Synlabianer časopis pro pacienty a lékaře
červenec–září 2014
ročník VIII.
Rettův syndrom Infekce a cestování Členové skupiny SYNLAB CZECH
www.synlab.cz
obsah čísla
národa: 4 Zdraví Češi u vyšetření ledvin a slinivky propadli Zdeněk Soudný
výsledků Laboratoře 6 Prezentace molekulární diagnostiky synlab genetics na hematologických konferencích MUDr. Soňa Peková, Ph.D.
a histaminová intolerance 9 Histamin Dr. med. Laura Maintz, Prof. Dr. med. Natalija Novak
11
Rettův syndrom
13
Infekce a cestování
14
Infekční průjmová onemocnění
16
5. synlab congress, Berchtesgaden & Salzburg 22. 5. – 25. 5. 2014
Ing. Vratislav Svatoň, Ing. Kateřina Štolcová
MUDr. Blanka Boualay
MVDr. Michaela Verčinská
MUDr. Václava Lorencová
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
2
úvodní slovo Milí čtenáři, ačkoliv je léto považováno za nejklidnější období v roce, ve společnosti synlab jsme neustále v plném nasazení. Máme za sebou náročné stěhování ředitelství společnosti. Přesunuli jsme se do prostor, ve kterých budou mít zaměstnanci větší pohodlí při práci pro Vás, naše kolegy, partnery a pacienty. Za rychlý a dobře organizovaný přesun z Holešovic do Karlína patří veliké díky provoznímu oddělení. Za předešlé období se toho kromě stěhování událo v synlabu mnoho. Konaly se Olomoucké hematologické dny, kde synlab genetics prezentoval nejnovější výsledky svých výzkumů, neméně významná pak byla účast synlabu genetics na mezinárodní konferenci European Hematology Association v Miláně. Postery z obou akcí máte možnost shlédnout v tomto čísle Synlabianeru. Společně se společností Profood - Jemo trading spol. s r.o. jsme organizovali seminář o histaminové intoleranci, na kterém přednášely světové kapacity z oboru – Dr. med. Laura Maintz a doc. MUDr. Martin Hrubiško, Ph.D. V pražské laboratoři synlabu probíhá v současné době zkušební kvantitativní stanovení koncentrace diaminooxidázy v séru. Důkazem toho, že se nám daří, byl i počet vyšetřených v rámci preventivního programu Zdraví národa, díky němuž jsme v první polovině roku 2014 poskytli vyšetření více než 5000 pacientů. Zájem o program stále roste, a to nejen ze strany pacientů, ale také lékařů a společností působících na poli zdravotnictví. Více o tom, jak dopadl sběr vzorků zaměřený na ledviny a slinivku, se dočtete na našich stránkách. Neměla bych opomenout ani společenskou odpovědnost, kterou naše společnost prokázala, když se ujala organizace charitativního koncertu pro kojenecký ústav v Krči a pomohla tak těm, kdo si ještě sami pomoci neumí dětem. Dále spolupracujeme na lepší informovanosti pediatrů a rodičů o Rettově syndromu. Jedná se o závažné neléčitelné onemocnění, o kterém se bohužel v ČR moc neví. Z toho důvodu je možné, že jsou mezi námi stovky postižených, kterým není poskytnuta adekvátní péče. Doufám, že se nám podaří problémy s nedostatkem informací v této oblasti snížit. Přeji Vám krásné léto a bezstarostnou dovolenou. Kateřina Štolcová Marketingový specialista SYNLABIANER 07+08+09/2014 Vydala laboratorní skupina SYNLAB CZECH, dne 15. 7. 2014. Periodicita Redakce Autoři
čvtrtletník Kateřina Štolcová, Roman Smetka Zdeněk Soudný, MUDr. Soňa Peková, Ph.D., Dr. med. Laura Maintz, Prof. Dr. med. Natalija Novak, Ing. Štěpánka Luxová, Ing. Vratislav Svatoň, Ing. Kateřina Štolcová, MUDr. Blanka Boualay, MVDr. Michaela Verčinská, Roman Smetka, MUDr. Václava Lorencová. DTP a grafika Tomáš Müller Manažer projektu Roman Smetka Kontakt
[email protected], +420 731 133 185 Zdroje fotografií archiv redakce, Shutterstock, iStock. 2014 © laboratorní skupina SYNLAB CZECH Neprodejné, vychází pouze v elektronické podobě bez možnosti využití inzertní plochy. www.synlab.cz
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
3
zdraví národa
Zdraví národa: Češi u vyšetření ledvin a slinivky propadli Po játrech se preventivní program Zdraví národa zaměřil na ledviny a slinivku. Výsledky měsíčního sběru vzorků dopadly podobně špatně jako u jater – ukázalo se, že každý druhý Čech má s těmito orgány problém. Zatímco u jater na tom byli hůř muži, v případě ledvin a slinivky horších výsledků dosáhly ženy, nejohroženější skupinou jsou potom ženy starší 50 let. Milým překvapením v rámci „druhého běhu“ programu byl počet vyšetřených, který se oproti první části programu výrazně zvýšil a dosáhl 2 770 pacientů. Autor: Zdeněk Soudný „Každý druhý Čech měl ve výsledcích minimálně jeden z parametrů mimo referenční mez – znamená to tedy, že každý druhý Čech má problémy s ledvinami či slinivkou, a měl by se jim proto ve zvýšené míře věnovat,“ komentoval výsledky MUDr. Aleš Ducháček, praktický lékař společnosti synlab. U 51 procent vyšetřených se minimálně v jednom sledova-
