugita et al., 1992), Vitamin B12 (Sugita et al., 1991),
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
14
senyawa antibacterial (Westerdahl et al., 1991), dan enzim – enzim hidrolitik seperti amylase (Sugita et al., 1996) dan protease (Hoshino et al., 1997). 2.4 Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus) 2.4.1
Klasifikasi Menurut Sanin (1968) , urutan taksonomi Ikan Patin dapat dijabarkan
sebagai berikut : Filum
: Chordata
Kelas
: Pisces
Sub kelas
: Teleostei
Ordo
: Ostariophysi
Sub Ordo
: Siluroidae
Famili
: Pangasidae
Genus
: Pangasius
Spesies
: Pangasius hypopthalmus.
2.4.2
Morfologi Ikan Patin Ciri – ciri morfologi ikan patin adalah memiliki badan memanjang
berwarna putih seperti perak dengan punggung berwarna kebiruan. Panjang tubuh ikan patin mencapai 120 cm. Kepala relative kecil dengan mulut terletak di ujung kepala agak disebelah bawah. Pada sudut mulutnya terdapat dua pasang kumis pendek yang berfungsi sebagai peraba (Susanto & Amri, 2008). Tubuh ikan patin terbagi menjadi tiga bagian, yaitu kepala, badan, dan ekor. Bagian kepala mulai dari ujung mulut sampai akhir tutup insang.
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
15
Bagian tubuh dari akhir tutup insang sampai pangkal sirip anal. Bagian ekor dimulai dari sirip anal sampai ujung ekor. Sirip ekor ikan patin bentuknya seperti gunting (bercagak) dan simetris. Ikan patin memiliki 5 sirip, yaitu sepasang sirip dada (pectoral fin), sepasang sirip perut (ventral fin), satu sirip punggung (dorsal fin), satu sirip dubur (anal fin), dan satu sirip ekor (caudal fin). Ikan pain memiliki sirip tambahan (adipose fin) yang terletak diantara sirip punggung dan sirip ekor. Sirip punggung ikan patin memiliki 1 jaringan keras (patil) dan 6 – 7 buah jari – jari lunak. Sirip dubur ikan patin cukup panjang, yakni mulai dari belakang dubur hingga pangkal sirip ekor, memiliki jari – jari lunak sebanyak 30 – 33 buah. Sirip perut ikan patin terdapat 6 jari – jari lunak. Sirip dada ikan patin terdapat 1 jari – jari keras (patil) dan 12 – 13 jari – jari lunak (Mahyuddin, 2010). 2.4.3
Sifat Biologis Ikan Patin Ikan patin merupakan ikan yang aktif pada malam hari (nocturnal).
Ikan patin sering bersembunyi di liang – liang di tepi sungai. Benih ikan patin di alam biasanya bergerombol dan sesekali muncul dipermukaan air untuk menghirup oksigen langsung dari udara pada saat menjelang fajar. Kebiasaan ini dimanfaatkan oleh petani dan nelayan ikan dalam melakukan penangkapan benih. Kemunculan benih ikan patin dalam jumlah besar biasanya menjelang akhir musim hujan (Kordi, 2010). Patin merupakan ikan pemakan tumbuhan dan hewan lain (omnivore) dan cenderung pemakan hewan lain (karnivora). Di alam patin memakan
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
16
ikan – ikan kecil, cacing, detritus, serangga, biji – bijian, potongan daun tumbuhan, rumput, udang kecil dan molusca. Ketika baru menetas (larva) ikan patin memakan dari cadangan makanan berupa kuning telur. Setelh kuning telur habis, beni ikan patin memakan plankton (Kordi, 2010). 2.5 Bakteri Aeromonas hydrophylla 2.5.1
Klasifikasi (Holt et al., 1998)
Kingdom
: Monera
Filum
: Protozoa
Ordo
: Pseudanonadales
Familia
: Fibrionaceae
Genus
: Aeromonas
Spesies
: Aeromonas hydrophylla
2.5.2
Morfologi Bakteri Aeromonas hydrophylla Bakteri Aeromonas hydrophylla adalah bakteri Gram negative,
berbentuk batang dengan ukuran 0,7 – 0,8 µm, bersifat fakultatif anaerob, kemoorganotrof, fermentative, sitokrom oksidase positif, dan bersifat motil. Bakteri ini resisten terhadap penisilin, tumbuh optimum pada suhu 37 0C dan dapat tumbuh pada kisaran suhu 4 – 450C. Bakteri A. hydrophylla tidak membentuk kapsul maupun spora. Koloni berbentuk bulat, tepi rata, cembung dan berwarna kuning keputih – putihan (krem) (Mulia, 2012). 2.5.3
Habitat Bakteri Aeromonas hydrophylla Dilihat dari cara hidupnya, bakteri ini bersifat patogen oportunistik,
selalu berada didalam air dan menyerang ikan pada saat ikan dalam kondisi
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
17
lemah. Bakteri ini juga dapat hidup di perairan tawar maupun pada perairan payau dan laut dan mempunyai toleransi suhu yang lebar. Perairan air tawar khususnya yang mengandung bahan organic merupakan habitat yang baik bagi perkembangan bakteri A. hydrophylla. Bakteri ini memiliki sifat biokimia, genetic, serologi, dan fenotif yang beragam (Mulia, 2012). 2.5.4
Patogenitas Bakteri Aeromonas hydrophylla Kemampuan bakteri A. hydrophila dalam menimbulkan penyakit
cukup tinggi. Tingkat keganasan bakteri ini dapat diukur dengan LD 50 cukup bervariasi, yaitu berkisar antara 104 – 106 sel/ml (Mulia, 2012). Penyakit bacterial yang disebabkan oleh
bakteri A. hydrophylla
disebut dengan MAS (Motile Aeromonas Septicemia). Gejala eksternal yang muncul akibat penyakit MAS adalah adanya ulse yang berbentuk bulat atau tidak teratur dan berwarna merah keabu – abuan, inflamasi, dan erosi didalam rongga dan sekitar mulut, seperti redmouth diasease. Selain itu, terjadi hemorrhagic pada sirip serta mata membengkak dan menonjol (eksophtalmia/popeye). Gejala internal dari penyakit MAS adalah pembengkakan ginjal, tetapi tidak lembek; petikiae (bintik merah) pada otot daging dan peritoneum, usus tidak berisi makanan, tetapi berisi cairan kuning. Gejala khas dari bakteri ini adalah adanya cairan kuning dalan jumlah besar didalam rongga perut (Mulia, 2012). Di Indonenesia, bakteri A. hydrophylla menyerang ikan air tawar seperti ikan gurami, ikan lele, ikan patin, dan ikan karper. Didaerah subtropik yang banyak terserang oleh bakteri ini adalah rainbow trout dan
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
18
Chinook salmon. Selain menyerang ikan, bakteri ini juga dapat menyerang amphibian, reptil (ular, kura – kura), buaya, bahkan berpotensi menyerang manusia. Bakteri A. hydrophylla dapat menyebabkan diare pada manusia (Mulia, 2012).
Isolasi Dan Identifikasi..., Putri Utami, FKIP UMP, 2017
