Szabadgyök-reakciók és az antioxidáns rendszer gasztroenterológiai betegségekben és diabetes mellitusban
dr. Szaleczky Erika
Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető:
Dr. Prónai László Ph.D. Dr. Somogyi Anikó Ph.D.
Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A hepatológia szabadgyökös és immunológiai vonatkozásai 2000
1
Tartalomjegyzék
oldal
Bevezetés
3
A nitrogén-oxid és a peroxinitrit
5
Az oxidatív stressz és a daganatok kialakulása
6
Az oxidatív stressz és a diabetes mellitus
6
A szabadgyökös reakciók vizsgálatának lehetőségei
8
Célkitűzések
9
Irodalmi háttér
12
1. Szabadgyökök és antioxidánsok
12
2. Az antioxidáns védelem
12
2.1. Az antioxidáns enzimek
13
2.2. A nem-enzimatikus antioxidáns védelem
14
2.2.1. Antioxidáns vegyületek
14
2.2.2. Antioxidáns tulajdonságú vitaminok
15
3. A nitrogén-oxid
17
3.1. A nitrogén-oxid biokémiája
19
3.2. A nitrogén-oxid bioszintézise
20
3.3. A nitrogén-oxid molekuláris hatásai
22
3.4. A nitrogén-oxid fiziológiás és toxikus hatásai
22
3.5. A citosztatikus és citotoxikus nitrogén-oxid
23
3.6. A nitrogén-oxid szerepe az immunitásban és a gyulladásban
24
3.7. A nitrogén-oxid fiziológiás és patofiziológiás szerepe a gyomor-bélrendszerben
24
3.7.1. NO felszabadulás a gyomor-bélrendszerben
25
3.7.2. Az NO és a nonadrenerg, nonkolinerg (NANC) beidegzés 25 3.7.3. Az NO és a gyomor-bélnyálkahártya védelem
27
3.7.4. Az NO szerepe bélbetegségekben
27
4. Az oxidatív stressz és a gyulladásos bélbetegségek
28
5. Összefüggések a cukorbetegség és a szabadgyökös folyamatok között
30
5.1. Etiológia
31
5.2. A prooxidáns és antioxidáns tényezők változásai a diabetest kísérő anyagcsere eltérések tükrében
33
5.2.1. Hiperglikémia-glikoziláció
34
5.2.2. Oxidált termékek
35
5.2.3. Diszlipémia
36
I
5.2.4. “Sorbitol pathway” - a poliol út 6. Az antioxidáns rendszer diabetes mellitusban
38 39
6.1. Az antioxidáns enzimrendszer változásai diabetes mellitusban
39
6.1.1. Elméleti lehetőségek az antioxidáns enzimek aktivitás változásaira diabetes mellitusban
39
6.1.2. Kísérletes és klinikai megfigyelések
41
6.2. Az antioxidáns vegyületek változásai cukorbetegségben
46
6.3. Az antioxidáns vitaminok koncentrációjának alakulása diabetes mellitusban
47
6.3.1. C vitamin
47
6.3.2. E-vitamin
52
6.3.3. A-vitamin
53
7. Az antioxidáns terápia lehetőségei diabetes mellitusban
53
7.1. E-vitamin
53
7.2. C-vitamin
53
7.2.1. Aszkorbinsav és protein glikáció
53
7.2.2. Kísérleti eredmények
54
Módszerek
57
(A) A gasztroenterológiai betegségekben szenvedők szabadgyökreakcióinak és antioxidáns státuszának vizsgálatakor alkalmazott módszerek
57
Betegek
57
1. Felső gasztrointesztinális kórképekben szenvedő betegek – plazmamérések
57
2. Felső gasztrointesztinális kórképekben szenvedő betegek szövetminta-mérések
58
3. Colorectalis carcinomában szenvedő betegek
58
4. Colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegek
59
5. Szöveti oxigén szabadgyök-scavengerek és a nitrát/nitrit szint vastagbél adenocarcinomában
62
6. Peroxinitrit kimutatása
62
Módszerek
62
1. Nitrát/nitrit meghatározás
62
2. Szuperoxid gyökfogó aktivitás mérése
63
3. Teljes szulfhidril tartalom meghatározás
63
4. Nitrotirozin meghatározás
64
II
5. Antioxidáns enzimmeghatározások
64
6. Plazma össz-scavenger kapacitás mérése
64
7. Fehérjemeghatározás
65
8. Statisztikai számítások
65
(B) A cukorbetegek antioxidáns védelmének vizsgálatakor alkalmazott módszerek
66
Betegek
66
1. Jól kontrollált 1. típusú cukorbetegek
66
2. Elfogadhatóan kontrollált 1. típusú cukorbetegek
67
3. A cukorbetegség időtartamának antioxidáns rendszerre gyakorolt hatásának vizsgálatában résztvevő betegek
68
4. Az intravazális antioxidáns védelem vizsgálatban résztvevő, inzulinnal kezelt cukorbetegek
69
5. 2. típusú, inzulinnal kezelt cukorbetegek
69
6. 2. típusú cukorbetegek plazma vitaminszintjének vizsgálata
70
7. 1. típusú cukorbetegek - plazma lipidfrakciók A és E vitamin koncentrációja
71
8. C vitamin pótlás vizsgálatban résztvevő cukorbetegek
71
Módszerek
72
1. Antioxidáns enzimek és vegyületek meghatározása
72
2. Vitaminszintek vizsgálata
74
3. Lipidperoxidáció meghatározása
75
4. Klinikai laboratóriumi paraméterek
75
5. Statisztikai számítások
76
Eredmények
77
(A) Oxigén és nitrogén központú szabadgyökreakciók és az antioxidáns rendszer vizsgálata gasztroenterológiai betegségekben
77
1. Emelkedett plazma nitrát/nitrit szint krónikus gastritisben és peptikus fekélybetegségben, összefüggés a Helicobacter pylori státusszal és a Helicobacter pylori eradikációval
77
2. Helicobacter pylori státusz és szöveti nitrát/nitrit szintek, szuperoxid gyökfogó aktivitás és szulfhidril csoportok peptikus fekélybetegségben vagy funkcionális dyspepsiában szenvedő betegekben
77
3. A plazma nitrát/nitrit szintek colorectalis carcinomában szenvedő betegekben
79
4. A plazma nitrát/nitrit szint és az antioxidáns védelem colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségekben
III
81
5. Colorectalis tumorszövet szuperoxid gyökfogó aktivitása, nitrát/nitrit és szulfhidril csoport tartalma
84
6. Peroxinitrit kimutatása colorectalis tumorszövetben
85
7. Antioxidáns védelem colorectalis daganatokban
86
(B) Az antioxidáns rendszer vizsgálata diabetes mellitusban
88
1. Intenzifikált inzulin kezelésben részesülő 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza
88
1.1. Jól kontrollált (HbA1c=6,06±0,48%) 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza
88
1.2. Megfelelően kontrollált (HbA1c=7,89±2,53%) 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza
90
2. A cukorbetegség klinikai fennállási időtartamának hatása a vér antioxidánsaira
91
3. Az intravazális antioxidáns védelem vizsgálata inzulinnal kezelt cukorbetegekben
92
4. A plazma redukált C vitamin és glutation szintje elfogadható anyagcsere - egyensúlyú cukorbetegekben
94
5. A plazma antioxidánsai - az antioxidáns vitaminok és a kis molekulasúlyú antioxidánsok - 2. típusú cukorbetegekben
95
6. A zsíroldékony antioxidáns vitaminok koncentrációja a plazma lipidfrakciókban hiperlipidémiában és 1. típusú diabetes mellitusban
100
6.1. Az E-vitamin koncentrációja hiperlipidémiában és 1. típusú diabetes mellitusban
100
6.2. Az A-vitamin koncentrációja hiperlipidémiában és 1. típusú diabetes mellitusban
101
7. Hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav szupplementáció hatása a glikozilált haemoglobinszintre
102
Megbeszélés (A) Oxigén és nitrogén központú szabadgyökreakciók és az antioxidáns rendszer vizsgálata gasztroenterológiai betegségekben
106
1. A plazma nitrát/nitrit szint magasabb peptikus fekélybetegségben és/vagy krónikus gastritisben - az emelkedés független a Helicobacter pylori státusztól vagy eradikációtól
106
2. Magasabb nitrogén-oxid koncentráció és alacsonyabb oxigén szabadgyök scavenger mennyiség Helicobacter pylori pozitív peptikus fekélybetegekből nyert gyomorszövetben
107
3. A plazma nitrát/nitrit szintek colorectalis carcinomában
107
IV
4. Emelkedett plazma nitrát/nitrit szintekhez alacsonyabb oxigén szabad gyökök elleni védelem társul colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségekben
109
5. Szulfhidril csoportok, szuperoxid gyökfogó aktivitás és nitrát/nitrit szintek colorectalis tumorszövetben
110
6. Nitrotirozin a tumorszövetben, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítéka colorectalis carcinomás betegekben
110
7. Csökkent plazma antioxidáns szintek colorectalis carcinomás betegekben
111
(B) Az antioxidáns rendszer vizsgálata diabetes mellitusban
113
1. Kielégítő antioxidáns védelem 1. típusú cukorbetegségben
113
2. A cukorbetegség klinikai fennállási időtartamának hatása a vér antioxidánsaira
114
3. Az intravazális antioxidáns védelem inzulinnal kezelt 1. és 2. típusú cukorbetegekben
116
4. A plazma redukált C-vitamin és glutation szintje elfogadható anyagcsere-egyensúlyú cukorbetegekben
116
5. A plazma antioxidánsai - az antioxidáns vitaminok és a kis molekulasúlyú antioxidánsok - 2. típusú cukorbetegekben
117
6. Lipidoldékony antioxidáns vitaminstátus a plazma lipidfrakcióiban hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben
118
6.1. E-vitamin koncentráció hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben
118
6.2. A-vitamin koncentráció hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben
118
7. A glikált hemoglobin szintek csökkenése hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav pótlás hatására egészségesekben és cukorbetegekben
119
Köszönetnyilvánítás
121
Irodalomjegyzék
122
V
Rövidítés-magyarázat jegyzék AA
aszkorbinsav
AI
aterogén index
ATP
adenozin-trifoszfát
BB
Bio Breeding
CAT
kataláz
CEA
carcinoembrionális antigén
cGMP
ciklikus guanozin-monofoszfát
DHAA
dehidroaszkorbinsav
DNS
dezoxiribonukleinsav
EDRF
endothelsejtből nyert relaxációs faktor
FAD
flavin-adenin-dinukleotid
FAM
flavin-mononukleotid
Gpx
glutation peroxidáz
Gred
glutation reduktáz
GR
glutation reduktáz
GSH
redukált glutation
GSSG
oxidált glutation
HDL
high density lipoprotein
Hp.
Helicobacter pylori
IDDM
inzulin dependens diabetes mellitus
LDL
low density lipoproteein
MDA
malondialdehid
NADH
nikotinamid-adenin-dinukleotid
NADPH nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NANC
nonadrenerg, nonkolinerg
NIDDM nem inzulin dependens diabetes mellitus NO
nitrogén-oxid
NOS ONOO
nitrogén-oxid szintáz -
peroxinitrit
SH
szulfhidril
SSA
szuperoxid gyökfogó aktivitás
SOD
szuperoxid dizmutáz
STZ
streptozotocin
TAS
teljes antioxidáns státusz
TBARS tiobarbitursav reaktív anyagok VIP
vazoaktív intestinalis polypeptid
VLDL
very low density lipoprotein
2
Bevezetés Évtizedek óta ismert és vizsgált a természetben és az emberi szervezetben
előforduló
reakcióképességű
párosítatlan
molekulák,
az
ún.
elektronokkal szabad
rendelkező,
gyökök
szerepe.
nagy
Számos
vizsgálat kutatta és kutatja ma is, hogy részt vesznek-e az egyes betegségek patogenezisében, vagy felszaporodásuk csak következményként kíséri-e a kórképeket. Munkánk
során
a
szabadgyökös
reakciók
egyes
résztvevőinek
vizsgálatát tűztük ki célul a populáció jelentős hányadát érintő két betegségcsoportban.
Kiváncsiak
voltunk,
vajon
a
szabad
gyökök
felszaporodását kísérő oxidatív stressz, valamint az azt egyensúlyban tartó
antioxidáns
védelem
hogyan
alakul
olyan
gasztroenterológiai
betegségekben, mint a peptikus fekély, a colitis ulcerosa és különösen a
vastagbélrák,
és
milyen
eltéréseket
találunk
1.
és
2.
típusú
cukorbetegség fennállása esetén.
A
klasszikus
antrum-nyálkahártya peptikus
peptikus krónikus
fekélybetegséget
gyulladásos
folyamatok,
a
fekélybetegség
a
mind
gyulladásával kiújulási a
gyomor,
elsősorban
az
társuló
folyamat.
A
hajlam
kiújulási
jellemzi.
hajlam
Mind
a
vonatkozásában
a
Helicobacter pylori infekciónak tulajdonítanak szerepet. Bár a kórkép előfordulása
a
fejlett
országokban
csökkenő
tendenciát
mutat,
megalapozott epidemiológiai adatok szerint még ma is a populáció 10%-a válik fekélyhordozóvá élete során (1). A
colitis
ismeretlen
ulcerosa
etiológiájú
idült
gyulladásos
bélbetegség. A gyulladásos reakció mélységében csak a nyálkahártyára lokalizálódik, kiterjedés szerint folytonos. Lefolyása során aktív és inaktív
periódusok
országokban kóros
váltakoznak
1-10/100.000
mértékű
tulajdonítanak
egymással.
lakos/év.
Patomechanizmusában,
felerősödésében,
szerepet
(2).
A
Előfordulása
immunológiai
nitrogén-oxid
és
a a
fejlett gyulladás
történéseknek
a
reaktív
oxigén
metabolitok szerepét az utóbbi években vizsgálják (3). A colorectalis carcinoma a nyugati országokban a leggyakoribb malignus vezető
betegség, halálok
és (4).
a
rosszindulatú Oka
folyamatok
ismeretlen,
egyes
között
a
adatok
második szerint
kialakulásáért az esetek közel 35%-ban az étkezési szokások tehetők felelőssé
(5).
Zsírban
és
húsban
gazdag,
3
valamint
rostban
szegény
étrend
jelentősen
keletkezésének colorectalis
megemeli
a
lehetőségét, rák
székletben
ami
rizikójának
a
ugyanakkor
emelkedéséhez
hidroxilgyökök
hozzájárulhat
(6).
A
a
gyulladásos
vastagbélbetegségek és a vastagbélrák közötti összefüggés ismert. A
diabetes
szindróma
mellitus
komplex
anyagcserezavar:
elsődleges a szénhidrát-reguláció felborulása, melyet azonban a zsír-, a fehérje- és a nukleinsav-anyagcsere zavara is kísér. A szindróma oka az abszolút vagy relatív inzulinhiány. Bár a hiperglikémia a diabetes mellitus minden megjelenési formájában megtalálható, mégis különféle eredetű,
eltérő
rendelkező,
genetikai
exogén
és
és
endogén
patofiziológiai kóroki
tényezőkre
vonatkozásokkal visszavezethető
szindrómát takar (7). Az elsődleges cukorbetegségnek két alapvetően különböző formáját, az 1. típusú vagy inzulin-dependens és a 2. típusú vagy nem inzulin-dependens diabetes mellitust különböztetik meg. Az aerob anyagcsere velejárója a reaktív oxigéngyökök képződése, ezért
az
ezen
életformát
folytató
élőlények
mind
rendelkeznek
valamilyen formájú antioxidáns védelemel (8). A szervezetben keletkező oxidáns - más néven prooxidáns - tényezők mennyiségét és minőségét egyrészt
magában
a
szervezetben
játszódó
anyagcsere
folyamatok,
másrészt külső hatások - pl. sugárzás, táplálék - határozzák meg (9). A
prooxidáns
felborulását
és
antioxidáns
tehát
az
tényezők
anyagcsere
közötti
folyamatok
egyensúlyi
állapot
megváltozása
vagy
környezeti hatások okozhatják.
Számos betegség patofiziológiájában feltételezik a szabadgyökök és
az
általuk
okozott
oxidatív
stressz
szerepét
(10),
azonban
e
folyamatoknak pontosabb megismerése, annak eldöntése, hogy az oxidatív stressz oka vagy következménye az egyes betegségeknek, még ma is a kutatás tárgya (11). Ezekben betegségekben a természetes antioxidáns védekezés
csökkenését
természetes károsodás
mutatták
ki.
antioxidáns
anyagok
csökkenthető,
és
A
kutatók
pótlásával ezzel
felvetették, esetleg
betegségek
az
hogy
a
oxidatív
progressziója
késleltethető (12). A
prooxidáns
tényezőkkel
szembeni
egyensúlyt
a
szervezet
antioxidáns védelmi rendszere biztosítja (13, 14); intracellularisan elsősorban
enzimek,
mint
a
kataláz,
a
glutation
peroxidáz
és
a
szuperoxid dizmutáz. Az enzimatikus antioxidánsok mellett számos nem
4
enzim molekula vesz részt az oxidáció elleni védelemben. A plazmában található komponensek közül - gyökfogó kapacitásuk és relatíve magas koncentrációjuk miatt - az albumin, a húgysav és a bilirubin tartható fontos antioxidánsnak. Annak ellenére, hogy ezeknek az anyagoknak a fő feladata
nem
a
gyökök
közömbösítése,
a
plazma
teljes
antioxidáns
kapacitásának 50-80%-t adják (15). További fontos antioxidánsok a plazmában sokkal kisebb koncentrációban jelenlévő - zsíroldékony Evitamin és béta-karotin, valamint a vízoldékony C vitamin (16, 17). A plazma
antioxidáns
kapacitásának
kisebb
hányadát
teszik
ki,
mégis
szerepük az oxidáció elleni védelemben jobban ismert, és valószínűleg élettanilag fontosabb (18, 19).
A nitrogén-oxid és a peroxinitrit A nitrogén-központú szabadgyökök alapmolekulája a nitrogén-oxid (NO),
mely
az
nitrogén-oxid
endothelsejtekben
szintáz
által
és
kis
a
neuronokban
mennyiségben
a
konstitutív
termelődve,
sejtvédő,
sejtreguláló (vazodilatáció, neuro-transzmisszió), míg az indukálható nitrogén-oxid citotoxikus
szintáz
(a
által
nagy
mitokondriális
koncentrációban
enzimek
és
a
légzési
termelődve, lánc
bénítása
révén) hatású (I). A közvetlen toxicitásért azonban nem az NO, hanem az
NO
oxigénnel
és
nitrovegyületei
szuperoxiddal
való
(nitrogén-dioxid,
reakciója
során
nitrogén-trioxid,
keletkező
peroxinitrit,
nitrózaminok) a felelősek. A
szervezetben
származékoknak
mutagén
etiológiájában makrofágok
(20).
nitrózó
képződő
szerepet
A
nitrózó
és
neutrofilek
interakciójából
keletkeznek.
vegyületeknek
tulajdonítanak vegyületek
által A
a
nitrit-
humán
rákok
nitrogén-oxid
termelt
fagociták
a
és
és
szuperoxid
valószínűleg
a
a
gyökök nitrózó
vegyületeket a daganatsejtek elpusztítására felhasználhatják, azonban e
vegyületek
képesek
a
reaktív
oxigén
intermedierekhez
hasonlóan
strukturális DNS változásokat indukálni. A peroxinitrit és a belőle származó
termékek,
deamináló,
nitráló
és
nitrolizáló
anyagoként
szerepelhetnek. E
nitrovegyületek
fiziológiásan rendelkező
is
közül
termelődő,
peroxinitrit
ma a
a
figyelem
hidroxilgyök
felé
fordult
az
endogén
úton
reakcióképességével
(21).
A
peroxinitrit
szuperoxidból és nitrogén-oxidból keletkezik, aktív biológiai oxidáns, mely
számos
molekulával
reagál,
tiolokat
5
oxidál,
lipidperoxidációt
iniciál, ioncsatornákat inaktivál, károsítja a DNS-t. A peroxinitritet a monocyták eredetileg a baktériumok elpusztítására termelik, de kóros körülmények
között,
mint
pl.
krónikus
gyulladásban,
képes
a
saját
sejtek DNS szintézisének károsítására is. A folyamatos sejtregenáció során
ezáltal
mutációk
sora
jöhet
létre,
s
ez
bizonyos
esetekben
malignus sejttranszformációhoz, tumor keletkezéséhez vezethet. A nitrotirozin in vivo a tirozin és a peroxinitrit reakciója során keletkezik. A nitrotirozin specifikus és stabil "footprint"-je a peroxinitrit és fenol gyűrűk, beleértve a fehérje asszociált tirozin maradékok in vivo reakciójának. Habár a nitrálás és a peroxinitrit szerepét
feltételezik
a
rák
etiológiájában,
eddig
nem
igazolták
és
nitrogén-
nitrotirozin keletkezését humán colorectalis daganatban.
Az oxidatív stressz és a daganatok kialakulása Az
oxidatív
központú
szabad
stressz gyökök
során
keletkező
egyaránt
fontos
oxigén-, szerepet
játszhatnak
a
daganatok kialakulásában (22, 23, 24). A reaktív oxigén és nitrogén -
vegyületek struktúrát
mint
a
karcinogének
véglegesen
átrendeződéseket, amplifikációkat
általában
megváltoztatni,
deléciókat, létrehozva,
-
pl.
1)
bázispár
inzerciókat
2)
képesek
DNS
mutációkat,
és
megváltoztathatják
a
szekvencia a
sejtszintű
jelátvitelt, 3) aktiválhatják a citoplazmatikus és a sejtmagban lévő szignál-transzdukciós foszfatázok
és
stresszproteinek
utakat
kinázok és
pl.
a
működését
gének
tirozin
nitrálása
gátolhatja
aktivitását
(25),
4)
befolyásolhatják,
a
tirozin és
olyan
melyek
a
növekedés, a differenciáció és a sejthalál szabályozásában résztvevő effektor génekhez tartoznak (26, 27, 28, 29).
Az oxidatív stressz és a diabetes mellitus A
cukorbetegség
fő
tünete
a
kórosan
magas
szérum
glükóz
koncentráció. A hiperglikémia oxidatív stresszt okoz a szövetekben és az
oxidált
szervezetben.
anyagok A
koncentrációjának
fehérjék
emelkedését
nem-enzimatikus
eredményezi
glikozilációjának
-
a más
szóval glikációjának - mértéke a glükóz koncentrációtól függ, és a jelenség vezet.
A
a
fehérjék
glükóz
strukturális
intracellularis
és
funkcionális
elhelyezkedése
a
megváltozásához relatíve
hosszú
élettartamú vörösvértestekben, és az erytrocyta membrán átjárhatósága
6
a glükóz számára a hemoglobint a megelőző 6-8 hét glükóz értékeinek jó becslőjévé
teszi.
A
hemoglobin
fiziológiás
glükóz
koncentráció
jelenlétében is glikálódik, de jóval nagyobb mértékben hiperglikémiás egyénekben.
A
plazmában
található
fehérjék,
így
az
albumin
is,
glikálódnak, de ez egy rövidebb időszak glükóz fluktuációját tükrözi. A
glikációt
a
glükóz
intermedierek
autooxidációja
termelődése
kíséri,
fokozza, így
és
reaktív
antioxidáns
oxigén
anyagokkal
befolyásolható lehet. Az érfal strukturális proteinjeinek glikációját olyan
reakciók
követik,
melyek
a
fehérjék
visszafordíthatatlan
megváltozásához
vezetnek.
Ezeket
a
nem-enzimatikus
glikozilációs
folyamatokat feltehetően a fehérjék oxidatív modifikációja kíséri. Ezt a
folyamatot
glikoxidációnak
is
szokták
nevezni
(30).
Glikoxidált
anyagok az öregedés alatt normálisan keletkeznek, de cukorbetegségben a
folyamat
felgyorsul,
mely
egyik
oka
lehet
az
erek
felgyorsult
öregedésének. A cukorbetegség - biokémiai szempontból - a felgyorsult kollagén öregedést is jelentheti. A glikoxidáció károsíthatja a sejtek DNS-ét, így szerepet játszhat a diabeteses szövődmények és a béta-sejt destrukció kialakulásában. A cukorbetegség hiperglikémiát
okoz,
ami
az
antioxidáns
nem
megfelelő
enzimek
kontrollja
glikoxidációjához
vezet, molekuláris biológiai szintű változásokat okoz, és kimeríti az antioxidáns kapacitást. Tehát a diabeteses szövődmények kialakulásában egy másik fontos tényező az antioxidáns rendszer gyengülése lehet. A
kóros
szénhidrát-anyagcsere
elősegíti
a
diabetes
késői
szövődményeinek kialakulását, melyek a cukorbetegség mindkét típusában feltehetőleg
azonos
glükózmolekula hypertonia) azonban
és
szabad
csak
patogenetikai a
társuló
gyökök
akkor
alapokon
egyéb
rizikó
indukálására
valószínűsíthető,
nyugszanak faktorok
képesek. ha
az
(9).
A
(dohányzás,
Toxikus
szerepük
antioxidáns
rendszer
károsodása kimutatható. A cukorbetegséget a prooxidáns és antioxidáns tényezők közti egyensúly felbomlása kíséri, és ez az oxidativ stressz szerepet játszhat a cukorbetegség szövődményeinek kialakulásában (9, 30, 31). A metabolikus folyamatok megváltozása cukorbetegség során az enzimatikus antioxidáns védelmet is befolyásolja, és ezek a változások szintén kapcsolatban lehetnek a diabetes késői szövődményeivel. A
cukorbetegséggel
megfigyeléseket
többnyire
és
az
oxidatív
jelentős
stressz-szel
hiperglikémiával,
és
kapcsolatos a
relatív
inzulinhiányt szükségszerűen kísérő valamennyi metabolikus változással rendelkező cukorbetegek
újonnan esetében
diagnosztizált tették.
A
vagy
rosszul
cukorbetegséget
7
a
kontrollált lipidperoxidok
felszaporodása oxidált
LDL
(32),
az
elleni
LDL
fokozott
antitestek
oxidációs
titerének
képessége
emelkedése
(33),
(34)
az
kíséri,
miközben az antioxidáns enzimek, mint a szuperoxid dizmutáz (35), a glutation
peroxidáz
aktivitása
gyengülhet
(36,
37).
Az
antioxidáns
vitaminok hozzáférhetősége is csökkenhet (38). Cukorbetegségben fokozott,
az
ateroszklerózis
patomechanizmusában
szerepet
kialakulásának
játszik
az
rizikója
oxidatív
stressz
(30, 31). A reaktív oxigén intermedierek hatásukat kifejthetik az LDL oxidálása,
az
endothel
kárositása,
a
vazomotilitás,
valamint
a
véralvadás befolyásolása révén. Az oxidált LDL-nek a „foam” sejtek kialakulásában tulajdonítanak szerepet, a szuperoxid anion/nitrogénoxid
arány
okozhatja,
eltolódása valamint
az
a
endothel
reaktiv
függő
oxigén
vazomotilitás
intermedierek
az
zavarát érfalat
közvetlenül károsíthatják.
A szabadgyökös reakciók vizsgálatának lehetőségei A
nitrogén-
(millisecundum),
és
és
a
oxigén-szabadgyökök kémiai
reakciók
rövid
féléletideje
bonyolultsága
miatt,
e
folyamatok és a betegségek összefüggésének vizsgálata még in vitro körülmények között is nehéz. Az in vivo folyamatoknál ezért többnyire e szabadgyökreakciók valamely többé-kevésbé specifikus végtermékének mérésére kell hagyatkoznunk. A
kis
nitrogén-oxid
vegyület,
ezért
in
vivo
mennyiségben
termelődését
termelődő,
nehéz
mérni.
nagyon A
reaktív
nitrogén-oxid
szintáz jelenlétének vagy hiányának kimutatása immunfestéssel széles körben alkalmazott módszer a nitrogén-oxid termelődésének elemzésére, de
human
szövetmintára
és
különleges
tárolásra
van
szükség.
Éhező
emberben, az endogén módon keletkezett NO és reakcióinak végterméke jól mérhető a plazma nitrát/nitrit szintjével (39). Korábbi méréseinkből ismert, hogy a fehérvérsejtek által termelt szuperoxid
mennyisége
fordítottan
arányos
a
plazma
ún.
szuperoxid
gyökfogó aktivitásával (40). A teljes szulfhidril csoportok mennyisége inverz összefüggést mutat a keletkező szuperoxid mennyiségével. A peroxinitrit, képződése helyén, gyorsan reakcióba lép az ott lévő
aminosavakkal.
A
tirozin
és
a
peroxinitrit
reakciójából
nitrotirozin keletkezik, mely specifikus, stabil, a többi aminosavtól eltérő abszorbciós spektrumú, és ezért jól mérhető molekula (41).
8
Célkitűzések Kutatásunk
tárgya
egyes
valamint
a
cukorbetegséget
egyensúly
tanulmányozása.
gasztroenterológiai (B)
Ezért
jellemző klinikai
betegségeket
(A),
prooxidáns-antioxidáns
vizsgálatainkban
mértünk
szabadgyökös paramétereket és az oxidatív stressz elleni védelemben szerepet játszó antioxidánsokat.
(A) A prooxidáns oldal jellemzésére a nitrogén-központú szabad gyökök jelenlétét indirekt módon vizsgáltuk, mérve a nitrát/nitrit szinteket, valamint megkíséreltük a nitrotirozin, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítékának kimutatását. A védekező rendszer tagjai közül számos antioxidáns enzim és kis molekulasúlyú vegyület koncentrációját határoztuk meg. Elektronspin rezonanciával meghatároztuk a szuperoxid gyökfogó aktivitást és kemilumineszcenciás
módszert
alkalmaztunk
az
össz-scavenger kapacitás meghatározására. Különböző betegségekben mért értékeinket
összevetettük
az
egészségesekével
és
az
eltéresek
betegség-specifikus voltát vizsgáltuk. (B)
A
cukorbetegség
mindkét
típusában
és
különböző
súlyosságú
anyagcsere-zavarban kerestük az antioxidáns rendszer egészségesektől eltérő
jellegzetességeit.
Egyaránt
meghatároztuk
az
antioxidáns
enzimek és a kis molekulasúlyú antioxidáns tulajdonságú vegyületek, valamint
az
A-,
E-,
C-vitamin
koncentrációját
a
plazmában.
A
zsíroldékony vitaminok szintjét a lipidfrakciókban is megmértük. Új összefüggéseket is kerestünk a diabetes típusa, súlyossága, klinikai időtartama, kezelése és a mért paraméterek között. Megvizsgáltuk az aszkorbinsav
kezelés
hatását
a
szénhidrát-anyagcsere
zavarának
mértékét jelző HbA1c szintekre. A következő kérdésekre kerestünk választ: (A) 1. a) Emelkedett-e a nitrogén-oxid szintézist tükröző plazma szint
nitrát/nitrit
peptikus
fekélybetegségben?
b)
Betegség
specifikus-e a plazma nitrát/nitrit szint változása vagy más felső gasztrointesztinalis
betegségben
nitrát/nitrit
változása
infekcióval?
szint d)
Van-e
hatása
is a
a
észlelhető?
Helicobacter H.
pylori
nitrát/nitrit szintekre (absztrakt: 7, 12).
9
c) pylori
Összefügg-e (H.
eradikációnak
a
pylori) a
plazma
2.
a)
Emelkedett-e
a
szöveti
nitrogén
és
oxigén
központú
szabadgyökök szintje H. pylori pozitív peptikus fekélybetegségben? b) A fekély helyére specifikus, lokalizált-e ez a változás? c) Változtate
a
H.
pylori
eradikációja
a
mért
értékeken?
és
d)
Keletkezik-e
meghatározása
colorectalis
peroxinitrit a fekélyszövetben (absztrakt: 20)?
3.
A
plazma
nitrát/nitrit
szintek
carcinomában szenvedő betegekben (XII) 4. A plazma nitrát/nitrit koncentráció, a szuperoxid gyökfogó aktivitás és a teljes szulfhidril szint összehasonlítása colorectalis carcinomás
betegekben,
colitis
ulcerosás
betegekben
és
egészséges
önkéntesekben (VIII, XIII, absztrakt: 15, 18). 5. Következő célunk annak megválaszolása volt, vajon változnak-e a
szöveti
oxigén
szabadgyök-scavengerek
és
a
nitrát/nitrit
szint
vastagbél adenocarcinomában (absztrakt: 21, 22).
6.
Kerestük
a
nitrotirozint,
mint
az
in
vivo
peroxinitrit
képződés bizonyítékát, betegekből műtét során eltávolított daganatos szövetekben és colitis ulcerosában szenvedő betegekből származó colon biopsiás mintákban. Választ kerestünk arra a kérdésre is, amennyiben keletkezik
nitrotirozin
szuperoxid
és
in
nitrogén-oxid
vivo,
vajon
termelődéssel
korrelál-e
emelkedett
colorectalis
carcinomás
betegekben? (VIII, XIII, absztrakt: 15, 17).
7.
A
természetes
szisztémás
vizsgálatuk
colorectalis
kerestük, hogy a
antioxidáns
carcinomában
rendszer
mely
része
védelem
szenvedő
tükrözi
eltéréseit
betegekben,
legjobban
a
és
betegség
súlyosságát (absztrakt: 4, 8).
(B) kezelt,
1.1. jól
Azzal
a
céllal,
kontrollált
hogy
az
intenzifikált
(HbA1c=6,06±0,48%,
átlag±SE)
inzulinnal 1.
típusú
cukorbetegség antioxidáns státuszra gyakorolt hatását tanulmányozzuk, összehasonlítottuk önkéntesekben glutation antioxidáns
a
1.
három
peroxidáz, anyagok
típusú fő
cukorbetegekben
antioxidáns
kataláz) szintjét
és
enzim
aktivitását, a
plazmában (IV, absztrakt: 11).
10
teljes
és
egészséges
(szuperoxid a
kis
antioxidáns
dizmutáz,
molekulasúlyú státuszt
a
1.2.
Következő
eltéréseinek részesülő
vizsgálatunk
tanulmányozása
1.
típusú
volt
célja
is
az
antioxidáns
intenzifikált
cukorbetegekben.
Ezúttal
inzulin
azt
védelem
kezelésben
vizsgáltuk,
hogy
megfelelő glikémiás kontrollal rendelkező (HbA1c=7,89±2,53%, átlag±SD) 1.
típusú
cukorbetegekben
találunk-e
eltérést
az
antioxidáns
enzimaktivitásokban vagy a plazma kis molekulasúlyú antioxidánsainak koncentrációjában (absztrakt: 24, 35).
2.
A
vizsgáltuk
cukorbetegség
az
antioxidáns
klinikai védelem
fennállási
különböző
idejének
hatását
összetevőire,
mint
a
vörösvértest szuperoxid dizmutáz és kataláz, a teljes vér glutation peroxidáz és a plazma teljes antioxidáns státusza, jól kontrollált cukorbetegek csoportjában (V, absztrakt: 10).
3.
Az
intravazális
antioxidáns
eltéréseit
védelem
vizsgáltuk
inzulinnal kezelt - 1. és 2. típusú - cukorbetegekben (absztrakt: 3).
4. A plazma redukált C vitamin és glutation szintjét határoztuk meg
elfogadható
anyagcsere
-
egyensúlyú
2.
típusú
cukorbetegekben
(absztrakt: 2). 5. kontroll tagjai
2.
típusú
egyénekben közül
a
diabetes
mellitusban
vizsgáltuk
plazmában
a
szenvedő
természetes
található
betegekben
antioxidáns
zsírban
és
és
rendszer
vízben
oldódó
antioxidáns vitaminokat és a jelentős koncentrációjú kis molekulasúlyú antioxidáns
anyagokat,
valamint
kapcsolatukat
a
szérum
lipid
szintekkel és egymással (VII, absztrakt: 13, 19).
6. A plazma és a lipoprotein frakciók (LDL+VLDL, HDL) E és A vitamin
koncentrációját
tanulmányoztuk
hiperlipémiában
és
intenzifikált inzulin kezelésben részesülő, 1. típusú cukorbetegekben (absztrakt: 23, 25, 26, 36, 37).
7. értékeltük
A
hosszú a
távú,
nagy
dózisú
szénhidrát-anyagcserére,
vizsgálatával (IX, absztrakt 1).
11
aszkorbinsav a
hemoglobin
pótlás
hatását
glikációjának
Irodalmi háttér
1. Szabad gyökök és antioxidánsok Szabad gyöknek nevezünk bármely atomot vagy molekulát, amely egy vagy több párosítatlan elektront tartalmaz. Ez a párosítatlan elektron megváltoztatja
az
atom
vagy
molekula
kémiai
reaktivitását.
A
szervezetben lévő molekulák túlnyomó többsége nem gyök, éppen ezért a képződő
szabad
reagálnak.
A
gyökök
nagy
reakció
valószinűséggel
eredménye
egy
nem
gyök
molekulákkal
láncreakció,
mely
során
újabb
gyökök keletkeznek. Antioxidáns bármely anyag, amelynek jelenléte - az oxidálható szubsztráthoz képest kis koncentrációban - késlelteti vagy meggátolja a szubsztrát oxidációját. A szervezet védelmét a szabad gyökök káros hatásai gyökök
ellen
számos
közvetlen
antioxidáns
enzim
hatástalanításával,
a
és
vegyület
biztosítja:
láncreakciók
a
megszakításával
vagy a már károsodott molekulák javításával (8). Az intracelluláris antioxidáns szuperoxid
védelmet dizmutáz,
elsősorban glutation
enzimek
szolgáltatják
peroxidáz
-,
mig
az
-
kataláz,
extracelluláris
térben különböző kis molekulasúlyú vegyületek - húgysav, aszkorbinsav, bilirubin közötti
stb.
-
biztosítják
egyensúlyt.
Oxidatív
a
prooxidáns
stresszről
és
antioxidáns
ennek
az
tényezők
egyensúlynak
a
felborulásakor beszélünk. A
reaktív
megfigyelték
szabadgyökök
(42),
játszanak-e,
azt
illetve
károsító
azonban, részt
hogy
hatását egy
vesznek-e
számos
betegségben a
betegség
betegségben oki
szerepet
kialakulási
folyamatában, óvatosan kell értékelnünk (11).
2. Az antioxidáns védelem Az védelem
aerob
anyagcsere
több
szinten
antioxidáns
hatású
lokalizációjának
során
keletkező
szerveződik.
vegyületek
biztosítása
és révén
Az
enzimek
reaktív
oxidánsok
elleni
antioxidáns
rendszer
az
megfelelő
szintjének
és
védekezik
a
kóros
szabadgyökös
hatások ellen. E rendszer károsodása több betegségben is igazoltan szerepet
játszik
magának
a
betegségnek
kialakításában.
12
és/vagy
következményeinek
2.1. Az antioxidáns enzimek Az
antioxidáns
biztosítják,
melyek
a
védelmet
a
sejten
keletkező
reaktív
belül
oxigén
főként
termékek
enzimek
lebomlását
katalizálják. A három fő antioxidáns enzim - a szuperoxid dizmutáz (SOD),
glutation
peroxidáz
(Gpx),
kataláz
(CAT)
-
szerkezetileg,
kofaktor igényükben és lokalizációjukban is eltérőek. Működésük során reaktív
oxigén
intermediereket
használnak
fel
szubsztrátként,
a
következő egyenletek szerint: SOD
O2-. + O2-. + 2H+
Gpx
ROH + 2GSH
CAT
2H2O2
--->
--->
--->
H2O2 + O2
ROH + H2O + GSSG
O2 + H2O
GSH és GSSG: redukált és oxidált glutation
Szuperoxid
dizmutáz:
a
szuperoxid
aniont
alakítja
hidrogén-
peroxiddá és oxigénné. A SOD aktivitást McCord és Fridovich 1969-ben fedezte fel, később bebizonyították, hogy az enzim szükséges az élet aerob körülmények között való fenntartásához (43). Több fajtája is ismeretes,
és
katalítikus MnSOD,
mindegyikben
centrumban.
valamint
a
legalább
Emberben rezet
egy
a
és
átmeneti
mangán cinket
fém
tartalmú
található
a
mitokondriális
tartalmazó
intra-
és
extracellulárisan található CuZnSOD-ok ismertek. Glutation
peroxidáz:
szelén
függő
enzim
(szelenoprotein).
A
plazmában található formája egy glikoprotein; a citoszólban, illetve a mitokondriumban rendelkezik.
található
Működéséhez
enzim
ettől
redukált
eltérő
glutationra
antigénstruktúrával van
szüksége,
így
közvetetten függ a flavoprotein glutation reduktáz, azáltal pedig a rendelkezésre katalítikus
álló
redukált
centrumában
egy
NAD(P)H
mennyiségétől
szelenocisztein
is.