ném parametru potvrdil pozitivní nález. „Neznamená to, že ti, komu výsledky ukázaly problém, trpí některým z onemocnění ledvin či slinivky. Měli by ale s výsledkovou listinou navštívit svého praktického lékaře, který rozhodne o dalším postupu. Jistě ale v mnoha případech bude potřeba detailnějších rozborů. Až v desítkách vyšetření byla přitom referenční mez u některého ze sledovaných parametrů překročena výrazně – v takovém případě se již velmi pravděpodobně jedná o vážnější problém a pacienti by jej neměli podceňovat,“ doplnil MUDr. Ducháček. I v případě ledvin se potvrzuje, že nejohroženější skupinou jsou lidé nad 50 let, a to bez ohledu na pohlaví. Poměrně překvapivý pohled na statistiky přineslo také zkoumání, kolik sledovaných kritérií bylo u jednoho pacienta zároveň mimo referenční mez – 6 pacientů přitom mělo problém u všech sedmi sledovaných faktorů. „Je potřeba zdůraznit, že podobně jako u jiných vnitřních orgánů, počátek onemocnění ledvin či slinivky nebolí, a lidé jej tak vůbec nemusí zjistit. Na preventivní vyšetření by proto měli chodit pravidelně,“ upozorňuje MUDr. Ducháček. A jak dodává, prevence před onemocněním obou orgánů je velmi podobná jako u mnoha jiných – nemít nadváhu,
nekouřit, mít dostatečný přísun tekutin, ale také si hlídat krevní tlak. „Bohužel v případě ledvin se téměř polovina pacientů dozví o problému až tehdy, když jim orgány selžou. Přitom včasná diagnóza onemocnění ledvin předchází nutnosti dialýz, nebo dokonce transplantace orgánu,“ varuje MUDr. Ducháček a dodává: „Podobně mnoho Čechů neví, že trpí některou z forem cukrovek. Vyšetření jsou rychlá a snadná a také léčba onemocnění v jeho počátku bývá velmi účinná.“ Tichým problémem je diabetes neboli cukrovka Naprosto alarmujících výsledků dosáhli Češi ve vyšetření glukózy v krvi. „Více než u 15 % vyšetřených se potvrdila glukóza v krvi mimo referenční mez. Přitom právě tento faktor je jedním z příznaků cukrovky. Toto procento je podstatně vyšší, než by odpovídalo předpokládanému výskytu cukrovky v české populaci, což dále zdůrazňuje skutečnost, že mnoho lidí o svém onemocnění neví a není léčeno,“ říká MUDr. Ducháček. Výskyt glukózy v krvi mimo referenční mez sice nutně neznamená cukrovku, je ale potřeba zdravotní stav konzultovat s praktickým lékařem a pravidelně se sledovat. Nejhorší výsledky glukózy v krvi se přitom týkají žen nad 50 let věku, které měly pozitivní nález o třetinu častěji než muži.
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
4
zdraví národa Dalším problémem české populace při vyšetření ledvin a slinivky v rámci programu Zdraví národa se ukázal kreatinin. Ten byl mimo referenční mez téměř u 12 % pacientů, výrazně hůře na tom jsou přitom ženy, u kterých vyšly špatné výsledky třikrát častěji než u mužů. „Hladina kreatininu je základním krevním ukazatelem funkce ledvin a její zvýšení může ukazovat na jejich onemocnění,“ podotýká MUDr. Ducháček. Častým problémem vyšetření ledvin a slinivky byla také močovina (urea) v krvi. Pozitivní nález měl přibližně každý desátý vyšetřený, přičemž opět výrazně častěji byly mimo referenční mez ženy než muži (a to v poměru 3:1 ve prospěch mužů). Jestliže ledviny nefungují tak, jak mají, nejsou schopny močovinu odstraňovat a ta zůstává v krvi. Močovina se tedy sleduje vždy při podezření na selhání ledvin a obecně indikuje jejich nesprávnou funkci. O něco lépe, přesto s poměrně častým výskytem mimo referenční
mez, si Češi vedli ve výsledcích vyšetření kyseliny močové v krvi. Zde byl problém u 5 % vyšetřených, přičemž opět platí, že ženy jsou na tom o třetinu hůře než muži. Vysoké hladiny kyseliny močové mohou přitom způsobovat ukládání jejich krystalů ve tkáních, a to hlavně v ledvinách (způsobující onemocnění ledvin) a v kloubní tekutině (při dně). V močových cestách se mohou krystaly kyseliny močové podílet na vzniku močových kamenů. Nálezy mimo referenční mez zaznamenali lékaři v rámci programu Zdraví národa také u vyšetření na alfa-amylázu v krvi, lipázu a pankreatickou amylázu. „Všechny tyto sledované faktory přitom ukazují na fakt, že česká populace má často problémy s ledvinami a slinivkou, přitom o nich velmi pravděpodobně ani neví. Jako jednou ročně necháme na servisní prohlídce zkontrolovat náš vůz, abychom s ním mohli v dalším roce bezpečně jezdit, měli bychom se stejně tak naučit pečovat o své zdraví. Například preventivní
vyšetření ledvin či slinivky může nejen pomoci včas zahájit léčbu, a tím zkrátit její potřebnou délku, ale může také zachránit život,“ uzavírá MUDr. Ducháček. Další na řadě: minerály v těle Další na řadě v preventivním programu Zdraví národa jsou minerály a jejich výskyt v těle. Bezplatné testování bude probíhat v druhé polovině roku (září). Mnoho lidí se i dnes na odběrová místa společnosti synlab obrací s prosbou o vyšetření orgánů, která již v programu Zdraví národa byly vyšetřovány. Ačkoli již jejich bezplatné vyšetření bylo ukončeno, každý zájemce si jej může zaplatit – jejich cena se pohybuje od sta do tří set korun a jsou to rozhodně dobře investované peníze. V případě zájmu o toto vyšetření se nemusíte objednávat – stačí přijít na odběrové pracoviště a požádat o kontrolu jater nebo ledvin a slinivky. Výsledky vám v takovém případě přijdou poštou domů, nebo k praktickému lékaři. Věnujte se svému zdraví – vyplatí se to!
