Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
BEBERAPA KENDALA PADA UNIT BIAKAN JARINGAN H.A.MARIA DAN HANIPAH ARIYANI Balai Penelitian Veteriner J1. RE Martadinata 30, Bogor 16114
RINGKASAN Untuk melayani isolasi dan identifikasi agen infeksi virus, Unit biakan jaringan (TC) merupakan satu unit yang sangat dan hares dipunyai oleh bagian Virologi. Keberadaan Unit TC ini sangat berkaitan dengan banyaknya aktivitas kegiatan penelitian . Beberapa hal terkait yag saling menunjang perlu diadakan untuk terlaksananya satu unit TC yang mampu menunjang keberhasilan penelitian . Ada tiga faktor utama yang saling terkait yang perlu diperhatikan : penyiapan alat dan sterilisasi, media dan larutan dan proses penyiapan dan penyimpanan biakan sel yang dihasilkan. Beberapa kendala di informasikan pada tulisan ini . Kata kunci: TC (Tissue Culture), biakan jaringan, virus, virologi
PENDAHULUAN Isolasi dan identifikasi virus merupakan salah satu cara untuk mengetahui agen penyebab penyakit yang disebabkan oleh virus, misalnya: ND, IB, ILT, POX (pada unggas), IBR, MCF, Blue Tongue (pada sapi), ORF (pada kambing dan domba), Rabies (pada anjing) . Unit biakan jaringan sangat dibutuhkan untuk kelestarian dan memperbanyak berbagai sel lestari dan pengadaan sel-sel primer (PAUL, 1975) . Sel lestari diperoleh dari luar negeri, misalnya : Australia, Inggris, Amerika, Korea, dan juga bisa diperoleh dari antar instansi antara lain dari: Biofarma-BDANung dan BPMSOH-Gunung Sindur. Sel-sel primer dapat dihasilkan dari Unit Biakan Jaringan, antara lain: Chicken Embryo Fibroblast (CEF) dari embrio ayam umur 7 sampai 10 hari, Chicken Embryo Liver (Celi) dari embrio ayam umur 14 hari, sel Thymus, sel Lung, sel Kidney (dari embrio kambing/domba), sel Thymus, sel Lung, sel Kidney (dari embrio sapi). Penyediaan sel primer dan sel lestari tergantung dari banyaknya aktifitas penelitian . Dari beberapa faktor penunjang ada 3 faktor penting yang perlu perhatian untuk berlangsungnya kegiatan biakan jaringan . Peralatan dan penyiapan alat-alat yang dibutuhkan : Biohazard, Incubator, Refrigerator, Water Bath, Microscope, Centrifuge dan ruang laboratorium yang ber-AC dan berfasilitas lampu Ultra Violet (WOLFENDEN . 1982). Peralatan lain yang harus disiapkan sebelum melakukan pekerjaan antara lain: botol-botol Tissue Culture, pipet dan seperangkat filter media. Faktor penting lainnya adalah penyiapan
197
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
media, larutan penyanggah dan sumber air (WOLFENDEN, 1982). Faktor lain yang tidak kalah pentingnya yaitu faktor penyiapan dan penyimpanan sel.
MATERI DAN METODE Peralatan penting yang dibutuhkan Biohazard Biohazard yang dipergunakan berstandar tekanan minimal 200 Kpa. Lampu ultra violet dinyalakan 10 menit sebelum dipergunakan . Permukaan biohazard dibersihkan dengan kapas beralkohol 70% untukmengurangi pencemaran dari debu.
Water bath (penangas air) Suhu air dalam water bath sebelum dipergunakan harus bersuhu 37 ° C, air dalam water bath diganti setiap 1 bulan sekali, sebaiknya dipergunakan air suling (destilasi) untuk mengurangi pencemaran dan korosi terhadap alat . Sentrifus Sentrifus yang dibutuhkan mempunyai kecepatan 1000-6000 rpm. Sebelum dipergunakan tabung sentrifus diseimbangkan terlebih dahulu dengan cara menimbang . Keseimbangan mempengaruhi proses pengendapan bahan . Mikroskop Lensa mikroskop dibersihkan dengan xylol terutama mempergunakan pembesaran yang tinggi dengan larutan oil emersi.