Az
található,
enzim
mely
a
transzláció során épül a polipeptid láncba, a szelénhiány in vitro és in
vivo
is
enzimdefektushoz
vezet.
A
Gpx
specifikus
H
donort,
glutationt használ nem specifikus szubsztrátok (H2O2, lipid és nemlipid hidroperoxidok) redukálásához. Az enzimaktivitáson túl szükséges lehet a rendelkezésre álló GSH és szelén mennyiségét is vizsgálni. Kataláz: tartalmazzák.
ubikviter Feltehetőleg
enzim, a
eukaryotákban
peroxiszómális
13
a
oxidázok
peroxiszómák által
termelt
hidrogén-peroxidot bontja vízzé és oxigénné, katalítikus centrumában hemet tartalmaz. Közvetett módon ezeken kívül számos más enzim is részt vesz az oxidatív
károsodás
megakadályozásában
vagy
helyreállításában
(pl.
glutation reduktáz, NADPH termelés enzimei, DNS repair enzimei). A különböző sejttípusok és a sejtek kompartmentjei eltérő mennyiségben tartalmaznak antioxidáns enzimeket.
2.2. A nem-enzimatikus antioxidáns védelem 2.2.1. Antioxidáns vegyületek Az
enzimatikus
antioxidáns
védelem
mellett,
mely
elsősorban
intracelluláris védelmet biztosít, számos nem-enzim molekula is részt vesz
a
szervezet
megvédésében.
A
különböző plazmában
komponenseinek található
az
oxidációtól
molekulák
közül
való
gyökfogó
tulajdonságai és magas koncentrációja miatt jelentős antioxidánsok az albumin,
a
húgysav
és
a
bilirubin.
Bár
ezen
vegyületeknek
nem
elsődleges funkciójuk a szabadgyökök semlegesítése, a plazma teljes antioxidáns kapacitását vizsgáló módszerek szerint annak 50-80%-át e vegyületek adják (15). Húgysav: Már több mint 100 éve ismert mint a purin anyagcsere végterméke
a
főemlősökben,
szabadgyök-fogó
képessége
és
ezáltal
feltételezhető antioxidáns szerepe azonban csak a közelmúltban vált ismertté. A húgysav döntően a májban képződik a xantinoxidáz által katalizált szív-
reakció
és
során,
kimutatták
vázizomzatban,
a
azonban
vesében
az és
enzim a
aktivitását lépben
is.
Plazmakoncentrációját befolyásolja a vesén keresztüli kiválasztás és az étrend is. Bilirubin: antioxidánsok
A
bilirubin
közé
tartozik.
az Az
ún.
scavengelő
(lánctörő)
kötődött
zsírsavakat
albuminhoz
védheti a peroxidációtól. Albumin: Az albumin szabad SH csoportjai és réz kötése miatt preventív antioxidáns (44). Magas koncentrációja és nagy a turnovere ellenére
az
oxidatív
stressz
hatások
kiküszöbölésében
játszott
biológiai szerepe feltehetően csekély. Mivel a vas és réz ionok elősegítik a szabadgyökös károsodások kialakulását, antioxidáns
az
őket
szerepet
szállító
töltenek
be:
14
és a
raktározó ferritin
fehérjék
fontos
intracellulárisan,
a
transzferrin extracellulárisan köti a vasat, a cöruloplazmin a réz kötésével gátolja meg annak szabadgyökös reakciókban való részvételét. A
hemopexin
és
haptoglobin
a
hem
és
hemfehérjék
gyök
katalizáló
képességét gátolják.
2.2.2. Antioxidáns tulajdonságú vitaminok További
-
lényegesen
kisebb
koncentrációban
jelenlévő
-
antioxidáns vegyületek a lipidoldékony E- és A-vitamin, valamint a vízoldékony C vitamin. Bár az említett antioxidáns kapacitásnak csak kisebb
hányadát
védelmében
teszik
jobban
ki,
ismert.
részvételük
a
antioxidáns
vitaminok
Az
membránok
antioxidáns
struktúrája
és
funkciója különböző. A zsírban oldódó vitaminok, az E- és A-vitamin plazmakoncentrációja vegyes táplálkozás mellett egészséges egyénekben szűk
határok
között
mozog,
míg
a
vízben
oldódó
C-vitamin
koncentrációja nagymértékben függ az aktuális beviteltől. E*vitamin:
Az
E-vitamin
összefoglaló
elnevezése
különböző
vegyületeknek (45). A természetben nyolc izomert találtak, mely Evitamin
aktivitással
jellemzője,
melyhez
rendelkezik. szaturált
Négynek
a
oldallánc
tokoferol
csatlakozik,
szerkezet
a
négynek
a
tokotrienol szerkezet, melyhez 3-3 kettőskötést tartalmazó oldallánc kapcsolódik. Emberben a legjelentősebb biológiai aktivitású az RRRalfa-tokoferol. Az alfa-tokoferol lipidperoxil gyökökkel reagálva egy viszonylag stabil lipid hidroperoxid gyököt hoz létre, miközben nem reaktív
tokoferil
gyökké
oxidálódik,
és
ezzel
megszakítja
a
gyökreakciókat. Az E-vitamin jelen van a lipidekben, legjelentősebben a sejtmembrán lipidjeiben és a keringő lipoproteinekben. A zsírszövet legfontosabb antioxidánsának tartják, elsődleges védelemet biztosít a lipidperoxidációval semlegesítésében károsodás
a
szemben.
láncreakciók
limitálásával.
sejtmembránok
Jelentős
károsítása
Az elleni
szerepe
van
megszakításával
E-vitamin védelemben
a és
különleges játszott
szabadgyökök az
oxidatív
fontossága
a
kulcsszerepében
rejlik. Segít megelőzni a DNS károsodásokat is, melyek mutációkhoz vezetnek, és védi a low-density lipoproteineket (LDL) és más lipidgazdag alkotórészeket az oxidációval szemben (46, 47). Az LDL molekula belsejében a foszfolipideket védi (48). Antioxidáns funkcióját azáltal tudja
fenntartani,
hogy
az
E-vitamin
gyököt
a
vízoldékony
aszkorbinsav, a C-vitamin regenerálja oxidált formájából a biológiai membránokban.
Az
E-vitamin
hiány
a
15
vörösvérsejtek
alakváltoztatási
képességét és élettartamát csökkenti, ugyanakkor fokozza az oxidálódás lehetőségét és a vörösvérsejtek adhezív képességét (49). A-vitamin: konjugált
A
karotinok
kettőskötéseket
hosszú
izoprenoid
tartalmazó
molekulák,
láncrészből
és
melyek
telítetlen,
szubsztituált ciklohexángyűrűkből épülnek fel. Az antioxidáns hatást a kiterjedt kettőskötés rendszer adja. Több mint 500-féle fordul elő a természetben, található
főként,
az
emberi
(alfa-karotin,
mint
növényi
vérben
és
béta-karotin,
szövetekben
lutein,
legjelentősebb
a
béta-karotin.
prekurzorai
a
szervezetben
és
pigmentek,
de
értékelhető
zeaxanthin,
Bizonyos
csupán
mennyiségben
cryptoxanthin),
karotinok
A-vitaminná
néhány
képesek
az
a
A-vitamin
alakulni.
A
β-
karotinnak van a legmagasabb A-vitamin aktivitása. Egy béta-karotin molekulából
két
A-vitamin
molekula
keletkezik.
A
karotinok
hatásos
szinglett oxigén befogók. Lánctörő antioxidánsként is működnek, és a szabadgyök-támadás karotinok
a
által
okozott
lipoproteinek
oxidatív
belső
károsodást
magjában
a
limitálják.
A
koleszterin-észtereket
védik. A béta-karotin a lipidperoxidáció kivédésében a tokoferollal szinergizmusban
működik
(50,
51).
Fontos
megemlíteni,
hogy
e
vegyületek esetében az antioxidáns hatás csak másodlagos (52). A bétakarotin
és
más
A-provitamin
karotinok
csak
akkor
alakulnak
A-
vitaminná, ha szükséges. A karotinok iránti igény és felhasználásuk különböző lehet az egyén oxidatív statuszától függően. C-vitamin: A legfontosabb epizód a C-vitamin történetében 1928ban történt, mikor Szent-Györgyi Albert redukáló ágenst izolált tiszta formában a mellékvesékből, majd 1931-ben a paprikából (53). Az
aszkorbinsav
hat
szénatomos
ketonolakton,
strukturálisan
hasonlít a glükózhoz és más hexózokhoz. Az emberből, a majmokból, és a tengerimalacból hiányzik az a májenzim, mely az L-gulonolakton -> Laszkorbinsavvá
alakulásához
szükséges.
Ebből
következik,
hogy
táplálékkal bevitt C-vitamint igényelnek a skorbut megelőzéséhez. Az aszkorbinsav
reverzibilisen
dehidroaszkobinsavvá
oxidálódik
a
szervezetben. Mindkét formája aktív. Az
aszkorbinsav
a
vékonybél
felső
plazmakoncentráció a beviteltől függően 28µM
(0.5
mg/dl).
koncentrációját Egészséges
Gyakran
használják
felnőtt
a a
szakaszán változik.
vitamin szöveti
fehérvérsejtjeinek
szívódik Megfelelő
fel.
bevitel
fehérvérsejtekben szint
A
mért
reprezentálásához.
aszkorbinsav
koncentrációja
27µg/108 sejt. A napi aszkorbinsav szükséglet 60 mg egészséges felnőtt férfi és nő számára, függetlenül az életkortól (54), de néhány újabb
16
vizsgálat bevitelt
azt
sugallja,
(RDA)
200
hogy
mg-ra
a
jelenlegi
kellene
60
növelni,
mg-os
mely
ajánlott
napi
gyümölcsökkel
és
zöldségekkel fedezhető. A C vitamin biztonságos dózisa kevesebb, mint napi 1000 mg, és 400 mg-os napi adagoknak nincs bizonyított értéke (55). Az aszkorbinsav oxidációs-redukciós folyamatokban és hidrogénion szállításban vesz részt. Erős redukáló anyag, antioxidáns, különösen a lipid és vitamin anyagcserében, fontos szerepe van a tetrahidrofolát oxidáció
elleni
védelemben.
Ugyancsak
nélkülözhetetlen
számos
sejtfunkcióhoz. Az aszkorbinsav fokozza a nem-hem vas felszívódását a vékonybélben. C vitamin szükséges a kollagén anyagcserében, a kollagén bioszintézis zavarai felelősek a skorbut tüneteiért. Az aszkorbinsav részt vesz a karnitin bioszintézisben, a tirozin metabolizmusban, a sebgyógyulásban, immunfunkciókban és tagja
a
gyógyszer
metabolizáló
enzimrendszereknek. A C-vitamin első vonalbéli antioxidáns a plazmában (56, 57, 58). Legfontosabb feladata a plazmalipidek védelme a peroxidativ károsodás ellen, melyet peroxilgyökök okoznak. A C-vitamin vizes oldatokban a szuperoxid
anion,
scavengere.
peroxilgyökök
Scavengeli
mieloperoxidáz gyököket.
a
a
enzimnek.
hipoklór
Szintén
Megakadályozhatja
nitrózáló
anyagokból
és
valamint savat
scavengeli
szinglett
és
a
nitrózaminok
aminokból
a
oxigén
szubsztrátja
nitroxid
a
és
hidroxil
keletkezését,
melyek
alakulnak
ki.
Szinergisztikus
kapcsolatban van az E-vitaminnal: regenerálja az alfa-tokoferolt az alfa-tokoferil gyökből. Oxidatív stressz hatására mennyisége csökken dehidroaszkorbinsavvá
redukálódik.
Ebből
intracellulárisan a glutation regenerálja.
a
Egészséges
formájából szövetekben
a
dehidroaszkorbinsav általában azonnal visszaalakul aszkorbinsavvá. A magas aszkorbinsav / dehidroaszkorbinsav arány fenntartása az adott szövetben az egészséges állapot jelzője lehet (59).
3. A nitrogén-oxid A Science folyóirat felmérése alapján, a nitrogén-oxid (NO) az 1992-es év molekulája volt (60). Ez a kis, instabil, potenciálisan mérgező,
a
sejtmembránon
szabadon
diffundáló
gáz
a
sejtben
L-
argininből az NO szintáz hatására képződik. Az NO eltérő élettani és kórélettani
hatásai
sokféleségével.
Az
NO
magyarázhatók szintáznak
képződésének
például
17
és
emlősökben
lebomlásának legalább
három
izoenzime (neuronális, endotheliális és indukálható) ismert. Maga az NO
eltérő
hatást
koncentrációban toxikus
fejt
ki
savas,
termelődve
hatású.
Mind
a
neutrális
sejtvédő,
fokozott,
míg
mind
és
lúgos
magas a
közegben,
koncentráció
csökkent
NO
kis
esetén
képződésnek
lehetnek káros hatásai. Mint neurotranszmitter, az NO fontos lehet az ingerképzésben
és
termelődő
erős
NO
felszabadulva
a
tanulásban. értágító,
fontos
elpusztításában.
Kóros
Az
a
stimulált
szerepet esetben
endothelsejtekben
játszik
az
gyulladás, az immunfolyamatok és
NO-nak a
állandóan
fagocyta a
sejtekből
mikroorganizmusok
szerep
juthat
daganatképződés
a
krónikus
mechanizmusában.
Jelen ismereteink szerint az NO terápiásan felhasználható a pulmonális hipertenzió,
az
relaxációjának szintézis
agyi
keringészavar,
elmaradásával
gátlása
pedig
járó
segíthet
a
betegségek a
szeptikus
simaizom
záróizmok
kezelésében, sokk,
a
az
NO
hipotónia,
illetve a gyulladásos folyamatok esetén.
Régóta ismert, hogy a cigarettafüst és a szerves, ill. petróleum alapú
anyagok
lebontása
során
keletkező
égéstermékek
(autó-
kipufogógáz, ipari füst) nagy koncentrációban tartalmaznak nitrogénoxidokat (1. táblázat). Még
egy
oxidot
egyszerű,
csupán
egy
kicsiny,
évtizeddel
ezelőtt
instabil
is
mérgező
a
nitrogén-
molekulának
tartották, mely szerepet játszhat pl. a savas esők pusztító hatásában és az ózonréteg károsításában.
1. táblázat A nitrogén oxidált termékei
szimbólum
név
megjegyzés
NO•
nitrogén-oxid
szabad gyök
NO+
nitrozónium kation
nitrolizáló szer, enzimműködést szabályozó
NO
nitroxil anion
N2O-dá alakul
NO2•
nitrogén-dioxid
szabad gyök, erős nitráló szer
N2O
nitrogén-oxidul
altatószer
N2O3
dinitrogén-trioxid
erős nitráló szer
N2O4
-
dinitrogén-tetraoxid
NO2• dimér, erős nitráló szer
NO2
-
nitrit
savi pH-n NO• képződik belőle
NO3-
nitrát
stabil anion
18
Az azóta eltelt időszakban az NO-ról alkotott kép gyökeresen megváltozott (61). 1981 óta tudjuk, hogy az emberben is endogén úton keletkeznek nitrátok (62), s az 1987-ben tett felfedezés, mely szerint az
endothelsejtek
L-argininből
NO-t
szintetizálnak,
s
ez
azonos
a
korábban ismert relaxációs faktorral (EDRF), új fejezetet nyitott az NO történetében (63). Azóta kutatások sora bizonyította, hogy az NO fontos neurotranszmitter (64), résztvesz az értónus szabályozásában, a szervezet védekező folyamataiban, s szerepe van a tanulásban (65, 66).
3.1. A nitrogén-oxid biokémiája Az NO instabil, potenciálisan mérgező, gázállapotú szabad gyök, mely szabadon diffundál a sejtmembránokon keresztül (67). Féléletideje 3-5 másodperc, labilitása annak köszönhető, hogy oxigén jelenlétében gyorsan nitráttá és nitritté alakul (68).
2NO• + O2 ---> 2NO2•
2NO2• ---> N2O4
NO2• + N2O4
H O
2
H O
2
> NO2- + NO3-
> NO• + 2NO3-
NO• + NO2• ---> N2O3
H O
2
> 2NO2-
A vegyületek midegyike erős nitrolizáló (X-NO), ill. nitráló (X-NO2), s aminosavakkal
való
reakciójuk
során
potenciálisan
karcinogén
nitrózaminok képződnek; R2-NH + X-NO ---> R2N-N=O
Vizes
oldatban
az
NO
és
a
szuperoxid
(O2-)
a
diffúziós
konstans
sebességével reagál egymással és peroxinitrit (ONOO-) keletkezik. A peroxinitrit fiziológiás pH-n igen •
(OH )
és
nitrogén-dioxidra
(NO2•)
instabil, bomlik
le.
gyorsan A
oxidáló ágens, s direkt szövetkárosító hatású.
O2- + NO• ---> ONOO-
ONOOH ---> NO2• + OH•
19
hidroxilgyökre
peroxinitrit
erős
Az NO reaktivitása és tulajdonsága redox állapotától függ (69, 70) (1. táblázat). Az nitrogén-oxid (NO•) könnyen képez komplexeket hem metalloproteinekkel, elektrontranszport
mint
lánc
pl.
a
hemoglobin,
enzimeivel
is.
A
és
reagálni
nitrozónium
tud
kation
az
(NO+)
nukleofil vegyületekkel reagál, mint pl. az elektron gazdag bázisok és aromás vegyületek. A metallonitrozil vegyületek fiziológiás válaszokat (pl.
vazodilatáció)
közvetítenek
vagy
kóros
válaszokat
indukálnak
(például karcinogenezis). A nitroxil anion (NO-) élettani szerepe nem ismert (70).
3.2. Az nitrogén-oxid bioszintézise Az
NO
az
L-arginin
guanidin
csoportjának
terminális
nitrogénjéből keletkezik (71, 72). A reakciót a nitrogén-oxid szintáz (NOS) katalizálja, melynek eddig három izoenzimjét azonosították (73, 74) (2. táblázat).
20
2. táblázat A nitrogén-oxid szintáz (NOS) izoenzimei közötti különbség (75)
Eredet
Állandó NO szintáz
Indukálható NO szintáz
endothelsejtek
makrofágok
egyes neuronok
májsejtek
mastocyták
daganatsejtek
thrombocyták
endothelsejtek
mellékvesevelő
mezangiális sejtek
vese macula densa Ca++ -calmodulin
függő
független
NO termelés
átmeneti (percek)
késleltetett (órák)
kis mennyiség (pikomol)
nagy mennyiség (nanomol)
excitatorikus aminosavak
lipopoliszaharidok
acetilkolin
néhány interleukin
ATP,ADP
tumor nekrózis faktor
Aktivátorok
thrombin bradikinin, histamin leukotriének nem ismert
Gátlószerek
glükokortikoidok
Emberben az izoenzim I (idegsejtekben és epithelsejtekben), II (makrofágokban) és III (endothelsejtekben) három különböző gén által kódolt
a
12-es,
17-es
és
7-es
kromoszómán
(76).
A
három
izoenzim
aminosav-szekvenciája kevesebb, mint 59%-os egyezést mutat. Mindegyik izoforma L-arginint és molekuláris oxigént használ szubsztrátként és NADPH-t, tetrahidrobiopterint, FAD-ot és FAM-ot igényel kofaktorként. Mindegyik
köt
calmodulint
és
tartalmaz
hemet
(77).
Az
I
izoform
állandóan jelen van a központi és perifériás idegsejtekben és bizonyos epithelsejtekben. Aktivitását Ca++ és calmodulin szabályozza. Funkciója a
szinaptikus
transzmisszió
hosszú
távú
regulálása
a
központi
idegrendszerben, a vérnyomás központi szabályozása, simaizom relaxáció és vazodilatáció a perifériás idegeken keresztül. Az NO szintáz II izoform számos ismert.
expresszióját sejtben. Az
NO
lipopoliszacharidok
Jelenleg szintáz
II
egyfajta független
21
és
indukálható a
Ca
++
citokinek
indukálják
izoenzim
szekvencia
koncentrációtól
és
nagy
mennyiségű NO-t termel, melynek citosztatikus hatása van a parazita célsejtekre
azzal,
hogy
gátolja
vas
tartalmú
enzimjeiket
és
DNS
fragmentációt okoz. Az indukált NO szintáznak szerepe van az autoimmun betegeségek és a szeptikus shock patofiziológiájában. Az izoform III főleg
az
endothelsejtekben
található.
Expressziója
állandó,
fokozható például az érben fellépő nyíróerővel. Aktivitását Ca
++
de és
calmodulin szabályozza. Az endothel sejtekből felszabaduló NO tartja az ereket dilatált állapotban, gátolja a thrombocyta és fehérvérsejt adhéziót,
valamint
feltételezhetően
a
vaszkuláris
simaizomsejt
proliferációt (78). Működését
tekintve
a
három
izoenzim
alapjában
két
csoportra
osztható, az állandóan kis mennyiségű NO-t termelő és az indukálható (nagy mennyiségben NO-t termelő) izoenzimekre (75) (2. táblázat).
3.3. A nitrogén-oxid molekuláris hatásai - A guanilát cikláz aktiválása A
vaszkuláris
endothelsejtekben
keletkező
NO
gyorsan
a
simaizomsejtek membránjába diffundál és a szolubilis guanilát cikláz hem
alegységéhez
miközben
az
kötődik.
Ez
intercelluláris
simaizomszövetben.
A
NO
a
a
c-GMP
kálcium +
Na -K
+
szint
emelkedéséhez
koncentráció
pumpát
is
csökken
aktiválja,
ami
vezet, az
ér
az
ér
simaizomsejt membrán átmeneti hiperpolarizációjához vezet. Az
NO
magyarázhatóak.
citotoxikus
hatásai
A
tumorsejtekre
makrofágok
különböző
mechanizmusokkal
kifejtett
toxicitása
NO
felszabadulással függ össze, mely gátolja a tumorsejt mitokondriális enzimeit, pl. a cisz-akonitázt és a NADH-szukcinát oxidoreduktázt. Az Fe-S proteineket tartalmazó mikrobiális enzimekkel való interakció is felelős az antimikróbás hatásért. A nukleinsavak nitrolizálása, mely a DNS
láncok
törését
okozza,
citotoxicitást
okoz.
Szövetkárosodást
peroxinitrit anion is okozhat.
3.4. A nitrogén-oxid fiziológiás és toxikus hatásai Az NO fiziológiás és toxikus hatásait a 3. táblázat foglalja össze.
22
a
3. táblázat. Az NO fiziológiás és toxikus hatásai
Fiziológiás hatás
Toxikus hatás
Felszabadulás
gyors, átmeneti (pikomol)
lassú, késleltetett (nanomol)
Kiváltás ingere
emelkedett ciklikus GMP szint
massziv ciklikus GMP emelkedés NO tartalmú szerek (tionitrátok) (RS-NO) nitrozil-vas komplexek (Fe(NO)2(RS)2
Biológiai hatás
vazodilatáció
lassú vazodilatáció
thrombocyta adhézió és aggregáció enzimekkel való interakció (pl. gátlás
mitokondriális
neurotranszmisszió
lánc bénítása)
enzimek,
légzési
citotoxicitás megváltozott immunválasz GMP: guanozin monofoszfát
3.5. A citosztatikus és citotoxikus nitrogén-oxid Az
aktivált
makrofágok
NO-t
szintetizálnak,
melyből
spontán
nitrit és nitrát keletkezik (79, 80). Ez a folyamat, mely L-arginin függő és bizonyos L-arginin analógokkal gátolható, felelős ezeknek a sejteknek a tumorsejt és baktérium ellenes aktivitásáért. Az NO okozta citotoxicitás biokémiai alapja az NO reakciója a respiratorikus folyamat és a DNS szintézis vastartalmú kulcsenzimeivel (81, 82). Indirekt
bizonyítékok
állnak
rendelkezésre
NO
képződésére
L-
argininből human makrofágokban, alveoláris makrofágokban és perifériás vérben lévő monocytákban (83). NO termelés folyik a human neutrophil sejtekben
is.
Az
NO
szuperoxiddal
történő
reakciója
során
-
toxikus
peroxinitrit képződik (ONOO ). Ez a sejtmembránon szabadon diffundálva citotoxikus szerepet játszhat a programozott sejthalálban is.
23
3.6. A nitrogén-oxid szerepe az immunitásban és a gyulladásban Több
mint
daganatokkal
egy
évszázada
szembeni
ismert
rezisztencia
nem
az
a
jelenség,
specifikus
módon
hogy
a
fokozható
bakteriális termékekkel, s ez a makrofágok aktivitásával kapcsolatos (84). Jelenlegi adatok
azt
feltételezik,
hogy
ez
a
nem
specifikus
immunitás az NO szintáz indukciójával függ össze. Egyre több adat van arra, hogy az NO-nak szerepe lehet az akut és
a
krónikus
gyulladásokban
(85).
NO
szintáz
inhibitor
adása
csökkenti a gyulladás mértékét patkányokban (86), mig L-arginin növeli azt. Immunkomplex okozta érkárosodás patkányok tüdejében és bőrereiben javítható
volt
NO
szintáz
gátlókkal.
Colitis
ulcerosában
szenvedő
betegekben az NO szintézis növekedett (87, 88), és NO szintézis gátlók javítják a kísérletesen létrehozott krónikus ileitist (89). Rheumatoid arthritises betegek plazmájában és synoviális folyadékában a nitrit koncentráció emelkedett (90). A máj Kuppfer sejtjei NO termeléssel válaszolnak endotoxin behatásra (91). Az
NO-nak
citosztatikus
szerepe
vagy
lehet
citotoxikus
a
szövetkárosításban,
lehet
nem
csak
hiszen
a
támadó
mikroorganizmusok, hanem az NO-t termelő és szomszédos sejtek számára is. Az önmagában is citosztatikus és citotoxikus NO reakcióba léphet oxigén
gyökökkel,
és
az
így
keletkező
molekulák
növelik
citotoxicitását (92).
3.7. A nitrogén-oxid fiziológiás és patofiziológiás szerepe a gyomor-bélrendszerben Számos
adat
áll
rendelkezésre
arról,
hogy
az
NO
a
gasztrointestinális rendszerben milyen szerepet tölt be. NO közvetíti a muscularis externa relaxációját, szabályozza a mucosa véráramlását, és ezzel részt vesz a mucosa védelmében, felel a záróizmok (cardia, Oddi-sphincter) gyulladásos incidenciájú
tónusának
bélbetegségek, vastagbél
fenntartásáért és
ezek
daganatok
(93,
tartós
94).
Szerepe
fennállásakor
patogenezisében
(95),
van
a
fokozott felel
a
májbetegségekben tapasztalt hemodinamikai változásokért, szabályozza a májsejtek működését és feltehetően közvetíti a hepatotoxicitást.
24
3.7.1. NO felszabadulás a gyomor-bélrendszerben
Nitrogén-oxid szintáz (NOS): Konstitutív NOS:
epitél sejtek, mastocyták, simaizom, neuronális sejtek
Indukálható NOS:
leukocyták, monocyták
Kémiai út:
nitrát (NO3-) redukció a gyomorban
Enzimatikus hasítás: denitrifikáló anaerob baktériumok a bélben Indukálható NOS a gyomor-bélrendszerben: Kiváltó tényezõk:
endotoxinok, gyulladásos bélbetegség okozta gyulladás
NO forrás:
leukocyta/monocyta/makrofág invázió (nmol mennyiségű NO), baktériumok?
Hatások:
- nyálkahártya hiperémia - gyulladás - nyálkahártya hiperszekréció - diarrhoe - az NO NANC-szerű hatása miatt - ileus - közvetlen citotoxikus hatás (citoszkeleton károsítás, ATP szintézis gátlás, a tight-junctio kitágítása) - permeabilitás növekedés
3.7.2. Az NO és a nonadrenerg, nonkolinerg (NANC) beidegzés
A
NANC
bélfali
gátló
neuronok
által
közvetített
simaizom
relaxáció fontos része a bél perisztaltikus reflexnek. A relaxáció patkány colon izolált darabjain létrehozható exogén NO adásával, és gátolható NO szintézis gátlókkal. Étel vagy folyadék gyomorba jutása proximális vezet.
Ezt
mediálja.
gyomor a
dilatációhoz
reflexet
Ugyancsak
NANC
NO
és
a
gyomor
neuronok
közvetíti
a
kapacitás
közvetítik, gyomor
és
a
az
növekedéséhez folyamatot
NO
alsó
oesophagus
gyomor
neuronális
sphincter vagus által közvetített relaxációját. NO
szabadul
stimulálásakor. valamint
a
Exogén
VIP/ATP
szintézis
fel
NO
szerü
gátlásával
Bauchin
billentyű
bevitel
hatást
hoz
és
a
gyomor-simaizom létre,
(N-nitro-L-arginin:
s
ez
L-NNA,
hyperpolarizációt gátolható
az
NO
N-nitro-L-arginin-
metilészter: L-NAME) vagy NO antagonisták adásával (pl. hemoglobin). NO szintáz kimutatható a myentericus plexusban és a bél idegsejtjeiben (NADP
diaforáz).
perisztaltikáját,
és
NO gyomor
gátolja és
a
jejunum
25
gyomor-bél ismételt
simaizmainak
relaxációját
hozza
létre, relaxálja a spinchtereket
(alsó
oesophagus
sphincter-cardia,
pylorus, Oddi-féle sphincter, Bauhin-billentyű, belső anusnyílás). Az epehólyag falában NADP diaforáz pozitív sejtek izolálhatók. A NANC
stimulálás
az
NO
képzésen
keresztül
gátolja
az
epehólyag
kontrakcióját (96). Fentiek alapján az NO-termelő idegek sűrűségének változása, az NO
termelés
megváltozása,
a
simaizmok
endogén
NO
iránti
érzékenységének megváltozása szerepet játszhat néhány neuromuszkuláris rendellenességben (4. táblázat).
4. táblázat Fiziológiás NO felszabadulás és a gasztroenterológiai betegségek
Betegség
NO felszabadulás
alsó oesophagus sphincter relaxáció zavara (achalasia)
csökkent
reflux oesophagitis
fokozott
gyomor-bél motilitászavarok
csökkent vagy fokozott
Oddi spinchter relaxáció zavarai
csökkent
Epehólyag kontraktilitás zavarai
csökkent vagy fokozott
Hirschprung kór (myentericus plexus hiánya)
csökkent
Az
achalasia
a
gátló
NANC
beidegzés
hiányának
vagy
csökkent
voltának eredménye. Achalasia esetén az NO szintáz hiányzik a gastrooesophagalis átmenet myentericus plexusaiból (97). Két beteg esetében, vizes oldatban befecskendezett NO gáz adásával bizonyítható volt, hogy a gastro-oesophagalis átmenet körkörös simaizom szövetének relaxációs képessége megtartott. Mivel a simaizom NO adásakor képes ellazulni, olyan szerek, melyeknek NO felszabadítás révén spazmolítikus hatásuk van, szerepet játszhatnak az achalasia korai kezelésében. A
Hirschpung
szintézisre.
Az
NO
betegség szintáz
jó
példa
hiányát
a
csökkent
mutatták
ki
vagy az
hiányzó
NO
aganglionos
szegmenthez tartozó plexusokban és izomzatban (98). Az NO komplett relaxációt okozott az ebben a kórban szenvedő betegből nyert colon szövetben. Miután a simaizom exogén NO hatására normálisan ellazul, új, bélszelektív NO generátorok kifejlesztése fontos kutatási feladat lehet a jövőben.
26
Más betegségek a hiperaktív L-arginin - NO rendszerrel lehetnek kapcsolatban.
Colitis
ulcerosában
a
colon
mucosaban
folyó
megnövekedett NO szintézis hozzájárulhat a toxikus megacolon esetében észlelt
csökkent
legalábbis
motilitáshoz
részben,
a
(99).
Amennyiben
megnövekedett
NO
a
hipomotilitás,
szintézisnek
köszönhető,
szelektív indukálható NO szintézis gátlóknak is terápiás szerepe lehet a gyomor-bélrendszerben.
3.7.3. Az NO és a gyomor-bélnyálkahártya védelem
Az endogén mucosális NO felszabadulás (1-5 nmol/g szövet/perc) védi
a
gyomor-
szabályozza
a
vérármalás
és
bélnyálkahártyát.
gyomor-
és
Megakadályozza thrombocyták
a
egyaránt
károsodás
és
fehérvérsejtek
adhézióját
endogén
bélnyálkahártya
biztosításával
ischemia/reperfúziós
Az
és
a
vérellátását.
véd korai
az
a
és
Az
NO
ischemia,
endotoxin
kitapadását
aggregációját
neuronális
sokk
a a
ellen.
mesenteriumban, a
NO
a
monocyta/makrofág
rendszer aktiválódását (100). Az NO-t felszabadító gyógyszerek (pl. nitroprusszid
nátrium,
bélnyálkahártyát
nitroglicerin)
(mukozális
és
védik
vaszkuláris
a
hatás).
gyomor-
Az
NO
és
szintézis
gátlása (L-NAME 10-100 µmol/l mennyiségben) nyálkahártya-léziókat hoz létre (101). Fenti
jótékony
kismennyiségű duodenális szintáz
NO-nak
hatások
és
konstitutív
tulajdoníthatóak.
fekélybetegségben
expresszió
a
a
H.
azonban pylori
enzim
által
termelt
Helicobacter
pylori
pozitív
fokozott
az
eradikálásával
indukálható az
NO
NO
szintáz
expresszió csökkent (102).
3.7.4. Az NO szerepe bélbetegségekben
Colitis ulcerosában és Crohn betegségben fokozott az NO termelés a nitrát/nitrit szint mérések alapján. Ez magyarázhatja a fokozott folyadékszekréciót
és
súlyos
esetben
a
paralitikus
ileust
toxikus
megacolonban (103). Vastagbél adenomában és carcinomában progresszív módon csökken a konstitutív és teljesen hiányzik az indukálható NO szintáz expresszió. Ismertek olyan adatok, hogy a nagy mennyiségű NO gátolja a daganatok növekedését (104).
27
Idiopathiás krónikus obstipációban (5 betegben) csökkent volt a teljes neurondenzitás, ezen belül a VIP receptorszám alacsony, míg az NO szintáz receptorszám magas volt (105). A nitrogén-oxidnak a kardiovaszkuláris rendszerben és a tüdőben betöltött
szerepéről,
a
patológiás
nitrogén-oxid
felszabadulás
keringésre gyakorolt következményeiről, a nitrogén-oxid idegrendszeri, valamint
farmakológiai
hatásairól
és
a
terápiás
felhasználási
lehetőségekről esik szó az I. közleményben.
4. Az oxidatív stressz és a gyulladásos bélbetegségek A
colitis
ulcerosát
szövetkárosodást fagocitákból
elősegíthetik
felszabaduló
mennyiségben
képződő
enzimatikus
és
és
a
a
Crohn
betegség
mediátorok,
toxikus
oxigén
nem-enzimatikus
betegséget aktív
ezen
antioxidánsai
fázisában
belül
metabolitok
kísérő
a
jelentős
(106).
védelmet
a
A
sejtek
nyújtanak
a
fagocitákból felszabaduló oxidánsok semlegesítése révén a gyulladásos folyamat csökkenéséig. Krónikus gyulladásos folyamatok során azonban az antioxidánsok és prooxidánsok közötti egyensúly felborul, oxidatív stressz alakul ki. A
vékony-
és
vastagbél
krónikus
gyulladása
jelentős
oxidatív
stresszel jár. A betegséggel járó szöveti és működésbeli károsodást mérsékli
a
fagociták
funkcióinak
farmakológiai
vagy
immunológiai
gátlása (107, 108). Az
aktivált
fagocitákban
a
sejtmembrán
myeloperoxidáz enzimjei nagy mennyiségben (109). Ezek
(O2.-
NADPH
termelnek
oxidáz
szabad
és
gyököket
H2O2, HOCl, N-klóraminok) nemcsak citotoxikusak, de
számos más kárositó hatásuk is van: növelik a simaizomsejtek nyugalmi feszültségét, csökkentik azok kontraktilitását (108), kémiai reakcióik következtében mutagén hatásúak (108, 110). A hidroxilgyökhöz hasonló nagy
reaktivitású
gyökök
keletkezhetnek
a
hidrogén-peroxid
és
a
hemoproteinek kölcsönhatása révén. A keletkező hem és aminosav gyökök károsíthatják a lipideket, fehérjéket és szénhidrátokat (111). Mind
a
kísérletes,
mind
a
humán
vastagbél
gyulladás
aktív
periódusában fokozott nitrogén-oxid termelődés figyelhető meg (99). A nitrogén-oxid gyököket
és
oxigénnel oxidáns
és
szuperoxid
termékeket
tud
sejtkárosodásnak.
28
anionnal
képezni,
is
melyek
reaktív
szabad
közvetitői
a
A
közvetlen
hatások
mellett
a
neutrofilekből
felszabaduló
oxidatív termékek - a proteáz-antiproteáz egyensúly felborítása révén - kedvező környezetet teremtenek az elasztáz, kollagenáz és zselatináz enzimeknek, melyek károsíthatják az epitheliumot és az intersticiumot (112). Kemiluminometriás (113) és hisztokémiai (114) vizsgálatok is igazolták, hogy a gyulladt bélterületeken fokozott a reaktív oxigén gyökök
képződése.
Ezt
igazolta
az
aktív
gyulladásos
bélbetegségben
szenvedő betegek vastagbél biopsziás mintáiban kimutatott emelkedett lipidperoxid szint (115). A bél mucosa, submucosa és serosa kisebb koncentrációban
tartalmaz
antioxidáns
enzimeket
mint
a
máj,
ennek
megfelelően az aktív gyulladással járó gyökös folyamatok legyőzhetik a védekező
rendszert,
ami
a
sejtes
elemek
és
sejtközötti
állomány
oxidatív módosulását eredményezi (116). Ezért az antioxidáns kezelés hasznos
lehet
a
valóban
jótékonynak
intraperitoneálisan
gyulladásos találták (118)
bélbetegségekben. az
adott
Egyes
vizsgálatok
intramuszkulárisan antioxidánsokat.
(117) Egy
vagy
további
feltételezés, mely a reaktív gyökök bélgyulladásban játszott szerepére utal, az 5-acetilszalicilsav hatásmechanizmusa. Mivel a gyógyszer még a gyulladás által okozott nyálkahártya permeabilitás fokozódás mellett sem éri el a lipoxigenáz vagy a cicloxigenáz aktivitásának, illetve a monocitákból
való
immunglobulin
felszabadulásnak
a
gátlásához
szükséges koncentrációt az intersticiumban (119, 120), bizonyítható, hogy kifejezett antioxidáns és szabadgyök-fogó hatásán keresztül hat.
29
5.
Összefüggések
a
cukorbetegség
és
a
szabadgyökös
folyamatok között A
cukorbetegség
és
az
antioxidáns
védelem
hiányossága
között
több ponton is kapcsolat figyelhető meg. A diabetes etiológiájában és szövődményeinek
kialakulásában
is
igazolható
a
kóros
szabadgyökök
szerepe (31). Kóroki szempontból a hasnyálmirigy béta-sejtjeinek antioxidáns védelmét és a szabadgyökök mediátor szerepét tekintjük át a béta-sejt károsodásának kialakulásában. A
már
kialakult
következménye fokozódását
a
diabetesben
fokozott
vonja
glikoziláció,
magával.
zsíranyagcsere-zavar.
A
a
A
hiperglikémia ami
cukorbetegség
mennyiségi
az
oxidatív
másik
lipideltérések
fontos mellett
közvetlen károsodás eleme
a
minőségi
változások is megfigyelhetők: az LDL glikoziláció és oxidáció lényeges tényező
a
közvetett
diabeteses következménye
folyamat megváltoztatja
díszlipidémiában. a
megnövekedett
A
magas
szorbitol
vércukorértékek képződés.
Ez
a
az intracelluláris redoxpotenciált. Szintén
hatással lehet a prooxidáns-antioxidáns egyensúlyra a cukorbetegségben megfigyelhető
szöveti
eltérései
a
és
aszkorbinsav
mikroszomális
csökkenés,
monooxigenáz
a
fémion
rendszer
háztartás
aktivitásának
változása. A szabadgyökös folyamatok szerepét a diabetes és szövődményeinek kialakulásában az 5. táblázatban foglaltunk össze.