ZDRAVÍ NÁRODA
OBJEDNÁVKA LABORATORNÍHO VYŠETŘENÍ
BLOK SLINIVKA + LEDVINY (DIABETES) ÚDAJE O PACIENTOVI
METODY HRAZENÉ SPOLEČNOSTÍ SYNLAB CZECH
RČ
Lipáza
Glukóza v séru
PŘÍJMENÍ
α-amyláza
Kreatinin
JMÉNO
Amyláza pankreatická
Urea Kyselina močová
POJIŠŤOVNA
ÚDAJE O LÉKAŘI
zlatý uzávěr (sérum)
PŘÍJMENÍ
Pacient svým podpisem uděluje souhlas společnosti synlab czech s. r. o., se sídlem Praha 6, U vojenské nemocnice 1200, IČ: 496 88 804 k tomu, aby nakládala s výsledky laboratorních vyšetření biologických vzorků odebraných pacientovi na základě této žádanky, jejichž druhy jsou vyznačeny na této žádance, tím způsobem, že tyto výsledky zašle registrujícímu poskytovateli ambulantní péče v oboru všeobecné praktické lékařství pacienta, jehož kontaktní údaje pacient na této žádance uvádí. Svým podpisem pacient dále zprošťuje ve smyslu § 51 odst. 2 písm. b) zákona č. 372/2011 Sb., o zdravotních službách společnost synlab czech s. r. o. jakožto poskytovatele zdravotních služeb v uvedeném rozsahu a za uvedených podmínek povinné mlčenlivosti, když jí uděluje souhlas k tomu, aby uvedeným způsobem sdělila předmětné údaje, které se jakožto poskytovatel zdravotních služeb dozvěděla v souvislosti s poskytováním zdravotních služeb.
JMÉNO ADRESA
©2014 synlab czech s. r. o.
IČP LÉKAŘE
ZDE NALEPTE ŠTÍTEK DATUM
www.synlab.cz
www.zdravinaroda.cz
PODPIS PACIENTA
*57002* 57002
Call centrum: 800 800 234
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
5
věda a poznání
Prezentace výsledků Laboratoře molekulární diagnostiky synlab genetics na hematologických konferencích Olomoucké hematologické dny v Olomouci a European Hematology Association v Miláně. Autor: MUDr. Soňa Peková, Ph.D.
Přístup 1: AML, MLL/AF6 pozitivní Ve dnech 1.–3. června 2014 se již 28. rokem konaly Olomoucké hematologické dny, které představují jednu z nejvyhledávanějších tuzemských hematologických konferencí. Laboratoř synlab genetics je pravidelným hostem těchto událostí a každým rokem prezentuje formou přednášek či posterových sdělení nejnovější výsledky své výzkumné práce. V letošním roce měla laboratoř synlab genetics možnost prezentovat dvě přednášky – „Characterization of the Rare Translocation t (3;10)(q26;q21) in an Acute Myeloid Leukemia Patient” a „Stanovení minimální reziduální nemoci s využitím mutací v genu CEBPA u pacientů s AML pomocí DNA sekvenování nové generace“ a jedno posterové sdělení na téma „Možnosti detekce zlomových míst u přestaveb zahrnujících gen MLL“ (Obrázek 1). Všechna tři sdělení byla věnována hematoonkologické problematice, především charakterizaci nových genetických abnormalit u akutní myeloidní leukémie (AML) a jejich využití v programu sledování minimální reziduální nemoci po transplantaci kostní dřeně. Hematoonkologické problematice se laboratoř synlab genetics intenzivně věnuje již řadu let a může se pochlubit celou řadou odborných seminářů, přednášek, posterů a rovněž odborných publikací v mezinárodních recenzovaných časopisech.
1. 2.
Detekce fúzního transkriptu MLL/AF6 v záchytu onemocnění (AcutePlexX) Návrh primerů pro long-range PCR: kombinace 1 forward primer z MLL (MLL F1) a 9 reverse primerů z intronu 1 (délka 32 kbp) a 1 reverse primer z exonu 2 genu AF6 (AF6Rx), navrženo na max. délku produktů cca 5 kbp
3.
Sekvenování produktu z long-range PCR
4.
Návrh a optimalizace pacient-specifické eseje a sledování MRN
Na Olomouckých hematologických dnech v letošním roce velmi úspěšně reprezentovaly laboratoř synlab genetics kolegyně Mgr. Lenka Žejšková, Ph.D., a Mgr. Tereza Jančušková. Obě kolegyně rovněž prezentovaly práci laboratoře synlab genetics na mezinárodní hematologické konferenci European Hematology Association (EHA) v Miláně, která se konala ve dnech 12.–15. června 2014. EHA je nejprestižnější evropskou hematologickou odbornou událostí a každým rokem jsou zde reportovány nejdůležitější
objevy a poznatky v oboru nemaligní i nádorové hematologie. Náš příspěvek popisoval molekulární charakterizaci unikátní translokace genu MECOM, kterou jsme popsali u jednoho z našich pacientů s akutní myeloidní leukémií. (Obrázek 2). Prezentace práce laboratoře synlab genetics na vědeckých fórech patří mezi její významné a strategické aktivity a je mimořádně pozitivní, že jsou výzkumné výsledky synlab genetics každoročně uznávány nejenom tuzemskou, ale i zahraniční odbornou veřejností.
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
6
věda a poznání
Možnosti detekce zlomových míst u přestaveb zahrnujících gen MLL Úvod Gen MLL (mixed lineage leukemia) se nachází na chromozomu 11 v oblasti 11q23. Přestavby genu MLL s různými fúzními partnery se vyskytují jak u dětských, tak u dospělých pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL) i akutní myeloidní leukémií (AML) a patří mezi prognosticky nepříznivé. Detekce minimální reziduální nemoci (MRN) je důležitým nástrojem pro sledování léčebné odpovědi u pacientů s akutní leukémií a umožňuje rizikovou stratifikaci pacientů. Exprese MLL fúzních transkriptů je obvykle nízká a neumožňuje senzitivní sledování MRN na úrovni mRNA. Možností je identifikace zlomových míst a vyšetřování MRN na DNA úrovni. V této práci bychom chtěli prezentovat naše zkušenosti s mapováním MLL zlomových míst.