bila
Kulkas
Kulkas yang cukup besar dan mempunyai suhu stabil mutlak harus ada untuk menyimpan media, Foetal bovine serum atau Foetal Calf Serum (FCS) dan berbagai larutan penyanggah yang memerlukan suhu dingin (4-8°C) dan juga area untuk menyimpan larutan penyanggah yang memerlukan atau harus dalam keadaan beku (-20°C), misalnya larutan L-glutamin, stock FBS dan stok antibiotik . Otoklaf sterilisasi basah
Otoklaf7sterilisasi basah dipergunakan untuk sterilisasi perlatan yang terbuat dari plastik, tutup botol, mikrofilter, alat-alat seksi, larutan penyangah. Atur suhu otoclafmencapai 121 °C dengan tekanan 161 kg/cm' . Sterilisasi kering/oven Sterilisasi kering/oven dipergunakan untuk mensterilisasi alat-alat yang terbuat dari kaca/gelas. Untuk pipet kaca, sumbat bagian pangkal dengan kapas dan dimasukkan pada tempat pipet. Alat-alat gelas yang akan disterilisasi tutup
19 8
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
permukaannya dengan alumunium foil, alat tersebut antara lain: beaker glass, gelas ukur, botol-botol biakan jaringan erlenmeyer, dan lain-lain . Masukkan alat-alat yang akan disterilisasi ke dalam oven pada suhu 160°C selama 1 jam. Seperangkat alat filter media Perangkat ini terdiri dari: fillter holder (yang telah dipasang membrane fillter), tabung media, corong, selang besi yang sudah disterilisasi basah dan pompa motor, dan alat ini disiapkan didalam biohazard untuk mengurangi pencemaran media dari udara sekitar . Dengan bantuan pompa motor maka media akan dialirkan dari tabung media melewati filter berukuran 0,22 nm ke botol-botol steril yang sudah disiapkan @ 100-500 ml. Biasanya dibutuhkan 1-2 jam untuk filterisasi 10 liter media. Inkubator Inkubator bersuhu 37°-39°C dibutuhkan untuk perkembang biakan sel . Sel tertentu membutuhkan juga kadar COZ 5%, sehingga dibutuhkan inkubator yang dilengkapi perangkat COz 5%. Penyiapan alat Cara pencucian alat-alat gelas yang baru Semua peralatan gelas yang baru direndam dalam larutan HCl 10% selama 1 malam, kemudian dibilas dengan air keran sebanyak 6 kali, lalu direndam lagi dalam air suling selama 1 malam. Dibilas lagi dengan air suling sebanyak 2 kali, kemudian dikeringkan (dalam alat pengering) pada suhu t 54°C sampai kering . Cara pencucian alat gelas yang telah dipakai (tidak terkontaminasi virus): semua alat gelas yang sudah dipakai direndam larutan Natrium hypochlorida (chlorise 3%) selama 1 malam, kecuali untuk pipet direndam dalam tempat khusus (pippete tank) . Kemudian alat-alat tersebut dicuci dengan mempergunakan sabun deterjen . Untuk bagian dalam alat-alat gelas dibersihkan dengan sikat botol. Alat-alat yang yang telah dicuci dibilas dengan air keran sebanyak 6 kali, kemudian dibilas ulang dengan mempergunakan air suling sebanyak 3 kali. Setelah bersih semua peralatan dimasukkan kedalam alat pengering barang pada suhu t 54°C sampai kering . Alat-alat gelas dibungkus satu persatu dan siap disterilisasi dengan metode kering atau basah (ANON. 1978) . Penyiapan Media dan Larutan Penyanggah Media yang dipergunakan pada unit biakan jaringan tergantung pada macam sel yang akan ditumbuhkan untuk virus tertentu antara lain: Dulbecco's Modifed Eagle Medium (DMEM), RPMI-1640, 199, Leibovitz's L 15, Earle's modified Eagle Medium (EMEM) . Pembuatan media dilakukan dengan mencampur serbuk media dengan air steril sesuai dengan kebutuhan (biasanya 1-5 It setiap kali pembuatan), kemudian ditambahkan Natrium Bikarbonat, Hepes, Antibiotik, lalu diputar dengan stirer sampai tercampur rata dan
199
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
ditentukan pH 7,2, setelah itu difilter dan ditampung pada botol @ 100-500 ml. Untuk mengetahui steril atau tidaknya media tersebut, dilakukan pengetesan dengan cara memasukkan sedikit media kedalam agar darah atau Nutrient Broth, kemudian simpan dalam suhu 37°C . Apabila dalam 2 hari tidak ada pertumbuhan bakteri atau jamur, maka media tersebut steril dan dapat digunakan untuk pembuatan berbagai komposisi sesuai kebutuhan (Tabe13) . Larutan penyanggah yang biasa dipergunakan pada unit biakan jaringan antara lain: Phosphate Buffer Saline yang tidak mengDANung Ca dan Mg (PBS - Ca,Mg) untuk pencucian sel dari embrio, Antibiotik Trypsin Versene (ATV) untuk memisahkan sel lestari pada pasase sel, Phosphate Trypsine EDTA (PTE), Hepes untuk menyesuaikan pH larutan, NaHCO3 (Natrium Bikarbonat) (ANON. 1948) . Air yang dipergunakan untuk membuat media atau larutan penyanggah harus air yang sudah diproses secara 3 kali didestilasi atau dengan cara di deionisasi, kemudian disterilisasi dengan cara