30
5. táblázat A szabadgyökös folyamatok szerepe a diabetes mellitus etiológiájában és szövődményeinek kialakulásában
KAPCSOLATOK AZ ANTIOXIDÁNS RENDSZER ÉS A CUKORBETEGSÉG KÖZÖTT etiológia ###elégtelen béta-sejt működés
- gyengébb antioxidáns védelem - szabad gyökök károsító hatása ###
relatív/abszolút inzulin hiány ###
következmények - hiperglikémia ###glikoziláció
###autoxidatív glikoziláció
- LDL glikoziláció -oxidáció
###diszlipémia
- fokozott szorbitol képződés
###redoxpotenciál változás
- aszkorbinsav metabolizmus megváltozik
###szöveti aszkorbinsav csökkenés
- eltérések a fémion háztartásban
###átmeneti fémek által katalizált folyamatok
egyensúlya megbomlik - monooxigenáz rendszer indukció
###fokozott szabad gyök képződés
5.1. Etiológia A
cukorbetegség
kísérletes
létrehozására
állatokban
már
évtizedek óta két - a Langerhans-szigeteket szelektíven pusztító vegyületet, az alloxant és a streptozotocint (STZ) használják (II). Az utóbbi időkben került felismerésre, hogy károsító hatásukban reaktív
31
oxigén gyököknek is szerepe van (121), ami felvetette a szabad gyökök etiológiai szerepét emberi diabetesben. Az alloxan toxicitása 3 tényezőn alapszik: 1. a vegyületet hatékonyan veszik fel a béta-sejtek 2. oxidált vegyületeket képez intracelluláris redukálószerekkel való reakciója révén 3. hasnyálmirigy szigetsejtjeiben a szervezet egyéb szöveteihez viszonyítva gyenge az enzimatikus antioxidáns védelem. A béta-sejteket vizsgálva azt találták, hogy közepes mennyiségű szuperoxid
dizmutázt,
viszont
alacsony
koncentrációjú
katalázt
és
glutation peroxidázt tartalmaznak. A különbség azonban nem elég nagy ahhoz,
hogy
megmagyarázza
specificitását,
azonban
a
szigetsejtre
minden
bizonnyal
toxikus
vegyületek
hozzájárul
a
sejtek
érzékenységéhez, és sérthetővé teszi azokat a gyulladással járó vagy a kemikáliák által okozott szabadgyökös károsodással szemben. A reaktív oxigén gyökök részvételét megerősíti, hogy az alloxan toxicitás in vitro és in vivo is gátolható kelátképző vegyületekkel (122),
hidroxilgyök-fogókkal
és
lipid
oldékony
antioxidánsokkal,
exogén szuperoxid dizmutáz (123) vagy kataláz bevitelével (124). A másik béta-sejt toxin, a streptozotocin hatásának mechanizmusa kevésbé
ismert.
A
többszörös
kis
dózisú
streptozotocinnal
indukált
diabetes kialakulása megakadályozható desferroxiaminnal (125), ami az átmeneti fémek által katalizált szabadgyök-reakciók szerepére utalna a STZ hatásában. Felvetették azonban a nitrogén-oxid és a prosztaglandin anyagcsere befolyásolásának lehetőségét is (126). Ionok által katalizált peroxidatív reakciók játszhatnak szerepet a transzfúziós siderosis, a diétás vas túlterhelés és az idiopátiás hemochromatosis hatására kialakuló cukorbetegségben is (127). Az
emberi
szolgáltatja
két
cukorbetegségnek állattörzs,
talán
melyekben
a
megfelelőbb
modelljét
cukorbetegség
spontán,
immunológiai mechanizmus révén alakul ki: a non-obese-diabetic (NOD) egér és a BB patkány (II). Kimutatható, hogy az antioxidáns hatású allopurinol,
dimetiltiourea
és
E-vitamin
késlelteti
a
diabetes
kialakulását, illetve annak incidenciáját ezekben az állatokban (128). Ez megerősítené a feltételezést, hogy az oxidatív károsodás a végső közös út a béta-sejt diszfunkció létrejöttében. Mások csak bizonyos antioxidáns
kombinációkat
találtak
kialakulásának hátráltatásában (129).
32
hatékonynak
a
diabetes
Bár Prevention
a
fenti
of
eredmények
Diabetes
állatkísérleteken
Mellitus
című
1994-es
alapulnak, kiadványa
a az
WHO IDDM
elsődleges prevenciójáról szóló része szabadgyök-fogó vegyületek pl. nikotinamid
alkalmazásának
lehetőségét
tárgyalja
a
bizonyítottan
genetikailag prediszponált egyéneknél (130) (1. ábra).
1. ábra Az IDDM primér prevenciója: szabadgyök scavengerek - pl. nikotinsav alkalmazása (WHO Technical Report Series 844, 1994)
A β-sejt oxidatív károsodása SOD, CAT, nikotinsav desferroxamin, Probucol
beta sejt
kevés kataláz katalase glutathion glutation peroxidáz peroxidáz
Alloxan
káros oxigén gyökök
Streptozotocin
oxidatív károsodás nem specifikus gyull
5.2. A prooxidáns és antioxidáns tényezők változásai a diabetest kísérő anyagcsere eltérések tükrében A diabeteses szövődmények kialakulásában valószínűleg lényeges az a tény, hogy a rosszul kezelt diabetes kóros anyagcsere állapottal jár,
és
ez
egyensúlyban.
lényeges A
hasonló
változásokat időtartamú
hoz és
létre
az
súlyosságú
antioxidáns cukorbetegség
egyénenként különböző mértékű szöveti károsodást okozhat (131), amire - egyebek közt - az egyénenként eltérő exogén és endogén antioxidáns ellátottság
is
magyarázatot
adhat.
A
következőkben
a
főbb
anyagcsereutak diabetest kísérő eltéréseinek szemszögéből vizsgáljuk a prooxidáns-antioxidáns egyensúly változásait.
33
5.2.1. Hiperglikémia-glikoziláció
A
szérumban
található
glükóz
fiziológiás
koncentrációban
is
kapcsolódik fehérjékhez, nem-enzimatikus reakciók során, - e folyamat a
glikoziláció.
tekinthető.
A
A
szérum
HbA1c
cukorbetegséggel
koncentrációja
járó
hiperglikémia
glikozilációs folyamatok fokozódását, 5%-nál alakulnak
ki.
fehérjékből
Az
(pl.
5%-ig
magával
magasabb
a
értékek
kitett
keringő
glükóz
koncentrációnak
IgG,
és
struktúrfehérjékből
a
vonja
HbA1c
emelkedett Hgb)
normálisnak
(arteriafal
kollagén, glomerularis bazálmembrán) Shiff bázisok, majd fluoreszcens ketoamin derivátumok, úgynevezett Amadori termékek képződnek. További kémiai
átalakulások
során
előrehaladott
glikozilációs
végtermékek
(úgynevezett AGEs = Advenced Glycosylation End products) alakulnak ki, melyek
a
hosszú
élettartamú
fehérjékhez
kapcsolódva
irreverzibilis
károsodást okoznak. A
szabad
gyököknek
a
fehérjék
glikozilációjában
játszott
szerepére utal, hogy révén
a
glükóz
molekula
autooxidálódhat,
átmeneti
fémek
hidroxilgyököket
által képez,
katalizált
reakció
fragmentációt
és
konformációs változásokat okoz a glikozilált fehérjékben. A jelenséget autoxidatív
glikozilációnak
nevezzük
(132),
eredményeként
glikoxidációs termékek képződnek (2. ábra). - IgG-t és más fehérjéket malondialdehid vagy közvetlenül oxigén gyökök hatásának kitéve hasonlóan fluoreszcencia figyelhető meg, mint az Amadori termékek képződésekor.
34
2. ábra Autoxidatív glikoziláció
Autoxidatív glikoziláció
glükóz glukóz
enediol gyök anion
enediol
O 2
M n+
M (n-1)+
fehérje
O2
ketoaldehid !
H2H2O2 O2
OH
O2
glikozilált fehérje glycosylált
glikoxidációs termék glycoxidációs termék Advanced Glycosylation End products
A
hiperglikémia
a
fenti
folyamatok
által
oxidatív
stresszt
jelent a szervezetnek és az oxidált termékek mennyiségének növekedését hozza létre. Mivel a glikoxidációs termékek az öregedés természetes folyamata figyelhető biokémiai
során
is
meg,
a
kialakulnak
és
diabetesben
cukorbetegséget
szempontból
-
úgy
is
ennek
meghatározhatjuk
mint
egy
olyan
felgyorsulása -
legalábbis
betegség,
melyet
a
kollagén felgyorsult öregedése jellemez (30).
5.2.2. Oxidált termékek Az oxidatív stressz mértékére az oxidatív károsodás mértékéből tudunk
következtetni:
az
oxidáció
termékeinek
képződési
sebessége,
egyensúlyi szintje és akkumulációjának mérése által. Legelőször Sato és mtsai mutatták ki, hogy diabeteses angiopátiás betegekben magasabb a plazma lipidperoxidok koncentrációja (133). Azóta számos vizsgálat megerősítette - kísérleti
állatokban
és
emberi
szabadgyök-reakciók termékeinek emelkedett voltát.
35
diabetesben
is
-
a
A
telítetlen
malondialdehid
(MDA).
lipidperoxidáció koncentrációt plazmájában találták
Ennek
és
kimutatása
meg
további
néven
igen
egyik
streptozotocin (134).
átalakulásakor
öregségi
pigmentet,
végterméke
hasznos
meghatározásához.
vörösvérsejtjeiben
MDA más
peroxidációjának
mértékének
figyeltek
az
termékeket,
zsírsavak
az
in
vivo
Emelkedett
diabeteses Szintén
a
MDA
patkányok
emelkedettnek
keletkező
lipofuszcin
cukorbeteg
patkányokban
(135). A fokozódott lipidperoxidációt humán vizsgálatok is igazolták. Noberasco
és
koncentrációját
mtsai
67
vetették
cukorbeteg össze
a
plazmájának
triglicerid,
malondialdehid
koleszterin,
HDL,
vércukor és HbA1c koncentrációkkal (32). A cukorbetegek csoportjában jelentősen emelkedett MDA szintet találtak, magasabb triglicerid, és HbA1c szintekkel egyetemben. A malondialdehid koncentráció a glikált hemoglobinnal mutatott jó korrelációt. A vörösvértestek membránjában megnövekedett malondialdehid koncentrációt írtak le, ami felelős lehet a sejtek csökkent élettartamáért, fokozott aggregáció készségéért és az endothelhez való kötődési hajlamukért (136, 137). Fentieket foglalja össze a 6. táblázat.
6. táblázat Oxidált termékek diabetesben
Oxidált termékek diabetesben Állatkísérletek - lipofuszcin mennyiség a vörösvértestekben " - vörösvértest membrán MDA szint " - plazma MDA koncentráció " Klinikai vizsgálatok - vörösvértest MDA tartalom "
glikozilált hemoglobin
- vörösvértest foszfolipid-MDA termék " - plazma MDA "
5.2.3. Diszlipémia Cukorbetegségben
a
szénhidrát
anyagcsere
minőségétől
és
a
cukorbetegség típusától függően változatos eltéréseket lehet észlelni
36
a szérum lipid paraméterekben (138, 139). Általánosságban a VLDL, LDL, chy frakciók emelkedése figyelhető meg. Ezen eltérések önmagukban is az
ateroszklerózis
rizikófaktorai,
cukorbetegségben
azonban
további
tényezőkkel is számolni kell: - az LDL érzékenysége az oxidációval szemben megnő (33) - az LDL glikozilálódik és oxidálódik (140) A
módosult
koleszterin
LDL
molekula
felvételét,
kemotaktikus toxikus
hatású, a
fokozza
a
makrofágok
simaizomsejtekre
és
a
fibroblasztokra (141). Ezen tulajdonságai révén szerepet játszik az ateroszklerotikus plakk kialakulásában (3. ábra).
3. ábra Diszlipémia diabetesben
Diszlipémia diabetesben
LDL glikoxidáció glycoxidáció
kemotaktikus hatás
módosult LDL
toxikus hatás simaizomsejt és fibroblasztra fokozott felvétel a makrof
=
Emelkedett
oxidált
LDL
koncentrációt
fokozott aterogenitá
mutattak
ki
diabeteses
állatokban és hipertrigliceridémiás cukorbetegekben. A lipidperoxidok in vivo jelentőségét igazolják Bellomo és mtsai vizsgálatai is, melyek arra utalnak, hogy az oxidált és az MDA által módositott LDL ellenes antitest NIDDM betegek plazmájában nagyobb titerben van jelen (34). Az LDL minőségi eltérései tehát magyarázatot adhatnak a cukorbetegségben megfigyelhető felgyorsult ateroszklerotikus folyamatokra.
37
5.2.4. “Sorbitol pathway” - a poliol út
Az emelkedett vércukorértékek eredményeként intracellulárisan is emelkedik glükóz
a
glükóz
felvétel
koncentráció
nem
azokban
inzulin-függő.
a
Így
sejtekben, például
melyekben a
a
diabeteses
neuropathia patogenezisében fontos szerepet tulajdonítanak a fokozott glükóz felvétel miatt előtérbe kerülő cukoralkoholok képződésének. Ha
az
egyszerű
redukálószerekkel karboxilcsoport alkoholok minden
vagy
reakció
emlős
megfelelő
specifikus
alkoholos
képződnek.
katalizált
cukrokat
A
során
szövetben
enzimekkel
hidroxilcsoporttá
glükóz
molekulából
szorbitol
körülmények
aldóz
keletkezik.
megtalálható,
ahol
redukáljuk,
alakul az
között
Az
és
a
polihidroxi
reduktáz aldóz
diabeteses
által
reduktáz
vaszkuláris
károsodás figyelhető meg, így a perifériás idegekben, a retinában, a glomerulusokban
és
a
szemlencsében.
A
folyamat
NADPH-t
igényel
kofaktorként (4. ábra).
4. ábra A poliol út
A poliol út GR
GSH
NADPH
glükóz " glukóz
AR
szorbitol " NADP
AR aldóz reduktáz reduktase AR:: aldóz GR:: glutation GR glutathionreduktáz reduktase GSH: redukált glutation GSH : redukált glutathion
A megnövekedett glükóz koncentráció következményeként a reakció egyensúlya vegyület
a
szorbitol
felhalmozódik,
képződés
irányába
szerkezeti
38
és
tolódik,
működési
a
sejtekben
zavarokat
okozva.
a A
fokozott
NADPH
felhasználás
jelentős
változást
okoz
a
sejt
redoxpotenciáljában, az intracelluláris redukált glutation hiányához vezet, ami gyengíti a sejtet az oxidatív stresszel szemben (142, 143). A
GSH
csökkenésnek
aszkorbinsav
szerepe
hiányban,
lehet
ugyanis
a
GSH-ra
cukorbetegeknél van
szükség
az
megfigyelt aszkorbinsav
dehidroaszkorbinsavból való regenerációjához.
6. Az antioxidáns rendszer diabetes mellitusban 6.1.
Az
antioxidáns
enzimrendszer
változásai
diabetes
mellitusban Elméleti
6.1.1.
lehetőségek
az
antioxidáns
enzimek
aktivitás
változásaira diabetes mellitusban A
cukorbetegséget
befolyásolják
az
kísérő
anyagcsere
antioxidáns-prooxidáns
eltérések
egyensúlyt,
több a
úton
mérleget
is a
prooxidáns tényezők javára billentve. -Indukció: válasz az oxidatív stresszre A szabadgyökök keletkezésének mechanizmusai: a glikoxidáció (30, 31), az intracelluláris NADH/NAD
arány
megváltozása
(hiperglikémiás
pseudohipoxia) (144), a prosztaglandin szintézis befolyásolása (145). Eukaryotákban az antioxidáns enzimek függ,
ilyenek
az
életkor,
szabályozása
hormonális
állapot,
számos
tényezőtől
szervspecificitás,
kofaktorok jelenléte (146). Oxídatív stressz hatására az antioxidáns enzimek expressziója fokozódhat (147), ezért feltételezhetjük, hogy a diabetest kísérő változások indukálhatják is ezen enzimeket. -Allosztérikus
hatások:
a
glikoziláció
befolyása
az
enzimműködésre A cukorbetegséget kísérő hiperglikémia elősegíti a glükóz nemenzimatikus
kötődését
a
fehérjékhez:
a
glikoziláció
szerkezeti
és
funkcionális változásokat okoz például a hemoglobinban, az albuminban, a szemlencse fehérjéiben, a vese glomerulusok bazálmembránjában, stb. A
magas
extra-
következtében
tehát
illetve
intracelluláris
glikozilálódhatnak
megváltozhatnak az antioxidáns enzimek.
39
és
glükóz
koncentráció
aktivitásukban
is
-Aktiváció-inaktiváció:
a
kofaktorok
koncentrációjának
változásai A SOD mangánt illetve rezet és cinket, a Gpx szelént, a kataláz pedig hemet tartalmaz kofaktorként. A diabeteses anyagcsere hatások e kofaktorok metabolizmusának megváltoztatása révén is befolyásolhatják az enzimatikus antioxidáns védelmet (5. ábra).
5. ábra Feltételezett interakciók a diabetes és az antioxidáns egyensúly között
- NADH/NAD arány növekedés - glikoxidáció
REAKTÍV ANYAGOK .
OH
H2O2
.
- cit P450IIe indukció - ciclooxigenáz aktiváció
O-.
DIABETES MELLITUS - hiperglikémia az enzimek
szabadgyökök
indukciója vagy inaktivációja
közömbösítése
- ketonémia - relatív inzulin deficiencia
CAT
SOD
- enzimek glikációja - GSH szintek csökkenése
GPx
- változás az ionszintekben: [Mn],[Se],[Zn],[Cu]
ANTIOXIDÁNS ENZIMEK
40
Az utóbbi évek vizsgálatai egyértelműen bizonyították, hogy a késői diabeteses szövődmények nagyobb valószínűséggel jelentkeznek, ha a
cukoranyagcsere
zavara
stressznek
szerepe
változásait
kell
súlyosabb
van
e
tudnunk
(148).
folyamatban,
megfigyelni.
Amennyiben az
Kérdés,
az
oxidatív
antioxidáns
rendszer
hogy
az
antioxidáns
rendszer működését a jó, illetve rossz szénhidrát anyagcsere egyensúly befolyásolja-e.
6.1.2. Kísérletes és klinikai megfigyelések
Szuperoxid dizmutáz: Hosszútávú kísérlet során Wohaieb a SOD aktivitás csökkenését figyelte meg
streptozotocin
cukorbeteg
patkányok
májában
és
veséjében,
ugyanakkor növekedett az enzim aktivitása a hasnyálmirigyben (149). Felvetette,
hogy
a
többi
szövethez
képest
alacsony
SOD
aktivitást
mutató pancreasban adaptív válaszként növekedik a SOD aktivitás, míg a májban
és
vesében
létrejövő
csökkenést
a
reaktív
oxigén
gyökök
közvetlen károsítása okozhatja. Négy hónapos kísérlet során Dohi nem talált különbséget streptozotocin cukorbeteg patkányok veséjének SOD aktivitásában
(150).
Matkovics
és
mtsai
a
tüdő
kivételével
minden
szervben (máj, vese, lép, agy, szív-, vázizomzat és hasnyálmirigy) SOD aktivitás csökkenést észleltek streptozotocin cukorbeteg patkányokban (151). Loven máj, vese és vörösvérsejt CuZnSOD-ot vizsgálva csökkent aktivitást talált 10 napos streptozotocin cukorbetegség után (152). Sukalski a máj mitokondrialis SOD aktivitásának csökkenését írta le (153). Cukorbeteg patkányok aortájában nem találtak eltérést a SOD aktivitásban (154). Kawamura és mtsai kimutatták, hogy a vörösvértest CuZnSOD in vitro és in vivo glikozilálódik és inaktiválódik, inzulin-dependens cukorbeteg gyerekekben pedig az inaktivált SOD nagyobb százalékban van jelen mint egészségesekben (155). Cukorbeteg egyének vörösvérsejt SOD aktivitásának
csökkenését
(151),
növekedését
(156),
valamint
változatlanságát is leírták (157, 158). Az extracelluláris SOD vizsgálata során szintén nagyobb arányban találtak
glikozilált
enzimet
cukorbetegekben
(159),
aktivitását
azonban nem találták a nem módosult enzimhez képest csökkentnek. A vizsgálatok azonban arra utaltak, hogy a cukor az enzim C-terminális végéhez
kapcsolódik,
s
így
csökkenti
annak
heparin
affinitását.
Ilymódon a sejtek felszínéhez kapcsolódó, azokat az extracelluláris
41
gyökökkel szemben védő aktív SOD mennyisége csökkenhet diabetesben, ezáltal érzékenyebbé téve a sejteket szuperoxid anionnal szemben. Glutation peroxidáz: Mukherjee követéses vizsgálat során 15 nap után a redukált glutation (GSH), 3 hét után a glutation reduktáz (Gred) szignifikáns csökkenését észlelte
streptozotocin
agyszövetében
és
cukorbeteg
vérében
(160).
A
patkányok
máj,
mitokondriális
vese
Gpx
és
és
a
Gred
aktivitásának csökkenését is megfigyelték cukorbeteg patkányok májában (153). Loven 10 nap után májban és az intestinális mucosaban vizsgálta a
GSH
tartalmat
hatására
a
(152).
májban
mucosában
nem
A
streptozotocinnal
szignifikánsan
volt
változás.
csökkent A
kiváltott a
cukorbetegség
glutation
jelenséget
tartalom,
oralisan
adott
a
GSH
mérsékelten javította, im. adott inzulin - mely a vércukorszintet is normalizálta
-
eredményezett
a
defektusára
a
kontroll
májban.
állatoknál
Vizsgálataik
Wohaieb
utalnak.
úgy
magasabb
közvetetten találta,
GSH
a
szintet
GSH
hogy
szintézis
az
egészséges
állatokban a magas Gpx és GSH tartalmú májban ezek aktivitása, illetve koncentrációja Kontroll
cukorbetegség
állatokban
a
során
Gpx
csökkent,
alacsony
szemben
aktivitást
a
vesével.
mutatott
a
többi
szervhez képest, cukorbetegekben pedig megnőtt a Gpx aktivitás (149). E változások inzulin adásával visszafordíthatóak voltak. Spontán diabeteses BB patkányok
vörösvértestjeiben
magasabb
a
Gred aktivitás. Alloxan diabeteses patkányokban emellett még a Gpx aktivitásának fokozódását is kimutatták (156). Hasonlóan fokozott Gred aktivitást
és
rezisztenciát jelenséget fokozott
a
a
GSH
találtak
peroxiddal 1.
hiperglikémia
NADPH
és
A
Gpx
típusú
miatti
termelésnek
tulajdonították.
2.
kiváltott
glükóz
csökkenése
elleni
cukorbetegekben kínálat
és
hatékonyabb
aktivitás
szignifikáns
is.
növekedésének,
GSH
A a
regenerációnak
csökkenését
észlelte
Dohi 4, illetve 8 hónappal a cukorbetegség indukálása után patkány aorta homogenizátumban (150). A plazma szelén tartalma magasabb volt a cukorbeteg
patkányokban.
endothelsejtjeiben változatlan
Gred
csökkent aktivitást
Tagami GSH
cukorbeteg
tartalmat
talált
(161),
és
Gpx
nyulak
aorta
aktivitást
Langenstroer
nem
és
talált
eltérést a Gpx aktivitásban (154). Blakytny
in
vitro
vizsgált
szarvasmarha
Gred
aktivitást
és
megállapította, hogy glükózzal, glükóz-6-foszfáttal és fruktózzal való inkubáció
az
enzim
aktívitást
időfüggően
csökkentette,
kísérlet alapján az enzim glikozilációja felelős (162).
42
amiért
a
Stahlberg cukorbeteg gyermekek vörösvérsejtjeiben csökkent Gred aktivitást
talált
(163).
Teljes
vérben
vizsgálva
a
Gpx
és
Gred
aktivitást, Walter és mtsai nem találtak különbséget cukorbeteg és nem cukorbeteg
egyének
között
Murakami
(164).
cukorbetegek
(éhomi
vércukor>140 mg/dl) vörösvértestjein végzett részletes vizsgálatokat: eredményei alapján a vörösvértestben megfigyelt GSH csökkenést és GSSG növekedést
annak
tulajdonítja,
hogy
a
gamma-glutamil-cisztein
szintetáz glikozilálódik és aktivitása csökken, továbbá csökken a Gred aktivitás, valamint a GSSG transzport (165). Yoshida megerősítette, hogy
rosszul
beállított
NIDDM
cukorbetegek
(HbA1c=10,6±1,3%)
vörösvértestjeiben a GSH szintézis és a tiol transzport károsodást szenved, s a sejtek érzékenyebbé válnak oxidatív stresszel szemben (166).
A
GSH
mértékét
szint
jellemző
beállított
negatív
HbA1c
korrelációt
szinttel
cukorbetegekben
mutatott
a
cukorbetegekben
(HbA1c=11,5±1,9%)
hiperglikémia
(167).
a
Rosszul
lipidperoxidáció
fokozottsága mellett kimutatható volt a GPx csökkent aktivitása és a GSH
szint
csökkenése,
retinopátiás tartalmat talált
cukorbetegekben
talált nők
a
elváltozás
kifejezettebb
csökkent
vörösvértestjeiben
vörösvértest
között,
Bono
(168).
cukorbetegek
különbséget
cukorbeteg
mindkét
Gpx
magasabbnak
GSH
találta
és
P-SH
Kaji
(157).
aktivitásokban
volt
nem
egészséges
viszont
a
plasma
és Gpx
aktivitását (158). Cser és mtsai magasabb szelén koncentrációt és Gpx aktivitást mértek cukorbeteg gyermekekben (169). Matkovics nagyobb Gpx aktivitást mért cukorbetegek vörösvértestjeiben (151). Kataláz: Tagami cukorbeteg nyulakban kataláz - valamint SOD, Gpx - aktivitás csökkenést figyelt meg aorta endothelsejtekben (161), az enzimértékek inzulin adásával helyreállíthatók voltak. Patkány aorta homogenizátum kataláz
aktivitását
vizsgálva
cukorbetegség
után
számolnak
(154).
cukorbeteg
be
(150),
nem
mások
Asayama
patkányokat,
Dohi
2
májukban
fokozott
hét és
talált
után
eltérést
kataláz vizsgált
veséjükben
4
hónap
aktivitásról streptozotocin
csökkent,
szívükben
fokozott kataláz aktivitást talált (170). Winkler 6 hét streptozotocin diabetest
követően
homogenizátumban. streptozotocin alloxannal,
a
kataláz
Mukherjee
cukorbetegség
illetve
csökkenését
átmeneti során
növekedést
patkányokban
streptozotocinnal
észlelte
kiváltott
máj
figyelt
(160).
3
diabetes
meg
hónappal után
a
hasnyálmirigyben és szívben fokozott, a májban és vesében csökkent kataláz
aktivitást
írtak
le
(149,
43
156).
A
vörösvértestek
kataláz
aktivitásában
sem
alloxannal
kiváltott
sem
spontán
cukorbeteg
pakányokban nem volt különbség. Hasonlóan Godin sem talált eltérést sem
1.
sem
aktívitásban.
2.
típusú
Matkovics
cukorbetegek streptozotoin
vörösvérsejtjei és
alloxan
kataláz cukorbeteg
patkányokban kataláz aktivitás csökkenést írt le a lépben, növekedést a
májban,
vesében
és
hemolizátumban.
Humán
vizsgálataikban
nem
találtak eltérést cukorbetegek és nem cukorbetegek között (151). Bono és
mtsai
nem
találtak
különbséget
cukorbetegek
és
egészségesek
vörösvérsejtjeinek kataláz aktivitásában (157). Kaji azonos eredményre jutott nők vizsgálata során (158). Az irodalomban fellelhető kísérletes és klinikai megfigyelések eredményeit a 7.a és 7.b táblázatokban összegeztük.
44
7.a táblázat Kísérletes eredmények
Állatmodellek vvt
SOD
Gpx
↓ Loven
teljes vér
Gred
CAT
↑ Godin
↑ Godin
= Wohaieb, Matkovics, Godin
↓ Mukherjee ↓,↓ b Dohi Tagami = Langenstroer
↓ Mukherjee = Tagami
endothel
↓ Tagami = angenstroer
máj
↓, ↓c Wohaieb Matkovics Loven Sukalski
↓, Wohaieb Sukalski
vese
↓ Wohaieb Matkovics Loven = Dohi
↑ Wohaieb
szív
↓ Matkovics
pancreas
↓ Matkovics ↑ Wohaieb
GSH
↓ Tagami
↓c ↓ Wohaieb Loven Mukherjee
↓, ↓c Sukalski Mukherjee
↓ Mukherjee
a
: az enzim heparin affinitása csökkent : a mérések teljes aorta homogenizátumból történtek c : mitokondriális enzimek SOD: szuperoxid dizmutáz, Gpx: glutation peroxidáz, GSH: glutation Gred: glutation reduktáz, CAT: kataláz b
45
↓ Tagami =b Dohi ↑ Langenstroer ↓ Wohaieb Godin Asayama ↑ Dohi Matkovics ↓ Wohaieb Godin Asayama ↑ Dohi Matkovics ↑ Wohaieb Godin Asayama ↑ Wohaieb Godin Asayama
7.b táblázat Klinikai eredmények
SOD
Gpx
Humán adatok plazma =a Adachi vvt ↓ Matkovics = Bono, Kaji ↑ Godin teljes vér
↑ Kaji, Cser ↓ Uzel = Kaji ↑ Matkovics = Walter
GSH
Gred
CAT
↓ Bono Murakami Jain Uzel
↓ Stahlberg Murakami ↑ Godin
= Godin Bono Kaji
= Walter
a
: az enzim heparin affinitása csökkent : a mérések teljes aorta homogenizátumból történtek c : mitokondriális enzimek SOD: szuperoxid dizmutáz, Gpx: glutation peroxidáz, GSH: glutation Gred: glutation reduktáz, CAT: kataláz b
A
7.
enzimek
táblázatból
ellentétes
szembetűnő,
irányú
hogy
azonos
változásait
is
szervekben
azonos
megfigyelték.
Ennek
hátterében többek között a szerzők által használt diabetes modellek közötti
eltérések
állhatnak:
szerepe
lehet
annak,
hogy
milyen
állattörzsön és milyen nemű állatokon, milyen életkorban indukáljuk a diabetest, milyen súlyos anyagcsere eltérés alakul ki és mennyi idő elteltével
vizsgáljuk
a
változásokat.
A
klinikai
vizsgálatoknál
hasonlóképpen megnehezíti az eredmények összevetését, hogy a szerzők nem szigorúan homogén csoportokat vizsgáltak a cukorbetegség típusa, kezelési módja, fennállása és a kialakult szövődmények szerint.
6.2. Az antioxidáns vegyületek változásai cukorbetegségben Húgysav: Pearl
és
mtsai
diabetesesekben
alacsonyabb
húgysavszintet,
és
a
húgysavszintekkel jól korreláló szérum antioxidáns kapacitást találtak (171). Whitehead és mtsai nagy populáción végzett méréseik alapján 7.0 mmol/l
(nőkben
9.0
mmol/l)
koncentrációig
emelkedő
vércukorszintek
mellett párhuzamosan emelkedő húgysavszinteket, majd magasabb glükóz koncentráció
mellett
a
húgysavszint
tapasztalták (172).
46
szignifikáns
csökkenését
Bilirubin: Tunon
adatai
alapján
“short-term”
streptozotocin
diabeteses
patkányokban a bilirubin termelés, a májban lezajló konjugáció és a pigment kiválasztása az epébe egyaránt fokozott. Ezeket a diabetes direkt következményének tartotta (173). Albumin: Inzulinhiány
a
máj
fehérje
szintézisének
csökkenéséhez
termelésének,
vezet
(174),
és
főleg
ennek
az
albumin
szerepe
lehet
a
cukorbetegekben gyengült antioxidáns védelem kialakulásában.
6.3.
Az
antioxidáns
vitaminok
koncentrációjának
alakulása
diabetes mellitusban 6.3.1. C-vitamin A
diabetest
kísérő
anyagcsere
változások
feltehetően
befolyásolják az antioxidáns természetű aszkorbinsav koncentrációját. A C-vitamin szint változása egyaránt lehet következménye a betegségfüggő
depléciónak
vagy
a
dehidroaszkorbinsav
(DHAA)
aszkorbinsavvá
(AA) alakulás hibájának. Utóbbi esetben a sejtekben és a szövetekben tartósan csökkent
alacsony
az
AA
szint
védekezőképességet
károsodással
szemben.
A
szövődmények
kialakulásáért
és
emelkedett
eredményez
C-vitamin is
a
DHAA
a
fokozott
hiány
felelős
szint,
a
pl.
ez
oxidatív
késői
lehet
és
diabeteses a
kollagén
szintézisben és thrombocyta működésben játszott szerepe miatt. A C-vitamin metabolizmus zavarát kísérletes és humán diabetesben is észlelték (175). Behrens és Madere írta le, hogy a humán IDDM egyik modelljének tartott spontán diabeteses BioBreeding (BB) patkányokban megváltozik az AA, DHAA és E-vitamin anyagcsere még mielőtt a diabetes fellépne. Az AA és DHAA szintek szignifikánsan magasabbak voltak a plazmában és a
lépben
a
diabetes-jelölt
állatokban,
összehasonlítva
a
kontroll
csoportéval, a 30. és 64. napon, de a különbség eltűnt a 113. napra (176). Bode
és
mtsai
azt
találták,
kontrollokétől eltérőek a diabeteses
hogy
az
AA
patkányok
és
DHAA
májában.
szintek
a
Kimutatható
volt a hexóz monofoszfát shunt (HMPS) kapcsolódása - NADPH-n keresztül - a glutation reduktázhoz, és a következményes DHAA csökkenés. Az AA termelődést direkt és a HMPS-n keresztül mérték. Az eredmények azt jelezték,
hogy
az
AA
termelődés
47
DHAA-ból
a
HMPS
úton
keresztül
történt, és ez szignifikánsan csökkent diabeteses májban. A glükóz-6foszfát
dehidrogenáz
diabeteses
májban.
(G6PDH) Mivel
aktivitás
a
G6PDH
csökkentnek
mutatkozott
elengedhetetlen
a
a
glutation
redukcióhoz szükséges NADPH biztosításához és a következményes DHAA redukcióhoz, csökkent aktivitása egyet jelent a megváltozott AA és DHAA szintekkel amely a diabeteses szövetekben megfigyelhető. A Cvitamin anyagcsere és a poliol út szoros kapcsolata mellett szól, hogy aldóz
reduktáz
gátlót
adva
diabeteses
patkányoknak,
a
szérum
aszkorbinsav koncentrációja megemelkedett (177). A
cukorbetegek
ellentmondásosak.
Az
C-vitamin alacsony
státuszának aszkorbinsav
vizsgálati
eredményei
koncentráció
diabetes
mellitusban lehet másodlagos a nem megfelelő étrendi C-vitamin bevitel miatt
vagy
összefügghet
a
vitaminnak
különböző
anyagcsere
folyamatokban betöltött szerepeivel. A C-vitamin bevitel határozza meg alapvetően
a
plazma
és
a
szövetek
aszkorbinsav
szintjét.
Azt
feltételezhetjük, hogy amennyiben a C-vitamin bevitel megfelelő, akkor az
a
vitamin
plazmakoncentrációját
a
nem
diabetesesekéhez
hasonló
szinten tartja. Ennek ellenére számos adat utal arra, hogy elegendő étrendi
C-vitamint
plazma
aszkorbinsav
fehérvérsejt
fogyasztó szintje
aszkorbinsav
diabeteses és/vagy
tartalma
betegeknek csökkent
(178,
179).
is a
alacsony
a
mononuclearis
Néhány,
diabetes
mellitusban szenvedő betegek plazma és/vagy fehérvérsejt aszkorbinsav szintjeit vizsgáló tanulmányt foglaltunk össze a 8. táblázatban.
48
8. táblázat Plazma és fehérvérsejt aszkorbinsav szintek diabetes mellitusban
Betegek
n
2. típus
134
diabetes mellitus
plazma AA ↓
plazma fehérvérDHAA sejt AA = ↑
Referencia
↓
normal
Stankova és mtsai 1984
Som és mtsai 1981
1., 2. típus
15+23 (20)
↓
=
n.a.
Jennings és mtsai 1987
1., 2. típus
58+32 (29+53)
=*
n.a.
=**
Schorah és mtsai 1988
↓
Cunningham és mtsai 1991
1. típus
=
2. típus
30 (30)
↓
↓
=
Sinclair és mtsai 1994
2. típus
53 (34)
=*
n.a.
↓
Akkus és mtsai 1996
1. típus - nephropathia
119
↓*
Ndahimana és mtsai 1996
2. típus
467 (180)
↓*
Sundaram és mtsai 1996
2. típus
56 (20)
↓
=
1., 2. típus
28+24 (24+20)
↓
n.a.
n.a.
Maxwell és mtsai 1997
2. típus
78 (44)
↓*
n.a.
n.a.
Somogyi és mtsai 1997
Nagano és mtsai 1996
n: betegek száma (kontrollok száma) AA: aszkorbinsav DHAA: dehidroaszkorbinsav n.a.: nincs adat =: nincs különbség a koncentrációkban a betegek és kontrollok között * AA+DHAA szintet mértek ** buffy layer
Egészséges személyekkel összehasonlítva a diabeteses betegeknek nagyon alacsony plazma AA koncentrációja és szignifikánsan magas DHAA koncentrációja volt függetlenül az életkortól, a nemtől, a betegség időtartamától, a kezelés típusától és a glikémiás kontrolltól Som és mtsai
vizsgálatában.
leukocyta
Ennek
aszkorbinsav
ellenére
nem
koncentrációkban.
volt Az
különbség
in
vitro
az
DHAA
átlagos redukció
arány a hemolizátumban, a vörösvérsejt redukált glutation szintje és a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz aktivitás (DHAA redukciót szabályozza) hasonló volt. Az aszkorbinsav turnover magasabb volt cukorbetegekben (180).
Stankova
és
mtsai
kimutatták,
mononuclearis
sejtek
DHAA
aszkorbinsav
koncentrációk
szenvedőkben.
Mivel
ezen
felvételének
hogy aránya
alacsonyabbak
ligandok
a
diffúziója
a
granulocyták lassúbb
diabetes közös
és
a
és
a
plazma
mellitusban
transzporterrel
történik, ez a megfigyelés tükrözheti a glükóz transzporterek csökkent
49
számát a plazmamembránokban néhány diabeteses fehérvérsejtben (181). Jennings
és
mtsai
vizsgálata
alapján
a
plazma
szignifikánsan alacsonyabbak voltak diabetesesekben. különbség
a
DHAA
cukorbetegekben.
koncentrációkban,
Nem
találtak
a
DHAA/AA
szignifikáns
AA
szintek
Habár
nem
arány
különbséget
volt
emelkedett az
inzulin-
dependens és nem inzulin-dependens betegek között, sem összefüggést microangiopathia
jelenlétével
vagy
a
rossz
glikémiás
kontrollal.
A
plazma DHAA/AA arány tükre lehet a megnövekedett oxidatív stressznek, és az eredmények azt sugallják, hogy a cukorbetegek kevésbé lehetnek képesek
az
oxidatív
stressz
koncentrációik
miatt
(182).
koncentrációkat
mértek
Schorah
inzulin-dependens
kivédésére Plazma és
és
mtsai
cukorbetegekben.
az
alacsonyabb
fehérvérsejt
C-vitamin
inzulin-dependens
Nem
találtak
AA
és
nem
különbséget
a
kontrollok és cukorbetegek között, sem a különböző diabetes típusok között, bár azon betegeknek, akiknek klinikai diabetese hosszabb ideje fennállt
magasabb
betegsége végzett
plazma
rövidebb
cukorbetegekben
volt
szignifikáns
főleg a
vitamin
időtartamú
vizsgálatban
cukorbetegekben,
C
a
értékeik (183).