Cíl Identifikace zlomových míst u přestaveb zahrnujících gen MLL a návrh pacient-specifické eseje pro sledování MRN na DNA úrovni. Metody Fúzní transkripty MLL/AF6, MLL/ AF9, MLL/AF10, MLL/ELL byly detekovány v záchytu onemocnění u 4 dospělých pacientů s AML a fúzní transkript MLL/AF4 u 1 dospělého pacienta s ALL. Pro identifikaci zlomového místa jsme použili 2 různé postupy. První zahrnoval long-range PCR z intronů spolu se sekvenací získaných produktů, u druhého postupu se využila kombinace konvenční mikrodisekce, sekvenování nové generace a long-range PCR spolu s následnou sekvenací získaných produktů. Získané sekvence byly využity pro
Závěr Přestavby genu MLL mohou být detekovány různými metodami (např. inverzní PCR, panhandle PCR). Naše výsledky ukazují další možnosti identifikace přestaveb zahrnujících gen MLL nezbytných pro přípravu pacientspecifické eseje pro senzitivní sledování MRN u pacientů s akutní leukémií. Lenka Žejšková1, Radek Plachý1, Tereza Jančušková1, David W. Hardekopf1, Jiří Štika1, Nadezda Kosyakova2, Thomas Liehr2, Alžběta Zavřelová3, Pavel Žák3, Veronika Petečuková4, Jan Novák4, Tomáš Kozák4, Soňa Peková1 synlab genetics s.r.o., Laboratoř molekulární diagnostiky, Praha 2 Institute of Human Genetics, Jena University Hospital, Jena, Germany 3 IV. interní hematologická klinika, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Hradec Králové 4 Interní hematologická klinika, Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, Praha
návrh pacient-specifické eseje a senzitivní sledování MRN pomocí kvantitativní real-time PCR. Výsledky S použitím výše uvedených postupů jsme identifikovali zlomová místa přestaveb genu MLL u 4 pacientů s AML a 1 pacienta s ALL. Prvním postupem jsme na nukleotidové úrovni detekovali zlomová místa MLL/ AF6 (viz Přístup 1), MLL/AF9 a MLL/ ELL, druhým postupem jsme získali sekvence zlomových míst MLL/AF10 (viz Přístup 2) a MLL/ AF4. Díky identifikaci zlomových míst jsme mohli sledovat MRN pomocí kvantitativní real-time PCR s vysokou senzitivitou při specificitě reakce. Dynamika počtu reziduálních buněk korelovala s klinickým průběhem onemocnění.
Přístup 2: AML, MLL/AF10 pozitivní 1.
Cytogenetické vyšetření
2.
46,XY,der(10)ins(10;11)(p12;q13q23),t(11;14)(q13;q11)
Mikrodisekce oblasti der(10), DOP-PCR, sekvenování nové generace (GS Junior, Roche)
DOP-PCR
3.
Mapovaní získaných dat k referenčním sekvencím chromozomů 10 a 11 s využitím softwaru, který byl naprogramován pro tyto účely
4.
Návrh a optimalizace pacientspecifické eseje a sledování MRN
1
Dle posledních zamapovaných čtení návrh primerů pro long-range PCR a sekvenování získaného produktu
www.synlab.cz SYNLABIANER duben–červen 2014
7
věda a poznání
Characterization of the Rare Translocation t(3;10) (q26;q21) in an Acute Myeloid Leukemia Patient
Step 1: Identifying Derivative Chromosome
X25
• Karyotype: 46,XX,t(3;10)(q26;q21) • Derivative chromosome 10 – target for chromosomal microdissection
Step 2: Chromosome Microdissection & Next-Generation Sequencing
DOP-PCR
• Fine-needle microdissection of the derivative chromosome 10 • DOP-PCR amplification followed by next-generation sequencing of dissected material (GS Junior, Roche)
Step 3: In-house Software Analysis & Long-range PCR
breakpoint
Aim Our aim was to use our strategy to identify the fusion partner on chromosome 10q21 and to characterize the precise nucleotide sequence of the chromosomal breakpoint. Methods Cytogenetic and molecular-cytogenetic techniques (Gbanding, mFISH), chromosome microdissection using glass needle, next-generation sequencing, long-range PCR and direct Sanger sequencing were used to characterize the DNA sequence flanking unique chromosomal breakpoint in translocationt (3;10) (q26;q21).
~2 kb
breakpoint
• Read alignment to reference sequences of chromosomes 3 and 10 using in-house developed software • Long-range PCR within the last mapped reads
Step 4: Direct Sequencing C10orf107 10q21.2
Introduction Recently, we introduced a flexible strategy for mapping cytogenetically identified unique abnormalities down to the single nucleotide level.This strategy has enabled us to design clone-specific assays for sensitive minimal residual disease (MRD) monitoring in acute leukemia patients*. Here we characterize the rare chromosomal translocationt (3;10)(q26;q21), involving the MECOM gene (MDS and EVI1 complex locus located in band 3q26), identified in an acute myeloid leukemia (AML) patient.
MECOM 3q26.2
• Direct sequencing of the long-range PCR product revealed a fusion of the MECOM gene (3q26.2) and C10orf107 (10q21.2) • Potential target for MRD detection and follow-up
1
Conclusions • In AML patients, the MECOM gene can be rearranged with a variety of other partner chromosomes and partner genes • We have identificated a novel fusion partner C10orf107 on chromosome 10q21 • DNA sequences of chromosomal breakpoints may be a useful tool for unique molecular MRD target identification in acute leukemia patients • The described approach opens up new possibilities in characterizing acquired as well as congenital chromosomal aberrations • Personalized „tailor-made“ medicine Tereza Jancuskova1, Radek Plachy1, Jiri Stika1, David W. Hardekopf1, Lenka Zejskova1, Inka Praulich2, Karl-Anton Kreuzer2, Nadezda Kosyakova3, Thomas Liehr3, Sona Pekova1
synlab genetics s.r.o., Laboratory for Molecular Diagnostics, Prague, Czech Republic 2 Department I of Internal Medicine, University at Cologne, Cologne,Germany 3 Institute of Human Genetics, Jena University Hospital, Jena, Germany
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
8
věda a poznání
Histamin a histaminová intolerance Autoři: Dr. med. Laura Maintz, Prof. Dr. med. Natalija Novak
ABSTRAKT Histaminová intolerance je výsledkem nerovnováhy mezi histaminem nahromaděným v těle a schopností organismu histamin odbourávat. Histamin je biogenní amin, který se vyskytuje v různé míře v mnoha potravinách. U zdravých osob může být histamin přijímaný potravou rychle odbourán aminoxidázami, zatímco osoby se slabou aminoxidázovou aktivitou jsou vystaveny riziku toxicity histaminu. Diaminoxidáza (DAO) je hlavním enzymem, který se podílí na metabolismu histaminu přijímaného s potravou. Bylo navrženo, že diaminoxidáza (DAO) jako sekreční protein může být odpovědná za vychytávání
extracelulárního histaminu po uvolnění tohoto mediátoru. Naproti tomu histamin-N-methyltransferáza (HNMT), tj. další enzym důležitý pro inaktivaci histaminu, je cytosolický protein, který může přeměňovat histamin pouze v intracelulárním prostoru. Porucha odbourávání histaminu na základě snížené aktivity DAO, která vede k nadbytku histaminu, může způsobovat řadu symptomů napodobujících alergickou reakci. Požití potravin bohatých na histamin nebo alkoholu či drog, které způsobují uvolňování histaminu, může u osob s intolerancí histaminu vyvolat průjem, bolest hlavy, rhinokonjunktivitidu,
astma, nízký tlak, arytmii, kopřivku, svědění, zarudnutí kůže a další projevy. Symptomy lze redukovat dietou bez histaminu nebo odstranit podáváním antihistaminik. Vzhledem k mnohotvárné povaze symptomů byla existence histaminové intolerance dlouho podceňována, a proto je nezbytné provést další dvojitě zaslepené, placebem kontrolované provokační studie. U pacientů, u nichž jsou výše uvedené symptomy spouštěny dotyčnými látkami a kteří mají negativní výsledek vyšetření na alergie či vnitřní onemocnění, je třeba histaminovou intoleranci považovat za základní patologický mechanismus. Am J Clin Nutr 2007;85:1185-96.