diautoclave selama 20 menit dengan suhu 120°C dengan tekanan 15 ATM . Foetal Bovine Serum (FBS) FBS merupakan komponen penting karena mengandung komposisi protein penumbuh sel . Bahan penumbuh sel ini diambil dari embrio sapi dan belum dapat digantikan dengan bahan kimia buatan . FBS masih diimpor dari luar negeri (Gibco BRL-USA . ; CSL Victoria-Australia ; Multiser-Australia) dengan kemasan 100-500 ml. FBS yang diterima, biasanya sudah diuji bebas dari mycoplasma ataupun virus laten lainnya, misalnya BVD (Bovine Viral Diarrhea) . FBS tersebut lalu diinaktivasi dengan pemanasan 56°C selama 30 menit, diuji terhadap kontaminasi agen bakteri dengan memasukkan kedalam agar darah atau Nutrient broth, yang diinkubasikan pada 37°C selama 2-3 hari. Bila steril maka FBS dapat didistribusikan kedalam botol-botol steril @ 25 ml disimpan pada suhu beku -20°C. Pengadaan FBS yang tidak tepat waktu dan sudah kadaluarsa maupun yang tidak berkesinambungan merupakan salah satu kendala . Penyiapan dan Penyimpanan Sel Sel lestari diperbanyak secara pasase bila sel dibutuhkan untuk penelitian atau tumbuh berlebihan (Tabel 1). Cara penyiapan sel jika sel dalam flask sudah merata maka media lama dibuang, kemudian sel dicuci dengan PBS, lalu ditrypsinasi dengan ATV dan flask diinkubasi pada suhu 37°C selama 2-3 menit . Apabila sel sudah terlihat melepas dari dasar flask, maka flask digoyang agar sel tidak bergerombol atau tidak menyatu melainkan lepas menjadi satu persatu atau dapat menggunakan pipet dengan cara mengambil dan menyemprotkan larutan sel beberapa kali. Kemudian ditambahkan media penumbuh ke dalam flask yang berisi sel lalu didistribusikan dalam beberapa flask lain tergantung dari banyaknya sel Flask diinkubasikan lagi pada suhu 37°C selama 1-3 hari untuk berkembang biak.
200
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Penyiapan Sel Primer Pembuatan sel primer (Tabel 2) juga tergantung kebutuhan penelitian di Virologi . Tidak seperti sel lestari, sel primer hanya dapat diperbanyak 2-3 kali pasase saja. Cara pembuatan yaitu organ embrio hewan yang diperlukan, dihaluskan dengan gunting clan pinset, lalu dicuci mempergunakan PBS beberapa kali sampai terlihat bersih dari darah, pindahkan ke dalam botol bermagnet yang steril, ditambahkan ATV/PTE, kemudian Trypsinasi dilakukan dalam water bath 37°C yang bermagnet stirer selama 5-10 menit, sampai cairan di dalam botol terlihat keruh. Tuang clan pindahkan cairan kedalam botol steril lain clan tambahkan ± 2m1 FBS, kemudian simpan kedalam kulkas selama 10 menit. Sedangkan organ yang belum hancur ditrypsinasi ulang, lakukan proses ini 2-3 kali. Cairan yang sudah terkumpul tadi kemudian disaring clan pindahkan ke dalam tabung sentrifuge clan diputar dengan kecepatan 1000-1500 rpm, kemudian buang supernatant clan tambahkan media penumbuh pada endapan sel . Larutan sel dimasukkan pada botol biakan jaringan, inkubasikan pada suhu 37°C. dilakukan bila sel-sel tersebut sedang tidak Penyimpanan sel dibutuhkan. Sel yang sudah merata ditrypsinasi, clan sudah terlepas dari flask ditambahkan sedikit media penumbuh, kemudian masukkan kedalam tabung sentrifus diputar dengan kecepatan 1500 rpm selama 5-10 menit. Endapan sel didasar tabung dilarutkan dengan media penyimpan (Tabel 3) yaitu freezing media yang mengandung 20% FBS clan 10% DMSO, dengan konsentrasi sel 5x106 sel/ml clan masukkan kedalam ampul @ 1-1,5 ml/ampul clan disimpan pada -70°C atau liquid nitrogen . Penyimpanan sel dilakukan secara bertahap, pada -20°C selama 1-2 jam kemudian dipindah dalam -70 °C selama ± 24 jam lalu pindahkan pada liquid nitrogen dimana sel dapat bertahan hidup sampai beberapa tahun (ANON ., 1997).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengamatan kendala yang sering terjadi pada Unit TC disajikan pada Tabel 4, juga disertai dengan dampak clan solusi kendala tersebut. Solusi yang dikemukakan disini merupakan saran untuk menyelesaikan kendala, sehingga masalah tidak berkelanjutan . Sebagai contoh, bila cel/biakan jaringan tersebut tidak dipergunakan pada saat itu, dapat disimpan pada -70°C dalam kurun waktu maksimal 5 tahun, atau disimpan dalam nitrogen cair (-180°C), sehingga tidak perlu import sel lestari yang harganya cukup mahal, cukup lama clan harus melalui berbagai prosedur. Kendala lainnya yang sering terjadi adalah sel tidak tumbuh atau mati pada waktu akan ditumbuhkan kembali, sedangkan saat itu isolat yang penting sangat membutuhkan host penumbuh. Hal tersebut dapat terjadi karena perubahan suhu tangki (sering dibukatutup) atau kebocoran pada tangki nitrogen .