Sinclair
AA
csökkenés
retinopathiában
szérum
voltak,
mint
és
mtsai
volt
szenvedőkben.
dehidroaszkorbinsav
:
akiknek által
látható
2.
típusú
aszkorbinsav
arány
növekedését mutatták ki (184). A mononuclearis leukocyta aszkorbinsav (MN-AA)
átlagosan
33%-kal
volt
kevesebb
IDDM
felnőttekben,
ha
nem
cukorbetegekével hasonlították össze Cunningham és mtsai. Amennyiben a MN-AA-t az étrendi C-vitamin bevitelhez igazították, a raktár deficit IDDM felnőttekben átlagosan 50% volt. Ez a megfigyelés azt támasztja alá, hogy a támogatja
szöveti
azt
az
AA
raktározás
elméletet,
hogy
károsodott az
IDDM
felnőttekben
“intracelluláris
és
skorbut”
hozzájárul a betegség krónikus degeneratív szövődményeihez (179). Egy Shoff és mtsai által diabeteses személyeken végzett vizsgálatban nem volt szignifikáns összefüggés megfigyelhető a glikált hemoglobin (GHb) és az E-vitamin, C-vitamin, valamint a béta-karotin bevitel között. Nem
diabeteses
negatív
egyénekben
korrelációt
az
energia-igazított
mutatott
a
Ghb-val
C-vitamin
életkorra
és
bevitel nemre
vonatkoztatva (185). Sinclair és mtsai vizsgálatában a plazma AA és DHAA
szintek
szignifikánsan
alacsonyabbak
voltak
diabeteses
betegekben. A plazma aszkorbát szintek csak a diabeteses csoportban függtek össze szignifikánsan a C-vitamin bevitellel, melyet étkezési naplóból és kérdőíves módszerrel állapítottak meg. Véleményük szerint az
alacsony
aszkorbát
szintek
diabetesben
50
magának
a
betegség
következményének tünnek és nem tudhatóak be nem megfelelő étrendi Cvitamin bevitelnek (178). Akkus mellitusos
és
mtsai
betegek
vizsgálatai
szerint
fehérvérsejtjeinek
a
2.
típusú
lipidperoxidációja
diabetes
emelkedett,
míg a fehérvérsejtek C-vitamin szintje csökkent. Nem volt összefüggés a fenti paraméterek és HbA1c vagy vércukor szintek között. Véleménye szerint a cukorbetegek fehérvérsejtjeit károsítja az oxidatív stressz, és ez oka lehet a csökkent baktériumellenes aktivitásnak (186). Egy Ndahimana szintet
és
mtsai
mérték
által
119
közölt
diabeteses
vizsgálatban gyermekben,
a
plazma
serdülőben
C-vitamin és
fiatal
felnőttben. A nephropathiás betegeknek alacsonyabb volt a C-vitamin szintjük. betegek
A
plazma
C-vitamin
életkorával
fennállásakor
és
észlelt
a
koncentrációk
betegség
alacsonyabb
negatívan
időtartamával.
C-vitamin
korreláltak A
szint
a
nephropathia
lehet,
hogy
a
vitamin fokozott vesén keresztüli kiválasztásának következménye (187). A
C-vitamin
szintek
retionopathiával
és
jelentősen
anélkül
(188).
alacsonyabbak Sundaram
és
cukorbetegekben mtsai
szerint
az
antioxidáns deficit és a nagyarányú peroxid-mediált károsodás korán megjelenhet
nem
inzulin-dependens
diabetes
mellitusban,
még
a
másodlagos szövődmények megjelenése előtt. 467 nem inzulin-dependens cukorbeteg esetében a diagnózist követő első két évben a C-vitamin szintek
szignifikánsan
tanulmányában
a
alacsonyabbak
szérum
AA
Nagano
(189).
szintje
56
nem
és
mtsai
inzulin-dependens
cukorbetegben szignifikánsan alacsonyabb, mint a kontrolloké. A szérum AA
koncentráció
fordítottan
rizikófaktoraitól, apolipoprotein mikroalbumin
mint
A-1 a
a
függött
az
atherosclerosis
testtömeg-index,
arány,
tiobarbitursav
vizeletben.
Ezekből
apolipoprotein reaktív
az
anyagok
eredményekből
olyan B
/ és
arra
következtettek, hogy a szérum AA csökkenés nyilvánvaló előrehaladott atherosclerosisos cukorbetegekben (190). Kísérletes és klinikai vizsgálatok egyetértenek abban, hogy a Cvitamin anyagcsere kóros cukorbetegségben. A változások, úgy tűnik, a szénhidrát-anyagcsere
változás
időtartamától
és
súlyosságától
függenek. Az, hogy az alacsony AA szint a betegség eredménye vagy oka nem egyértelmű. Ettől függetlenül az alacsony koncentráció arra utal, hogy
cukorbetegségben
a
szövetek
nem
megfelelően
védettek
oxidatív
stressz ellen, és így jobban ki vannak téve az oxidatív károsodásnak. Cukorbetegségben az oxidált és redukált C-vitamin aránya változik, és
51
a vitamin megoszlása a plazma és a szövetek között az egészségesekétől eltérő. 6.3.2. E-vitamin
Az
E-vitaminnak
aktivitásán
túl,
egyéb
anyagcserezavarban. glikozilációját,
a
fentebb fontos
Például
már
feladatai
ismert,
normalizálja
részletezett
a
is
hogy
antioxidáns
lehetnek gátolja
thrombocyta
diabeteses a
fehérjék
aktivitást,
szerepet
játszik a vaszkuláris tónus fenntartásában (prosztaglandin szintézis), és javítja az inzulin hatását. Spontán diabeteses BB patkányokat vizsgáltak Behrens és mtsai Újszülött állatok
plazma és szöveti E-vitamin szintjét magasabbnak
találták, mint a kontrollokét, míg inzulinnal kezelt állatok magasabb E-vitamin
koncentrációja
30
csökkent.
E
nem
változásokat
változásaival
magyarázni,
nap
alatt
tudták
ezért
az
csak
a
egészségesek plazma
felvetették,
szintjére
lipidszintjének
hogy
a
diabetes
megváltoztatja az E-vitamin metabolizmusát (191, 192). A és
2.
plazma E-vitamin szintjét vizsgálták Vandewoude és mtsai 1. típusú
egyének
cukorbetegekben.
Nem
találtak
vitaminkoncentrációjával
szignifikáns
különbséget
különbséget
összehasonlítva.
találtak
egészséges Ugyanakkor
hiperlipoproteinémiában
mind
kontroll, mind cukorbeteg egyénekben. Az E-vitamin/koleszterin arány nem különbözött a két csoportban. Megállapították, hogy a plazma Evitamin szint összefügg a plazma lipidszintekkel, különösen az összkoleszterin és az LDL-koleszterin koncentrációval (193). Mivel az Evitamin
főleg
a
plazmakoncentrációjának
lipoproteinek változása
belsejében
mintegy
tükörképe
szállítódik, a
lipoprotein
szint változásának. Watanabe és mtsai az E-vitamin anyagcsere és a thrombocyták kapcsolatát vizsgálták. Negatív összefüggést találtak az alvadási faktorok és a thrombocyták E-vitamin koncentrációja között. Arra
következtettek,
cukorbetegek
hogy
thrombocytáiban
az
alacsonyabb
közvetve
E-vitamin
hozzájárulhat
szint
a
növekedett
trombóziskészségükhöz (194). Azt az összefüggést, hogy a plazma Evitamin
koncentrációk
egészséges
és
cukorbeteg
különböznek Karpen és mtsai is igazolták (195).
52
egyénekben
nem
6.3.3. A-vitamin Sasaki és mtsai a szérum retinol valamint a retinol-kötő fehérje szinteket
mind
nők,
mind
férfiak
esetében
magasabbnak
találták
cukorbetegekben, mint egészséges kontrollokban. Lipidcsökkentő terápia szignifikánsan csökkentette a retinol szintet (196).
7. Az antioxidáns terápia lehetőségei diabetes mellitusban Az antioxidánsok preventív szerepéről a diabetes etiológiájával kapcsolatban antioxidáns
említést
tettünk.
vitaminnak
a
már
A
következőkben
kialakult
néhány
fontosabb
cukorbetegségben
kifejtett
hatásaival foglalkozunk az irodalmi adatok alapján.
7.1. E-vitamin Kisérletes
cukorbetegségben
kimutatták
az
E-vitamin
LDL
oxidációját gátló hatását (197, 198), mely emelkedett vércukorértékek mellett is megfigyelhető volt. Kimutatták, hogy csökkenti a hemoglobin glikációját vitamin
cukorbetegekben
adagolás
után
(199).
idős
Paolisso
és
cukorbetegekben
mtsai az
3
hónapos
inzulinra
E-
adott
anyagcsere válasz javulását írták le (200).
7.2. C-vitamin Számos szerző vizsgálta a C-vitamin glikáció gátló képességét antioxidáns aszkorbinsav
tulajdonsága pótlást
miatt.
követően
Vannak
csökken
a
közlések,
HbA1c
szint
miszerint
patkányokban,
csökkent glikált albumin szintekkel együtt. Emberekben az eredmények ellentmondásosak.
7.2.1. Aszkorbinsav és protein glikáció
Többek vetették
között
fel,
hogy
Stolba az
és
mtsai,
aszkorbinsav
valamint
Khatami
interferálhat
és a
mtsai protein
glikozilációval (201, 202). Az aszkorbinsav a hemoglobin koncentrációt antioxidáns tulajdonága révén is befolyásolhatja, bár egyéb lehetséges mechanizmusokat is számba kell vennünk. Először, az aszkorbinsav és a dehidroaszkorbinsav a glükózhoz hasonlóan kötődnek a fehérjékhez. Így
53
például amikor a hemoglobinhoz kapcsolódnak, főleg a hemoglobin béta lánc N-terminális valin végéhez kötődnek (203). Magas koncentrációban az aszkorbát versenyez a glükózzal a fehérjekötésért. Az igy kialakult termékek (“aszkorbilált fehérjék”) veszélyesek lehetnek az erekre. A töltés különbségen alapuló vizsgálómódszerek
nem
tudnak
különbséget
tenni a glikált és az aszkorbilált hemoglobin között, és ezért nem mérnek HbA1c csökkenést. Ebben az esetben, habár a HbA1c viszonylag alacsonyabb, egy hemoglobin-aszkorbát konjugátum Young
vörösvértestekben.
és
kell
ioncserélő
mtsai
megjelenjen
a
kromatográfiát
használtak, és arra következtettek, hogy nem az aszkorbiláció volt a felelős
a
HbA1c
csökkenésért
aszkorbinsav
pótlást
követően
streptozotocin cukorbeteg patkányokban (204). Az interakció egy másik módja
szintén
aszkorbinsav erről
van
a
strukturális
vetélkedhetnek szó,
az
hasonlóságon
egymással
extracellularis
a
alapul:
sejtbe
a
való
glikáció,
glükóz
és
az
bejutásért.
Ha
melyet
a
glikált
albuminszint segítségével mérhetünk, nem változhat. Azonban a glikált albumint cukorbeteg
csökkentnek egyénekben
találták (203).
aszkorbát
Végül
az
pótlást
aszkorbinsav
követően módosíthatja
nem az
inzulin hatását, amint Paolisso és mtsai vetik fel, javítja a nemoxidatív
glükóz
metabolizmust
és
ezáltal
jobb
glükóz
kontrollt
eredményez (205).
7.2.2. Kísérleti eredmények Ellentmondóak a cukorbetegek átmeneti aszkorbinsav kezeléséről szóló
irodalmi
közlemények.
A
9.
táblázat
vitamin pótlás vizsgálat kimenetelét.
54
összefoglalja
néhány
C-
9. táblázat Diabetes mellitus és aszkorbinsav pótlás
Napi dózis
Időtartam
Betegek
Glükóz
GHb
Referencia
500 mg
15 nap
NIDDM és nem-DM
változatlan
n.a.
Som és mtsai 1981
500 mg
4 hónap
DM
változatlan
változatlan
Bishop és mtsai 1985
1000 mg
3 hónap
nem-DM
változatlan
csökkent
Davie és mtsai 1992
1500 mg
3 hónap
nem-DM
változatlan
változatlan
Weykamp és mtsai 1995
2*500 mg
4 hónap
NIDDM
előnyös
2000 mg
90 nap
NIDDM
csökkent
1000 mg
2 hét
DM
változatlan
1000 mg
40 nap
DM és nem-DM
változatlan
Paolisso és mtsai 1995 csökkent
Erikssson és mtsai1995 Wang és mtsai 1995
csökkent
Szaleczky és mtsai 1998
n.a.: nincs adat DM: diabetes mellitus, NIDDM: nem inzulin-dependens diabetes mellitus, GHb: glikált hemoglobin Davie és mtsai mind a glikált albumin, mind a glikált hemoglobin csökkenését
észlelték
nem
diabetesesekben
3
hónapos,
1000
mg/nap
aszkorbinsav pótlást követően. Véleményük szerint a cukornak és az aszkorbátnak a fehérjéhez való kötődésért folytatott versenye felelős ezekért a változásokért (203). Ezzel ellenkezőleg Weycamp és mtsai azt a konklúziót vonták le, hogy még 1500 mg/nap dózis - 12 hétig - sem csökkenti nem diabetesesekben in vivo a hemoglobin glikációt (206). Napi 500 mg vitamin alkalmazása cukorbetegeknek 4 hónapos időtartamig sem változtatta meg a glikált hemoglobin szintet (207). Paolisso és mtsai által végzett vizsgálatban krónikus C-vitamin pótlás
(0,5
g
szignifikáns
naponta csökkenést
koncentrációjában, triglicerid javította
kétszer
az
a
teljes
anyagcserét.
A
test
hónapig)
okozott
inzulin,
szintekben.
4
20
az
százalékos
össz-,
betegben
glükóz
a
placeboval
plazma az
szabadgyökök
LDL-koleszterin
krónikus
C-vitamin
felhasználást
plazma
szemben
és
C-vitamin
a
és
a
adagolás
nem-oxidatív
szint
növekedés
összefüggött a plazma LDL-koleszterin és az inzulin szintek százalékos csökkenésével.
A
százalékos
plazma
C-vitamin
szint
növekedés
összefüggött a plazma szabadgyök koncentráció százalékos csökkenésével és
glutation
szint
növekedésével.
Az
eredményekből
arra
következtetett, hogy a krónikus C-vitamin adagolás előnyös hatásokkal bír
mind
a
glükóz-,
mind
lipid-anyagcserére
55
idős
2.
típusú
cukorbetegekben (208). Eriksson és Kohvakka eredményei szintén arra utalnak, hogy a magas dózisú AA pótlásnak előnyös hatásai vannak nem inzulin
függő
cukorbetegségben
a
glikémiás
kontrollra
és
a
szérum
lipidszintekre. Az AA pótlás (2 g/nap, 90 napig) 56 NIDDM betegekben javította a glikémiás kontrollt, mind az éhomi vércukorszint, mind a HbA1c
javult.
triglicerid
Az
AA
pótlás
szintekre
is
jótékony
hatása
megfigyelhető
a
volt
koleszterin (209).
és
a
Kísérletes
tanulmányok mutatják, hogy a poliol út hatékonyan gátolható lehet AAval az aldóz reduktázra kifejtett direkt hatásán keresztül. Egy kettős vak cross-over klinikai vizsgálatban Wang és mtsai AA tablettát vagy inozitol tablettát használva nyolc cukorbetegben kimutatták, hogy két hétig tartó napi 1000 mg-os AA pótlás 12.2%-os erytrocyta sorbitol és 21.8%-os
erytrocyta
eredményezett,
míg
sorbitol az
/
plazma
egyidőben
mért
glükóz
éhomi
arány
plazma
csökkenést
vércukor
nem
mutatott különbséget (210). Összefoglalva,
a
krónikus
C-vitamin
adásnak
lehetnek
előnyös
hatásai a cukor-anyagcserére. Még nem egyértelmű, hogy a C-vitamin antioxidáns aktivitása direkt befolyásolja-e a cukoranyagcserét, vagy valamely
más
mechanizmus
-
pl.
az
aszkorbinsav
és
a
glükóz
strukturális hasonlóságukon alapuló, a fehérje kötődésért folytatott versenye, a sejtbe való bejutásért zajló versenye, az aszkorbinsavnak az a képessége,
hogy
megváltoztatja
az
inzulin
hatását,
a
vitamin
direkt hatása az aldóz reduktázra, vagy a glükoneogenezis gátlása a májban az emelkedett redukált glutation/oxidált glutation arány révén (211, 212) stb. - a felelős a talált változásokért. Nem
ismertek
még
pontosan
azok
az
antioxidáns
vitamin
mennyiségek, melyek preventív hatása biztosan igazolható és károsodást nem okoznak. Az optimális aszkorbinsav igény cukorbetegeknél a jövőben határozandó meg.
56
Módszerek
(A) A gasztroenterológiai betegségekben szenvedők szabadgyökreakcióinak és antioxidáns státuszának vizsgálatakor alkalmazott módszerek Betegek A
felső
ulcerosában
gasztrointesztinális
szenvedő
betegeket
a
kórképekben
Semmelweis
és
a
colitis
Orvostudományi
Egyetem
II.sz. Belgyógyászati Klinika Endoszkópos Laboratóriumába vizsgálatra került betegek közül válogattuk.
Valamennyi
résztvevőtől
beleegyező
nyilatkozatot kértünk és valamennyi vizsgálatot a Helsinki Deklaráció elveivel összhangban folytattuk. A
colorectalis
Orvostudományi Kemoterápiás,
carcinomában
Egyetem
szenvedő
Oktató
Kórház
valamint
Sebészeti
jelentkezők
mintái
betegeket I.
Osztályain
a
Semmelweis
Belgyógyászati kezelt
betegek
és közül
válogattuk. Önként
szolgáltak
egészséges
kontrollként.
Egészségesnek tartottuk őket, mert egyetlen ismert betegség jelét vagy tünetét
nem
mutatták,
normál
rutin
laboratóriumi
paraméterekkel
rendelkeztek, nem szedtek gyógyszert. A betegcsoportok és az önkéntes kontrollcsoportok jellemzőit az egyes vizsgálatoknál részletezzük.
1.
Felső
gasztrointesztinális
kórképekben
szenvedő
betegek
-
plazmamérések (absztrakt: 7, 12) A
plazma
nitrát/nitrit
szintjét
mértük
meg
50
felső
gasztrointesztinális kórképben szenvedő betegben (27 férfi és 23 nő, átlagéletkoruk
46±16
év).
Tanulmányoztuk
a
Helicobacter
pylori
(H.
pylori) eradikáció hatását is a plazma nitrát/nitrit szintekre ezekben a betegekben. Rutin endoszkópia során endoszkópos mintavétel történt az
antrum
alvadását
és
corpus
heparinnal
területéről, gátoltuk.
valamint
Mindezt
vért
vettünk,
megismételtük
4
melynek
hét
múlva,
sikeres H. pylori eradikáció után. A
betegek
közül
12
peptikus
fekélybeteg
volt,
23
krónikus
gastritisben, 6 reflux oesophagitisben, 9 dyspepsiás tünetegyüttesben
57
szenvedett.
A
látóterenkénti normal, 6-20
biopsiás
minták
mononuclearis MNC
=
enyhe,
beosztását
sejtek 21-40
(MNC)
MNC
=
patológus
száma
végezte
alapján:
közepes,
>40
<5
MNC
MNC
a =
=
súlyos
és
Giemsa
gastritis. A
H.
pylori
státusz
meghatározása
ureáz
teszttel
festéssel történt. Az 50 beteg közül 32 (64%) volt H. pylori pozitív. A H. pylori eradikációjára hármas kombinációt (clarithromycin (3x500 mg/nap)
+
metronidazol
(2x500
mg/nap)
+
omeprazol
nem
szteroid
(2x20
mg/nap)
alkalmaztunk 7 napig. A
betegek
egyike
sem
szedett
gyulladásgátló
gyógyszert vagy nitrát tartalmú készítményt.
2.
Felső
gasztrointesztinális
kórképekben
szenvedő
betegek
-
szövetminta-mérések (absztrakt: 20) 14 peptikus fekélybetegségben szenvedő beteget (9 férfi és 5 nő, átlagéletkoruk 42±12 év) és 16 funkcionális dyspepsiás beteget (10 férfi és 6 nő, átlagéletkoruk 40±10 év) vontunk be a gyomorbiopsiás anyagban
végzett
aktivitás,
szöveti
szulfhidril
nitrát/nitrit tartalom
és
szint,
szuperoxid
nitrotirozin
gyökfogó
meghatározására
tervezett vizsgálatba. 21 beteg volt H. pylori pozitív és 9 volt H. pylori negatív. A H.
pylori
pozitív
betegek
esetében
alkalmazott
egyhetes
hármas
kombináció a H. pylori eradikációjára (2x1g amoxicillin + 2x500 mg clarithromycin + 2x20 mg omeprazol) 21 esetből 20-ban sikeres volt.
3. Colorectalis carcinomában szenvedő betegek (XII, absztrakt: 4, 8) A
plazma
nitrát/nitrit
szinteket
mértük,
valamint
összehasonlítottuk 29 colorectalis carcinomában szenvedő betegben (18 férfi és 11 nő, átlagéletkoruk 66±2 év) és 13 egészséges önkéntesben (4 férfi és 9 nő, átlagéletkoruk 28±2 év) a három fő antioxidáns enzim (szuperoxid dizmutáz, glutation peroxidáz, antioxidáns
anyagok
szintjét
és
az
kataláz)
aktivitását,
össz-scavenger
kapacitást
az a
plazmában. Mivel a szívelégtelenség és a nitrogén-oxidot felszabadító gyógyszerek szedése (mint pl. nitroglicerin) tudottan emeli a plazma nitrát/nitrit
szintet,
a
betegeket
állapotuk alapján is elemeztük.
58
gyógyszerelésük
és
kardiális
A betegek közül 11 rectum-, 12 coloncarcinomában szenvedett, két betegnek
mindkét
lokalizációban
volt
daganata.
Valamennyi
daganat
hisztológiailag adenocarcinomának, két beteg esetében adenocarcinoma mucinosának
bizonyult.
A
daganatok
döntő
többségét
a
vizsgálatot
megelőző egy éven belül diagnosztizálták, közel felét a vizsgálatot megelőző
1
hónapon
belül
radikális műtét, 8
beteg
megoperálták. esetében
19
beteg
palliatív
esetében
műtét.
A
történt
betegek
fele
részesült kemoterápiában (azonos protokoll szerint: 1.-5.nap: 550mg/m2 fluorouracil és 15 mg/m2 calcium-folinat, 28 naponta) a vizsgálatot megelőző egy hónapon belül. A kemoterápia indikációja 6 beteg esetében adjuváns volt, 7 beteg kapott palliatív kemoterápíát. A betegeket távoli metasztázisok hiánya vagy megléte alapján két csoportba osztottuk: •
Dukes
B,C
felosztás
-
az
szerinti
Astler-Coller B
és
C
szerint
módosított
(n=14,
stádium
11
Dukes-féle
férfi
és
3
nő,
átlagéletkoruk 71±2,4 év) •
Dukes D - az Astler-Coller szerint módosított Dukes-féle felosztás szerinti D stádium (n=15, 7 férfi és 8 nő, átlagéletkoruk 62±3,1 év)
Májáttétben szenvedett 12 beteg, 3 esetben peritonealis, 2 esetben kismedencei, 1 esetben pulmonalis metasztázis volt kimutatható. Az általunk alkalmazott stádium besorolás lényege: A stádium: csak a mucosát érintő tumor, B stádium: a submucosát átlépő tumor, negatív regionalis
nyirokcsomókkal,
C
stádium:
pozitív
regionális
nyirokcsomók, D stádium: távoli áttétek vannak jelen (213, 214).
4.
Colorectalis
carcinomában
és
gyulladásos
bélbetegségben
szenvedő betegek (VIII, XIII, absztrakt: 15, 18) A
plazma
nitrát/nitrit
koncentrációt,
a
szuperoxid
gyökfogó
aktivitást és a teljes szulfhidril szintet összehasonlító vizsgálatba 69
colorectalis
carcinomában
szenvedő
beteg
(42
férfi
és
27
nő,
átlagéletkoruk 69±11 év), 20 aktiv colitis ulcerosában szenvedő beteg (8 férfi és 12 nő, átlagéletkoruk 48±11 év) és 30 egészséges önkéntes (átlagéletkoruk
48±11
év)
került.
A
betegek
coloncarcinomában
szenvedett.
Valamennyi
adenocarcinomának,
négy
esetében
beteg
közül
daganat
24
rectum-,
45
hisztológiailag
adenocarcinoma
mucinosának
bizonyult. A daganatok közül 41-et a vizsgálatot megelőző hat hónapon belül diagnosztizálták. Ötvenkilenc beteg a vizsgálatot megelőzően már
59
részesült kemoterápiában (azonos protokoll szerint: 1.-5.nap: 550mg/m2 fluorouracil és 15 mg/m2 calcium-folinat, 28 naponta). A betegeket 3 alcsoportba
osztottuk
a
betegség
kiterjedtsége
alapján,
az
Astler-
Coller által módosított Dukes klasszifikáció szerint: 25 beteg a Dukes B,
13
beteg
a
Dukes
C
és
31
beteg
Dukes
D
stádiumba
tartozott.
Tizenhat betegben májáttét, 2-ben peritonealis, 4-ben tüdőáttét, 17ben
pedig
helyi
recidiva
volt
kimutatható.
A
betegek
rutin
laboratóriumi paramétereit az 10. táblázat foglalja össze. Minden
colitis
ulcerosás
beteg
a
betegség
aktív
stádiumában
volt. 20 colitis ulcerosás beteg közül a Truelove-Witts-féle beosztás szerint 6 betegnek enyhe, 8 betegnek közepes és 6 betegnek súlyos aktivitású volt a betegsége. Valamennyien 5-ASA kezelést kaptak, és a közepes
és
súlyos
stádiumban
lévők
(maximum napi 32 mg).
60
szteroid
terápiában
részesültek
10. táblázat A colorectalis carcinomás betegek laboratóriumi adatai
Hb
Fvs
We
SGOT
SGPT
gGT
SAP
kreat
vércukor
(g/l)
(x109/l)
(mm/óra)
(U/l)
(U/l)
(U/l)
(U/l)
(µmol/l)
(mmol/)
Dukes B
136±14,1
6,7±1,8
23±20
17±6,6
18±6,7
22±8,6
183±58
93±21,0
5,73±1,15
Dukes C
121±19,0
5,9±2,0
34±12
17±8,5
18±6,5
27±19,7
187±73
71±12,0
5,4±0,82
Dukes D
128±14,1
7,45±2,3
48±30
21±11
19±9,7
56±68,2
244±148
95±24,8
6,29±1,66
s
s
s
s
s
se Ca
se P
se chol
húgysav
összfeh.
albumin
CEA
Ca 19.9
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
(µmol/l)
(g/l)
(g/l)
(ng/ml)
(U/ml)
Dukes B
2,38±0,13
1,11±0,18
5,9±1,57
262±80
72±8,1
40,9±4,18
9,5±23,5
21,6±27,8
Dukes C
2,41±0,14
1,18±0,14
5,7±0,50
240±72
70±2,2
41.23±3.24
90±216,6
23,9±17,6
Dukes D
2,45±0,17
1,14±0,2
5,8±1,50
261±73
74±4,0
43,25±5,12
168±271,6
253,2±511
s
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg. s: szignifikáns különbség, p<0.05
61
5.
Szöveti
oxigén
szabadgyök-scavengerek
és
a
nitrát/nitrit
szint vastagbél adenocarcinomában (absztrakt: 21, 22) Fent részletezett betegek közül 31 vastagbél adenocarcinomában szenvedő
betegből
vizsgáltunk,
(átlagéletkoruk
mértük
a
szuperoxid
63±11
év)
gyökfogó
származó
aktivitást,
tumorszövetet a
szulhidril
tartalmat és a nitrát/nitrit szintet. A betegeket az Astler-Coller által módosított Dukes klasszifikáció szerint csoportosítottuk: Dukes B 19, Dukes C 6, Dukes D 6 beteg. A tumorszövetet műtét alkalmával nyertük és -80 °C-n tároltuk a mérésekig.
6. Peroxinitrit kimutatása (VIII, XIII, absztrakt: 18, 17) Nitrotirozin daganatszövetből
32
tartalom esetben,
mérésére colitis
műtét
során
ulcerosában
eltávolított
szenvedő
betegből
colonoscopia során nyert biopsiás anyagból 13 esetben került sor. Valamennyi
daganatos
betegnek
(átlagéletkoruk
65±10
év)
colon
vagy rectum adenocarcinomája volt. Az Astler-Coller által módosított Dukes klasszifikáció szerint 11 beteg B, 12 beteg C és 9 beteg D stádiumú.
Módszerek
1. Nitrát/nitrit meghatározás (VIII, XII, XIII, absztrakt: 7, 12, 15, 18, 20, 21, 22) A plazma és a szöveti nitrát/nitrit meghatározás Griess reagens segítségével, Green és mtsai módszere alapján történt (215). A plazma vagy
a
végeztük.
homogenizált A
nitrát
szövet
fehérjementesítését
nitritté
való
redukciója
ultrafiltrálással kadmium
oszlop
segítségével történt. A vizsgálat elve a következő: a cadmium oszlop nitritté
redukálja
a
nitrátot,
amely
Griess
reagenssel
bíborvörös
színt ad. A nitrit redukciójára nincs szükség, mert közvetlenül reagál a Griess oldattal. A vörös szín a minta 60°C-ra történő melegítése során keletkezik. A leolvasás spektrofotométerrel 550 nm-en, 2 percnél történik, szobahőmérsékleten. A méréshez a mintákat 10.000 Daltonos szűrőn 30 percig filtráltuk 6.000/perc fordulatszámon. A fehérjementes mintából 100 µl-t adtunk a méréshez. Kontrollként nátrium nitrát és
62
nátrium
nitrit
µmol/l
5-100
oldatát
használtuk.
Az
eredményeket
µmol/l-ben adtuk meg.
2. Szuperoxid gyökfogó aktivitás mérése(VIII, XIII, absztrakt: 15, 18, 20, 21, 22) A
plazma
szuperoxid
gyökfogó
aktivitás
(SSA)
mérését
elektronspin rezonanciás módszerrel végeztük (216). A módszer elve a következő: A hipoxantin/xantin oxidáz rendszerben képződött szuperoxid aniont 5,5-dimetil-pirrolin-oxid gyökcsapdával (DMPO) megfogjuk, s az így keletkezett DMPO-szuperoxid komplex spinjel-számát elektromágneses spektrométerrel bizonyos
mérjük.
tartományban
A
DMPO-szuperoxid
lineárisan
követi
komplex
a
spinjel-szám
keletkezett
szuperoxid
anionok számát és kompetitív módon gátolható szuperoxid dizmutázzal (SOD).
Először
standard
gátlási
görbét
hipoxantin, 0,5 mmol/l desferrioxamin
és
készítünk. 34
vagy
A
68
0,5
mmol/l
mmol/l
DMPO-t
tartalmazó, 7,4 pH-jú foszfátpufferhez 50 µl, 2-20 U/ml SOD-t adunk (végső térfogat 0,2 ml). A reakciót xantin oxidáz (50 mU/ml) adásával indítjuk és a mérést
40
másodpercen
belül
elkezdjük.
A
szuperoxid
gyökfogó kapacitás méréséhez a plazma 0,05 ml-t adjuk a SOD helyett. A reakció
xantin
oxidázzal
másodpercig
keverjük,
rezonanciás
vizsgálatra
történő
majd
0,18
alkalmas
indítása ml
után
térfogatú,
lapos
az
oldatot
az
3
elektronspin
kapilláriscsőbe
szívjuk
fel
(JEOL Co. Ltd., Tokyo, Japán). Az elektronspin rezonanciás spektrumot JES-FE 2xG (JEOL Co. Ltd., Tokyo, Japán) spektrométerrel mérjük 355±5 mT
erősségnél,
9,42
GHz
modulációs
frekvenciánál,
0,125
mT
modulációval, 1000-es amplitúdóval, 0,3 válaszérzékenységgel, 2 perces követéssel
8mV
mikrohullám
erősséggel.
A
kísérlet
statisztikai
analízisét a minták háromszori mérésének átlagából végeztük.
3.
Teljes
szulfhidril
tartalom
meghatározás
(VIII,
XIII,
absztrakt: 15, 18, 20, 21, 22) A
plazma
teljes
szulfhidril
(SH)
tartalmának
meghatározása
spektrofotometriásan, Sedlak és Lindsay által leírt módszer szerint történt Ellman reagenssel (412 nm) (217).
63
4. Nitrotirozin meghatározás (VIII, XIII, absztrakt: 17, 18, 20) A
mintákban
a
nitrotirozin
jelenlétének
meghatározása
szemikvantitatív módszerrel történt, Kaur és Halliwell leírása alapján A
(218).
szövetmintákat
először
homogenizáltuk,
majd
hidrolízist
végeztünk. Az így kapott oldat, valamint a plazma fehérjementesítése ultrafiltrációval
történt
(10.000
Dalton
szűrő).
Ezután
a
mintákat
káliumfoszfát puffer és 10%-os metanol oldatban áramoltattuk át, magas nyomású folyadék kromatográf segítségével Crestpaque C185S oszlopon. A kapott spektrogrammon a nitrotirozin abszorbciós csúcs leolvasása 365 nm-en történt, 5,8 percnél. A nitrotirozin azonosításához a mintákat autentikus
nitrotirozinnal
(1
ezekből a spektrum ismételt
µmol/l)
felvétele
1:1
arányban
után,
a
5,8
kevertük, percnél
majd
észlelt
csúcs leolvasása történt. A vizsgálat érzékenységi határa 10 nmol/l nitrotirozin.
5. Antioxidáns enzimmeghatározások (absztrakt: 4, 7) A
vörösvérsejt
SOD
aktivitást
spektrofotometriásan,
SOD-525
kittel (Bioxytech S.A., Bonneuil/Marne, Franciaország), a GSH szintet kolorimetriásan, Franciaország),
GSH-400 a
kittel
kataláz
(Bioxytech
aktivitást
Aebi
S.A.,
Bonneuil/Marne,
szerint
(219)
mértük.
Utóbbihoz a vörösvérsejteket négy alkalomal mostuk 0,9% NaCl oldatban, a hemoglobin koncentrációt Haemisol reagenssel (Human Rt., Gödöllő) mértük meg. Valamennyi mintát 10% hemoglobin tartalmúra higítottuk. A plazma
Gpx
aktivitását
Bonneuil/Marne,
immunoassay
Franciaország)
módszerrel
határoztuk
meg,
(Bioxytech
a
heparinos
S.A., vérből
szeparált plazmát -20 °C-n fagyasztva tároltuk.
6. Plazma össz-scavenger kapacitás mérése (absztrakt: 4, 7) A plazma teljes gyökfogó kapacitás méréséhez Blázovics és mtsai kemilumineszcenciás
módszerét
alkalmaztuk,
Berthold
Lumat
LB
9501
luminometeren (220). A H2O2-mikroperoxidáz-luminol (Sigma Chem Co., St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok) rendszerben mértük a gyökfogó kapacitást. alkalommal
A 30
méréseket másodpercig
a
minták mértünk.
bemérésével Az
indítottuk,
eredményeket
a
minden
plazmamentes
rendszer integrált fényintenzitásához viszonyított csökkenésként, RLU (relative light unit)%-ban fejeztük ki.
64
7. Fehérjemeghatározás A fehérjemeghatározás a mintákból Lowry módszere szerint Folinreagens felhasználásával történt (590 nm) (221).
8. Statisztikai számítások A csoportok közti különbségek értékelésére kétmintás t-próbát és egyszempontos variancia analízist post hoc LSD, valamint Knewman-Keuls összehasonlítással, elemzésére
korreláció
programcsomag
a
vizsgált analízist
segítségével.
paraméterek végeztünk
A
a
közti
kapcsolatok
SIMSTAT
statisztikai
null-hipotézist
valószínűsége kisebb volt, mint 0,05.
65
elvetettük,
ha
(B) A cukorbetegek antioxidáns védelmének vizsgálatakor alkalmazott módszerek Betegek A
vizsgálatokban
Orvostudományi
Egyetem
résztvevő II.
sz.
cukorbetegeket
Belgyógyászati
a
Semmelweis
Klinika
Anyagcsere
Ambulanciáján gondozott betegek közül válogattuk ki. Vizsgálatainkat
az
Egyetem
Tudományos
Bizottságának engedélyeivel (TUKEB 21/1994 és résztvevő
írásos
beleegyezési
Kutatásetikai
112/1996),
nyilatkozatának
valamennyi
birtokában
végeztük
(222). Kizártuk vizsgálatainkból mindazokat, akik kóros vese- (szérum kreatinin:
>200
µmol/l),
vagy
kétszerese,
gGT:
>100
hematológiai
vagy
bármilyen
májfunkciós
U/l),
értékekkel
akut
(SGOT:
>
normál
rendelkeztek,
betegségben
szenvedtek.
érték
daganatos, Kizáró
ok
volt továbbá hormon tartalmú gyógyszerek vagy vitaminok fogyasztása a vizsgálatot megelőző 6 héten belül. A
betegcsoportok
és
a
-
lehetőségeink
szerint
-
valamennyi
esetben nemek, életkor és testömeg-index alapján illesztett önkéntes kontrollcsoportok jellemzőit az egyes vizsgálatoknál részletezzük. Az 1., 3., 4. és 8. pont alatt ismertetett betegcsoportok részlegesen átfedik egymást, a 2. és 7. pontban lévők megegyeznek.
1. Jól kontrollált 1. típusú cukorbetegek (IV, absztrakt: 11) Összehasonlítottuk 11 1. típusú cukorbetegben, valamint életkor és testtömeg-index (BMI) alapján illesztett 17 egészséges önkéntesben (11. táblázat) a három fő antioxidáns enzim - szuperoxid dizmutáz, glutation
peroxidáz,
antioxidáns
anyagok
kataláz szintjét
-
aktivitását,
és
a
teljes
a
kis
antioxidáns
molekulasúlyú státuszt
a
plazmában. A cukorbetegség átlagos fennállása betegeink esetében 10 év volt (range: 1-33 év); az átlagos HbA1c érték 6,06±0,48%, amely jó vércukor kontrollra utalt. Veseszövődménye egyiküknek sem volt. Valamennyi cukorbeteg intenzifikált inzulin terápiában - napi 35
inzulin
injekció
-
részesült.
inzulinkészítményt alkalmaztunk.
66
Minden
esetben
humán
11. táblázat Jól kontrollált 1. típusú cukorbetegek és kontrollok klinikai adatai
esetszám
életkor
nem
BMI
vércukor
HbA1c
(év)
(f:n)
(kg/m2)
(mmol/l)
(%)
Kontroll
17
30±1,98
10:7
23,5±0,93
5,13±0,15
4,81±0,14*
IDDM
11
32±3,92
6:5
23,1±0,99
6,78±0,75
6,06±0,48*
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. A szignifikáns különbségeket jelöltük: *, p<0,05
2. Elfogadhatóan kontrollált 1. típusú cukorbetegek (absztrakt: 24, 35) 25 1. típusú cukorbeteget és 40 nem cukorbeteget vontunk be a vizsgálatba (12. táblázat), melyben mértük a szuperoxid dizmutáz, a glutation
peroxidáz,
molekulasúlyú
a
antioxidáns
glutation anyagok
reduktáz
szintjét
aktivitását,
és
a
teljes
a
kis
antioxidáns
státuszt a plazmában. A cukorbetegség átlagos fennállása 10,6±7,95 év volt; az átlagos HbA1c érték 7,89±2,53%, amely elfogadható vércukor kontrollra utalt. Valamennyi
cukorbeteg
intenzifikált
inzulin
kezelésben
részesült. Az inzulin valamennyi esetben humán inzulinkészítmény volt.
12. táblázat Elfogadhatóan
kontrollált
1.
típusú
cukorbetegek
és
kontrollok
klinikai adatai
életkor
BMI 2
vércukor
HbA1c
(év)
(kg/m )
(mmol/l)
(%)
Kontroll
38,10±10,24
24,83±4,82
5,15±0,65
5,16±0,40
DM
35,80±12,71
23,35±3,81
11,83±5,55
7,89±2,53
s
s
Az eredményeket átlag ± SD értékben fejeztük ki. A szignifikáns különbséget jelöltük: s, p<0,05
67
3.
A
cukorbetegség
időtartamának
antioxidáns
rendszerre
gyakorolt hatása vizsgálatában résztvevő betegek (V, absztrakt: 10) A cukorbetegség klinikai fennállási idejének hatását vizsgáltuk az
antioxidáns
cukorbetegek betegség
védelem
különböző
csoportjában.
klinikai
42
fennállási
cukorbetegségben
kevesebb,
hosszabb
volt
ideje
önkéntesek
A
szolgáltak
összetevőire
beteget
idejének
mint
10
éve
25
(1-es
(2-es
(0-ás
kontrollált
csoportra
alapján:
cukorbetegsége kontrollként
két
jól
osztottuk
beteg
szenvedett
csoport),
csoport).
csoport,
a
17-üknek Egészséges
n=15).