Celý článek naleznete na www.synlab.cz v sekci Aktuality.
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
9
věda a poznání
Kvantitativní stanovení koncentrace diaminooxidázy (DAO) v séru – laboratoř synlab czech Praha Autor: Ing. Štěpánka Luxová DAO je enzym produkovaný enterocyty. Jeho hlavní funkcí je odbourávání histaminu. V případě nedostatku tohoto enzymu nebo inhibice aktivity se objeví příznaky histaminové intolerance. Léky ovlivňující funkci DAO (uvolňující histamin nebo blokující aktivitu enzymu DAO) myorelaxancia (pancuronium, alcuronium, D-tubokurarin), narkotika (thiopental), analgetika (morfium, pethidine, nesteroidní protizánětlivé léky, kyselina acetylsalicylová, metamizol), lokální anestetika (prilokain), antihypotonika (dobutamin), antihypertenziva (verapamil, alprenolol, dihydralazin), antiarytmika (propafenon), diuretika (amilorid), léky ovlivňující střevní motilitu (metoklopramid), antibiotika (cefuroxim, cefotiam, izoniazid, pentamidin, kyselina klavulanová, chlorochin), mukolytika (acetylcystein, ambroxol), broncholytikum (aminofylin), H2 antihistaminika (cimetidin), cytostatika (cyklofosfamid), antidepresiva (amitriptylin)
Odběr srážlivá krev – týden před odběrem přerušit léčbu antihistaminiky, pacient nemusí být na lačno, nemusí držet histaminovou dietu Preanalytika – v den odběru doručit do laboratoře Stabilita v séru: • pokojová teplota – 4 dny, • při 2–8 °C – 9 dní, • při −20 °C – 6 měsíců Poznámka Vzorky budou po dodání do laboratoře v Praze zamraženy a po nashromáždění dostatečného množství vzorků (18) bude analýza provedena. V současné době je stanovení DAO nabízeno pouze lékařům společnosti synlab (zkušební provoz). Po provedení analýzy bude vyhodnocen přínos testu a zváženo zařazení do spektra nabízených vyšetření. Požadavky na vyšetření DAO zasílejte na samostatné žádance (K).
Možné příznaky Kožní podráždění kůže, kopřivka, svědění, zčervenání, otoky Gastrointestinální žaludeční křeče, nadýmání, průjem, zvracení Dýchací otok a svědění rtů, jazyka, Eustachovy trubice, hlasivek, akutní dýchací obtíže, kýchání, zahlenění, kašel, dechová tíseň, sípavé/pískavé dýchání Srdeční a cévní pokles krevního tlaku, bolesti hlavy, bušení srdce, závratě až ztráta vědomí
Kontraindikace anafylaktický šok, gravidita (významné zvýšení DAO během těhotenství), konzumace některých léků a alkoholu
Hodnocení dle doporučení výrobce: <3 U/ml (3,75 ng/ml)
vysoká incidence HIT (histaminová intolerance)
3–10 U/ml (3,75–12,5 ng/ml)
pravděpodobná HIT
>10 U/ml (>12,5 ng/ml)
nízká incidence HIT
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
10
informace pro lékaře a pacienty
Rettův syndrom
Často se mezi příznaky uvádějí tzv. „mycí“ pohyby rukou – zde je důležité vědět, že:
Autoři: Ing. Vratislav Svatoň, Ing. Kateřina Štolcová
Možná jsou mezi námi stovky postižených dívek a žen, jejichž rodiny neznají diagnózu a nemohou se o ně adekvátně postarat. Rettův syndrom je závažné komplexní neurologické onemocnění, způsobené mutací genu ležícího na chromozomu X. Onemocnění je neléčitelné a postihuje téměř výhradně dívky, které jsou pak plně odkázány na pomoc druhých. První podezření na Rettův syndrom získá dětský lékař nebo neurolog, pokud zaznamená při pravidelných vyšetřeních zpomalení psychomotorického vývoje dítěte. (Vojtková, 2012) Diagnostika Rettova syndromu Příznaky Rettova syndromu nejsou ve většině případů zjevné od narození děvčátka. Teprve mezi 6. až 18. měsícem života dochází ke zpomalení až úplnému zastavení vývoje. Stále bývá v některých případech kvůli nedostatku informací špatně diagnostikován jako např. autismus, mozečkový syndrom, těžká mentální retardace, dětská mozková obrna apod. Pro Rettův syndrom jsou typické stereotypní, opakující se pohyby rukou v kombinaci se ztrátou schopnosti brát do rukou předměty a účelně je používat. Diagnózu lze definitivně určit na základě genetického vyšetření, které prokáže mutaci v daném genu. Podle jakých příznaků a kdy začít uvažovat o testování na Rettův syndrom? Zásadním mezníkem je období, kdy se vývoj holčičky zpomalí a zastaví – to nastává přibližně mezi 6. a 18. měsícem života.