20 1
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/
KESIMPULAN Kendala-kendala lain yang di sampaikan diatas merupakan faktor yang perlu diperhatikan mengingat unit TC merupakan salah satu penunjang keberhasilan penelitian bidang Virologi dimasa yang akan datang, dimana teknologi dan ilmu pengetahuan berkembang cepat dan bertambah canggih .
UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu drh . Lies Parede. MSc, PhD atas bantuan dan saran dalam pembuatan tulisan ini .
DAFTAR BACAAN ANONIM. 1978. Manual of veterinary Investigation laboratory techniques. 2"ded. Part 8. Virologi Ministry ofAgriculture Fishenis DAN Food. ANONIM. 1984. Manual of veterinary Investigation laboratory techniques. Vol . 1 : 172-187 . ANONIM. 1948. Difco Manual of Culture Media DAN Reagent . Difco Lab. Detroit, Michigan : 24, 218. PAUL, J. 1975. Cell DAN Tissue Culture. 5thed. Churchill, Livingstone . NY; 9,124. WOLFENDEN, J.P. 1982. A laboratory guide . AUIDP-ADAB, Canberra: 2-24. ANONIM. 1997. Prosedur kerja Virologi . Kelompok Peneliti Virologi, Balitvet.
Tentu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Lampiran enis Sel Lestari yang dipergunakan pada Unit Biakan aringan, Virologi Balitvet
Tabel 1 .
el
h.
enS
Hewan
Nama dagang
981
el ea18n
roster
Baby hamsterKidney 21
981
estan
onyet
983
el lestan
984
e Ieslan
apt
el lestad
onyet
11K(13)
arc - tsea e ' .lure IX' ( ./ Chicken Embryo, Vitm,blast (CEF) m""')
ngps
991
e lestad
Swtne estls S Fig Kidney IS (PKI5) .(. .Coy MLA
osla
Tabel 2. e primer
987997
e) primer
987997
e prmer
Tabel 3. Komposisi
Media
Growth is tunaImh ) c"GM
I
- -
' rh
" ,rm ulezky(~ur~6ies Virus hogcholera, virus AujesAy ((Psembrabies) - _ Rabies Malig nant Calanhal Fever (MCF)
aura
gang
Ipa al
e ur yam PF
Chicken Embryo Fi roblast (CEF)
Foetus
Bovine Kidney, Bovine Lung Bovine Testis Bovine Thymus Seep Kidney Sheep Thymus Sheep Testis Sheep Lung
Chicken Embryo Liver (CELT) Chicken Embryo Kidney (CEK)
api ambmg/ cmba
H.budT.i-M a .L.M nlwa....ir bin4.n a"LIOMiwaMn air ..a .l.m ...Im"n 2iwam .E
E
1 . ".
I "
aidmpna.i.m i.mw ."i. K .t6
am gene Itlan
Habis
Infectious Bursal Disease (I BD) Reo vin. Infectious Laryngo Traeheitis (ILT), Egg Drop Syndrome'76 (EDS'76) ILT, Infectious Bronchitis (IB) Infectious Bovine Rhinotracheuls (IBR) Bovine Virus Diarrhea (BVD), Bovine Retrovirus, Bovine Leukemia Virus Orf, IBR Bovine Retrovirs, Bovine Leukemia Virus BVD IBR
Habis Habis Habis Habis Habis Habis Habis Habis Habis
Berbagai Komposisi Media yang dipergunakan pada Unit Biakan Jaringan, Virologi Balitvet
L
FBS
I
L.giuumin
~-
Anlibiofk
eusvep, allamycm (ienWmyCm Pehslrep.Karamycin Genlamycin
PMi 16th utoclavable - .1 .I
easvep, mycm Crcntamycin .