Az
1-es
típusú és 2-es típusú cukorbetegek aránya 8 : 17, valamint 3 : 14 volt az 1-es és a 2-es csoportban (13. táblázat). A vizsgált cukorbetegek különböző kezelési módokban részesültek: kizárólag
diéta,
orális
antidiabetikumok,
vagy
inzulin,
de
valamennyien kielégítő glikémiás kontrollal rendelkeztek (HbA1c < 8%).
13. táblázat A
cukorbetegség
időtartamának
antioxidáns
rendszerre
gyakorolt
hatásának vizsgálatában résztvevő betegek (1-es és 2-es csoport) és kontrollok (0-ás csoport) klinikai adatai
0
DM fennállása
életkor
nem
BMI
vércukor
HbA1c
(évek)
(évek)
(f:n)
(kg/m2)
(mmol/l)
(%)
-
32±2,89
10:5
23,49±1,15
5,47±0,21
4,88±0,16
*,^
*, ^^
**,^^
26,19±0,68
8,79±0,84
6,52±0,35
*
*
**
csoport 1
**, ^^ 4,73±0,62
csoport 2 csoport
48±3,32
18:7
** 20,65±1,85
55±3,17
9:8
^^
27,07±0,89 10,36±8,36 7,37±0,49 ^
^^
^^
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. A statisztikailag különböző csoportok jelölve:
68
*, ^
p<0,05
**, ^^
p<0,005
4. Az intravazális antioxidáns védelem vizsgálatban résztvevő, inzulinnal kezelt cukorbetegek (absztrakt: 3) Munkánkban 32 inzulinnal kezelt (16 férfi: 6 IDDM - 10 NIDDM, 16 nő: 5 IDDM - 11 NIDDM) cukorbetegben vizsgáltuk az antioxidáns védelem különböző összetevőinek (teljes vér glutation peroxidáz, vörösvérsejt szuperoxid
dizmutáz
és
kataláz
aktivitás,
szérum
albumin,
húgysav,
bilirubin szintek és plazma teljes antioxidáns státusz) összefüggését a
cukorbetegséget
és
lipid-anyagcserét
jellemző
laboratóriumi
paraméterekkel. A
betegeket
hasonlóan
-,
az
a
anamnézis
cukorbetegség
alapján fennállása
-
előző szerint
vizsgálatunkhoz két
csoportba
osztottuk: •
DUR0 - 0 és 10 év közötti diabetes tartam (n=16 fő, tartam: 4,8±0,8 év, átlagéletkoruk 41,7±3,9 év)
•
DUR1 - 10 évnél régebben fennálló cukorbetegség (n=16 fő, tartam: 20,3±1,9 év, átlagéletkoruk 54,2±3,3 év) A
két
csoport
cukoranyagcseréjét
jellemző
éhomi
vércukor
és
glikozilált hemoglobin koncentrációk, valamint a testtömeg index nem különböztek szignifikánsan (14. táblázat).
14. táblázat Az
intravazális
antioxidáns
védelem
vizsgálatban
résztvevő
cukorbetegek klinikai adatai
BMI
vércukor
HbA1c
(kg/m2)
(mmol/l)
(%)
DUR0
26,0±1,0
7,95±1,10
6,34±0,41
DUR1
27,1±1,0
10,10±0,97
7,09±0,43
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki.
5. 2. típusú, inzulinnal kezelt cukorbetegek (absztrakt: 2) Összehasonlítottuk 22 2. típusú, inzulinnal kezelt cukorbetegben (DM, 13 nő és 9 férfi) és 13 nem cukorbeteg (kontroll, 8 nő és 5 férfi)
egyénben
(15.
táblázat)
a
glutation szintjét.
69
plazma
redukált
C-vitamin
és
15. táblázat 2.
típusú,
inzulinnal
kezelt
cukorbetegek
és
kontrollok
klinikai
adatai
esetszám
kor
BMI 2
vércukor
HbA1c
(év)
(kg/m )
(mmol/l)
(%)
Kontroll
13
35±5
20,6±0,9
4,84±0,18
4,67±0,11
DM
22
57±2
28,3±0,6
9,98±0,87
7,36±0,21
s
s
s
s
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0.05
6. 2. típusú cukorbetegek plazma vitaminszintjének vizsgálata (VII, absztrakt: 13, 19) A
plazmában
található
zsírban
és
vízben
oldódó
antioxidáns
vitaminok és a jelentős koncentrációjú kis molekulasúlyú antioxidáns anyagok
koncentrációját,
valamint
kapcsolatukat
a
szérum
lipid
a vizsgálatban, melybe 78 2. típusú
szintekkel tanulmányoztuk abban
cukorbeteget (39 férfi, 39 nő) és 44 egészséges egyént (19 férfi, 25 nő) vontunk be. A cukorbetegség átlagos tartama 8,6±1,91 év. Az
átlagos
HbA1c
szint
(6,85±0,20%)
jó
szénhidrát-anyagcsere
helyzetet jelzett. A
cukorbetegek
cukorbetegeket
közül
kizárólag
alcsoportokra
diétával
kezelt
bontottuk
nem
volt.
tovább:
A
orális
antidiabetikummal, tabletta és inzulin kombinációjával vagy inzulinnal kezeltekre. Diéta mellett szulfanilurea kezelésben (Gilemal tbl.: 12, Diaprel
tbl.:
3,
Glurenorm
tbl.:
1
beteg)
16
egyén
részesült,
szulfanilurea és biguanid (Gilemal tbl. és Adebit tbl.) kezelésben 9 fő.
Inzulint
kapott
43
beteg.
Az
inzulinkezelés
kizárólag
human
inzulinok (Actrapid HM, Insulatard, vagy Humulin R és N) adagolását jelentette.
6
fő
részesült
inzulin
(Humulin
U)
és
szulfanilurea
(Gilemal tbl.) kezelésben. A
vizsgált
személyeket
a
szérum
koleszterin
és
triglicerid
értékek alapján további csoportokra osztottuk: - kontroll (normális szérum koleszterin és triglicerid érték)
70
-
hiperlipémiás
kontroll:
szérum
koleszterin
>5,3
mmol/l
és/vagy
triglicerid >2,5 mmol/l - diabetes mellitus (normális szérum koleszterin és triglicerid érték) - diabetes mellitus hiperlipémiával: szérum koleszterin >5,3 mmol/l és/vagy se triglicerid >2,5 mmol/l. A
vizsgált
egyének
szénhidrát-anyagcseréjét
jellemző
paramétereket a 16. táblázat tartalmazza. Mindkét csoportba középkorú egyéneket vontunk be. A kontrollcsoport tagjai közé azok kerültek, akiket
egészségesnek
kívánalmak
miatt
találtunk,
a
gyógyszert
kontrollcsoport
nem
szedtek.
életkora
E
klinikai
alacsonyabb
volt
a
betegcsoporténál.
16. táblázat 2. típusú cukorbetegek és kontrollok klinikai adatai
életkor
BMI 2
vércukor
HbA1c
(év)
(kg/m )
(mmol/l)
(%)
Kontroll
38,34±2,34
23,59±1,02
5,15±0,13
4,66±0,04
DM
59,01±1,12
28,75±0,61
9,78±0,48
6,85±0,20
s
s
s
s
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0,05
7. 1. típusú cukorbetegek - plazma lipidfrakciók A- és E-vitamin koncentrációja (absztrakt: 23, 25, 26, 36, 37) A vizsgálatban résztvevők megegyeztek a 2. pontban ismertetettekkel. További - a lipidszintek alapján történő - alcsoportokra beosztásukat a 6. pontban leírtak szerint végeztük.
8.
C-vitamin
pótlás
vizsgálatban
résztvevő
cukorbetegek
(IX,
absztrakt 1) 36
személyt
vontunk
be
a
vizsgálatba,
valamennyien
részletes
kivizsgáláson vettek részt a vizsgálat előtt. 12 NIDDM és 7 IDDM beteg alkotta
a
cukorbeteg
kontrollcsoportként.
csoportot,
Éjszakai
17
éhezést
nem
cukorbeteg
követően
vénás
szolgált
vérmintákat
vettünk valamennyi résztvevőtől 2 nappal a vitaminpótlás megkezdése
71
előtt.
A
résztvevőket
megkértük,
hogy
az
eddig
alkalmazott
diétát
folytassák, és ne változtassanak cukorbetegségük kezelésén, hacsak nem szükséges.
Elrendeltük,
hogy
szedjenek
40
napig
reggeli
után
egy
aszkorbinsav pezsgőtablettát (1000 mg C-vitamin, Pharmavit Rt). A 41. napon ismét vénás vérmintákat gyűjtöttunk, és ugyanúgy dolgoztuk fel, mint korábban. Két beteg panaszkodott átmeneti emésztési zavarokra, de nem
volt
szükséges
megszakítani
a
kezelést.
Két
résztvevő
a
kontrollcsoportból nem jelent meg a 41. napon, így 34 beteg mérési eredményeit elemeztük.
Módszerek
1. Antioxidáns enzimek és vegyületek meghatározása A
teljes
vér
különböző
antioxidáns
összetevői
közül
a
következőket mértük: teljes vérben - glutation peroxidáz aktivitás vörösvérsejtekben - szuperoxid dizmutáz, kataláz aktivitás szérumban
és/vagy
plazmában
-
albumin,
bilirubin,
húgysav;
teljes
szulfhidril tartalom (SH csoportok); glutation reduktáz aktivitás; Avitamin, C-vitamin, E-vitamin; teljes antioxidáns státusz (TAS) Az éhgyomri, heparinos vérmintákat vérvétel után jéghideg vízben tartottuk,
a
plazmát
3000g-vel
10
percig
történő
centrifugálással
nyertük. A szedimentumot négy alkalommal mostuk 0.9% NaCl oldatban, a hemoglobin
koncentrációt
Haemisol
reagenssel
(Human)
mértük
meg,
valamennyi mintát 1% hemoglobin tartalmúra higítottuk.
A
teljes
vér
glutation
peroxidáz
aktivitást
Ransel
kittel
(Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság) mértük (IV, V; absztrakt: 2, 3, 10, 11, 24, 35). A glutation peroxidáz (Gpx) szelén dependens
enzim
(szelenoprotein),
mely
egy
specifikus
H
donort
-
glutationt - használ nem-specifikus szubsztrátok - H2O2, lipid és nemlipid
hidroperoxidok
redukálásához.
Gpx
aktivitás
mérhető
mind
a
vörösvértestekben, mind a plazmában. Ez a módszer Paglia és Valentine módszerén alapszik (223): A glutation peroxidáz katalizálja a glutation cumene hidroperoxid általi oxidációját. glutation
Glutation
azonnal
reduktáz
redukált
és
formába
NADPH
jelenlétében
alakul
és
a
az
NADPH
oxidált NADP+-vé
oxidálódik. Az abszorbancia csökkenés fotometriásan 340 nm-n mérhető.
72
A kit higító anyagával történt higítást követően Haemisol reagenst (Fe-cianid) (Human Rt., Gödöllő) adtunk a mintákhoz. Az aktivitást U/ml teljes vérben fejezzük ki. Kit: RANSEL, Randox CatNo RS504 Minta: 50 ml heparinos teljes vér, -20 °C-on két hétig tárolható. vörösvértest
A
szuperoxid
dizmutázt
1%
hemoglobin
tartalmú
vörösvértest szuszpenzióból Ransod kittel (Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság) mértük (IV, V; absztrakt: 2, 3, 10, 11, 24,
35)
A
szuperoxid
folyamatok
során
dizmutációjának oxigénre.
dizmutáz
(SOD)
keletkező,
elősegítése
Számos
szerepe
mérgező
hidrogén
betegségben
köztük
az
oxidatív
szuperoxid peroxidra
diabetesben
energia
gyök
és
(O2)
molekuláris
számoltak
be
a
vörösvértest SOD megváltozásáról. Ez a módszer xantint és xantin oxidázt használ szuperoxid gyökök képzésére,
a
szuperoxid
gyök
2-(4-jodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-
feniltetrazolium kloriddal reagál és azt egy vörös formazán festékké alakítja.
A
szuperoxid
dizmutáz
aktivitás
mérése
fenti
reakció
gátlásának mértékén alapul. Az eredményeket vagy SOD aktivitás U/ml vér vagy U/g hemoglobin -ként fejezhetjük ki. Kit: RANSOD, Randox CatNo SD125 Minta: azonos térfogatú (0,5 ml) heparinos teljes vérből szeparált és 0.9% NaCl oldatban négyszer mosott vörösvértestek. A vörösvértesteket ezután (2 ml) hideg bidesztillált víz hozzáadásával lizáljuk. Ezen a ponton a minták fagyaszthatóak és -20 °C-on két hétig tárolhatóak. A
vörösvértest
hidrogén-peroxid
kataláz
bontásának
aktivitást mérésével
Aebi
(219)
határoztuk
módszerével meg
(IV,
a V;
absztrakt: 2, 3, 10, 11, 24, 35). Valamennyi
enzimaktivitást
g/hemoglobinra
vonatkoztatva
adtunk
meg. A plazma teljes antioxidáns statuszának meghatározására Randox TAS
kitet
(Randox
Laboratories
Ltd.,
Antrim,
Egyesült
Királyság)
használtunk (IV, V; absztrakt: 2, 3, 10, 11, 24, 35). Az
Abst
{azino-bis-etil-benzo-tiazolin-szulfonsav}
peroxid
(metmyoglobin) és H2O2 hozzáadásakor Abts+ kation gyökké alakul. Ennek viszonylag stabil kékeszöld színe van, mely kolorimetriásan 600nm-n mérhető.
A
hozzáadott
színesedést
csökkentik,
antioxidáns
kapacitást
mintában
található
koncentrációjukkal egy
vízoldékony
73
antioxidánsok arányos
E-vitamin
ezt
mértékben. analógéhoz,
a Az a
troloxhoz hasonlítjuk, és azzal a trolox koncentrációval fejezzük ki, mely azonos csökkenést okoz a gyökképződésben. Kit: Total Antioxidant Status, Randox CatNo NX 2332 Minta:
20
ml
frissen
vett
heparinos
plazma,
48
órán
keresztül
tárolható +4 °C-on vagy két hétig -20 °C-on. A plazma glutation reduktáz meghatározására Randox Glutathione Reductase kitet (Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság) használtunk (absztrakt: 22, 33). A
glutation
reduktáz
meghatározás
használatos
lehet
rosszindulatú
daganatos és májbetegségekben, a táplálkozás megítélésében (riboflavin státusz
meghatározása)
és
genetikailag
meghatározott
hiányállapotok
feismerésében. Fontos megbizonyosodnunk, hogy az enzim hiányállapotát nem a riboflavin hiánya okozza-e. A
meghatározás
glutation
(GSSG)
elve:
a
redukcióját
glutation NADPH
reduktáz
katalizálja
jelenlétében,
a
NADP+-vé
mely
oxidálódik. Az abszorbancia csökkenés 340 nm-n mérhető. Az aktivitást U/l-ben fejezzük ki. Kit: Glutathione Reductase, Randox CatNo GR 2368 Minta:
20
ml
frissen
vett
heparinos
plazma,
48
órán
keresztül
tárolható +4 °C-on A plazma redukált glutation szintjét módosított (aszkorbinsav a redukált
formában
tartáshoz,
glioxilsavas
inkubáció
a
többi
béta-
amino-tiol kiiktatásához) Ellmann reakcióval határoztuk meg (224)(IX, absztrakt: 2). A
plazma/szérum
spektrofotometriásan
teljes Ellman
szulfhidril reagenssel
tartalmát
mértük
(SH
csoportok)
(absztrakt:
24,
35)
(217).
2. Vitaminszintek vizsgálata (VII, absztrakt: 13, 19, 23, 25, 26, 36, 37) A
vitaminszintek
meghatározásához
heparinnal
alvadásgátolt
plazmát használtunk, melyet feldolgozásig fagyasztva tároltunk (alfatokoferol: -20 °C, retinol és aszkorbinsav -70 °C ). A
plazma
izokratikus (Labor
MIM)
A-
magas
és
E-vitamin
nyomású
mértük.
Az
szintjét
folyadék
elválasztás
Liquochrom
kromatográf reverz
(HPLC)
fázisú,
modell
2010
berendezésen
BST
Rutin
C18
töltetű 250x4mmol/l, 10 µm szemcseméretű (Bio-Szeparációs és Technikai
74
Kft.) kolonnán történt. Az alfa-tokoferol koncentráció meghatározáshoz a Shearer által leirt metodikát magunk módosítottuk (225, III), az anyagok mennyiségét megkétszereztük, és az extraktumot hűtött rotációs vákuum bepárlással koncentráltuk. A retinol koncentrációját kétszeres kloroformmal
történt
extrakciót
követően
határoztuk
meg
325
nm-n.
Standardként all-trans-retinolt és alfa-tokoferolt, belső standardként all-trans-retinil-acetátot és alfa-tokoferil-acetátot (Sigma Chem Co., St.
Louis,
MO,
Amerikai
Egyesült
Államok)
használtunk.
A
módszer
kontrollálására az ún. Sample Weight Test-el történt. A plazma C vitamin mérésekre kétféleképpen került sor: 1.) Az aszkorbinsav (AA) redukált formában tartásához a teljes vérhez azonnal ditiotreitol
(DTT)
oldatot
adtunk.
A
plazma
C
vitamin
szintjét
triklórecetsavval történő deproteinizálás után α-α‘-dipyridil és FeCl3 oldatok hozzáadásával dehidroaszkorbinsavvá (DHAA) oxidálást követően kolorimetriásan mértük (226); 2.) Az aszkorbinsavat HPLC készüléken Harapanhalli
által
leírt
módszerrel
határoztuk
meg
(227).
Metafoszforsav puffert adtunk valamennyi plazmamintához. A keveréket lecentrifugáltuk oszlopra. úgy,
és
a
Valamennyi
hogy
a
kettő
tisztított
felülúszót
plazmamintából közül
az
két
injektáltuk
preparátumot
egyikhez
ditiotreitolt
a
HPLC
készítettünk, adtunk,
hogy
redukálja a DHAA-t, és ily módon a plazma teljes AA tartalma volt nyerhető. A másik minta DTT mentes volt, így a nem redukált AA volt mérhető.
DHAA
egyenlő
a
teljes
AA
és
a
nem
redukált
AA
közötti
különbséggel.
3. Lipidperoxidáció meghatározása (IV, V, absztrakt: 8, 9) A
lipidperoxidáció
tiobarbitursav mtsai
reaktív
módszerével
hidrogén
anyagainak
mértük
peroxiddal
mértékének
90
0,02
(TBARS)
mmol/l
percig
meghatározásához koncentrációját
rézacetáttal
történt
inkubációt
és
plazma
a
Pyles
0,88
és
mmol/l
követően;
az
eredményeket µmol/l TBARS-ként fejeztük ki (228).
4. Klinikai laboratóriumi paraméterek A vércukrot glükóz-oxidáz módszerrel (Boehringer-Mannheim GmbH, Mannheim,
Németország),
a
szérum
triglicerid
(GPO-PAP,
Boehringer-
Mannheim GmbH, Mannheim, Németország), a szérum koleszterin (CHOD-PAP, Boehringer-Mannheim
GmbH,
Mannheim,
75
Németország),
a
HDL-koleszterin
(foszfowolframat-MgCl2-os meghatározás, Németország), Hitachi
717
Roche a
kicsapás +
szérum
enzimatikus
Boehringer-Mannheim
albumin,
automatán
immunturbidimetriával
után
bilirubin
és
mértük.
A
kolorimetriás
GmbH,
Mannheim,
húgysav
koncentrációt
HbA1c
mennyiségét
(Boehringer-Mannheim
GmbH,
Mannheim,
Németország) határoztuk meg (IV, V, VII, IX, absztrakt: 2, 3, 10, 11. 13, 19). A vércukor, a szérum triglicerid, a szérum koleszterin, a HDLkoleszterin, a húgysav, az albumin mérése Hitachi 717 laboratóriumi automatán (Diapack, Dialab GmbH, Bécs, Ausztria), az LDL-koleszterin mérése
precipitációs
módszerrel,
kolorimetriával
(BioMerieux,
Marcy
l’étoile, Franciaország), a HbA1c meghatározása Abbot IMX analyseren (Abbot Laboratories, Abbot Park, Illinois, USA; referenciaérték: 4,46,4 %) történt (XIV, absztrakt: 23, 25, 26, 36,37).
5. Statisztikai számítások A csoportok közti különbségek értékelésére kétmintás t-próbát és egyszempontos variancia analízist post hoc LSD összehasonlítással, a vizsgált
paraméterek
közti
kapcsolatok
korreláció analízist végeztünk a SIMSTAT
elemzésére
statisztikai
Spearman's programcsomag
segítségével. A C-vitamin pótlás hatásának vizsgálatakor - two way, repeated measures ANOVA és programot
használtuk.
korreláció
Valamennyi
analízis
-
vizsgálatban
elvetettük, ha valószínűsége kisebb volt, mint 0,05.
76
a a
CSS
Statistica
null-hipotézist
Eredmények
(A) Oxigén és nitrogén központú szabadgyökreakciók és az antioxidáns rendszer vizsgálata gasztroenterológiai betegségekben 1. Emelkedett plazma nitrát/nitrit szint krónikus gastritisben és peptikus fekélybetegségben, összefüggés a Helicobacter pylori státusszal és a Helicobacter pylori eradikációval (absztrakt: 7, 12) A plazma nitrát/nitrit szintek szignifikánsan magasabbak voltak peptikus
fekélybetegekben
gastritisben
oesophagitisben (28±3
µmol/l,
vetettük
µmol/l,
(47±18
n=9)
össze,
emelkedtek,
grade
III=113±56
µmol/l).
szintekben
a
n=23), n=6)
plazma a
volt
a
grade
különbség (Hp.)
krónikus
összehasonlítottuk
szintek
grading-gel
szignifikánsan
súlyossága II= a
progrediált
µmol/l,
49±21 plazma
pozitiv
reflux
tünetegyüttesben
hisztológiai
gastritis
pylori
és/vagy
dyspepsiás
Ha
µmol/l,
I=44±14
Helicobacter
n=12)
nitrát/nitrit
krónikus
Nem
ha
vagy
szenvedőkével.
a
ahogy
(hisztológiai
µmol/l,
(33±5
µmol/l,
(87±48
grade
nitrát/nitrit
(n=32)
és
negatív
(n=18) betegek között (61±39 µmol/l vs. 42±18 µmol/l). Sikeres Hp. eradikáció gastritisben
sem
peptikus
(n=5)
nem
fekélybetegekben változtatta
meg
(n=5), az
sem
krónikus
emelkedett
plazma
nitrát/nitrit szinteket.
2. Helicobacter pylori státusz és szöveti nitrát/nitrit szintek, szuperoxid gyökfogó aktivitás és szulfhidril csoportok peptikus fekélybetegségben
vagy
funkcionális
dyspepsiában
szenvedő
betegekben (absztrakt: 20) A szöveti nitrát/nitrit szignifikánsan magasabb, gyökfogó
aktivitás
alacsonyabb
Hp.
(SSA)
pozitív
és
a
peptikus
szulfhidril fekélyben
csoportok szenvedő
a
szuperoxid
szintje
(SH)
betegekben,
ha
funkcionális dyspepsiával vetjük össze (17. táblázat). A Hp. pozitív betegeknek szignifikánsan magasabb nitrát/nitrit és alacsonyabb SH szintje van, mint a Hp. negatívoknak (18. táblázat).
77
A szöveti nitrát/nitrit alacsonyabb, és az SSA és SH magasabb Hp.
eradikáció
után,
de
az
értékek
nem
érik
el
a
statisztikai
szignifikancia határát (19. táblázat). A szöveti nitrát/nitrit emelkedés
és
az
SSA
és
SH
csökkenés
specifikus a fekély helyén, de az értékek nem érik el a statisztikai szignifikancia határát (20. táblázat). 0,5 nmol szenzitivitásnál nitrotirozin nem volt kimutatható a gyomorbiopsiás mintákban.
17. táblázat Szöveti
szuperoxid
gyökfogó
aktivitás
(SSA),
teljes
szulfhidril
tartalom (SH) és nitrát/nitrit szintek peptikus fekélybetegekben és funkcionális dyspepsiában
SSA
SH
nitrát/nitrit
(U/mg prot)
(µmol/mg prot)
(µmol/mg prot)
10,2±3,3
56±26
645±89
17,8±5,7
84±23
434±67
*
*
*
peptikus fekély (n=14) funkcionális dyspepsia (n=16)
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg. *: szignifikáns különbség, p<0,05 18. táblázat Szöveti
szuperoxid
tartalom
(SH)
és
gyökfogó
aktivitás
nitrát/nitrit
szintek
(SSA),
teljes
Helicobacter
szulfhidril
pylori
szerint
H. pylori
SSA
SH
nitrát/nitrit
státusz
(U/mg prot)
(µmol/mg prot)
(µmol/mg prot)
pozitív
11,3±4,2
58±32
567±103
15,2±6,2
81±24
466±89
*
*
(n=21) negatív (n=9)
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg. *: szignifikáns különbség, p<0,05
78
státusz
19. táblázat Szöveti
szuperoxid
gyökfogó
aktivitás
(SSA),
teljes
szulfhidril
tartalom (SH) és nitrát/nitrit szintek Helicobacter pylori eradikáció előtt és után
H. pylori
SSA
SH
nitrát/nitrit
eradikció
(U/mg prot)
(µmol/mg prot)
(µmol/mg prot)
11,3±4,2
58±32
567±103
14,5±5,8
71±38
518±129
előtt (n=21) után (n=20)
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg.
20. táblázat Szöveti
szuperoxid
gyökfogó
aktivitás
(SSA),
teljes
szulfhidril
tartalom (SH) és nitrát/nitrit szintek a fekély helyéről és a nem fekélyes szövetből
Szövet
SSA
SH
nitrát/nitrit
(U/mg prot)
(µmol/mg prot)
(µmol/mg prot)
fekély területéről
10,2±3,3
56±26
645±89
nem fekélyes szövet*
13,5±4,8
78±36
554±17
a betegek száma: 14 *krónikus aktív gastritis Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg.
3.
A
plazma
nitrát/nitrit
szintek
colorectalis
carcinomában
szenvedő betegekben (XII)
Amennyiben valamennyi beteg adatait figyelembe vettük, nem volt statisztikailag egészséges
szignifikáns
kontrollok
plazma
különbség
a
nitrát/nitrit
40,00±3,89 vs. 38,18±3,36 µmol/l, p=0,07).
79
betegek szintje
(n=29) között
és
az
(n=13,
Ha akiknek
a
betegek
daganatát
alcsoportjait
vizsgáltuk,
több,
6
mint
hónappal
azoknak a
a
betegeknek,
vizsgálat
előtt
diagnosztizálták (n=11) szignifikánsan magasabb plazma nitrát/nitrit szintjük volt, mint akiket a vizsgálatot megelőzően 6 hónapon belül diagnosztizáltak (n=18, 50,47±10,08 vs. 34,34±2,17 µmol/l, p=0,03). Azok a betegek, akik a vizsgálatot megelőző egy hónapon belül kemoterápiában
részesültek
(n=15)
szintén
szignifikánsan
magasabb
nitrát/nitrit szinttel rendelkeztek, mint akik az utóbbi 4 hétben nem kaptak kemoterápiát (n=14, 47,91±7,78 vs. 33,34±2,52 µmol/l, p=0,04). Továbbá, a plazma nitrát/nitrit szintje magasabb volt a betegek azon alcsoportjában is, akik műtéten nem estek át (n=15), mint azoknak akiket egy hónapon belül operáltak (n=14, 45,67±6,88 vs. 33,68±2,90 µmol/l, p=0,047). A betegek azon alcsoportjában, akik nitroglicerint szedtek (5-10 mg/nap) magasabb volt a plazma nitrát/nitrit szintje, de a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (41,76±7,17 vs. 35,73±2,20 µmol/l, p=0,067). Nem
volt
alcsoportjai
statisztikailag
között,
akár
a
szignifikáns
daganat
különbség
lokalizációja,
a
akár
betegek stádiuma
alapján elemeztük (21. táblázat).
21. táblázat Plazma nitrát/nitrit szintek colorectalis carcinomában szenvedő betegekben
Tumor lokalizáció
Plazma nitrát/nitrit
Kontroll
n=13
38,18±3,36
Colon
n=14
44,29±7,71
Rectum
n=13
32,35±2,04
Stádium
Az
Plazma nitrát/nitrit
Kontroll
n=13
38,18±3,36
Dukes B, C
n=14
39,20±5,09
Dukes D
n=15
40,89±6,25
eredményeket
átlag
±
SEM
(µmol/l)
találtunk szignifikáns különbséget.
80
értékben
fejeztük
ki.
Nem
4.
A
plazma
nitrát/nitrit
szint
és
az
antioxidáns
védelem
colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségekben (VIII, XIII, absztrakt: 15, 18) A colorectalis carcinomás betegek és a colitis ulcerosás betegek plazma
nitrit/nitrát
szintje
egyaránt
szignifikánsan
nagyobb
volt,
mint az egészséges személyeké (51,2±26,2 vs. 29,6±6,3 µmol/l, p<0,01). A plazma szuperoxid gyökfogó aktivitása (SSA) és teljes szulfhidril tartalma (SH) egyaránt szignifikánsan csökkentebb volt a betegekben, mint egészségesekben (SSA: 39±11,5 vs. 88±25,1 U/g protein, SH: 7,7± 3,89 vs. 10,9±4,14 µmol/mg protein, p<0,01) (22. táblázat és 6. ábra A-C.).
22. táblázat A
plazma
tartalma
szuperoxid (SH)
és
gyökfogó
aktivitása
nitrát/nitrit
szintje
(SSA),
teljes
colorectalis
szulfhidril
carcinomában,
colitis ulcerosában (UC) és kontroll egyénekben
SSA
SH
nitrát/nitrit
(U/g protein)
(µmol/mg protein)
(µmol)
88±25,1
10,9±4,14
29,6±6,3
Carcinoma (n=69)
39±11,5 *
7,7±3,89 *
51,2±26,2 *
UC (n=20)
52±18,9 *
6,4±2,1 **
56,0±14,6 **
Kontroll (n=30)
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg. Szignifikáns különbség (*: p<0.05, **: p< 0.01) a csoportok között
6. ábra A-C. A
plazma
tartalma
szuperoxid (SH)
és
gyökfogó
aktivitása
nitrát/nitrit
szintje
colitis ulcerosában és kontrollokban
81
(SSA),
teljes
colorectalis
szulfhidril
carcinomában,
Nem volt szignifikáns különbség az NO releasing készítményeket (pl. nitroglicerin) szedő és nem szedő betegek plazma nitrát/nitrit szintje között. A
betegek
alcsoportjait
tekintve
(módosított
Dukes-féle
klasszifikáció), a daganat kiterjedésével párhuzamosan nőtt a plazma nitrát/nitrit
szintje
és
csökkent
a
plazma
SH.
Ezek
az
eltérések
azonban nem érték el a szignifikancia határát (23. táblázat).
23. táblázat A
plazma
szuperoxid
tartalma szenvedő
(SH)
és
gyökfogó
aktivitása
nitrát/nitrit
betegekben,
az
(SSA),
szintje
Astler-Coller
által
teljes
szulfhidril
colorectalis
daganatban
módosított
Dukes
féle
klasszifikáció szerinti csoportosításban
SSA
SH
nitrát/nitrit
(U/g protein)
(µmol/mg protein)
(µmol)
Dukes B
36,3±8,75
8,24±5,26
52,76±24,49
Dukes C
43,87±20,1
6,54±1,92
37,77±16,74
Dukes D
40,1±12,38
7,77±3,14
54,86±29,36
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg. Nem volt szignifikáns különbség a plazma nitrát/nitrit, SSA, SH szintekben, ha a daganatos betegek alcsoportjait vizsgáltuk a nemek, a diagnózis
időpontja,
a
daganat
elhelyezkedése
vagy
az
alkalmazott
kezelés szerint. A nitrát/nitrit szintek azonban szignifikánsan
magasabbak,
az
SSA és SH szintek alacsonyabbak voltak a nagyobb aktivitású colitis ulcerosában (7. ábra).
7. ábra A
plazma
szuperoxid
gyökfogó
aktivitása
(SSA),
teljes
szulfhidril
tartalma (SH) és nitrát/nitrit szintje különböző súlyosságú/aktivitású colitis ulcerosában szenvedő betegekben
* p< 0,05
1 vs. 3
** p< 0,01
1 vs. 3
1 = enyhe aktivitás, 2 = közepes aktivitás, 3 = súlyos aktivitás (Truelove-Witts-féle beosztás)
82
Szignifikáns
negatív
korrelációt
találtunk
a
vörösvérsejt
süllyedés és a plazma SH tartalma között (r=0,526, p<0,01) (8. ábra). Nem
volt
összefüggés
koncentrációk
és
a
kimutatható további
a
mért
plazma rutin
nitrát/nitrit,
laboratóriumi
SSA,
SH
paraméterek
(hemoglobin, vörösvérsejtszám, fehérvérsejtszám, összfehérje, albumin, májfunkciós értékek) között.
8. ábra Korreláció a vörösvérsejt süllyedés és a plazma teljes szulfhidril csoport tartalma között r=0,526 p< 0,01
110 Vörösvérsejt süllyedés [mm/h]
100
y = -3.0504x + 61.498 r =- 0.526 p<0.01
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
10
20
SH [ µ M/m g protein]
83
5.
Colorectalis
tumorszövet
szuperoxid
gyökfogó
aktivitása,
nitrát/nitrit és szulfhidril csoport tartalma (absztrakt: 21, 22) A szöveti SH csökkent és az SSA emelkedett az előrehaladottabb esetekben.
Statisztikailag
szignifikáns
különbséget
(p<0,01)
figyeltünk meg az SSA-ban a Dukes B és C, valamint a B és D stádium között (24. táblázat).
24. táblázat A
tumorszövet
tartalma
és
szuperoxid
gyökfogó
nitrát/nitrit
betegekben,
az
szintje
Astler-Coller
aktivitása,
teljes
colorectalis által
szulfhidril
daganatban
módosított
szenvedő
Dukes
féle
klasszifikáció szerinti csoportosításban
Betegek
SH
SSA
Nitrát/nitrit
száma
(µmol/mg prot)
(mU/mg prot)
(µmol)
Dukes B
19
126±183
11,1±8,6
7,11±0,9
Dukes C
6
71±38
18,7±14,6*
7,52±1,3
Dukes D
6
47±52
18,8±5,3*
7,56±0,8
Az eredményeket átlag ± SD értékben adtuk meg. Szignifikáns különbség (*: p< 0,01) a csoportok között
Nem betegek
volt neme,
összefüggés a
tumor
a
fenti
paraméterek
lokalizációja,
vagy
és
az
életkor,
bármely
mért
összefüggés
a
a
rutin
laboratóriumi paraméter között. Nem
volt
statisztikailag
szignifikáns
betegek
plazma és szöveti (daganatszövet) nitrát/nitrit, SSA és SH szintjének összevetése során, azonban szignifikáns negatív
korrelációt
tudtunk
kimutatni a plazma nitrát/nitrit koncentrációja és a daganatszövet SSA szintje között (r=-0,570, p<0,05).
84
6. Peroxinitrit
kimutatása
colorectalis
tumorszövetben
(VIII,
XIII, absztrakt: 15, 17) Nitrotirozin jelenléte 7 alkalommol/lal volt kimutatható a 32 vizsgált
tumorszövetben
(9.
ábra).
A
plazmában
és
a
többi
daganatszövetben azonban a nitrotirozin nem volt kimutatható. Nem volt különbség a nitrotirozin jelenlétében vagy hiányában a daganatos betegek alcsoportjai között, amikor az életkort, nemet, vagy más
rutin
laboratóriumi
paramétert
vizsgáltunk.
Nem
találtunk
összefüggést a nitrotirozin jelenléte, illetve hiánya és a szövet SH, SSA, nitrát/nitrit szintje között.
9. ábra Vastagbél
adenocarcinoma
hidrolizált
szöveti
homogenizátum
reprezentációs HPLC képe Abszorpció: 365 nm, Erősítés: 8-12 mV, Késési idő: 0 perc A = nitrotirozin nincs a mintában B = nitrotirozin van a mintában A nitrotirozin abszorpciós spektruma 5,8 percnél jelentkezik.
85
7. Antioxidáns védelem colorectalis daganatokban (absztrakt: 4, 8) Az
antioxidáns
szuperoxid valamint
dizmutáz a
enzimaktivitások és
a
plazmában
vörösvértestek
-
mért
glutation
vörösvértest glutation
szintje
kataláz,
peroxidáz
nem
-,
különböztek
szignifikánsan a három csoportban (egészségesek, Dukes B, C és Dukes D). A plazma össz-gyökfogó kapacitása szignifikánsan alacsonyabb volt mind a Dukes B,C (p=0,0002), mind a Dukes D csoportban (p=0,0000) a kontroll csoporthoz viszonyítva, és szignifikáns különbséget tudtunk kimutatni
a
két
betegcsoport
között
is
(p=0,0466)
(25.
és
26.
táblázat).
25. táblázat Plazma glutation peroxidáz enzim aktivitás, össz-scavenger kapacitás és
a
szérum
kis
molekulasúlyú
antioxidánsainak
koncentrációja
colorectalis carcinomában szenvedő betegekben
Kontroll
Dukes B,C
Dukes D
n=13
n=13
n=15
Albumin (g/l)
46,0±0,65**,^^
38,2±1,87**
37,3±2,82^^
µmol/l) Bilirubin (µ
14,8±1,09
17,0±0,00
58,9±31,83
µmol/l) Húgysav (µ
207,9±21,78
259,5±28,98
265,0±18,36
Gpx (ng/ml)
69,05±7,14
54,20±8,20
TSC (%)
57,9±1,54**,^^
43,49±1,96**,
51,27±7,19 +
36,80±2,5^^,+
Az eredményeket átlag ± SEM fejeztük ki. Szignifikáns különbség (*,^,+: p<0,05 **,^^,++: p< 0,01) a csoportok között *Kontroll vs. Dukes B,C; ^Kontroll vs. Dukes D; +Dukes B,C vs. Dukes D TSC:
össz-scavenger
kapacitás;
az
eredményeket
100-relatív
fény
intenzitás %-ában fejeztük ki (az integrált fényintenzitás csökkenés százaléka)
86
26. táblázat Erythrocyta
glutation
szint
(GSH),
szuperoxid
dizmutáz
(SOD)
és
kataláz (CAT) enzim aktivitás colorectalis carcinomában
Kontroll
Dukes B,C
Dukes D
n=13
n=13
n=15
GSH (%)
100±12,73
162±46,22
204±43,64
SOD (U/ml)
2,25±0,13
2,37±0,09
2,33±0,16
CAT (k/g Hb)
1,76±0,10
1.96±0.11
2.03±0.10
Az eredményeket átlag ± SEM fejeztük ki.
A
szérum
kis
molekulasúlyú
antioxidáns
vegyületei
közül
a
bilirubin és a húgysav nem különböztek szignifikánsan, de a szérum albumin szint mindkét betegcsoportban szignifikánsan alacsonyabb volt a kontrollokhoz viszonyítva (25. táblázat). Két daganatos beteg a D stádiumú
csoportból
rendelkezett,
ennek
extrém ellenére
emelkedett
szérum
nekik
a
volt
bilirubin
legalacsonyabb
értékkel a
plazma
össz-scavenger kapacitásuk. A
két
betegcsoportot
egymással
összehasonlítva
a
D
stádiumú
betegekben szignifikánsan magasabb CEA értéket találtunk: 110,9±31,7 ng/ml vs. 2,98±0,96 ng/ml, p<0,005). Az
státusz
antioxidáns
időbeli
változását
mutatva,
össz-scavenger kapacitása szignifikánsan alacsonyabb volt
a
plazma
azokban
a
betegekben, akiknek daganatát a vizsgálatot megelőző 6 hónapon belül diagnosztizálták: kontroll: 57,9±1,54 % vs. tumor diagnózis 6 hónapon belül:
36,32±2,41
plazma
glutation
kataláz
%
vs.
tumor
peroxidáz
emelkedett,
azokban
diagnózis
aktivitása a
régebben:
csökkent,
betegekben,
akik
míg
46,36±1,85 a
%.
A
vörösvérsejt
hosszabb
daganatos
anamnézissel rendelkeztek, kontrollokkal összehasonlítva: 93,89±25,69 ng/ml vs. 44,32±6,61 ng/ml, p=0,045 és 2,12±0,14 k/gHb vs. 1,76±0,10 k/gHb, p=0,035. Nem paraméterben
volt sem
különbség a
egyetlen
betegcsoportok
más
vizsgált
között,
akár
antioxidáns a
daganat
lokalizációját, a diagnózis idejét, vagy a műtét idejét elemeztük.