Poté se zpravidla začnou objevovat některé z těchto příznaků: • ztráta schopnosti brát do rukou předměty, hrát si s nimi, ovládat hračky, vkládat jídlo do úst, • vkládání rukou do úst, • ztráta řeči, zapomenutí dosud naučených slabik a slov, • vydávání zvuků jako např. houkání, chrčení, někdy až „chrochtání“, • zpomalení růstu hlavičky a chodidel, • malý vzrůst a nízká hmotnost (neprospívání), • studené nohy, • „měkké“ svaly, někdy by se dalo říci „hadrové“ tělíčko (hypotonie), • šilhání (strabismus), které může souviset s hypotonií, • častý, zdánlivě bezdůvodný pláč a nervozita, • noční buzení s pláčem nebo se smíchem, • snížený práh bolesti, • skřípání zubů (bruxismus), • tiky v obličeji, zvláštní záškuby, grimasy, • u chodících: zhoršení chůze nebo ztráta schopnosti chodit (přibližně 50 % dívek je schopno chůze), • u nechodících lezoucích: zhoršení lezení nebo ztráta schopností lézt, • divné pohyby rukou a nohou, • stereotypní, opakující se pohyby rukou (např. listování v knížce, otáčení hračky stále dokola), • polehávání na břiše, na zádech, • omezení nebo ztráta schopnosti komunikovat s okolím, • omezení nebo ztráta zájmu o lidi a věci kolem sebe.
• zpravidla nastupují až později a jsou skutečně jedním z typických příznaků Rettova syndromu, • nepřipomínají pouze „mycí“ pohyby, ale jedná se rovněž o tleskání, narážení dlaní nebo prsty o sebe, bouchání, ždímání, vkládání rukou či prstů do úst. Jak poznat Rettův syndrom u starší dívky nebo u ženy, které byla z důvodu nedostatku informací stanovena jiná diagnóza? (např. autismus, mozečkový syndrom, těžká mentální retardace, dětská mozková obrna apod.) Pravděpodobně v prvních měsících a rocích prošla vývojem s uvedenými příznaky. Další roky života s Rettovým syndromem mohou přinést následující: • zlepšení nálady a kontaktu s okolím, • zlepšení spánku (méně pláče), • zlepšení očního kontaktu, • epileptické záchvaty, • poruchy dýchání, • polykání vzduchu, • reflux, • zácpu, • skoliózu, • kyfózu, • osteoporózu, • pakliže zůstala zachována schopnost chůze (přibližně 50 % pacientek), může dívka v některých případech chodit po špičkách. Několik let se již v diagnostice Rettova syndromu uplatňují molekulárně genetické metody, které jsou postaveny na analýze genu MECP2 (z 90 % ale již byla potvrzena existence dalších odpovědných genů – např. FOXG1 a CDKL5).
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
11
informace pro lékaře a pacienty Rettův syndrom v ČR Prevalence je ve světě odhadována 1:10 000 až 1:25 000 v ženské populaci. Podle odborníků může být v ČR 250–800 žen s Rettovým syndromem. 60 dívek a žen z ČR má již diagnózu Rettova syndromu stanovenou, ale pravděpodobně zbývají stovky žen a dívek, které mají diagnózu chybnou. Od r. 2001 do r. 2013 byla laboratorně potvrzena diagnóza RTT u 60 dívek/žen, tzn. v průměru jsou potvrzovány jednotky ročně. Nízký počet diagnostikovaných v ČR je dán malou povědomostí jak mezi laiky, tak mezi lékaři.
Důležité zdroje informací pro pediatry a rodiče: RETT-COMMUNITY je občanské sdružení založené z iniciativy rodičů a přátel dívek s Rettovým syndromem: www.rett-cz.com Důležité informace a poznatky o domácí a lékařské péči, diagnostice, výzkumu: www.rettuvsyndrom.cz Na těchto stránkách naleznete také přehledný referát pro odborníky v sekci „Rettův syndrom očima odborníků“. Potřebné kontakty pro odborníky k diagnostice a testování naleznete na: www.synlab-genetics.cz
„Očima nám říkají daleko víc, než si vůbec dokážeme představit.“ dr. Andreas Rett
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
12
informace pro lékaře a pacienty
Cestování a infekce Autor: MUDr. Blanka Boualay
Slunečné počasí a letní dny představují pro řadu z nás pobyt u vody a dovolenou např. u moře, v posledních letech i ve vzdálenějších exotických krajích. Široká nabídka nejrůznějších typů cest do cizích zemí umožňuje prakticky poznat vše. Cestování do těchto zemí přináší jedinečné zážitky, ale souvisí vždy i s určitým zdravotním rizikem. Může se jednat o úrazy, zhoršení stavu chronických onemocnění, dále to mohou být náhlé komplikace a cestovatelé jsou ohroženi také infekcemi. Můžeme s jistotou říci, že prevence, vhodná příprava na cestu a důsledné dodržování hygienických zásad znamenají základ úspěchu a také představují klidnější pobyt v dané zemi s minimalizací zdravotních rizik. Velmi často se turisté neopodstatněně obávají především klasických tropických nemocí, jako jsou cholera, mor, lepra, spavá nemoc (Chagasova nemoc) nebo postižení tkání různými typy parazitů – červů. K nejčastějším a nejzávažnějším infekcím patří tzv. „průjmy cestovatelů“, záněty jater, záněty dýchacích cest, sexuálně přenosné choroby i různé alergie. Průjmy se mohou objevovat již v souvislosti s pouhou změnou prostředí nebo klimatu, nemusí se hned jednat o infekční průjem. Závažnější infekce jsou pak: malárie (tropické a subtropické oblasti), stále častěji se objevující nákaza u turistů – horečka Dengue (tropické a subtropické oblasti), japonská encefalitida (Jihovýchodní Asie), infekce přenášené potravinami, virové hepatitidy, vzácně virová horečka Chikungunya (Jižní Afrika, Sahara, Jihovýchodní Asie). Musíme si ale uvědomit, že pravděpodobnost nákazy různými infekcemi bývá vždy zcela odlišná pro návštěvníky měst, hotelů a luxusních letovisek a pro ty, kteří jsou v přírodě nebo se přibližují životním podmínkám místních obyvatel.