_
"tley°wldn IIM43glPa,m1 ; K."my .i n
511 M6 ;
-
Iw/ rviti .s . I . Pnnstrcp.Karlamyein edium Gcntamycin Media Penyanggah= MM Mempunyat knm[M,sisi yang soma, kecuali karMlungan FBS2% I'vti."Go IIM6BMI III,
" d"na aiP"6i
Jenis Sel Primer yang dipergunakan pada Unit Biakan Jaringan, irologi Balitvet ewan
981 ekarang
'
mlaVtrus A Newcastle Ilk," disease (ND)
I~~~~~,SRflR,T1~1;R7.T1Fr7RfIPfTl(~t7F5T :' a
=a al°"bl i.inVI" mniwaw ."b i" ilm ..a.liwsm . "I, ".a"n a' " W m ..a.l" .n nI--
In ecltous Bovine none elas HR ; Bovine Vns Diarrhea (H VD); Partial- type 3 (P13) Rabies BT; BFF ties AntitM,di Momklonal um vdlnleellouc anal Disease IBD) -_
Bovine Turbinate HT Baby hamster Kidney C13 Baby Hamster Lung(BHL) Neun aston,a r Myloma (Sp2) .M Baby GreenMonkey
roster
eterangan
am penehfan
Blm Tongue T ,Bovine Ephemeral Fever Fs Adx,Mrus (Pennlaran lewal gtgilan Iryamuk) BT. BFF,IneenowtaryngoTracheills (I LT), ujeszky (Pseullorahies)
Veto
tell 984
Dlpa ,
11K 21
-y.i n
511 pt
ABC
i
Hepes 7PB
OP1
HT/HAT
NEAA DMSO
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5,fi~ I%Jari (stok) IM
-
-
-
-
-
, : (stock
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Tabel 4.
Kendala, Dampak dan Solusi pada Unit Biakan Jaringan, BALITVET
Perihal
Kendala
Ruangan
Fumigasi
Binharard W ater ut
eFa filler odak berfungsi,Imnpu IN malt Temp ru. ' ; n k sta i eeepatan u
Centrif4a Mikms rrp
ampu matt Ixnsa kotor bebamur any trmga es ; peniinginan lidak tepat; penuh lum a to ms; such unr (kunr)
Kulkas A al-a at dan peangkat filter (senrrlfus) is uan larutan
Penyiapan n Penyi-Farun Scl
teem
j
Alasan
I.upa.Baban abis, iturtda Terlewat Rusak; Filter lidak berlunger normah 'ridak pemah diganti A at ,udah tea
Konlaminasi
Bet yang tram
er¢ak protein & bahan reagent nyak malt karemi pularan
Sel lidak lerlihatjelas
sasm
Solusi
J-axxetahmi
Su
Alai sudah 1 . Alai sudah Iw . lampu cad-g Perlu iservis Terlalu keeiI Tidak uiperhitun Jmnl pecah ; kegiatan meningkat
Dampak
Konlaminst
Daya aktif maWn menurun Mer-ak kandungan protein Tidak siap antri ; pemtrdaan ketja;
e alai-FaFuarsa; FBS lertglas ; Air yang Irennutu rendah; reagin pelengkap lidak ,elalu tersedia
Kareru barang import dare Pen . terlambat ;
Kontamirusi; penundaan keja : ref tidak tumhuh baik
htok to x xteri kurang; harmsya nahal; -7u°I' dan lank Nivogen cair Ixnuh ; Nitmgen cair sering kering
Tuhe B-g imlxr dan Pen. Terlamlvai, kelraxtran tank Nimtgen air
Se su it tumMih imtuk Setrrolayer. Pentudaan keja ; Ieslari mahal
Pertai i Punya lebih dart satu Pert.t is Puny. ebi dan satu Serns mti-; e iki; Punya lebih dart salu Per i i Ptmya lebih dad 5alu Beli bam ;jmnlah ditamlwh
Dana cadangan harux lersedta selxlum dan Pim. Cav; Stok media dan FBS dice-karr dengan arts keja . Perlaiken dan -Wmen -7U°(: ; Nitmgen cair hams selalu tenedia