87
(B) Az antioxidáns rendszer vizsgálata diabetes mellitusban 1.
Intenzifikált
inzulin
kezelésben
részesülő
1.
típusú
cukorbetegek antioxidáns státusza
1.1
Jól
(HbA1c=6,06±0,48%)
kontrollált
1.
típusú
cukorbetegek
antioxidáns státusza (IV, absztrakt: 11)
Az
aterogén
index
(összkoleszterin/HDL
koleszterin)
gyakorlatilag ugyanakkora volt a beteg- és a kontrollcsoportban (3,05 vs.
3,08).
A
szérum
egyik
fontos
antioxidánsának,
a
húgysavnak
a
szintje alacsonyabb volt a cukorbeteg csoportban (188 vs. 156 µmol/l), de a különbség nem volt szignifikáns (p=0,01)(27. táblázat).
27. táblázat Jól kontrollált 1. típusú cukorbetegek és kontrollok aterogén indexe, valamint a szérum néhány antioxidáns vegyületének koncentrációja
n
LDL
Aterogén
Bilirubin
Albumin
húgysav
(mmol/l)
index
(µmol/l)
(g/l)
(µmol/l)
Kontroll
17
2,55±0,16
3,05±0,20
11,44±1,21
47,1±0,6
187,8±12,0
IDDM
11
2,84±0,30
3,08±0,24
13,00±2,20
46,4±0.9
156,4±15,1
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki.
Az antioxidáns enzim aktivitások (vörösvértest SOD és kataláz, teljes vér Gpx) nem különböztek a két csoportban. Hasonlóan a teljes antioxidáns
státusz
(TAS)
-
a
plazma
össz-antioxidáns
védelmének
mértéke - és a TBA reaktív anyagok koncentrációja (TBARS) sem volt statisztikailag
különböző
a
kontrollokban
táblázat és 10. ábra).
88
és
cukorbetegekben
(28.
28. táblázat Az
antioxidáns
peroxidáz status
enzimekek
(Gpx),
(TAS)
és
kataláz a
–
szuperoxid
(CAT)
–
dizmutáz
aktivitása,
thiobarbitursav
reaktív
a
(SOD), teljes
anyagok
glutathion antioxidáns
koncentrációja
(TBARS) jól kontrollált 1. típusú cukorbetegekben és kontrollokban
SOD
Gpx
CAT
TAS
TBARS
(U/gHb)
(U/gHb)
(k/gHb)
(mmol/l)
(µmol/l)
Kontroll
783±595
44,1±4,8
1,17±0,07
0,80±0,17
3,60±0,34
IDDM
797±689
37,1±8,5
1,28±0,07
0,72±0,14
3,82±0,27
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. Nem volt szignifikáns különbség a csoportok között.
89
1.2. Megfelelően kontrollált (HbA1c=7,89±2,53%) 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza (absztrakt: 24, 35)
A szérum fontos antioxidánsai
közül
a
húgysav
és
az
albumin
szint, valamint a szérum teljes szulfhidril tartalma szignifikánsan alacsonyabb volt a cukorbeteg csoportban (287 vs. 224 µmol/l, 53 vs. 50 g/l, és 7,39 vs 6,66 mmol/g prot) (p<0,001; p<0,05; és p<0,001). Az antioxidáns
enzim
aktivitások
közül
csak
a
teljes
vér
glutation
peroxidáz bizonyult csökkentebbnek a diabeteses egyénekben (56 vs 51 U/gHb, p<0.05), míg a vörösvértestek szuperoxid dizmutáz és a plazma glutation teljes
reduktáz
antioxidáns
aktivitása státusz
nem
sem
különböztek volt
a
két
statisztikailag
csoportban.
A
különböző
a
kontrollokban és cukorbetegekben (29. táblázat).
29. táblázat Antioxidáns vegyületek koncentrációja, antioxidáns enzimek aktivitása és
a
teljes
antioxidáns
státusz
megfelelően
kontrollált
1.
típusú
cukorbetegekben és kontrollokban
Bilirubin
Húgysav
Albumin
SH-csoportok
(µmol/l)
(µmol/l)
(g/l)
(mmol/g prot)
9,73±4,47
287,6±73,1
53,3±3,6
7,39±1,13
11,92±9,22
224,4±52,3
49,9±7,3
6,66±1,37
s
s
s
Gpx
SOD
GR
TAS
(U/g Hb)
(U/g Hb)
(U/l)
(mmol/l)
Kontroll
56,6±10,3
996±320
52,7±7,2
1,93±0,10
DM
50,7±12,2
912±141
52,1±10,8
1,92±0,11
Kontroll DM
s
Az eredményeket átlag ± SD értékben fejeztük ki. A szignifikáns különbséget jelöltük: s, p<0,05
90
2. A cukorbetegség klinikai fennállási időtartamának hatása a vér antioxidánsaira (V, absztrakt: 10). A
klinikai
koncentráció
és
kémiai az
tesztek
aterogén
alapján
index
a
szérum
glükóz,
szignifikánsan
a
HbA1c
emelkedett
volt
mindkét cukorbeteg csoportban kontrollokkal összehasonlítva. A
szérum
albumin
szignifikánsan
alacsonyabb
volt
a
2-es
-
régebb óta cukorbeteg - csoportban a kontroll csoporthoz képest, de más alacsony molekulasúlyú anyagok koncentrációja, így a húgysav és a bilirubin nem mutatott szignifikáns különbséget (30. táblázat).
30. táblázat Az
aterogén
index,
az
antioxidáns
vegyületek
koncentrációja
és
a
tiobarbitursav reaktív anyagok koncentrációja (TBARS) cukorbetegekben (1-es és 2-es csoport) és kontrollokban (0-ás csoport)
0 csoport 1
Aterogén
Kreatinin
Albumin
Húgysav
Bilirubin
TBARS
index
(µmol/l)
(g/l)
(µmol/l)
(µmol/l)
(µmol/l)
3,02±0,24
97,2±3,1
47,3±0,6
**
*
3,59±0,22
csoport 2
191,0±14,3 11,53±1,46 31,1±0,17
94,8±3,1
*
46,3±0,5
196,4±12,0 13,84±1,65 4,15±0,30
4,54±0,32 108,1±11,4 45,06±0,7 193,0±13,6
csoport
*
*
9,41±0,58
3,46±0,24
^^
**, ^^
*
*
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. A statisztikailag különböző csoportok jelölve:
*, ^
p<0,05
**, ^^
p<0,005
A mért antioxidánsok közül a vörösvértest szuperoxid dismutáz (SOD) aktivitása és a plazma teljes antioxidáns státusz (TAS) volt szignifikánsan
alacsonyabb
összehasonlítva, vörösvértest
míg
a
kataláz
a
2-es
teljes (CAT)
vér
csoportban glutation
aktivitások
nem
az
1-es
peroxidáz
csoporttal (Gpx)
különböztek
és
a
a
három
p<0,05)
volt
csoportban (11. ábra). Szignifikáns
negatív
összefüggés
(r=-0,33
megfigyelhető a TAS és a betegség fennállási ideje között (12. ábra).
91
3.
Az
intravazális
antioxidáns
védelem
vizsgálata
inzulinnal
kezelt cukorbetegekben (absztrakt: 3) A
régebb
óta
cukorbeteg
-
DUR1
-
csoportban
szignifikánsan
magasabb volt a szérum triglicerid és koleszterinszint, valamint az aterogén
index
(koleszterin/HDL)
értéke:
3,37±0,25
vs.
4,62±0,33;
p<0,01. Nem volt szignifikáns különbség a szérum bilirubin, húgysav illetve
albumin
koncentrációkban,
valamint
az
antioxidáns
enzimek
aktivitásában (31. táblázat).
31. táblázat A szérum lipidszintek, az antioxidáns vegyületek koncentrációja és az antioxidáns enzimek aktivitása 10 éven belül diagnosztizált (DUR0) és 10 évnél régebben fennálló (DUR1) cukorbetegségben
triglicerid
koleszterin
Aterogén
bilirubin
(mmol/l)
(mmol/l)
index
(µmol/l)
DUR0
1,60±0,22
5,41±0,30
3,37±0,25
12,38±1,70
DUR1
2,68±0,33
6,34±0,26
4,62±0,33
9,38±0,61
s
s
s
húgysav
albumin
SOD
CAT
GPX
(µmol/l)
(g/l)
(U/g Hb)
(k/g Hb)
(U/g Hb)
DUR0
192,5±17,8
46,4±0,6
745±90
1,26±0,07
41,6±6,8
DUR1
195,2±14,3
45,0±0,7
603±34
1,30±0,08
32,0±3,3
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0,05
A DUR0 és DUR1 csoportok plazma teljes antioxidáns státusz (TAS) értékei (0,76±0,04 mmol/l vs. 0,65±0,04 mmol/l, p<0,05) szignifikánsan különböztek. Kisebb volt a plazma TAS a DUR1 csoportban (13. ábra).
92
13. ábra A
plazma
teljes
antioxidáns
státusza
10
éven
belül
diagnosztizált
(DUR0) és 10 évnél régebben fennálló (DUR1) cukorbetegségben
T eljes A ntioxidáns S tátusz 0,80 0,70
p<0.05
0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 DUR0
DUR1
A vörösvértestek szuperoxid dizmutáz (SOD) csoportban glikozilált
negatív
korrelációt
hemoglobinnal
mutatott
(ezért
a
aktivitása
mindkét
vércukorszinttel
együttesen
értékeltük
és a
a két
csoportban): vércukor - SOD: r = -0,57 p<0,01; HbA1c - SOD: r = -0,44 p<0,03 (14. ábra).
93
14. ábra
SOD(U/gHb)
Összefüggés glukóz és SOD értékek között 1200 1000 800 600 400 200 0 0
5
10
15
20
GLU(m M)
Összefüggés HbA1c és SOD értékek között
SOD(U/gHb)
1200 1000 800 600 400 200 0 2
4
6
8
10
12
HbA1c(%)
4. A plazma redukált C-vitamin és glutation szintje elfogadható anyagcsere - egyensúlyú cukorbetegekben (absztrakt: 2) 2. típusú, inzulinnal kezelt, elfogadható anyagcsere-egyensúlyú betegekben csökkenését
a
plazma
tudtuk
redukált
kimutatni
glutation
szintjének
szignifikáns
kontroll
csoporthoz
képest
a
(32.
táblázat). A
plazma
redukált
C
vitamin
szintjét
alacsonyabbnak
találtuk
cukorbetegekben, de az eltérés nem volt szignifikáns (32. táblázat). A cukorbeteg csoportban a HbA1c és a plazma C vitamin szint között
negatív
anyagcseréjű
korrelációt
betegek
esetében
találtunk,
azaz
alacsonyabb
C
a
rosszabb
vitamin
érték
cukorvolt
mérhető. Szignifikánsan különbözött a diabeteses és a kontroll csoport triglicerid és koleszterin szintje, azonban nem találtunk szignifikáns
94
korrelációt e lipidparaméterek és a plazma C vitamin, valamint GSH szintje között.
32. táblázat A szérum lipidszintek, az antioxidáns vegyületek koncentrációja és a plazma redukált C-vitamin és glutation szintje 2. típusú, inzulinnal kezelt,
elfogadható
anyagcsere
egyensúlyú
cukorbetegekben
és
kontrollokban
esetszám
triglicerid
koleszterin
(mmol/l)
(mmol/l)
AI
Kontroll
13
1,32±0,18
5,36±0,31
3,09±0,31
Diabetes
22
2,45±0,28
6,52±0,20
3,16±0,16
s
s
bilirubin
húgysav
albumin
C-vitamin
GSH
(µmol/l)
(µmol/l)
(g/l)
(µmol/l)
(µmol/l)
Kontroll
15,92±2,96
215±21,3
51,69±1,11
85,34±18,41
41,73±2,33
Diabetes
10,76±0,88
221±20,1
50,53±0,69
53,08±5,50
29,38±2,30 s
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0,05
5. A plazma antioxidánsai - az antioxidáns vitaminok és a kis molekulasúlyú antioxidánsok - 2. típusú cukorbetegekben (VII, absztrakt: 11, 17) A vizsgált egyének lipid-anyagcseréjét jellemző paramétereket a 33. táblázat tartalmazza.
95
33. táblázat Szérum lipidszintek 2. típusú cukorbetegekben és kontrollokban
triglicerid
koleszterin
LDL koleszterin
HDL koleszterin
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
Kontroll
1,73±0,32
5,32±0,17
3,10±0,17
1,46±0,07
DM
2,80±0,25
5,89±0,13
3,66±0,16
1,07±0,05
s
s
s
s
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0,05
A plazma A-, E-,
C-vitamin
értékeit
a
34.
táblázat
foglalja
össze.
34. táblázat A
plazma
A-,
E-,
C-vitamin
értékek
a
cukorbeteg
és
kontroll
csoportokban
Kontroll
DM
A-vitamin
E-vitamin
C-vitamin
(µmol/l)
(µmol/l)
(µmol/l)
1,954±0,075
28,55±1,388
33,27±3,008
n=36
n=44
n=30
2,383±0,100
32,14±0,941
36,31±3,294
n=63
n=78
n=47
s, p<0,01
s, p<0,05
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség n: esetszám
A diabeteses csoportban az E-vitamin szintet és az A-vitamin szintet
is
szignifikánsan
magasabbnak
találtuk,
mint
kontroll
egyénekben (34. táblázat) Az
A-vitamin
szintek
magasabbak
voltak
a
férfiakban,
mint
a
nőkben az összes betegre vonatkoztatva (férfi : nő: 2,417±0,795 µmol/l : 2,035±0,591 µmol/l, p<0,01, úgy a kontroll egyénekben (férfi : nő: 2,132 µmol/l : 1,811 µmol/l, p<0,05), mind a cukorbetegekben (férfi :
96
nő: 2,555 µmol/l : 2,189 µmol/l, p<0,05). Ez a különbség nem függött a lipid státusztól: sem a koleszterin, sem a triglicerid, sem az LDL koleszterin nem különbözött szignifikánsan a két nemben. Egyedül a HDL koleszterin szinteket találtuk nőkben magasabbnak (férfi : nő: 1,21 mmol/l : 1,63 mmol/l, p<0,01) Az
E-vitamin/koleszterin,
vitamin/koleszterin
és
az
E-vitamin/LDL,
A-vitamin/LDL
arány
nem
valamint tért
el
az a
Akét
csoportban. A
C-vitamin
szintekben
észlelt
különbségek
nem
voltak
szignifikánsak. Cukorbetegeink alacsonyabb
A
terápia
vitamin
szint
szerinti volt
alcsoportjainak
mérhető
az
részesülőkben, mint az orális antidiabetikumokkal
vizsgálatakor
inzulin
kezelésben
kezelt
betegekben
(35. táblázat).
35. táblázat A plazma A-, E-, C-vitamin értékek cukorbetekben terápiás felosztás szerint
DM – tabletta
DM – tabletta és inzulin DM – inzulin
A-vitamin
E-vitamin
C-vitamin
(µmol/l)
(µmol/l)
(µmol/l)
2,72±0,16
33,25±1,68
38,15±4,59
n=25
n=21
n=20
2,37±0,22
32,58±3,19
37,78±13,1
n=6
n=6
n=5
2,14±0,16
31,46±1,21
37,03±5,43
n=26
n=43
n=19
s
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p <0,05
Az inzulinnal kezelt cukorbetegek szignifikánsan alacsonyabb Avitamin
szintje
összefüggésben
lehet
azzal,
hogy
ebben
a
betegcsoportban az LDL koleszterin szint is szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a p.os antidiabetikummal kezeltekben (3,26±0,26 mmol/l vs. 4,08±0,20 mmol/l, p<0,05). A 6 kombinált antidiabetikus kezelésben (p.os antidiabeticum és inzulin) részesült cukorbeteg plazma A-vitamin koncentrációja és
97
lipidparaméterei a másik két csoport értékei között helyezkedtek el, egyiktől sem különböztek szignifikánsan. Az E- és C-vitamin szintekben az antidiabetikus kezelés alapján nem találtunk szignifikáns különbséget. Hiperlipémiás cukorbetegeinkben mind az A-, mind az E-vitamin szintje szignifikánsan magasabbnak bizonyult (36. táblázat).
36. táblázat A plazma A-, E-vitamin értékek a vizsgált csoportok felosztása szerint
Kontroll
Hiperlipémia
Diabetes mellitus
Diabetes mellitus
A-vitamin
E-vitamin
(µmol/l)
(µmol/l)
1,97±0,12
25,09±1,68
n=17
n=20
2,03±0,11
33,53±1,98
n=15
n=20
2,01±0,15
25,17±1,11
n=15
n=18
2,57±0,12
34,86±1,05
n=44
n=56
s
s
+ hiperlipémia
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0,05 n: esetszám
Szignifikáns pozitív korrelációt találtunk a szérum koleszterin, triglicerid, valamint a vizsgált zsíroldékony vitaminok szintje között (37. táblázat).
98
37. táblázat A
plazma
A-,
E-vitamin
értékek
összefüggése
a
szérum
lipid
paraméterekkel
A-vitamin
E-vitamin
triglicerid
0,407
0,666
koleszterin
0,377
0,521
A táblázatban a korrelációs együtthatók (r) értékét tüntettük fel, p<0,001.
A
plazma
A-
és
E-vitamin
szintje
egymással
is
összefüggést
mutatott (r=0,415, p<0,001). Nem
volt
összefüggés
kimutatható
a
szénhidrát-anyagcserét
jellemző paraméterek (éhomi vércukor és HbA1c) valamint az A-, E- és Cvitamin értékek között. A pozitív
plazma
antioxidáns
korelációt
vegyületei
mutatott
az
közül
A-vitamin
a
húgysav
koncentráció
koncentrációval
(r=0,548,
p<0,001). A kis molekulasúlyú antioxidánsok közül az albumin, a húgysav és a
bilirubin
koncentráció
nem
különbözött
egymástól
betegekben
és
egészségesekben. Cukorbetegekben nem sikerült összefüggést kimutatni a HbA1c szintekkel. A húgysav és az albumin koncentráció - a normális tartományokon inzulinnal
belül,
kezelt
de
szignifikánsan
cukorbetegekben,
mint
kezelésben részesültekben (38. táblázat).
99
az
alacsonyabb orális
volt
az
antidiabetikus
38. táblázat A
kis
molekulasúlyú
antioxidánsok
plazmakoncentrációja
kontroll
és
cukorbeteg egyénekben
Kontroll
DM – tabletta
DM – tabletta
Albumin
Bilirubin
Húgysav
(g/l)
(µmol/l)
(µmol/l)
50,8±1,29
12,0±1,28
271±12,1
n=39
n=38
n=39
51,0±0,48
9,9±0,58
340±19,1
n=25
n=24
n=25
47,8±0,73
8,7±0,71
296±15,5
n=5
n=6
n=6
49,4±0,51
10,2±0,57
258±15,7
n=37
n=40
n=38
és inzulin DM – inzulin
s
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. s: szignifikáns különbség, p<0,05 n: esetszám
6. A zsíroldékony antioxidáns vitaminok koncentrációja a plazma lipidfrakciókban
hiperlipidémiában
és
1.
típusú
diabetes
mellitusban (absztrakt: 25, 36) 6.1.
Az
E-vitamin
koncentrációja
hiperlipidémiában
és
1.
típusú
diabetes mellitusban (absztrakt: 26, 37)
Nem cukorbeteg 1). hiperlipémiások plazmájában magasabb az Evitamin
koncentráció,
mint
normolipémiásokéban
(32,96±4,34
vs.
25,14±3,28 µmol/l) 2). Ez a különbség megfordul, ha szérum koleszterin szintre 5,92±0,94)
vonatkoztatjuk 3).
A
HDL
hiperlipémiásokban frakció
a
E-vitamin
(10,5±2,1
E-vitamin
vitaminkoncentrációt
vs.
tartalma 9,98±3,04
koncentrációja
nem
(5,32±0,86
különbözik
µmol/l)
4).
hiperlipémiásokban
vs.
normoA
és
VLDL+LDL magasabb
(22,98±4,48 vs. 14,64±3,12 µmol/l) 5). A VLDL+LDL frakció E-vitamin koncentrációja
a
frakció
koleszterin
szintjére
számolva
normolipémiásokéban magasabb (4,66±0,98 vs. 5,47±1,30).
100
azonban
a
Cukorbetegeket vizsgálva 1). a hiperlipémiások plazma E-vitamin koncentrációja
szignifikánsan
magasabb
nem
hiperlipémiásokkal
összehasonlítva (38,54±15,75 vs. 25,75±5,50 µmol/l) 2). Ez a különbség eltűnik,
ha
a
vitamin
vonatkoztatjuk
koncentrációt
(5,82±1,24
a
vs.
szérum
koleszterin
5,93±1,04)
3).
szintre
Cukorbeteg
hiperlipémiások VLDL+LDL frakciójában szignifikánsan magasabb az vitamin
koncentráció
koncentráció
különbség
vonatkoztatjuk normo-
és
(26,10±14,65 eltűnik,
(5,34±2,31
vs.
hiperlipémiások
vs.
15,21±4,71
ha
koleszterin
5,46±1,56)
között
nem
5).
µmol/l)
A
koncentrációra
Cukorbetegek
mutatható
4).
E-
ki
esetében
szignifikáns
különbség a HDL frakció E-vitamin koncentrációjában, HDL koleszterin koncentrációra vonatkoztatva sem (10,54±2,53 vs. 12,44±3,31 µmol/l).
6.2.
Az
A-vitamin
koncentrációja
hiperlipidémiában
és
1.
típusú
diabetes mellitusban (absztrakt: 23)
Nem
cukorbeteg
koncentrációja
1).
szignifikánsan
hiperlipémiások magasabb
plazma
mint
A-vitamin
normolipémiásoké
(2,44±0,52 vs. 2,08±0,43 µmol/l) 2). Ez az eltérés megfordul, ha a vitamin koncentrációt szérum koleszterin szintre számoljuk (0,39±0,10 vs. 0,49±0,11) 3). A hiperlipémiások VLDL+LDL lipoprotein frakciójában az A-vitamin koncentráció magasabb (0,26±0,08 vs. 0,18±0,07 µmol/l) 4). A
VLDL+LDL
frakció
A-vitamin
koncentrációja
koleszterin
szintre
számolva a fenti különbség eltűnik (0,05±0,02 vs. 0,07±0,03) 5). A HDL frakció
A-vitamin
normolipémiásokban,
tartalma mind
magasabb
önmagában,
mind
hiperlipémiásokban, koleszterin
mint
koncentrációra
számolva (2,17±0,48 vs. 1,89±0,36 µmol/l). A cukorbeteg 1). normo- és hiperlipidémiások plazma A-vitamin koncentrációja nem különbözött értékelhetően (1,65±0,32 vs. 2,09±0,07 µmol/l)
2).
A
vonatkoztatott
cukorbeteg plazma
hiperlipémiások
A-vitamin
koleszterin
koncentrációja
szintre
szignifikánsan
alacsonyabb, mint a normolipémiásoké (0,23±0,10 vs. 0,39±0,10) 3). A hiperlipémiás
cukorbetegek
VLDL+LDL
lipoprotein
frakciójában
az
A-
vitamin koncentráció magasabb (0,29±0,01 vs. 0,14±0,06 µmol/l) 4). A VLDL+LDL frakció A-vitamin koncentrációja koleszterin szintre számolva a fenti különbség eltűnik (0,05±0,02 vs. 0,05±0,02) 5). Cukorbetegek esetében
normo-
és
hiperlipémiások
101
között
nem
mutatható
ki
szignifikáns különbség a HDL frakció A-vitamin koncentrációjában, HDL koleszterin koncentrációra vonatkoztatva sem (1,50±0,27 vs. 1,81±0,06).
7. Hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav szupplementáció hatása a glikozilált haemoglobinszintre (IX, absztrakt: 1) A vizsgálat kezdetén meghatároztuk a glükóz, HbA1c, triglicerid, bilirubin, vércukor,
húgysav a
HbA1c
és
albumin
és
a
szinteket.
triglicerid
Mint
koncentráció
várható magasabb
volt,
a
volt
a
cukorbeteg csoportban (39. táblázat). A HbA1c szintek range-e 4,6%11,8%. A C-vitamin pótlás után a vércukor és a triglicerid szintek nem változtak szignifikánsan, az albumin és a bilirubin értékek ugyancsak változatlanok maradtak (39. táblázat). Az mellett,
aszkorbinsav
pótlás
szignifikánsan
a
plazma
megemelte
a
aszkorbát
plazma
GSH
szintek
emelése
koncentrációt
a
cukorbeteg csoportban. Továbbá a szérum húgysav szintek is emelkedtek (39. táblázat).
102
39. táblázat A mért paraméterek 40 napos 1000 mg aszkorbinsav pótlás előtt és után a kontroll (n=15) és a cukorbeteg csoportban (DM, n=19).
Kontroll csoport
DM csoport
n=15
n=19
kezelés előtt
kezelés után
kezelés előtt
kezelés után
vércukor (mmol/l)
5,29±0,13
5,06±0,13
7,89±0,77*
9,08±1,09*
triglicerid (mmol/l)
1,44±0,28
1,40±0,19
2,05±0,25*
2,21±0,26*
koleszterin (mmol/l)
5,31±0,37
5,17±0,28
5,74±0,32
5,57±0,29
albumin (g/l)
46,1±0,6
45,8±0,7
45,6±0,7
45,7±0,5
bilirubin (µmol/l) (µ
11,1±1,2
10,8±1,14
11,7±1,5
12,2±1,6
glutation (µmol/l) (µ
21,3±4,0
38,6±9,8
28,4±3,6
59,2±13,0#
195,9±17,2
231,1±22,3#
196,1±13,5
222,9±19,9#
húgysav (µmol/l) (µ
Az eredményeket átlag ± SEM értékben fejeztük ki. A csoportok (*) és a kezelés előtti és utáni értékekek
(#) közötti
szignifikáns különbségeket (p<0,05) jelöltük. A glutation mérések esetében n 12 (kontroll) és 11 (DM). Az aszkorbinsav kezelés szignifikáns hatása volt megfigyelhető a glikált haemoglobin szintekre: a csökkenés a kezelés előtti értékek 7%-a és 9%-a volt a kontroll és a diabeteses csoportban (15. ábra).
103
15. ábra HbA1c (%) 40 napos 1000 mg aszkorbát pótlás előtt és után a kontroll K, n=15) és a cukorbeteg csoportban (DM, n=19).
7.5 7
*
6.5
*#
HbA1c(%)
6 5.5 5 4.5
#
4 K csoport
3.5
D M csoport 3 kezelés elõtt
kezelés után
Az adatok átlag ± SEM.
A szignifikáns különbségeket (p<0,05) a K és DM csoportok között (*) és a kezelés előtti és utáni értékek között (#) jelöltük.
Pozitív összefüggést találtunk a
HbA1c
0.
napi
értékei
és
a
HbA1c csökkenése között mindkét csoportban (r=0,83; p<0,001 és r=0,63; p<0,005 a kontroll és a cukorbeteg csoportban) (16. ábra). Ez azt jelenti,
hogy
haemoglobin
az
aszkorbinsav
glikációra
a
kezelés
cukorbeteg
értékek magasabbak voltak.
104
hatása
kifejezettebb
csoportban,
ahol
a
volt
a
kiindulási
16. a,b ábra Összefüggés a glikált haemoglobin (%) csökkenése és a kiindulási HbA1c (%) értékek között aszkorbinsav pótlás alatt a kontroll (K) csoportban (a) és a cukorbeteg (DM) csoportban (b).
HbA1c csökkenés
4 3 2 1 0 -1 3.0
5.0
9.0
11.0
HbA1c (%) a K csoportban
a)
HbA1c csökkenés
7.0
4 3 2 1 0 -1 -2 3.0
5.0
b)
7.0
9.0
11.0
HbA1c (%) a DM csoportban
Negatív korrelációt figyeltünk meg az átlagolt kezelés előtti és utáni
vörösvérsejt
értékek
és
a
HbA1c
csoportot együtt elemeztük.
105
csökkenés
között,
ha
a
két
Megbeszélés
(A) Oxigén és nitrogén központú szabadgyökreakciók és az antioxidáns rendszer vizsgálata gasztroenterológiai betegségekben 1.
A
plazma
nitrát/nitrit
szint
magasabb
peptikus
fekélybetegségben és/vagy krónikus gastritisben - az emelkedés független a Helicobacter pylori státusztól vagy eradikációtól (absztrakt: 7, 12) A
gyomormucosában
nitrogén-oxid
szintáz
mind
emelkedett,
aktivitásról
mind
beszámoltak
változatlan már,
de
(229)
peptikus
fekélybetegségben szenvedőkben alacsonyabb nitrát/nitrit szinteket is leírtak a gyomorban és a plazmában. A Helicobacter pylori (H. pylori) baktériumról
ismert,
hogy
gyulladást
és
a
monocyták-macrophagok
invázióját idézi elő a gyomormucosában. A gyulladás általában növeli az indukálható nitrogén-oxid szintáz szintézist és a szuperoxid gyökök termelődését.
H.
pylori
infekcióról
kimutatták,
hogy
in
vitro
indukálja a nitrogén-oxid szintézist a gyomormucosában, de nincs adat az in vivo viszonyokról. A
mért
gyomormucosa
emelkedett
plazma
nitrogén-oxid
nitrát/nitrit
szintáz
szintek
(indukálható
alapján
forma)
a
aktivitása
emelkedett lehet peptikus fekélybetegségben szenvedőkben. Az emelkedés azonban nem specifikus sem peptikus fekélybetegségre, sem H. pylori fertőzésre, hiszen krónikus gastritisben szenvedőkben és sikeres H. pylori
eradikáció
után
is
megfigyelhető.
A
plazma
nitrát/nitrit
koncentráció korrelál a gyomorban lévő gyulladás súlyosságával, de a H. pylori státusszal nem. Felvethető az is, hogy az emelkedett plazma nitrát/nitrit szint nem a megnövekedett gyomor nitrogén-oxid szintáz aktivitás nitrozó
eredménye,
vegyületek
hanem -
tükrözheti
melyek,
mint
mennyiségét is.
106
a
gyulladás
karcinogén
során
ágensek
termelődő
ismertek
-
2.
Magasabb
szabadgyök
nitrogén-oxid scavenger
koncentráció
mennyiség
és
alacsonyabb
Helicobacter
oxigén
pylori
pozitív
peptikus fekélybetegekből nyert gyomorszövetben (absztrakt: 20) A H. pylori infekció gyulladást és azáltal magasabb nitrogén és oxigén
szabad
gyök
koncentráció
koncentrációt
magasabb
kifejezettebb.
A
a
direkt
fekély
indukál helyén,
bizonyíték
a
gyomormucosában.
ahol
hiányának
a
Ez
a
gyulladás
ellenére
magasabb
a
valószínűsége peroxinitrit képződésnek ilyen körülmények között. Az a tendencia, miszerint a nitrogén és oxigén gyök koncentráció csökken a sikeres H. pylori eradikáció után, valószínűleg nem specifikus, hanem a gyulladás csökkenésének tudható be. Az a tény, hogy nitrotirozint nem sikerült kimutatni a szövetmintákban, nem zárja ki a peroxinitrit képződés lehetőségét a gyomormucosában.
3.
A
plazma
nitrát/nitrit
szintek
colorectalis
carcinomában
(XII) A nitrogén-oxid (NO) és nitrovegyületei szerepének megítélése a carcinogenesisben ma még ellentmondásos. A daganatsejtekből származó NO gátolja a sejtnövekedést in vitro, de stimulálja a tumorgenesist és a
kísérletes
tüdőmetastasisokat
in
vivo
(230).
Az
NO,
melyet
feltehetően a tumorban termelődött nitrogén-oxid szintáz (NOS) termel, elősegítheti a tumornövekedést az angiogenesis fokozásával. Emelkedett nitrogén
oxid
szintáz
carcinomában
expresszióról
(231),
Barett
számoltak
be
oesophagusban
humán és
emlő
társuló
adenocarcinomákban, míg a nitrogén-oxid termelődés pozitívan korrelál a tumor grade-del (232). Az indukálható NOS expresszió emlőrákban jól korrelál a hónalji nyirokcsomó áttétek számával (233). Azonban éppen ellekezőleg,
arról
is
vannak
adatok,
hogy
a
NOS
gén
aktivációja
gátolja a carcinoma metastasisokat (234). Az indukálható NOS szelektiv expressziója szövet
magas
benignus
volt
kimutatható
indukálható
szövet
nem
NOS
(235).
human
prostata
tartalommol/lal
Primér
tüdőrákos
rákban;
a
carcinoma
rendelkezett, betegek
míg
magasabb
a NO
tartalmú levegőt lélegeznek ki, az alveolaris makrofágok NO termelése emelkedett eredményeként emelkedett
az
indukálható
(236). plazma
NOS
Hepatocellularis nitrát/nitrit
aktivitás carcinomában szintje
up-regulációjának szenvedő
korrellál
tumortömeggel, mind a tumor felületi kiterjedésével (237).
107
betegek mind
a
Míg
nagy
találtak
a
epidemiológiai
szervezet
tanulmányok
nitrát/nitrit
pozitív
tartalma
és
összefüggést a
gyomorrákok
incidenciája között (238, 239), addig csak egyetlen tanulmány nyújt adatot a nitrovegyületek szerepéről (vörös- és fehérhús fogyasztása) a vastagbéldaganatok kialakulásával kapcsolatban (240). Első ilyen irányú vizsgálatunkban a plazma nitrát/nitrit szintek nem különböztek a kontrollokétól, amikor valamennyi beteget figyelembe vettünk. Mivel a plazma nitrát/nitrit indirekt markere a nitrogén-oxid szintézisnek, azt a következtetést vonhattuk le, hogy nitrogén-oxid termelődés változásai a tumorszövetben, nem okoznak jelentős változást a plazma nitrát/nitrit szintekben. Ennek ellenére megfigyeltünk néhány esetben plazma nitrát/nitrit szint
emelkedést
a
betegek
egyes
alcsoportjaiban:
magasabb
plazma
nitrát/nitrit volt megfigyelhető valamennyi beteg alcsoportban, ha 1) a
daganatot
a
vizsgálatot
megelőzően
diagnosztizálták, 2) nem történt
több,
megelőzően
mint
műtét
hat
vagy
hónappal
3)
a
műtét
korábban, mint 1 hónappal történt a vizsgálat előtt. Annak ellenére, hogy számtalan tényező van, mely potenciálisan befolyásolja a plazma nitrát/nitrit szinteket, azzal érvelhetünk, hogy a tumor jelenlétének időtartama a szervezetben úgy tűnik, megemeli a plazma nitrát/nitrit szinteket. Szívelégtelenségben és nitrát felszabadító vegyületek hatására a plazma
nitrát/nitrit
vizsgálatokban. vegyületeket kizárhatő,
Saját szedők
szignifikánsan
szintek
vizsgáltunkban plazma
magasabb,
hogy
emelkedését
mutatták
a
nitrát
nitrát/nitrit
mint
a
befolyásolná
nem a
plazma
így
más
felszabadító
szintje
szedőknek,
ki nem
ez
nitrát/nitrit
a
volt faktor szintet
colorectalis carcinomás betegekben. A nemrégen kemoterápiában részesültek csoportjában mért magasabb plazma nitrát/nitrit szintek, a nagymennyiségű daganatsejt pusztulás által okozott gyulladással és következményes nitrogén-oxid szintézis indukcióval magyarázható. További
vizsgálatok,
a
tumorszövet
és
a
plazma
nitrát/nitrit
összehasonlításával talán közelebb vihetnek minket, annak a kérdésnek a megválaszolásához, vajon a nitrogén-oxid szintézis emelkedett-e a colorectalis carcinomás betegek tumorszövetében. A fentiek alapján magunk is újabb vizsgálatot végeztünk több beteg
bevonásával.
A
talált
elváltozások
108
specifikus
vagy
nem
specifikus
voltának
igazolására
a
daganatos
betegek
mellett
gyulladásos bélbetegségben is elvégeztük a méréseket.
4. Emelkedett plazma nitrát/nitrit szintekhez alacsonyabb oxigén szabad gyökök elleni védelem társul colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségekben (VIII, XIII, absztrakt: 15, 18) Tanulmányunkban indirekt módszerekkel vizsgáltuk a nitrogén-oxid és a szuperoxid szintjét colitis ulcerosában és humán colorectalis daganatokban.
Mind
colitis
ulcerosás
betegekben,
mind
a
daganatos
betegekben a plazmában növekedett a nitrát/nitrit szintet találtunk. A plazma nitrát szint növekedése a daganatos betegekben fokozott endogén NO szintézisből is származhat. Mivel azonban nem magát az NO-t, hanem egy reakciósorozat végtermékét mértük, a nitrát/nitrit szint emelkedés elvben lehet egyéb, a daganatszövettel össze nem függő nitrovegyület felszabadulás eredménye is (pl. nitrátok szedése). Esetünkben nem volt szignifikáns
különbség
között.
plazma
A
a
nitrátot
szedő
nitrát/nitrit
a
és
nem
szedő
vizelettel
betegcsoport
ürül,
így
a
plazmaszinteket esetleg a veseműködés kóros volta is befolyásolhatja. Csökkent
vesefunkció
azonban
egyetlen
betegünkben
sem
volt
kimutatható. Így a plazma nitrát/nitrit szintek emelkedése sem az NO-t felszabadító
gyógyszereknek,
sem
a
kóros
vesefunkciónak
nem
tulajdonítható ezekben a betegekben, sokkal inkább valószínű, hogy a monocyták megemelkedett endogén NO termeléséből származik. A csökkent plazma szuperoxid gyökfogó aktivitás és szulfhidril szint
fokozott
oxigén
gyulladásos
állapotban,
keletkezése
során.
cöruloplazmin, vitamin
és
plazmában
a
az nincs
A
szabadgyök-reakciókra mint SSA-t
szabad
SH
a a
önálló
colitis
ulcerosa,
plazmában
döntően
csoportokat
extracelluláris
utalnak
tartalmazó
szuperoxid
enzimszintézis,
dizmutáz
fokozott
mind
mind az
olyan
a
tumor
albumin,
fehérjék, adják.
oxigén
a
Mivel
a Ca
szabadgyök
felszabaduláskor e scavenger kapacitás csökken. Ez a csökkenés azonban másodlagos és tumoros betegekre nem specifikus, mert minden krónikus gyulladásban
kimutatható
(40),
most
azt
is
kimutattuk,
hogy
az
emelkedett NO képződés sem specifikus a tumoros folyamatra. A
daganat
kiterjedésével
(módosított
Dukes
klasszifikáció)
párhuzamosan az átlagos plazma nitrát/nitrit szint növekedett, az SH szint
csökkent,
bár
-
valószínűleg
109
a
kis
esetszám
és
az
értékek
szórása
miatt
-
ezek
az
eltérések
nem
érték
el
a
statisztikai
szignifikancia határát.
5.
Szulfhidril
csoportok,
nitrát/nitrit
szintek
szuperoxid
gyökfogó
colorectalis
aktivitás
carcinomás
és
betegek
tumorszövetében (absztrakt: 21, 22) Feltételezve, hogy összefüggés van a plazma nitrát/nitrit szint emelkedés
és
a
tumoros
szövetben
zajló
reakciók
között,
összehasonlítottuk a plazma és a tumoros szövetminták nitrát/nitrit szintjét,
szignifikáns
szövetekben
mért
változatlan
összefüggést
alacsonyabb
nitrát/nitrit
SH,
azonban
a
nem
találtunk.
szignifikánsan
szintekkel,
magasabb
emelkedett
A SSA
szuperoxid
és
változatlan nitrogén-oxid koncentrációt sugall daganatos betegekben. A daganatsejtek
NO
szintéziséről
az
irodalom
nem
egységes.
Human
szövetmintákból kimutatták, hogy a bélben a normális hám - adenoma carcinoma progresszió során folyamatosan csökken a bélsejtekben a cNOS expresszió és ezzel párhuzamosan az iNOS is eltűnik a sejtekből (104). Más
tanulmányban
azonban
coloncarcinoma
sejttenyészetben
igen
nagy
szórást mutató NOS expressziót, és ezzel nem korreláló NOS aktivitást találtak (232). Kérdésünk részben megválaszolatlan maradt, s egyenlőre a következő két lehetőség merül fel: 1) a plazma nitrát/nitrit szint emelkedés
nem
a
tumoros
szövetből
származik,
2)
a
nitrát/nitrit
szöveti szint mérése nem alkalmas a szövetek endogén NOS aktivitásának mérésére.