Před každou plánovanou cestou na dovolenou do zahraničí je nutné zjistit si důležité informace o dané destinaci. Patří k nim také epidemiologická situace v dané oblasti, zdravotní rizika a zvláštní očkování. V současnosti se lze obrátit na jakékoliv centrum cestovní medicíny a očkování v České republice a domluvit si návštěvu vždy s dostatečným časovým předstihem. Důležité je mít v pořádku především povinné očkování. Při první návštěvě centra cestovní medicíny se provede odhad rizika vzniku infekčního onemocnění a jsou zároveň stanoveny priority očkování. Posléze je vypracován individuální očkovací plán, kdy se bere v úvahu věk cestovatele, jeho zdravotní stav, základní onemocnění (diabetes, hypertenze, alergie), cílová oblast cestovatele, roční období, způsob cestování a ubytování – pobyt ve volné přírodě, hotelový pobyt, dostupnost lékařské péče v místě pobytu, uskutečněná očkování a také stupeň rizikového chování, např. extrémní sporty nebo sexuální turistika. Důležité je brát v úvahu kromě věku, pohlaví, těhotenství i imunitní stav (vzhledem k aplikaci vakcín), prodělané infekční nemoci, předchozí imunizace a čas do odjezdu. U dětí je potřeba především zvážit pobyt v dané oblasti a postupovat opatrně, individuálně, s ohledem na věk dítěte a délku pobytu.
Doporučená vakcinace vždy vychází z epidemiologické situace výskytu vybraných infekčních onemocnění v dané oblasti ve světě. Aktuální informace jsou k dispozici na webových stránkách WHO (World Health Organization), CDC (Centers for Disease Control and Prevention), IAMAT (International Association for Medical Assistance to Travellers) a databáze Infekčních Rizik ve Světě (IRS). K druhům prováděné vakcinace patří poliomyelitida, záškrt, tetanus, virová hepatitida A, virová hepatitida B, břišní tyfus, žlutá zimnice, japonská encefalitida, meningokoková meningitida A+C, vakcinace proti vzteklině, antimalarická profylaxe. Po návratu z dovolené je nutné dodržet schéma antimalarické profylaxe a v případě zdravotních obtíží se dostavit do infekční ambulance. Na závěr bych doporučila nepodceňovat riziko nákazy infekčními nemocemi na cestách, dodržovat preventivní opatření a využívat možnosti účinné ochrany, abychom se ze svých cest vraceli s krásnými nezapomenutelnými zážitky, s načerpanou energií, v plné síle a zdraví.
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
13
laboratorní techniky
Infekční průjmová onemocnění Autor: MVDr. Michaela Verčinská
Podle epidemiologických údajů v ČR je zaznamenáno přibližně 50–70 000 průjmových onemocnění infekční etiologie. Jsou to údaje, které jsou hlášeny ošetřujícími lékaři. Vzhledem k tomu, že většina takto nemocných lékaře vůbec nevyhledá, předpokládá se, že skutečná incidence je podstatně vyšší. Definice akutního průjmu musí splňovat podmínky náhlého rozvoje a maximálně 14denního trvání. Dále je tento stav charakterizován 2 a více řídkými stolicemi denně (nebo i jedinou), které obsahují hlen, krev nebo hnis. Etiologicky se v našich podmínkách vyskytují virové gastroenteritidy (rotaviry, střevní adenoviry, caliciviry, astroviry), salmonelózy, kampylobakteriózy a enterotoxikózy (otravy z potravin). Zvýšený výskyt bakteriálních infekcí a enterotoxikóz je vázán na letní a podzimní měsíce roku. Virové střevní infekce jsou spíš vázány na zimní a jarní měsíce. Kampylobakteriové infekce převýšily počtem hlášení salmonelové. Výrazně ubylo shigelóz, podobně v nízkých počtech se vyskytují yersiniózy a parazitární infekce (původce Giardia intestinalis, Cryptosporidium parvum). V etiologii cestovatelů převažují kmeny Escherichia coli, z parazitárních Entamoeba histolytica. Druhy patogenních bakterií se liší ve způsobu, kterým vyvolávají onemocnění: • Adherence a kolonizace sliznice, spojená s produkcí toxinů: bakterie produkují proteiny, které jim umožňují adherovat ke střevní stěně, potlačit normální střevní flóru a kolonizují střevní sliznici; tyto bakterie nejsou invazivní, mohou však vyvolat průjem pomocí svých toxinů. Do této skupiny patří např. Vibrio cholerae, enterotoxické a enterohemo-
ragické kmeny E. coli, Shigella dysenteriae, Clostridium difficile, Vibrio parahaemolyticus. • Invaze do enterocytů a jejich destrukce: bakterie napadají buňky slizničního epitelu a množí se v nich, ve sliznici vznikají místa ostrůvkovité destrukce enterocytů, které se makroskopicky jeví jako vředy; tyto změny probíhají zejména v oblasti tlustého střeva; ve stolici je přítomna krev a hlen a člověk má horečku a zvýšené zánětlivé ukazatele. Do této skupiny patří např. shigely a enteroinvazivní E. coli. • Invaze do M-buněk sliznice a do hlubších tkání: bakterie využívají mechanismu M-buněk (fagocytace částic ze střevního lumen a předávání antigen prezentujícím buňkám a lymfatickým tkáním) – transportu do hlouběji uložených tkání nebo napadením těchto buněk. Příkladem může být Salmonella enterica, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica. Některé druhy – Salmonella typhi, Yersinia
pseudotuberculosis – vyvolávají celkové onemocnění (postižení střevní sliznice ustupuje do pozadí). Tato skupina běžně vyvolává horečnatá průjmová onemocnění, ale mohou způsobit i mezenteriální lymfadenitidu a u oslabených jedinců i sepsi. • Produkce enterotoxinů mimo hostitelský organismus: po požití takto kontaminované potraviny za několik hodin nastupuje zvracení a průjem; původcem bývají Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus. Infekční dávka se druhově značně liší. U obligátních patogenů je velmi nízká, tj. méně než 102 (Shigella, Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba, rotaviry). Vyšší dávka, tj. 103 –104 je u patogenů – např. Campylobacter – které nejsou přirozeným lidským patogenem. U příležitostných patogenů je dávka poměrně vysoká, tj. 106–109 (salmonely, Vibrio cholerae, enterotoxigenní E. coli).
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
14
laboratorní techniky Průkaz bakteriálních patogenů Základní význam má kultivační vyšetření stolice. Při současných známkách sepse se odebírají také hemokultury. Při podezření na choleru se používají speciální půdy, proto je nutná telefonická dohoda s laboratoří. Serologická vyšetření v diagnostice nelze použít, protože proces se odehrává jen na sliznicích a nemoc má akutní průběh (nejsou tedy vytvořeny podmínky pro tvorbu sérových protilátek). Klasické vyšetřování protilátek se proto provádí jen při podezření na extraintestinální manifestaci infekce (salmonelóza – Widal test, yersinióza – aglutinace, Elisa). Naopak pomocí značených protilátek lze ve stolici prokázat bakteriální antigeny nebo enterotoxiny. Tyto metody (enzymoimunoanalýza, latex-aglutinace) se využívají u obtížně kultivovatelných patogenů, např. Clostridium difficile. Průkaz virových patogenů V rutinní diagnostice se testuje nativní stolice pomocí latex-aglutinačního testu, event. pomocí testu Elisa. K dispozici je diagnostika
rotavirů, střevních adenovirů, calicivirů (zejména norovirů) a event. astrovirů. Průkaz parazitárních patogenů Většinu vajíček a cyst parazitů lze prokázat mikroskopickým vyšetřením preparátu ze stolice. Vzhledem k intermitentnímu vylučování vajíček a cyst je nutné provádět odběr obvykle třikrát s odstupem 1–3 dnů. U infekcí Giardia intestinalis a Entamoeba histolytica je třeba vyšetřovat vzorek čerstvé stolice (hledají se zde trofozoiti, kteří ve staré stolici nejsou v „odečitatelné“ podobě). Přítomnost extraintestinálních parazitů lze detekovat také serologickými metodami. Na základě klinických příznaků akutního průjmového onemocnění nelze etiologickou diagnózu stanovit, ale v některých případech je možné ji odhadnout. Na základě anamnestických údajů a základního objektivního vyšetření lze v našich podmínkách rozlišit 4 skupiny nemocí. U cestovatelů do tropů a subtropů je diferenciální diagnostika ještě širší.
• enterotoxikózy: krátká inkubační doba, obvykle probíhá bez horečky a většinou dominuje zvracení. Stolice je vodnatá, žluté barvy, bez příměsi krve a hlenu. Diferenciálně diagnosticky je třeba vyloučit otravu houbami nebo léky, event. předávkování projímadly. Základním léčebným opatřením je rychlá rehydratace. • akutní infekční průjmy v užším slova smyslu: hlavním projevem je horečka, bolesti břicha a průjmové stolice s příměsí hlenu nebo krve. Zvracení se vyskytuje méně často a nemoc trvá většinou několik dnů. Lékař musí posoudit nejen stav hydratace, ale také závažnost infekce a dále nakažlivost a event. potřebu izolace. • stavy napodobující akutní infekční průjmové onemocnění: do diferenciální diagnostiky je třeba zahrnout zánětlivá onemocnění střev neznámého původu (ulcerózní kolitida, Crohnova nemoc, divertikulitida). Pod tímto obrazem se mohou manifestovat i jiná závažná onemocnění, jejichž příčina leží mimo střevní trakt (např. apendicitida a jiné náhlé příhody břišní, mimoděložní těhotenství, prudce probíhající sepse, syndrom toxického šoku, legionelóza). • subakutní, chronické nebo recidivující průjmy: z infekčních příčin to mohou být zejména klostridiová kolitida, vzácněji parazitární nákazy, popř. infekce HIV. U této skupiny je hlavním cílem lékaře zjistit etiologii. Obecně platí, že čím déle onemocnění trvá, tím vyšší je pravděpodobnost neinfekčního původu.
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
15
aktuálně
5. synlab congress Berchtesgaden & Salzburg, 22. 5. –25. 5. 2014 Ve dnech 22. až 25. 5. 2014 se konal tradiční kongres společnosti synlab. Účastníci byli tentokráte sezváni do malebného městečka Berchtesgaden na samotném jihu Německa. Na programu byly vize naší společnosti, odborné přednášky i program pro volné chvíle. Účastníci se tak mohli dozvědět něco o směřování naší společnosti, o vizích a cílech na následující dva roky, spoustu zajímavých novinek v oblasti laboratorní diagnostiky a mimo jiné také porovnat zkušenosti nabyté v různých regionech Evropy. Z odborných přednášek, kterých se aktivně účastnili i externí pracovníci, vybíráme:
Jak být úspěšní v koagulaci Autor: MUDr. Václava Lorencová Do odborného programu kongresu byla zařazena prezentace Dr. U. Schmitt, specialistky na hemostázu synlab MVZ Stuttgart. V přednášce byla vyzdvižena důležitost správné indikace hemokoagulačních vyšetření vzhledem ke klinickému stavu pacienta a diferenciální diagnóze. Dr. Schmitt poukázala na všechny důležité momenty včetně rodinné a osobní anamnézy pacienta, cílené anamnézy, dodržení podmínek preanalytické fáze. Zmínila se též o záměru laboratoře zpracovávat koagulační vyšetření ze zamražených vzorků plazmy.
V další části zdůraznila potřebu spolupráce laboratoře s klinikem a vyzdvihla důležitost event. cíleného doplnění některých vyšetření za účelem diferenciálně diagnostické rozvahy. Tento postup pak vede ke správné diagnóze, mnohdy i původně neočekávané, která však zabezpečí správný další postup a event. adekvátní léčbu pacienta. Na závěr byly uvedeny dvě zajímavé kazuistiky reprezentující stavy, kdy původně předpokládaná diagnóza, postavená na výsledcích základního koagulačního screeningu, doplněním dalších vyšetření vede k překvapivému závěru.
Např. pacient s klinickým podezřením na trombózu dolní končetiny měl v koagulačním screeningu sice mírně zvýšené D-dimery, ne však na hodnoty obvyklé u trombotických stavů. Neočekávaným výsledkem bylo prodloužení aPTT. Dalšími cílenými vyšetřeními byla stanovena konečná diagnóza hemofilie s hladinou faktoru VIII pod 10 % – tedy lehká forma s krvácením do svalu, nově zjištěná až v dospělosti.
www.synlab.cz SYNLABIANER červenec–září 2014
16