6. Nitrotirozin a tumorszövetben, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítéka colorectalis carcinomás betegekben (VIII, XIII, absztrakt: 15, 17) Elsőként
sikerült
kimutatnunk
tumorszövetekben
(7
esetben)
nitrotirozin jelenlétét, ami az in vivo peroxinitrit képződésre utal. Nem zárható ki az sem, hogy nitrotirozin több mintában és a betegek plazmájában is jelen volt, koncentrációja feltehetően nem érte el a módszerünkkel colitis
kimutatható
ulcerosás
betudható,
hogy
peroxinitrit képződik,
a
ahol
betegek
biopsiás
felületes
volt
mucosa a
határértéket.
mélyebb
monocyták
A
anyagában a
biopsiás
rétegeiben,
sokkal
110
nitrotirozin
nagyobb
annak
a
hiánya ténynek
mintavétel. vagy
számban
a
Ha
a is a
submucosában vannak
jelen,
elkerülhetjük a keletkezési helyét, ha csupán rutin biopsiát veszünk. Peroxinitrit in vivo képződésére már van példa, rheumatoid arthritises valamint veseelégtelenségben és szepszisben szenvedő dializált betegek plazmájában (218), de jelenlétére colorectalis carcinomában irodalmi adatot nem találtunk.
A
3.-6.
vizsgálatokat
összefoglalva,
a
fokozott
plazma
nitrát/nitrit szint, a csökkent antioxidáns védelem és a peroxinitrit in vivo képződése direkt bizonyíték arra, hogy nitrogén- és oxigénszabad
gyökök
carcinomában
fokozott és
mennyiségben
további
adatot
szabadulnak
nyújtanak
a
toxicitására és a carcinogenesisben kifejtett vonatkozóan.
Az
a
tény,
hogy
hasonló
fel
colorectalis
nitrátok/nitrózaminok lehetséges
változások
szerepükre
figyelhetőek
meg
colitis ulcerosás betegekben azt jelzi, a találtak nem specifikusak a tumorok keletkezésére, de megfigyelhetőek más gyulladásos helyzetekben is, mint az aktív colitis ulcerosa.
7. Csökkent plazma antioxidáns szintek colorectalis carcinomás betegekben (absztrakt: 4, 8) Az irodalomban növekvő számú bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy a daganatos megbetegedéseket a prooxidáns és antioxidáns tényezők közti
egyensúly
felbomlása
kíséri.
A
daganatos
betegek
természetes
antioxidáns szintjeiről elérhető adatok jelenleg is ellentmondásosak, és az eredményeket a vizsgáltokba bevont betegek daganatának fajtája és stádiuma befolyásolja. Daganatos betegségben szenvedők perifériás vérében és tumorszövetben a lipid peroxidok felszaporodását mutatták ki (241), miközben az antioxidáns enzimek, mint a szuperoxid dizmutáz (241, 242), a glutation peroxidáz (243, 244) és a kataláz aktivitása gyengülhet, vagy éppen emelkedhet a betegség során kontroll egyénekhez viszonyítva. Az antioxidáns vitaminok elérhetősége is csökkenhet (245, 246). Vizsgálatunkból
arra
következtethetünk,
hogy
a
colorectalis
daganatban szenvedő betegek gyengébb plazma antioxidáns védelemmol/lel rendelkeznek,
melynek
mértéke
stádiumnak
megfelelően.
tisztázása,
hogy
Mivel
a
ezért
csoportok
függ
További a
a
vizsgálatokat
változásért,
bilirubin
és
betegség mely
húgysav
súlyosságától igényel
összetevők
értékei
nem
a
annak
felelősek. különböztek
szignifikánsan, feltehető, hogy a gyengébb antioxidáns státuszért az
111
alacsonyabb koncentrációjú albumin -, mely a plazma fontos antioxidáns komponenese antioxidáns
-
és/vagy
vegyület
valamely
csökkent
antioxidáns
volta
felelős.
vitamin
vagy
egyéb
Elkerülhetetlen
volt,
hogy a betegek a daganatos csoportban idősebbek legyenek, de mivel az életkor nem korrelált az össz-scavenger kapacitással, így ez nem lehet egyedül
felelős
a
csökkent
antioxidáns
státuszért.
Más
vizsgálatainkból úgy tűnik, hogy a plazma scavengerek csökkenése nem specifikus
daganatos
betegekre,
más
krónikus
gyulladásokban
is
előrehaladottabb
a
megfigyelhető (216, 220, XIV). Eredményeink
azt
mutatják,
hogy
minél
betegség, annál rosszabbul működik az antioxidáns védelem. Még mindig nem tisztázott azonban, hogy ennek okozati szerepe van-e, vagy csupán következmény, a prooxidáns tényezőkkel szembeni védelem kimerülésének az
eredménye.
Mindenesetre,
mivel
a
csökkent
antioxidáns
aktivitás
valóban rizikó, ez azt sugallja, hogy az antioxidáns terápia a régóta daganatban
szenvedőkben
esetleg
segíthet
a
távoli
metastasisok
megjelenésének késleltetésében. A szisztémás antioxidáns aktivitás vizsgálatakor, jelenleg, a kemilumineszcenciás
módszerrel
meghatározott
plazma
össz-scavenger
kapacitásának mérése a legértékesebb módszer a természetes szisztémás antioxidáns
rendszer
tanulmányozására.
Tükrözni
látszik
a
daganat
súlyosságát és fennállási idejét colorectalis carcinomás betegekben.
112
(B) Az antioxidáns rendszer vizsgálata diabetes mellitusban 1.
Kielégítő
antioxidáns
védelem
1.
típusú
cukorbetegségben?
(IV, absztrakt: 11, 24, 35) Bár a cukorbetegség szövődményeinek patofiziológiája feltehetően soktényezős, az in vitro kísérletek, az állatkísérletek, valamint a humán
vizsgálatok
eredményei
növekedett
szabadgyök
képződésen
keresztül az oxidatív stressz szerepére is utalnak. Cukorbetegségben a hiperglikémiához
társultan
növekedett
reaktív
oxigén
metabolit
képződést mutattak ki. Az intenzifikált inzulin kezelés - mely a fiziológiás inzulin elválasztást
hivatott
tükrözni
-
elismerten
választandó
módszer
inzulin dependens fiatal cukorbetegek számára, mert ez biztosítja a legjobb metabolikus kontrollt. Hatásvizsgálatok bizonyították a hosszú távon
jelentkező
szövődmények
számának
csökkenését
(148),
habár
növekvő számú hipoglkémiás reakciót is megfigyeltek. Összehasonlítottuk cukorbetegek hogy
antioxidáns
megvizsgáljuk,
jól státuszát
vajon
kontrollált
inzulin-dependens
kontrollokéval,
abból
intenzifikált
kezeléssel
a
célból,
megvalósuló
jó
glikémiás kontroll esetén találunk-e eltéréseket. Az
1.1.
(vörösvértest
vizsgálat
alapján
az
antioxidáns
szuperoxid
dizmutáz
és
kataláz,
enzim
teljes
aktivitások
vér
glutation
peroxidáz) nem különböztek a két csoportban. Az 1.2. vizsgálatban az antioxidáns
enzim
aktivitások
közül
csak
a
teljes
vér
glutation
peroxidáz aktivitás bizonyult csökkentnek a diabeteses egyénekben. Más vizsgált
antioxidáns
enzimaktivitások
(vörösvértest
szuperoxid
dismutáz, plazma glutation reduktáz) nem különböztek a két csoportban. A SOD aktivitás mások által leírt gyengülését cukorbetegségben az
enzim
glikációjának
tulajdonították
(35).
Ez
a
megfigyelés
magyarázhatja, hogy a vizsgálatunkban mért alacsonyabb HbA1c értékek amelyek a nem enzimatikus glikáció szintjét tükrözik a plazmában és a vörösvérsejtekben
-
miért
jártak
együtt
a
vörösvérsejt
szuperoxid
dizmutáz jó működésével. Ugyancsak nem volt különbség megfigyelhető a spektrofotometriás módszerrel meghatározott teljes antioxidáns státusz (TAS) értékében, és
a
TBARS
koncentráció
sem
volt
kontrollokban és a cukorbetegekben.
113
statisztikailag
különböző
a
Inzulinnal kezelt cukorbetegeknek alacsonyabb húgysav szintjük van (171), ami befolyással lehet a plazma antioxidáns hatékonyságára. A
cukorbetegek
szinttel
a
mi
1.1.
rendelkeztek,
szignifikáns.
1.2.
vizsgálatunkban
de
a
különbség
vizsgálatunkban
a
is
nem
alacsonyabb volt
cukorbetegek
húgysav
statisztikailag húgysav
szintje
szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult. Összefoglalva,
nagyon
jó
glikémiás
kontroll
mutatókkal
rendelkező IDDM betegek random válogatott csoportjában egyáltalán nem, és
megfelelő
glikémiás
kontroll
mutatókkal
rendelkező
1.
típusú
cukorbetegekben sem találtuk súlyos jelét az antioxidáns emzimrendszer kiegyensúlyozatlanságának.
Feltételezzük,
hogy
az
1.
típusú
cukorbetegséget azon esetekben, amikor a vércukor szigorú kontrollja intenzifikált inzulin terápiával megvalósul, nem vagy csak részlegesen kísérik a prooxidáns - antioxidáns egyensúly változásai. Levonhatjuk azt a következtetést, hogy az intenzifikált inzulin kezelés eszközével megvalósuló szigorú glikémiás kontroll legalább részben, megelőzi az oxidatív károsodást, és ezáltal véd a cukorbetegség szövődményeinek kialakulásával szemben.
2. A cukorbetegség klinikai fennállási időtartamának hatása a vér antioxidánsaira (V, absztrakt: 10). Ma
már
nem
hiperglikémia
lehet
a
fő
kétségünk tényező
afelől, a
hogy
cukorbetegségben
mikrovaszkuláris
a
szövődmények
kialakulásáért és súlyosbodásáért. A nagy longitudinalis vizsgálat, a Diabetes Control and Complications Trial (148) következtetése az volt, hogy a szigorú glikémiás kontroll a legjobb módszer a szövődmények fellépésének
késleltetésére,
hangsúlyozva
a
ezzel
patogenetikai
is
a
hiperglikémia
mechanizmusban.
jelentőségét
Habár
az
egyéni
érzékenység különböző, a cukorbetegség szövődményei sok év elteltével még
a
nagyon
érrendszer
jól
számára
kontrollált a
cukorbetegekben
cukorbetegség
olyan
is
állapot,
megjelennek. mely
Az
felgyorsult
öregedést okoz. Az oxigén szabadgyököknek szerepet tulajdonítanak az atherosclerosis pathogenezisében, így diabetesben a szabad gyököknek része
lehet
a
diabeteses
macroangiopathiák
kialakulásában.
Az
(abszolút vagy relatív) inzulin hiány, a magas glükóz koncentráció, a fehérje
szubsztrátok
nem-enzimatikus
stressz, az autooxidatív glikáció jelen
van
mind
1.,
mind
2.
és
típusú
114
glikációját az
előtérbe
diabetes
kísérő kerülő
mellitusban.
oxidatív poliol A
út
szabad
gyökök pontos szerepe és helye az atherosclerosishoz vezető reakciók sorában pontosan nem ismert, bár ez lehetséges helye lenne antioxidáns anyagokkal történő beavatkozásnak. Az antioxidáns terápia indikációit, az adagolásoknak és az ellenőrzésnek módját még ki kell dolgozni. Az
1-es
csoport
betegcsoport
-
-
egy
jó
antioxidáns
glikémiás
kontrollal
paraméterei
nem
rendelkező
különböztek
a
kontrollcsoportétól, habár az életkor, a testtömeg-index, a glükóz és a HbA1c magasabb volt. Nem volt szignifikáns különbség az 1-es és 2-es csoport között az életkorban, a testömeg-indexben, a glükóz és a HbA1c szintben, de az albumin szint, a SOD aktivitás és a TAS szignifikánsan különbözött.
Azt
(elfogadható kevesebb,
találtuk,
HbA1c),
mint
kontrollált
10
év
nem
hogy
változtatja
alatt,
de
cukorbetegségnek
antioxidánsok fennállási
szintjére. idejének
a
meg
kontrollált
az
hosszabb
is
Mivel
jól
antioxidáns
időszak
szignifikáns
a
vizsgálat
hatásának
diabetes
alatt
még
hatása
célja
vizsgálata
státuszt
a
volt
a
jól
van
az
cukorbetegség a
különböző
paraméterekre, elkerülhetetlen volt, hogy a betegek a hosszú tartamú diabeteses életkor,
csoportban
hanem
a
kissé
idősebbek
cukorbetegség
voltak.
klinikai
Ezzel
fennállási
együtt ideje
nem
az
mutatott
összefüggést az antioxidáns státusszal. Az albumin, amely a plazma fontos
antioxidáns
összetevője,
és
a
TAS
jelentős
hányadát
adja,
alacsonyabb volt a 2-es csoportban. Pozitív összefüggést mutatott a TAS-sal (r=0,34; p<0,05), és antioxidáns
státuszért.
Az
így
részben
elfogadható
felelős
és
lehet
a
csökkent
összehasonlítható
HbA1c
értékek ellenére a két cukorbeteg csoportban, a SOD aktivitás, melyet a glikoziláció kimutatottan csökkent (159), alacsonyabb volt a hosszú ideje fennálló cukorbeteg csoportban, összehasonlítva a rövid idejű csoporttal. Eredményeink cukorbetegség Még
nem
azt
rosszabb
ismert,
jelzik,
hogy
funkciójú
hogy
ez
a
a
hosszabb
antioxidáns
prooxidáns
klinikai
fennállású
védelemmol/lel
tényezők
elleni
társul.
védekezés
kimerülésének az eredménye vagy a hosszú ideig tartó relatív inzulin hiány okozta metabolikus változások következménye. Mindenesetre, ha a csökkent antioxidáns aktivitás valóban érrendszeri rizikótényező, ez azt sugallja, hogy az antioxidáns terápia azok számára, akik hosszú ideje
cukorbetegségben
szenvednek,
megjelenésének késleltetésében.
115
segíthet
a
szövődmények
3. Az intravazális antioxidáns védelem inzulinnal kezelt 1. és 2. típusú cukorbetegekben (absztrakt: 3) Azon inzulinnal kezelt cukorbetegek, akiknek betegsége hosszabb ideje
áll
fenn
-
előző
vizsgálatunk
eredményeivel
összhangban
-,
gyengébb plasma antioxidáns védelemmol/lel rendelkeznek. Mivel ezúttal a két csoport albumin, bilirubin és húgysav értékei nem különböztek szignifikánsan,
feltehető,
hogy
a
gyengébb
antioxidáns
státuszért
valamely antioxidáns vitamin vagy egyéb antioxidáns vegyület csökkent volta
felelős.
index,
ami
az
kapcsolatban.
Ezen
betegeket
életkorral Mindkét
vizsgálva
és
magasabb
cukorbetegségük
megfigyelés
az
volt
az
aterogén
beállitásával
atherosclerosis
lehet
fokozott
rizikójára utal a hosszabb ideje betegek csoportjában. A rövid
vörösvérsejtek és
eredmény
a
SOD
hosszútávú
alátámasztja
aktivitása
negatív
cukor-anyagcserét
a
megfigyelést,
asszociációt
jellemző
mely
mutat
értékekkel.
szerint
a
a Az
szuperoxid
dizmutáz enzim aktivitása érzékeny mutatója az antioxidáns rendszer oxidativ
stresszre
bekövetkező
megváltozásának.
Ennek
okára
az
irodalmi adatok többféle magyarázatot nyújtanak: a SOD glikozilálódhat és így aktivitása csökken (35, 159) vagy a SOD expresszióért felelős gének változnak meg az oxidatív stressz hatására.
4. A plazma redukált C-vitamin és glutation szintje elfogadható anyagcsere-egyensúlyú cukorbetegekben (absztrakt: 2) Méréseink alapján a 2. típusú, inzulinnal kezelt, elfogadható anyagcsere-egyensúlyú szintje
cukorbetegek
szignifikánsan
alacsonyabb
GSH
szint
csökkent
plazma a
lehetséges
redukált
glutation
kontrollcsoportéhoz
oka
a
(GSH)
képest.
Az
gammol/la-glutamil-cisztein
szintetáz enzim csökkent vagy károsodott működésének (glikáció okozta inaktiváció vagy csökkent mRNS expresszió) következtében csökkent GSH szintézis és/vagy a csökkent glutation reduktáz aktivitás (166, 167). Utóbbi oka lehet: a) a NADPH hiány (a hyperglikémia esetén fokozott működésű
aldóz-reduktáz
elhasználja
a
NADPH-t
vagy
a
glükóz-6-P-
dehidrogenáz nem termel elég NADPH-t) b) az enzim glikációja (162). Elképzelhető az is, hogy a GSH felhasználása fokozott. A cukorbetegekben talált alacsonyabb - bár nem szignifikánsan különböző
-
plazma
aszkorbinsav
szint
116
lehetséges
oka
a
fokozott
oxidatív
stressz,
a
megnövekedett
aszkorbinsav
turnover
vagy
a
csökkent GSH szint. A cukorbeteg csoportban a közti
negatív
fellelhető
összefüggés
ellentmondást,
HbA1c
talán mely
és
a
plazma
feloldhatja a
C-vitamin
azt
cukorbetegekben
az
szint
irodalomban
mért
C-vitamin
szintekkel kapcsolatos (178, 180, 183).
5. A plazma antioxidánsai - az antioxidáns vitaminok és a kis molekulasúlyú antioxidánsok - 2. típusú cukorbetegekben (VII, absztrakt: 13, 19) Egészségesekben és cukorbetegekben az A- és E-vitamin szintje szignifikáns összefüggést mutatott a lipidparaméterekkel. oldódó
antioxidáns
lipoproteinek
vitaminok
plazmakoncentrációja
koncentrációjától
nagymértékben
vitaminok a lipoproteinekben szállítódnak. A magasabb
plazma
lipidszintek
antioxidáns
miatt
csak
vitamin
jelent
a
függ,
diabetesben
zsírban keringő
mivel
koncentráció
látszólag
A
ezek
a
észlelhető
az
emelkedett
fokozott
antioxidáns
védelmet, a fokozott membránvédő hatás csak akkor valószínűsíthető, ha nem abszolút, hanem a lipoproteinekre vonatkoztatott koncentrációjuk magasabb. Ezt igazolják azok a vizsgálatok, melyek arra utalnak, hogy diabeteses
betegekben
a
lipoproteinek
oxidativ
modifikációja
vagy
glikációja fokozott annak ellenére, hogy a zsíroldékony antioxidáns vitaminok abszolút koncentrációja magasabb. Az inzulinnal kezelt cukorbetegek szignifikánsan alacsonyabb Avitamin
szintje
betegcsoportban
összefüggésben az
LDL
lehet
koleszterin
azzal,
szintje
hogy is
ebben
a
szignifikánsan
alacsonyabb, mint a p.os antidiabetikummol/lal kezeltekben. Férfiakban az
A-viatmin
koncentráció
magasabb,
egyénekben,
mint
cukorbetegeben.
státusztól,
sem
a
koleszterin,
Ez sem
mint a
nőkben,
különbség a
úgy
nem
triglicerid,
a
függ sem
kontroll a az
lipid LDL
koleszterin nem különbözött szignifikánsan a két nemben. Egyedül a HDL koleszterin
szinteket
találtuk
nőkben
magasabbnak.
A
vizsgált
vitaminok plazma koncentrációja nem mutatott összefüggést a betegek és a kontrollok életkorával. C vitamin koncentráció jól kezelt, kiegyensúlyozott - C vitamin szempontjából nem restriktív - diétájú 2. típusú cukorbetegekben nem különbözik
szignifikánsan
az
egészséges,
egyénekétől.
117
vegyes
táplálkozású
Jól kezelt 2. típusú cukorbetegekben a kis molekulasúlyú plazma antioxidánsok koncentrációja megegyezik a nem cukorbetegekével, kivéve a húgysav szintet, mely inzulinnal kezelt cukorbetegekben alacsonyabb. Ezeknek az antioxidánsoknak a koncentrációja nem mutat összefüggést a plazma lipidszintekkel.
6.
Lipidoldékony
antioxidáns
vitaminstátus
a
plazma
lipidfrakcióiban hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben (absztrakt: 25, 36) 6.1.
E-vitamin
koncentráció
hiperlipidémiában
és
1.
típusú
cukorbetegségben (absztrakt: 24, 35)
nem
A
frakcióiban lipidekben
cukorbeteg -
az a
hiperlipémiások
érelmeszesedés koleszterin
apoB
tartalmú
kialakulásában
szintre
lipoprotein
szerepet
vonatkoztatott
játszó
E-vitamin
koncentráció kisebb, mint normolipémiásokéban. Cukorbetegek HDL és VLDL+LDL lipoprotein frakcióiban, a frakció koleszterin tartalmára vonatkoztatva, az E vitamin koncentráció nem különbözik
normolipémiás
cukorbetegekben
-
és
ellentétben
hiperlipémiás a
nem
statusban.
cukorbetegekkel
-
a
Tehát VLDL+LDL
frakcióban mért, koleszterin szintre vonatkoztatott, antioxidáns vitamin koncentráció hiperlipémiás betegekben nem
alacsonyabb,
E-
mint
normolipémiásokban.
6.2.
A-vitamin
koncentráció
hiperlipidémiában
és
1.
típusú
cukorbetegségben (absztrakt: 23) Az A-vitamin valamennyi vizsgált betegcsoportban főleg a “védő” HDL koleszterinben helyezkedik el. A nem cukorbetegek két csoportja között az A-vitamin/koleszterin arányban nem észleltünk különbséget a VLDL+LDL frakcióban, míg a HDL frakiókban a hiperlipémiások csoportjában találtunk magasabb értéket. Cukorbetegekben frakciók
koleszterin
mind
a
VLDL+LDL,
tartalmára
mind
a
vonatkoztatott
HDL
frakciókban
A-vitamin
a
tartalom
azonos volt mormolipémiás és hiperlipémiás statusban egyaránt. Hiperlipémia esetén mind a kontrollokban, mind a cukorbetegekben az össz-plazma A-vitamin/koleszterin arány alacsonyabb volt, mint a
118
normolipaemiás
csoportokban,
ami
csökkent
antioxidáns
védelemre
utalhat.
7. A glikált hemoglobin szintek csökkenése hosszú távú, nagy dózisú
aszkorbinsav
pótlás
hatására
egészségesekben
és
cukorbetegekben (IX, absztrakt: 1) A bemutatott eredmények azt igazolják, hogy a hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav pótlás csökkenti a glikált haemoglobin szinteket egészséges és cukorbeteg személyekben egyaránt. A
magas
glikációjához membránjuk
glükóz vezet.
glükóz
koncentráció
Az
a
erytrocyták
permeabilitása
a
fehérjék
relatíve hemoglobint
nem-enzimatikus
hosszú a
életeideje
megelőző
6-8
és hét
szérum glükóz szintjének jó mutatójává teszi. A plazmában található fehérjék,
mint
az
albumin
is
glikálódnak,
de
ez
rövidebb
időszak
glükózkoncentráció változásait tükrözi. A különböző antioxidánsok hatását a fehérjék glikációjára számos tanulmány
vizsgálta,
különböző
eredménnyel.
In
vitro
kisérletek
kimutatták, hogy az aszkorbinsav interferál a fehérje glikozilációval (201, 202). Alacsonyabb HbA1c szinteket közöltek patkányokban hosszú távú aszkorbinsav adagolást követően (204), csökkent glikált albumin szintekkel
együtt.
A
humán
vizsgálatok
eredményei
sokkal
ellentmondásosabbak: Davie és mtsai (203) mind a glikált albumin, mind a
glikált
haemoglobin
csökkenését
észlelték
nem
diabeteses
személyekben 3 hónapig tartó 1000 mg/nap aszkorbát pótlást követően. Feltételezték, hogy a glükóz és az aszkorbinsav fehérje kötésért való versengése az oka a változásoknak. Ugyanakkor, Weykamp és mtsai (206) azt figyelték meg, hogy még 12 hétig adagolt 1500 mg/nap adag sem csökkentette az in vivo hemoglobin glikációt. Napi 500 mg C-vitamin adagolása
cukorbetegeknek
4
hónapon
keresztül
sem
volt
hatással
a
glikált haemoglobin szintekre (207). Az
aszkorbinsav
a
hemoglobin
glikációt
több
módon
befolyásolhatja. A glükóz és az aszkorbinsav versenyezhet a sejtbe való bejutásért vagy a fehérje kötődésért. A kompetitív mechanizmus az aszkorbinsav-függő valószínűnek
hemoglobin
eredményeink
glikáció
fényében.
Ha
csökkenésben az
nem
aszkorbinsav
tűnik
kompetitív
módokon befolyásolja a hemoglobin glikációt, magasabb glükóz szintek a glikáció kisebb mértékű csökkenéséhez vezetnek. Ezzel ellentétben, a mi
esetünkben
a
HbA1c
csökkenés
pozitívan
119
korrelált
a
kiindulási
értékekkel (16. ábra). Így az a mechanizmus, mellyel az aszkorbinsav (amely
két
nagyságrenddel
kisebb
koncentrációban
van
jelen
a
vörösvérsejtekben, mint a glükóz) befolyásolja a glikációt, valami más kell legyen. Alternatívaként, az aszkorbinsav a hosszú távú vércukorszintet befolyásolhatja
a
szénhidrát
metabolizmus
enzimmol/lűködéseinek
változtatásával vagy az inzulin elválasztás fokozásával (247) vagy az inzulin hatás módosításával, mint ahogy Paolisso és mtsai felvetik, a nem-oxidatív glükóz metabolizmus javításának révén (208). Vizsgálatunkban az aszkorbát alkalmazás legjelentősebb hatása a plazma
GSH
szint
emelkedés
volt.
A
plazma
GSH
pozitívan
korrelál
májbeli koncentrációjával (248). A stimulált glikogenolízis megelőzése - mely a máj GSH/GSSG arány megemelésével az aszkorbátnak köszönhető, - lehet felelős a glikáció
szérum
csökkenéséért.
aszkorbinsav
kezelés
glükóz Annak
nem
és
következményesen
ellenére,
csökkentette
hogy a
a
haemoglobin
vizsgálatunkban
mérsékelten
az
emelkedett
vércukorszinteket, a HbA1c szignifikáns csökkenése azt jelzi, hogy az aszkorbinsav kivédheti a glikogenolísist az oxidatív epizódok során. Megjegyzendő, hogy a vércukorszint szignifikáns csökkenését figyelték meg nagyon nagy dózisú (1g/testsúly kg/nap) aszkorbát adását követően kezeletlen streptozotocin diabeteses patkányokban (204). Eredményeink fenntartásának
hangsúlyozzák
fontosságát
a
megfelelő
diabetesben,
amely
antioxidáns
szint
hozzájárulhat
a
szénhidrát anyagcsere javításához és csökkentheti a késői szövődmények kialakulásának veszélyét.
120
Köszönetnyilvánítás A
vizsgálatok
a
Semmelweis
Orvostudományi
Egyetem
II.
sz.
Belgyógyászati Klinikáján “A hepatológia szabadgyökös és immunológiai vonatkozásai”
doktori
gasztroenterológiai
“Szabadgyök
program,
betegségekben”
és
“A
reakciók
szénhidrát-
és
lipidanyagcsere kapcsolata a szabadgyökös reakciókkal és szerepük az arteriosclerosis kialakulásában” című alprogramok keretében készültek. Az értekezés megírását a Soros Alapítvány ösztöndíjjal támogatta. Köszönöm mindazok munkáját, akik segítségemre voltak:
Prof. Dr. Fehér János Prof. Dr. Tulassay Zsolt Dr. Prónai László, Dr. Somogyi Anikó Dr. Blázovics Anna Dr. Molnár Béla Dr. Rosta András Dr. Ágoston Márta, Dr Molnár Jeanette, Dr. Sármán Beatrix Dr. Papik Kornél, Dr. Prechl József, Dr. Pusztai Péter Dr. Joós Ágnes, Dr. Katona Csilla, Dr. Várnai Judit Herold Magdolna, Kocsis Ibolya Albert Karola, Berky Sarolta Kaján Andrea, Szendrei Éva
121
Irodalomjegyzék 1.
Rácz I. A Helicobacter pylori patogenetikai szerepe a fekély keletkezésében In: Varró V. (szerk.) Gastroenterologia, Medicina, Budapest, 105.o., l998
2.
Nagy
F.
Colitis
ulcerosa
In:
Varró
V.
(szerk.)
Gastroenterologia, Medicina, Budapest, 302.o., l998
3.
Grisham
MB.
Oxidants
and
free
radicals
in
inflammol/latory
bowel disease. Lancet 344, 859, 1994
4.
Újszászy
L.
Colorectalis
carcinoma
In:
Varró
V.
(szerk.)
Gastroenterologia, Medicina, Budapest, 318.o., l998
5.
Owen RW. Faecal steroids and colorectal carcinogenesis. Scand J Gastroenterol Suppl 222, 76-82, 1997
6.
Erhardt JG, Lim SS, Bode JC, Bode C. A diet rich in fat and poor in dietary fiber increases the in vitro formation of reactive oxygen species in human feces. J Nutr 127(5), 706-709, 1997
7.
Fövényi
József,
Arnold
Csaba,
Andor
Miklós:
Cukorbetegség
-
megelőzés, kezelés, gondozás
8.
Sies H. Strategies of antioxidant defense. Eur J Biochem 215, 213-219, 1993
9.
Somogyi A, Pusztai P, Prechl J, Fehér J. A diabetes mellitus és a
szabad
gyökös
reakciók
feltételezett
kapcsolata
az
érelmeszesedéssel. Orv Hetil 135(33), 1815-1818, 1994
10.
Fehér
J,
Vereckei
A.
Szabadgyök
reakciók
jelentősége
az
orvostudományban. Medicina, Biogal, Budapest, 1985
11.
Halliwell
B.
Free
radicals,
antioxidants
and
human
curiosity, cause, or consequence? Lancet 344, 721-724, 1994
122
disease:
12.
Maxwell
S.
Prospects
for
the
use
of
antioxidant
therapies.
Drugs 49(3), 345-361, 1995
13.
Jacob RA, Burri BJ. Oxidative damage and defense. Am J Clin Nutr 36(6), 985S-990S, 1996
14.
Halliwell B, Murcia MA, Chirico S, Aruoma OI. Free radicals and antioxidants in food and in vivo: what they do and how they work. Crit Rev Food Sci Nutr 35(1-2), 7-20, 1995
15.
Wayner DDM, Burton GW, Ingold KU, Barclay LRC, Locke SJ. The relative contributions of vitamin E, urate, ascorbate and proteins to the total peroxyl radical-trapping antioxidant activity of human blood plasma. Biochem Biophys Acta 924. 408-419, 1987
16.
Head
KA.
Ascorbic
acid
in
the
prevention
and
treatment
of
cancer. Altern Med Rev 3(3), 174-186, 1998
17.
Ghiselli A, D'Amicis A, Giacosa A. The antioxidant potential of the Mediterranean diet. Eur J Cancer Prev 6(Suppl 1), S15-19, 1997
18.
Zino S, Skeaff M, Williams S, Mann J. Randomised controlled trial
of
effect
concentrations
of
of
fruit
lipids
and
and
vegetable
consumption
antioxidants.
Britmed
J
on
plasma
314(7097),
1787-1791, 1997
19.
Stahelin
HB,
Thurneysen
J,
subsequent
cancer
Gey
KF,
Eichholzer
Brubacher
G.
mortality
Plasma in
the
M,
Ludin
E,
Bernasconi
antioxidant 12-year
vitamins
follow-up
of
F, and the
prospective Basel Study. Am J Epidemiol 133(8), 766-775, 1991
20.
Bartsch formed
H,
Ohshima
N-nitroso
H,
compounds
Pignatelli and
B,
nitrosyl
Camels agents
S. in
Endogenously human
cancer
etiology. Phamacogenetics 2(6), 272-277, 1992
21.
Prior
WA,
Squadrito
GL.
The
chemistry
of
peroxynitrite:
a
product from the reaction of nitric oxide with superoxide. Am J Physiol 268, L699-L722, 1995
123
22.
Babbs CF. Free-radicals and the etiology of colon cancer. Free Radic Biol Med 8(2), 191-200, 1990
23.
Salim AS. The permissive role of oxygen-derived free radicals in the development of colonic cancer in the rat. A new theory for carcinogenesis. Int J Cancer 53, 1031-1055, 1993
24.
Salim
AS.
Oxygen-derived
free-radical
scavengers
prolong
survival in colonic cancer. Chemotherapy 38, 127-134, 1992
25.
Darley-Usmar V, Wiseman H, Halliwell B. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance. FEBS Letters 369(2-3), 131-135, 1995
26.
Cerutti PA. Oxy-radicals and cancer. Lancet 344, 862-863, 1994
27.
Yang MH, Schaich KM. Factors affecting DNA damage caused by lipid hydroperoxides and aldehydes. Free Radic Biol Med 20(2), 225236, 1996
28.
Thomson
A,
Hemphill
D,
Jeejeebhoy
KN.
Oxidative
stress
and
antioxidants in intestinal disease. Dig Dis 16(3), 152-158, 1998
29.
Blakeborough MH, Owen RW, Bilton RF. Free radical generating mechanism in the colon: their role in the induction and promotion of coloractal cancer? Free Radic Res Commol/lun 6(6), 359-367, 1989
30.
Baynes
JW.
Role
of
oxidative
stress
in
development
of
complications in diabetes. Diabetes 40(4), 405-412, 1991
31.
Wolff SP. Diabetes mellitus and free radicals. Britmed Bull 49(3), 642-652, 1993
32.
Noberasco
C,
Odetti
P,
Boeni
D,
maiello
M,
Adezati
L.
Malondialdehyde (MDA) level in diabetic subjects. Relationship with blood glucose and glycosylated hemoglobin. Biomed Pharmacother 45, 193-196, 1991
124
33.
Tsai
EC,
Hirsch
IB,
Brunzell
JD,
Chait
A.
Reduced
Plasma
Peroxyl Radical Trapping Capacity and Increased Susceptibility of LDL to Oxidation In Poorly Controlled IDDM. Diabetes 43, 1010-1014, 1994
34.
Bellomo G, Maggi E, Poli M, Agosta FG, Bollati P, Finardi G. Autoantibodies
against
oxidatively
modified
low-density
lipoproteins in NIDDM. Diabetes 44, 60-66, 1995
35.
Kawamura N, Okawara T, Suzuki K, Konishi K, Mino M, Taniguchi N.
Increased
glycated
Cu,Zn-superoxide
dismutase
levels
in
erythrocytes of patients with IDDM. J Clin Endocrinol Metab 74(6), 1352-1354, 1992
36.
Blakytny R, Harding JJ. Glycation (non-enzymatic glycosilation) inactivates glutathione reductase. Biochem J 288, 303-307, 1992
37.
Godin DV, Wohaieb SA, Garnett ME, Goumeniouk AD. Antioxidant enzyme alterations in experimental and clinical diabetes. Mol Cell Biochem 84, 223-231, 1988
38.
Yew MS. Effect of streptozotocin diabetes on tissue ascorbic acid and dehydroascorbic acid. Horm Met Res 15(3), 158, 1983
39.
Rhodes PM, Leone Am, Francis PL, Struthers AD, Moncada S. The L-arginine: nitric oxide pathway
is
the
major
source
of
plasma
nitrite in fasting humans. Biochem Biophys Res Commol/lun 209, 590596, 1995
40.
Prónai L, Arimori S, Fehér J. Superoxide scavenging activity of plazma in various immol/lunological disorders to
detect
the
actual
activity
of
ongoing
helpful parameter
inflammol/lation.
In:
Fehér J, Blázovics A, Matkovics B, Mézes M. (szerk.) Role of free radicals in biological systems. Akadémia Könyvkiadó, Budapest, 2127.o, 1993
125
41.
Kaur oxidative
H,
Halliwell
damage
in
B.
Evidence
chronic
for
nitric-oxide
inflammol/lation.
mediated
Nitrotyrosine
in
serum and synovial fluid from rheumatoid arthritis patients. FEBS Letters 350, 9-12, 1994
42.
Fehér
J,
Csomós
G,
Vereckei
A.
Free
radical
reactions
in
medicine. Springer Verlag, Berlin, 1987
43.
McCord JM, Keele B, Fridovich I. An enzyme based theory of obligate anaerobiosis: The physiological function of SOD. Proc Natl Acad Sci 68, 1024-1027, 1971
44.
Suzuki E, Yasuda K, Takeda N, Sakata S, Era S, Kuwata K, Sogami M,
Miura
K.
Increased
oxidized
form
of
human
serum
albumin
in
patients with diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pr 18(3), 153158, 1992
45.
Prónai
L,
antioxidáns
-
Láng
I,
Fehér
therapiás
J.
Az
E-vitamin
felhasználása.
Orv
-
Hetil
egy
természetes
133(20),
1215-
1219, 1992
46.
Behrens
WA,
Thompson
JN,
Madere
R.
Distribution
of
alpha-
tocopherol in human plasma lipoproteins. Am J Clin Nutr 35, 691696, 1982
47.
Jain SK, Levine SN, Duett J, Hollier B. Reduced vitamin E and increased
lipofuscin
products
in
erythrocytes
of
diabetic
rats.
Diabetes 40(10), 1241-1244, 1991
48.
Kokoglu E, Ulakoglu E. The transport of vitamin E in plasma and its
correlation
to
plasma
lipoproteins
in
non-insulin-dependent
diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pr 14(3), 175-181, 1991
49.
Caye-Vaugien C, Krempf M, Lamarche P, Charbonnel B, Pieri J. Determination erythrocytes
of of
alpha-tocopherol
type
I
and
type
II
in
plasma,
diabetic
platelets
patients
by
and high-
performance liquid chromatography. Int J Vitam Nutr Res 60(4), 324330, 1990
126
50.
Krempf M, Ranganathan S, Ritz P, Morin M, Charbonnel B. Plasma vitamin A and E in type 1 (insulin-dependent) and type 2 (noninsulin-dependent) adult diabetic patients. Int J Vitam Nutr Res 61(1), 38-42, 1991
51.
Martinoli L, Di-Felice M, Seghieri G, Ciuti M, De-Giorgio LA, Fazzini
A,
Gori
alpha-tocopherol
R,
Anichini
R,
concentrations
Franconi in
F.
Plasma
retinol
insulin-dependent
and
diabetes
mellitus: their relationship to microvascular complications. Int J Vitam Nutr Res 63(2), 87-92, 1993
52.
Blázovics
A,
Fehér
J.
Sikerek
és
kudarcok
a
retinoid
terápiában. Gyógyszereink 46, 124-129, 1996
53.
Szent-Györgyi
A.
Observations
on
the
function
of
peroxidase
systems and the chemistry of adrenal cortex. Description of a new carbohydrate derivative. Biochem J 22, 1387-1409, 1928
54.
Marcus R, Coulston AM. Water-soluble vitamins. In: Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P. (szerk.) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eight Edition, 1548.o., 1990
55.
Levine
M,
Conry-Cantilena
C,
Wang
Y,
Welch
RW,
Washko
PW,
Dhariwal KR, Park JB, Lazarev A, Graumlich JF, King J, Cantilena LR. Vitamin C pharmacokinetics in healthy volunteers: evidence for a recommol/lended dietary allowance. Proc Nat Acad Sci USA 93(8), 3704-3709, 1996
56.
Bode AM, Yavarow CR, Fry DA, Vargas T. Enzymatic basis for altered ascorbic acid and dehydroascorbic acid levels in diabetes. Biochem Biophys Res Commol/lun 191(3), 1347-1353, 1993
57.
Cunningham
JJ,
Ellis
SL,
McVeigh
KL,
Levine
RE,
Calles
Escandon J. Reduced mononuclear leukocyte ascorbic acid content in adults with insulin-dependent diabetes mellitus consuming adequate dietary vitamin C. Metabolism 40(2), 146-149, 1991
127
58.
Frei
B,
England
L,
Ames
B.
Ascorbate
is
an
outstanding
antioxidant in human blood plasma. Proc Natl Acad Sci USA 86, 63776381, 1989
59.
Halliwell B. Vitamin C: the key to health or a slow-acting carcinogen? Redox Rep 1, 5-9, 1994
60.
Culotta E, Koshland DE Jr. No news is good news. Science 258, 1862-1865, 1992
61.
Gibaldi M. What is nitric oxide and why are so many people studying it?. J Clin Pharmacol 33, 488-496, 1993
62.
Green, LC, Ruiz de la Luzuragia K, Wagner DA, Rand W, Istfan N, Yuong VR, Tannenbaum SR. Nitrate biosynthesis in man. Proc Natl Acad Sci USA 78, 7764-7768, 1981
63.
Palmer accounts
RMJ, for
Ferringe
the
AG,
Moncada
biological
S.
activity
Nitric
of
oxide
release
endothelium
derived
relaxing factor. Nature 327, 524-526, 1987
64.
Lowenstein
CJ,
Dinerman
JL,
Snyder
SH.
Nitric
oxide:
a
physiologic messenger. Ann Intern Med 120, 227-237, 1994
65.
Chapman
PF,
Atkins
CM,
Allen
MT,
Haley
JE,
Steinmetz
JE.
Inhibation of nitric oxide synthases impairs two different forms of learning. Neuroreport 3, 567-570, 1992
66.
Moncada
S,
Palmer
RMJ,
Higgs
EA.
Nitric
oxide:
physiology,
pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 43, 109-142, 1991
67.
Ignarro LJ. Biological actions and properties of endotheliumderived nitric oxide formed and realeased from artery and vein. Circulation Res 65, 1-21, 1989
68.
Kiechle
FL,
Malinski
T.
Nitric
oxide
/
Biochemistry,
pathophysiology and detection. Am J Clin Pathol 100, 567-575, 1993
128
69.
Anggard
E.
Nitric
oxide:
mediator,
murderer,
and
medicine.
Lancet 343, 1199-1206, 1994
70.
Stamler JS, Singel DJ, Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox activated forms. Science 258, 1898-1902, 1992
71.
Wright
CE,
Rees
DD,
Moncada
S.
Protective
and
pathological
roles of nitric oxide in endotoxin shock. Cardiovasc Res 26, 48-57, 1992
72.
Antoni F, Csuka I, Romics L. A szervezetben képződő nitrogénoxid szabadgyök szerepe. Orv Hetil 1333, 773-776, 1992
73.
Morris SM Jr, Billiar TR. New insights into the regulation of inducible nitric oxide synthesis. Am J Physiol 266, E829-839, 1994
74.
Nathan C, Xie Q-w. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem 269, 13725-13728, 1994
75.
Kam PCA, Govender G. Nitric oxide: basic science and clinical applications. Anaesthesia 49, 515-521, 1994
76.
Forstermann U, Closs EI, Pollock JS, Nakane M, Schwarz P, Gath I, Kleinert H. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification,
molecular
cloning
and
functions.
Hypertension
23,
1121-1131, 1994
77.
Hrabák A, Bajor T, Temesi Á. A nitrogén-monoxid (NO) termelése, funkciója és kapcsolata az arginin anyagcserével. Biokémia XIX, 3340, 1995
78.
Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammol/lals. Biochem J 298, 249-258, 1994
79.
Denis M. Human monocytes/macrophages: NO or no NO? J Leukoc Biol 55, 682-684, 1994
129
80.
Granger DN, Kubes P. The microcirculation and inflammol/lation: modulation of leukocyte-endothelial cell adhesion. J Leukoc Biol 55, 662-675, 1994
81.
Guarner C, Soriano G, Tomas A, Bulbena O, Novella MT, balanzo J, Vilardell F, Mourelle M, Moncada S. Increased serum nitrite and nitrate
levels
in
patients
with
cirrhosis:
relationship
to
endotoxemia. Hepatology 18, 1139-1143, 1993
82.
Ignarro LJ. Heme-dependent activation of guanylate cyclase by nitric oxide; a novel signal transduction mechanism. Blood Vessels, 28, 67-73, 1991
83.
Forstermann action
of
U.
Properties
and
endothelium-derived
mechanism
relaxing
of
production
factor.
J
and
Cardiovasc
Pharmacol 8 (Suppl 10), S45-51, 1986
84.
Moncada S. The L-arginine: nitric oxide pathway. Acta Physiol Scand 145, 2o1-227, 1992
85.
Nussler
AK,
Billiar
TR.
Inflammation,
immunoregulation,
and
inducible nitric oxide synthase. J Leukoc Biol 54, 171-178, 1993
86.
Gustafsson LE, Leone AM, Persson MG, Wiklund NP, Moncada S. Endogenous nitric oxide present
in
the
exhaled
air
of
rabbits,
guinea pigs and humans. Biochem Biophys Res Commol/lun 181, 852857, 1991
87.
McCall
T,
Vallance
P.
Nitric
oxide
takes
center-stage
with
newly defined roles. Trends Pharmacol Sci 13, 1-6, 1992
88.
Middleton SJ, Shorthouse M, Hunter JO. Increased nitric oxide synthesis in ulcerative colitis. Lancet 341, 465-466, 1993
89.
Miller MJS, Sadowska-Krowicka H, Chotinaruemol S, Kakkis JL, Clark DA. Amelioration of chronic ileitis by nitric oxide synthase inhibition. J Pharmacol Exp Ther 264, 11-16, 1993
130
90.
Farrell
AJ,
concentrations
Blake
of
DR,
nitrite
Palmer
in
RMJ,
synovial
Moncada
fluid
and
S.
Increased
serum
samples
suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic disease. Ann Rheum Dis 51, 1219-1222, 1992
91.
Billiar TR, Curran RD, Ferrari FK, Williams DL, Simmons RL. Kuppfer
cell:
hepatocyte
cocultores
release
nitric
oxide
in
response to bacterial endotoxin. J Surg Res 48, 349-353, 1990
92.
Beckman
JS,
Beckman
TW,
Chen
J,
Marshall
PA,
Freeman
BA.
Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA 87, 1620-1624, 1990
93.
Boeckxtaens GJ, Mebis J, Janssens J, Geboes K, DeMan JG, Herman AG, Pelikmans PA. Clinical relevance of nitric oxide in the gut. Lancet 344, 129-130, 1994
94.
Fehér E, Montague C. Distribution and morphological features of nicotinamid
adenine
dinucleotide
phosphate
diaphorase
(NADPH-d)
activity in intrinsic neurons of the Oddi spinchter of the cat. Neurosci Lett 170, 114-116, 1994
95.
Grisham MB. Oxidants and free radicals in inflammatory bowel disease. Lancet 344, 859-861, 1994
96.
McKirdy cholinergic
ML,
McKirdy
inhibitory
HC,
Johnson
innervation
CD.
shown
Non-adrenergic by
electrical
nonfield
stimulation of isolated strips of human gall bladder muscle. Gut 35, 412-416, 1994
97.
Mearin F, Mourelle M, Guarner F, Salas A, Riveros Moreno V, Moncada S, Malagelada JR. Patient with achalasia lack nitric oxide synthase in the gastro-oesophageal junction. Eur J Clin Invest 23, 724-728, 1993
131
98.
Vanderwinden
JM,
De
Laet
M-H,
Schiffman
SN,
Mailleux
P,
Lowenstein CJ, Snyder SH, Vanderhaeguen JJ. Nitric oxide synthase distribution in the enteric nervous system of Hirschprung disease. Gastroenterology 105, 969-73, 1993
99.
Boughton-Smith NK, Evans SM, Hawkey CJ, Hawkey CJ, Cole AT, Balsitis M, Whittle BJR, Moncada S. Nitric oxide synthase activity in ulcerative colitis and Crohn disease. Lancet 342, 338-340, 1993
100.
Salzman AL. Nitric oxide in the gut. New Horizont 3, 352-364,
1995
101.
Whittle
BJR,
Boughton-Smith
NK,
Moncada
S.
Biosynthesis
and
Role of the Endothelium-Derived Vasodilatator, Nitric Oxide, in the Gastric Mucosa. Ann NY Acad Sci 664, 126-139, 1992
102.
Mannick EE, Bravo LE, Zarama G, Realpe JL, Zhang XJ, Ruiz B,
Fontham ET, Mera R, Miller MJ, Correa P. Inducible nitric oxide synthase,
nitrotyrosine,
gastritis:
effect
of
apoptosis
antibiotics
in
and
Helicobacter
antioxidants.
pylori
Cancer
Res
56(14), 3238-3243, 1996
103.
Oudkerk-Pool
M,
Bouma
G,
Visser
JJ,
Kolkman
JJ,
Tran
PD,
Menwissen SG, Peña AS. Serum nitrate levels in ulcerative colitis and Crohn’s disease. Scand J Gastroenterol 30, 784-788, 1995
104.
Moochhala S, Chhatwal VJ, Chan ST, Ngoi SS, Chia YW, Rauff A.
Nitric oxide synthase activity and expression in human colorectal cancer. Carcinogenesis 17, 1171-1174, 1996
105.
Cortesini
synthase
C,
and
Cianchi VIP
F,
Infantino
distribution
in
A,
Lise
enteric
M.
Nitric
nervous
oxide
system
in
idiopathic chronic constipation. Dig Dis Sci 40, 2450-2455, 1995
106.
Grisham
MB,
Granger
DN.
Neutrophil-mediated
mucosal
injury:
role of reactive oxygen metabolites. Dig Dis Sci 33, 6S-15S, 1988
132
107.
Harris ML, Schiller HJ, Reilly PM, Donowitz M, Grisham
MB,
Bulkley GB. Free radicals and other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease. Cause, consequnce,
or
epiphenomenon?
Pharmacol Ther 53, 75-408, 1992
108.
Grisham
MB.
inflammol/latory
Role bowel
of
reactive
disease.
Curr
oxygen
Opin
metabolites
Gastroenterol
9,
in 971-
980,1993
109.
Klebanoff SJ. Oxygen metabolits from pfagocytes. In: Gallin JI,
Goldstein IM, Snyderman R (szerk.) New York: Raven Press 541-588, 1992
110.
Weitzman SA, Gordon LI. Blood: inflammation and cancer. Role of
phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood
76,
65-63,
1990
111.
Grisham MB. Reactive oxygen metabolites of oxygen and nitrogen
in biology and medicine. r g Landes Company, Austin, Texas, 1992
112.
Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med 320,
365-376, 1989
113.
Keshavarzian
production
of
A,
Sedghi
reactive
S,
Kanofsky
oxygen
J
metabolites
et by
al.
Excessive
inflammed
colon:
analysis by chemoluminescence probe. Gastroenterology 103, 186-196, 1992
114.
Oshitani
Kobayashi
K.
N,
Kitano
Location
A, of
Okabe
H,
superoxide
Nakamura anion
S,
Matsumato
generation
in
T,
human
colonic mucosa obtained by biopsy. Gut 34, 936-938, 1993
115. V,
Ahnfelt-Ronne I, Neilson OH, Christensen A, Langholz E, Binder Riis
P.
Clinical
evidence
supporting
the
radical
scavenger
mechanism of 5-aminosalicylic acid. Gastroenterology 98, 1162-1169, 1990
116.
Grisham MB, MacDermott RP, Deitch EA. Oxidant defense mechanism
in the human colon. Inflammation 14, 669-680, 1990
133
117.
Emerit J, Pelletier S, Tosoni-Verilgnue D, Mollet M. Phase II
trial of copper/zinc superoxide dismutase (CuZnSOD) in traetment of Crohn's disease Free Radic Biol Med 7, 145-149, 1989
118.
Keshavarzian
A,
Haydeck
J,
Zabihi
R,
Doria
M,
Dástice
M,
Sorenson JRJ. Agents capable of eliminating reactive oxygen species catalase,
WR-2721
or
Cu(II)2(3,5-DIPS)4
decreases
experimental
colitis. Dig Dis Sci 37, 1866-1873, 1992
119.
Yamada T, Volkmer C, Grisham MB. Antioxidant properties of 5-
ASA: potential mechanism for its anti-inflammatory activity. Can J Gastroenterology 4, 295-302, 1990
120.
Grisham MB, Granger DN. 5-aminosalicylic acid concentration in
mucosal interstitium of cat small and large intestine. Dig Dis Sci 34, 375-378, 1989
121.
Malaisse WJ. Alloxan toxicity to the pancreatic B-cell. A new
hypothesis. Biochem Pharmacol 31(22), 3527-3534, 1982
122.
Eizirik
DL,
deLucio
MA,
Boschero
AC,
Hoffmann
ME.
1,10-
phenantroline, a metal chelator, protects against alloxan but not streptozotocin induced diabetes. Free Radical Biol Med 2(3), 189192, 1986
123.
Grankvist K, Marklund S, Taljedal IB. Superoxide dismutase is a
prophylactic against alloxan diabetes. Nature 294(5837), 158-160, 1981
124.
Fischer
LJ,
Hamburger
SA.
Inhibition
of
alloxan
action
in
isolated pancreatic islets by superoxide dismutase, catalase, and a metal chelator. Diabetes 29(3), 21321-21326, 1980
125.
Mendola J, Wright JR, Lacy PE. Oxigen free radical scavengers
and immol/lune destruction of murine islets in allograft rejection and multiple low dose streptozotocin induced insulitis. Diabetes 38, 379-385, 1989
134
126.
Corbett
JA,
autoimmol/lune
Mc
Daniel
destruction
ML.
of
Does
beta
nitric
cells?
oxide
Possible
mediate
therapeutic
interventions in IDDM. Diabetes 41, 897-903, 1992
127.
McLaren GD, Muir WA, Kellermeyer RW. Iron overload disorders:
natural history, pathogenesis, diagnosis and therapy. Critrev Cl Lab Sci 19, 205-266, 1983
128.
Murthy VK, Shipp JC, Hanson C, Shipp DM. Delayed onset and
decreased
incidence
of
diabetes
in
BB
rats
fed
free
radical
scavengers. Diabetes Res Clin Pr 18(1), 11-16, 1992
129.
Flechner I, Maruta K, Burkart V, Kawai K, Kolb H, Kiesel U.
Effect of radical scavengers on the development of experimental diabetes. Diabetes Res 13(2), 67-73, 1990
130.
Prevention of Diabetes Mellitus, WHO Technical Report Series
844, 1994
131.
Cudworth
AG,
Bodansky
HJ,
West
KM.
Genetic
and
metabolic
factors in relationship to the prevalence and severity of diabetic complications. In: Keen H, Jarrett J. Complications of diabetes, London
132.
Wolff
SP,
Dean
RT.
Glucose
autoxidation
and
protein
modification. Biochem J 245, 243-250, 1987
133.
Sato Y, Hota N, Sakamoto N, Matasuoka s, Ohishi N, Yagi K.
Lipid peroxide level in plasma of diabetic patients. Biochem Med 21, 104-107, 1979
134.
Jain
SK,
Levine
SN,
Duett
J,
Hollier
B.
Elevated
lipid
peroxidation levels in red blood cells of streptozotocin treated diabetic rats. Metabolism 39(9), 971-975, 1990
135.
Jain SK, Levine SN, Duett J, Hollier B. Reduced vitamin E and
increased
lipofuscin
products
in
Diabetes 40, 1241-1244, 1991
135
erythrocytes
of
diabetic
rats.
136.
Jain SK, McVie R, Duett J, Herbst JJ
lipid
peroxidation
and
glycosylated
Erythrocyte membrane
hemoglobin
in
diabetes.
Diabetes 38, 1539-1543, 1989
137. M,
Ziegler O, Guerci B, Muller H, Candiloros H, Méjean L, Donner Stoltz
JF,
Drouin
P.
Increased
erythrocyte
aggregation
in
insulin dependent diabetes mellitus and its relationship to plasma factors: a multivariate analysis. Metabolism, 43 (9), 1182-1186, 1994
138.
Somogyi
A.
Diabetes
mellitus
és
lipoproteinek.
Orv
Hetil
134(43), 2371-2378, 1993
139.
Betteridge DJ. Diabetic dislipidemia. Am J Med 96(6A), 25-31,
1994
140.
Hunt JV, Smith CCT, Wolf SP. Autoxidative glycosylation and
possible
involvement
of
peroxides
and
free
radicals
in
LDL
modification by glucose. Diabetes 39,1420-1424, 1990
141.
Lyons TJ, Li W, Wells-Knecht MC, Jokl R. Toxicity of mildly
modified LDL to cultured retinal capillary endothelial cells and pericytes. Diabetes 43, 1090-1095, 1994
142.
Srivastava SK, Ansari NH, Liu S, Izban A, Das B, Szabo G,
Bhatnagar A. The effect of oxidants on biomembranes and cellular metabolism. Mol Cell Biochem 91(1-2), 149-157, 1989
143.
Nagasaka Y, Fujii S, Kaneko T. Effects of high glucose and
sorbitol pathway on lipid peroxidation of erythrocytes. Horm Metab Res 21(5), 275-276, 1989
144.
Williamson JR, Chang K, Frangos M, Hasan KS, Ido Y, Kawamura T,
Nyengaard JR, van den Enden M, Kilo C, Tilton RG. Hyperglycemic pseudohypoxia
and
diabetic
complications.
Diabetes
42,
801-813,
1993
145.
Tesfamariam
B.
Free
radicals
in
diabetic
endothelial
dysfunction. Free Radical Biol Med 16(3), 383-391, 1994
136
cell
146.
Harris ED. Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J 6, 2675-
2683, 1992
147.
Kullik I, Storz G. Transcriptional regulators of the oxidative
stress response in prokaryotes and eukaryotes. Redox Report 1, 2329, 1994
148.
Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The
effect
of
intensive
progression
of
treatment
long-term
of
diabetes
complications
on
in
development
of
insulin-dependent
diabetes mellitus. N Eng J Med 329, 977-986, 1993
149.
Wohaieb
defense
SA,
Godin
mechanisms
in
DV.
Alterations
streptozotocin
in
free
induced
radical
diabetes
tissue in
rat.
Diabetes 36, 1014-1018, 1987
150.
Dohi
T,
Kawamura
K,
Morita
K,
Okamoto
H,
Tsujimoto
A.
Alterations of plasma selenium concentrations and the activities of tissue
peroxide
metabolism
enzymes
in
streptozotocin
induced
diabetic rats. Horm Metab Res 20, 671-675, 1988
151.
Matkovics
B,
Varga
Sz
I,
Szabo
L,
Witas
H.
The
effect
diabetes on the activities of the peroxide metabolism enzymes
of
Horm
Metab Res 14, 77-79, 1982
152.
Loven D, Schedl H, Wilson H, Daabees TT, Stegink LD, Diekus M,
Oberley L. Effect of insulin and oral glutathione on glutathione levels and superoxide dismutase activities in organs of rats with streptozotocin induced diabetes. Diabetes 35, 503-507, 1986
153.
Sukalski KA, Pinto KA, Berntson JL. Decreased susceptibility of
liver
mitochondria
associated
increase
from in
diabetic alpha
rats
to
tocopherol.
oxidative Free
damage
Radical
Bio
and Med
14(1), 57-65, 1993
154.
Langenstroer
P,
Pieper
GM.
Regulation
of
spontaneous
EDRF
release in diabetic rat aorta by oxigen free radicals. Am J Physiol 63(1Pt2), H257-265, 1992
137
155. N.
Kawamura N, Ókawara T, Suzuki K, Konishi K, Mino M, Taniguchi Increased
glycated
Cu,Zn-superoxide
dismutase
levels
in
erythrocytes of patients with IDDM J Clin Endocrinol Metab 74(6), 1352-1354, 1992
156.
Godin DV, Wohaieb SA, Garnett ME et al. Antioxidant
enzyme
alterations in experimental and clinical diabetes. Mol Cell Biochem 84, 223-231, 1988
157.
Bono
A,
CaimiG,
Catania
A,
Sarno
A,
peroxide metabolism in diabetes mellitus
Pandolfo
L.
Red
cell
Horm Metab Res 19(6),
264-266, 1987
158.
Kaji H, Kurasaki M, Ito K, Saito T, Saito K, Níoka T, Kojima Y,
Ohsaki Y, Ide H, Tsuji M et al. Increased lipoperoxide value and glutathione peroxidase activity in blood plasma of type I diabetic women. Klin Wochenschr 63(16), 765-768, 1985
159.
Adachi T, Ohta H, Hirano K, Hayashi K, Marklund SL. Non-enzymic
glycation of human superoxide dismutase. Biochem J 279(Pt1), 263267, 1991
160.
Mukherjee B, Mukherjee JR, Chatterjee M. Lipid peroxidation,
glutathione activities Cell
161.
levels in
and
changes
streptozotocin
in
induced
glutathione diabetic
related
rats.
enzyme
Immol/lunol
Biol 72, 109-114, 1994
Tagami S, Kondo T, Yoshida K, Hirokawa J, Ohtsuka Y, Kawakami
Y. Effect of insulin on impaired antioxidant activities in aortic endothelial cells from diabetic rabbits. Metabolism 41(10), 10531058, 1992
162.
Blakytny R, Harding JJ. Glycation (non-enzymatic glycosilation)
inactivates glutathione reductase. Biochem J 288, 303-307, 1992
138
163.
Stahlberg
MR,
Hietanen
E.
Glutathione
and
glutathione
metabolizing enzymes in the erythrocytes of healthy children and children
with
rheumatoid leukemia.
164.
Walter
insulin
arthritis,
dependent coeliac
diabetes
disease
and
mellitus, acute
juvenile
lymphoblastic
Scand J Clin Lab Invest 51(2), 125-130, 1991
RM,
Uriu-Hare
JY,
Olin
HL,
Oster
MH,
Anawalt
BD,
Critchfield JW, Keen CL
Copper, zinc, manganese, and magnesium
status
of
and
complications
diabetes
mellitus
Diabetes
Care
erythrocytes
from
14(11), 1050-1056, 1991
165.
Murakami
K.
Glutathione
metabolism
in
patients with diabetes mellitus. Hokkaido Igaku Zasshi 66(1), 2940, 1991
166.
Yoshida K, Hirokawa J, Tagami S, Kawakami Y, Urata Y, Kondo T.
Weakened cellular scavenging activity against oxidative stress in diabetes mellitus: regulation of glutathione synthesis and efflux. Diabetologia 38, 201-210, 1995
167.
Jain SK, McVie R. Effect of glycemic control, race (white vs.
black) and duration of diabetes on reduced glutathione content in erythrocytes of diabetic patients. Metabolism 43, 306-309, 1994
168. and
Uzel N, Sivas A, Uysal M, Oz H. Erythrocyte lipid peroxidation glutathione
peroxidase
activities
in
patients
with
diabetes
mellitus. Horm Metab Res 19, 89-90, 1987
169.
Cser A, Sziklai LI, Menzel H, Lombeck I. Selenium status and
lipoproteins in healthy and diabetic children. Trace Elem Electroly 7(4), 205-210, 1993
170.
Asayama K, Hayashibe H, Dobashi K, Níitsu T, Miyao A, Kato K.
Antioxidant enzyme status and lipid peroxidation in various tissues of diabetic and starved rats. Diabetes Res 12(2), 85-91, 1989
171.
Pearl A, Hale A, Whitehead T. Serum urate as a free radical
scavenger in diabetics. J Med Syst 17(3-4), 233-237, 1993
139
172.
Whitehead Tp, Junger I, Robinson D, Kolar W, Pearl A, Hale A.
Serum urate, serum glucose and diabetes. Ann Clin Biochem
29, 159-
161, 1995
173.
Tunon
MJ,
transport
of
Gonzalez
P,
bilirubin
Garcia-Pardo in
rats
LA,
with
Gonzalez
J.
Hepatic
streptozotocin-induced
diabetes. J Hepatol 13(1), 71-77, 1991
174. JM.
Jefferson LS, Liao WS, Peavy DE, Miller TB, Appel MC, Taylor Diabetes-induced
alterations
in
liver
protein
synthesis.
Changes in the relative abundance of mRNAs for albumin and other plasma proteins. J Biol Chem 258(2), 1369-1375, 1983
175.
Cunningham
JJ.
Altered
vitamin
C
transport
in
diabetes
mellitus. Med hypothesis 26, 263-265
176.
Behrens WA, Madere R. Vitamin C and vitamin E status in the
spontaneously
diabetic
BB
rat
before
the
onset
of
diabetes.
Metabolism 40(1), 72-76, 1991
177.
Bode AM, Yavarow CR, Fry DA, Vargas T. Enzymatic basis for
altered ascorbic acid and dehydroascorbic acid levels in diabetes. Biochem Biophys Res Commol/lun 191(3), 1347-1353, 1993
178.
Sinclair AJ, Taylor PB, Lunec J, Girling AJ, Barnett AH. Low
plasma ascorbate levels in patients with type 2 diabetes mellitus consuming adequate dietary vitamin C. Diabetic Med 11(9), 893-898, 1994
179.
Cunningham
JJ,
Ellis
SL,
McVeigh
KL,
Levine
RE,
Calles
Escandon J. Reduced mononuclear leukocyte ascorbic acid content in adults with insulin-dependent diabetes mellitus consuming adequate dietary vitamin C. Metabolism 40(2), 146-149, 1991
180.
Som S, Basu S, Mukherjee D, Deb S, Choudhury PR, mukherjee S,
Chatterjee SN, Chatterjee IB. et al. Ascorbic acid metabolism in diabetes mellitus. Metabolism 30(6), 572-577, 1981
140
181.
Stankova L, Riddle M, Larned J, Burry K, Menashe D, Hart J,
Bigley
R.
Plasma
dehydroascorbate
ascorbate
transportin
concentrations patients
with
and
blood
diabetes
cell
mellitus.
Metabolism 33(4), 347-353, 1984
182.
Jennings PE, Chirico S, Jones AF, Lunec J, Barnett AH. Vitamin
C metabolites and microangiopathy in diabetes mellitus. Diabetes Res 6(3), 151-154, 1987
183.
Schorah CJ, Bishop N,
Wales JK, Hansbro PM, Habibzadeh N.
Blood vitamin C concentrations in patients with diabetes mellitus. Int J Vitam Nutr Res 58(3), 312-318, 1988
184.
Sinclair
AJ,
Girling
AJ,
Gray
L,
Lunec
J,
Barnett
AH.
An
investigation of the relationship between free radical activity and vitamin C metabolism in elderly diabetic subjects with retinopathy. Gerontology 38(5), 268-274, 1992
185.
Shoff SM, Mares Perlman JA, Cruickshanks KJ, Klein R, Klein BE,
Ritter LL. Glycosylated hemoglobin concentrations and vitamin E, vitamin C, and beta-carotene intake in diabetic and nondiabetic older adults. Am J Clin Nutr 58(3), 412-416, 1993
186.
Akkus I, Kalak S, Vural H, Caglayan O, Menekse E, Can G, Durmus
B. Leukocyte lipid peroxidation, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and serum and leukocyte vitamin C levels of patients with type II diabetes mellitus. Clin Chim Acta 244(2), 221-227, 1996
187.
Ndahimana
J,
Dorchy
H,
Vertongen
F.
Erythrocyte
and
plasma
antioxidant activity in diabetes mellitus type I. Presse Med 25(5), 188-192, 1996
188.
Rema M, Mohan V, Bhaskar A, Shanmugasundaram KR. Does oxidant
stress play a role in diabetic retinopathy? Indian J Ophthalmol 43(1), 17-21, 1995
141
189.
Sundaram RK, Bhaskar A, Vijayalingam S, Viswanathan M, Mohan R
Shanmugasundaram KR. Antioxidant status and lipid peroxidation in type II diabetes mellitus with and without complications. Clin Sci Colch 90(4), 255-260, 1996
190.
Nagano S, Kurokawa M, Ebara T, Naito H, Sakamaki R, Furukawa S,
Hirano
T,
Maeda
M,
Tsuji
A.
Decrease
of
serum
ascorbic
acid
concentrations in patients with diabetic macroangiopathy. J Nutr Sci Vitaminol 42(1), 1-9, 1996
191.
Behrens WA, Madere R. Vitamin C and vitamin E status in the
spontaneously
diabetic
BB
rat
before
the
onset
of
diabetes.
Metabolism 40(1), 72-76, 1991
192.
Behrens WA, Scott FW, Madere R, Trick KD. Increased plasma and
tissue levels of vitamin E in the spontaneously diabetic BB rat. Life Sci 35(2), 199-206, 1984
193.
Vandewoude MG, van-Gaal LF, Vandewoude MF, De-Leeuw IH. Vitamin
E status in normocholesterolemic and hypercholesterolemic diabetic patients. Acta Diabetol Lat 24(2), 133-139, 1987
194.
Watanabe J, Umeda F, Wakasugi H, Ibayashi H. Effect of vitamin
E on platelet aggregation in diabetes mellitus. Tohoku J Exp Med 143(2), 161-169, 1984
195. of
Karpen CW, Cataland S, O'Dorisio TM, Panganamala RV. Production 12-hydroxyeicosatetraenoic
acid
and
vitamin
E
status
in
platelets from type I human diabetic subjects. Diabetes 34(6), 526531, 1985
196.
Sasaki H, Twasaki T, Kato S, Tada N. High
retinol/retinol-
binding protein ratio in noninsulin-dependent diabetes mellitus. A J
197.
Med
Sci. 310(5), 177-182, 1995
Morel DW, Chisolm GM. Antioxidant treatment of diabetic rats
inhibits lipoprotein oxidation and cytotoxicity. J Lipid Res 30, 1827-1834, 1989
142
198.
Douillet C, Chancerelle Y, Cruz C, marondes C, Kergonou JF,
Renaud S, Ciavatti M. High dosage vitamin E effect on oxidative status
and
serum
lipids
distribution
in
streptozotocin
induced
diabetic rats. biochem Med Metab Biol 50(3), 265-276, 1993
199.
Ceriello
Lefebvre
A,
PJ.
Guigliano
Vitamin
E
D
Quatraro
reduction
of
A,
Donzella
protein
C,
Dipalo
G,
glycosylation
in
diabetes. Diabetes Care 14, 68-72, 1991
200.
Paolisso G, Di Maro G, Galzerano D, Cacciapuoti F, Varricchio
G, Varrichio M, DOnofrio F. Pharmacological doses of vitamin E and insulin action in elderly subjects. Am J Clin Nutr 59, 1291-1296, 1994
201.
Stolba P, Hatle K, Krnakova A, Streda M, Starka L. Effects of
ascorbic acid on nonenzymatic glycation of serum proteins in vitro and in vivo. Diabetologia 30, 585A, 1987
202.
Khatami M, Suldan Z, David I, Weiye L, Rockey J. Inhibitory
effects
of
pyridoxal
phosphate,
ascobate
and
amino-guanidine
on
nonenzymatic glycosylation. Life Sci 43, 1725-1731, 1988
203.
Davie
SJ,
Gould
BJ,
Yudkin
JS.
Effect
of
vitamin
C
on
glycosylation of proteins. Diabetes 41, 167-173, 1992
204.
Young IS, Tate S, Lightbody JH, McMaster D, Trimble ER. The
effects of desferrioxamine and ascorbate on oxidative stress in the streptozotocin diabetic rat. Free Rad Biol Med 18, 833-845, 1995
205.
Paolisso G, D'Amore A, Balbi V, Volpe C, Galzerano D, Giugliano
D, Sgambato S, Varricchio M, D'Onofrio F. Plasma vitamin C affects glucose
homeostasis
in
healthy
subjects
and
in
non-insulin-
dependent diabetics. Am J Physiol 266, E261-268, 1994
206.
Weycamp CW, Penders TJ, Baadenhuijsen H, Muskiet FAJ, Martina
W, van der Silk W. Vitamin C and glycohemoglobin. Clin Chem 41, 713-716., 1995
143
207.
Bishop
N,
Schorah
supplementation
on
CJ,
Wales
diabetic
crossover study. Diabetic Med
208.
JK.
The
effect
hyperlipidaemia:
a
of
vitamin
double
C
blind,
2(2), 121-124, 1985
Paolisso G, Balbi V, Volpe C, Varricchio G, Gambardella
A,
Saccomanno F, Ammol/lendola S, Varricchio M, D'Onofrio F. Metabolic benefits deriving from chronic vitamin C supplementation in aged non-insulin dependent diabetics. J Am Coll Nutr 14(4), 387-392, 1995
209.
Eriksson
J,
Kohvakka
A.
Magnesium
and
ascorbic
acid
supplementation in diabetes mellitus. Ann Nutr Metab 39(4), 217223, 1995
210.
Wang H, Zhang ZB, Wen RR, Chen JW. Experimental and clinical
studies on the reduction of erythrocyte sorbitol-glucose ratios by ascorbic acid in diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pr 28(1), 18, 1995
211.
Braun L, Garzó T, Mandl J, Bánhegyi G. Ascorbic acid synthesis
is stimulated by enhanced glycogenolysis in murine liver. FEBS Lett 352, 4-6, 1994
212.
Braun L, Poussu A, Garzó T, Mandl J, Bánhegyi G. Glutathione
depletion induces glycogenolysis dependent ascorbic acid synthesis in isolated murine hepatocytes. FEBS Lett 388, 173-176, 1996
213.
Astler VB, Coller FA. The prognostic significance of direct
extension of carcinoma of the colon and rectum. Ann Surg 129, 846, 1954
214.
Dukes CE. The classification of cancer of the rectum. J Pathol
35, 323, 1932
215.
Green
LA,
Wagner
DA,
Glogowski
J,
Skipper
PL,
Wishmok
JS,
Tannenbaum SR. Analysis of nitrate, nitrite and [15N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem. 1982, 126, 131-138, 1982
144
216.
Prónai
L,
Ichikawa
Y,
Ichimori
K,
Nakazawa
H,
Arimori
S.
Association of enhanced superoxide generation by neutrophils with low superoxide scavenging activity of the peripheral blood, joint fluid,
and
their
leukocyte
components
in
rheumatoid
arthritis:
effects of slow-acting anti-rheumatic drugs and disease activity. Clin Exp Rheumatol 9, 149-155, 1991
217.
Sedlak J, Lindsay R. Estimation of total, protein bound and
nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal Biochem 25, 195-205, 1968
218.
Kaur
H,
oxidative
Halliwell
damage
in
B.
Evidence
chronic
for
nitric-oxide
inflammol/lation.
mediated
Nitrotyrosine
in
serum and synovial fluid from rheumatoid arthritis patients. FEBS Letters 350, 9-12, 1994
219.
Aebi H. Catalase in vitro. Method Enzimol 105, 125-127, 1984
220.
Blázovics A, Kovács Á, Lugasi A, Hagymási K, Bíró L, Fehér J.
Antioxidant defense in erythrocytes and plasma of patients with active
and
quiescent
Crohn
disease
and
ulcerative
colitis:
a
chemiluminescent study. Clin Chem 45(6), 895-896, 1999
221.
Lowry
OH,
Rosenbrough
NJ,
Farr
AL,
Randall
BJ.
Protein
mesurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-275, 1951
222.
Randle
European
PJ,
Lefebvre
Association
PJ,
for
Alberti
the
KGMN.
study
of
The
policy
diabetes
of
on
the
human
investigation. Diabetologia 15, 431-432, 1978
223.
Plagia
DE,
Valentine
WN.
Studies
on
the
quantitative
and
qualitative characterisation of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 70, 158-169, 1967
224.
Ball CR. Estimation and identification of thiols in rat spleen
after
cystein
or
glutathione
treatment:
relevance
to
protection
against nitrogen mustards. Biochem Pharmacol 15, 809-816, 1966
145
225.
Shearer MJ. Vitamins. In HPLC of small molecules - a practical
approach. Edited by C.K.Lim IRL PRESS Oxford-Wasshington DC. 175179, 1986
226.
Omaye ST, Turnbull JD, Sauerberlich HE. Selected methods for
the determination of ascorbic acid in animal cells, tissues, and fluids. Methods Enzymol 62, 3-11, 1979
227.
Harapanhalli
ascorbic
acid
RS,
Howell
levels
in
RW,
mice
Rao
DV.
following
Testicular dietary
and
plasma
intake:
high
performance liquid cromatography analysis. J Chromatogr 614, 233243, 1993
228.
Pyles LA, Stejskal EJ, Einzig S. Spectrophotometric measurement
of plasma thiobarbituric acid reactive substances in the presence of hemoglobin and bilirubin interference. PSEBM, 202(4), 407-419, 1993
229.
Middleton SJ, Reynolds PD, Shorthouse M, Hunter JO, Moss S.
Nitric oxide synthase in gastric mucosa. Gut, 36(6), 942, 1995
230.
Edwards
P,
Cendan
JC,
Topping
DB,
Moldawer
LL,
MacKay
S,
Copeland EM, Lind DS. Tumor cell nitric oxide inhibits cell growth in
vitro,
but
stimulates
tumorigenesis
and
experimental
lung
metastasis in vivo. J Surg Res 63, 49-52, 1996
231.
Thomsen
LL,
Miles
DW,
Happerfield
L,
et
al.
Nitric
oxide
synthase activity in human breast cancer. Br J Cancer 72(1), 41-44, 1995
232.
Jenkins DC, Charles IG, Baylis SA, Lelchuk R, Radomski
MW,
Moncada S. Human colon cancer cell lines show a diverse pattern of nitric oxide synthase gene expression and nitric oxide generation. Br J Cancer 70, 847-849, 1994
233.
Duenas-Gonzalez A, Isales CM, del-Mar-Abad-Hernandez M.
Expression of inducible nitric oxide synthase in breast cancer correlates with metastatic disease. Mod Pathol 10(7), 645-649, 1997
146
234.
Xie K, Dong Z, Fidler IJ. Activation of nitric oxide synthase
gene for inhibition of cancer metastasis. J Leukoc Biol 59, 798803, 1996
235.
Klotz T, Bloch W, Volberg C, et al. Selective expression of
inducible in human prostate carcinoma. Cancer 82(10), 1897-1903, 1998
236.
Liu CY, Wang CH, Chen TC, et al. Increased level of exhaled
nitric oxide and up-regulation of inducible nitric oxide synthase in patients with primary lung cancer. Br J Cancer 78(4), 534-541, 1998
237.
Moriyama A. High plasma concentrations of nitrite/nitrate in
patients with hepatocellular carcinoma. Am J Gastroenterol 92(9), 1520-1523, 1997
238.
Joossens JV, Hill MJ, Elliott P, Stamler R, Lesaffre E, Dyer A,
Nicols R, Kesteloot H. Dietary salt, nitrate and stomach cancer mortality in 24 countries. European Cancer Prevention (ECP) and the INTERSALT Cooperative Research Group. Int J Epidemol 25, 494-504, 1996
239.
La-Vecchia
C,
D'Avanzo
B,
Airoldi
L,
Braga
C,
Decarli
A.
Nitrosamine intake and gastric cancer risk. Eur J Cancer Prev 4, 469-474, 1995
240.
Bingham SA, Pignatelli B, Pollock JR, Ellul A, Malaveille C,
Gross G, Runswick S, Cummol/lungs JH, O'Neill IK. Does increased endogenous explain
formation
the
of
association
N-nitroso between
compounds red
meat
in
the
and
human
colon
colon
cancer?
Carcinogenesis 1996, 17, 515-523, 1996
241.
Csővári
S,
Angyal
T,
Benkő
K,
Strenger
I.
Free-Radical
Reactions and Cancer. Voprosy Meditsinskoi Khimii 38(5), 4-5, 1992
242.
Hoffmann CEJ, Webster NR, Wiggins PA, Chisholm EM, Giles GR,
Levenson SH. Free radical detoxifying system in human colorectal cancer. Br J Cancer 51, 127-129, 1985
147
243.
Pawlowicz Z, Zachara BA, Trafikowska U, Nowicki A. Low levels
of selenium and activity
of
glutathione
patients with gastrointestinal neoplasms.
peroxidase
in
Pol Tyg Lek
blood
of
48(25-26),
554-556, 1993
244.
Jendryczko A, Pardela M, Kozlowski A. Erythrocyte glutathione
peroxidase in patients with colon cancer. Neoplasma 40(2), 107-109, 1993
245.
Georgiannos
SN,
Weston
PM,
Goode
AW.
Micronutrients
in
gastrointestinal cancer. Br J Cancer 68(6), 1195-1198, 1993
246. SL.
Palan PR, Mikhail MS, Goldberg GL, Basu J, Runowicz CD, Romney Plasma
levels
of
beta-carotene,
lycopene,
canthaxanthin,
retinol, and alpha- and tau-tocopherol in cervical intraepithelial neoplasia and cancer. Clin Cancer Res 2(1), 181-185, 1996
247.
Wells
Ascorbic
WW,
Dou
acid
is
CZ,
Dybas
essential
LN, for
Jung the
CH,
Kalbach
release
of
HL,
Xu
insulin
DP. from
scorbutic guinea pig pancreatic islets. Proc Natl Acad Sci USA 92, 11869-11873, 1995
248.
Shigesawa
glutathione
T,
Sato
determination
C, in
Marumo
F.
patients
Significance with
alcoholic
of
plasma
and
alcoholic liver disease. J Gastroenterol Hepatol 7, 7-11, 1992
148
non-
