Sterilisace. Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Sterilisace Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Sterilisace a hodnocení účinnosti sterilisačních postupů 

sterilisace zahrnuje aplikaci biocidního agens nebo fyzikální pochody s cílem odstranit, nebo usmrtit zárodky všech mikroorganismů  podmínky sterilace  degradace aktivních složek preparátů  snížená stabilita  zhoršená uživatelská přijatelnost



testování účinnosti sterilisačních postupů  znalost složení kontaminující mikroflory  bez informací – kontaminující bakterie jsou citlivé jako referenční organismus  původci spongiformní encefalopathie (BSE), Creutzfeldt-Jakobovy choroby sterilizace vlhkým teplem 134-138 C, 18 min



referenční mikroorganismy  spory Bacillus stearothermophilus (sterilizace vlhkým teplem)  spory Bacillus subtilis (sterilizace suchým teplem, chemická sterilace)  spory Bacillus pumilus (sterilizace ionisujícím zářením)

Průmyslově využívané metody sterilizace 

fysikální metody sterilisace  sterilisace vlhkým teplem  sterilisace suchým teplem  sterilisace ionisujícím zářením  sterilisace UV zářením  sterilisace filtrací



chemické metody sterilisace  sterilisace ethylenoxidem  sterilisace formaldehydem

Kinetika hynutí mikroorganismu vlivem smrtících faktorů

t

dN  cdt dt 0

Účinnost sterilizace t

dN   cdt dt 0 N počet živých buněk, t čas, c měrná reakční rychlost pro tepelnou destrukci spor

ln

N  cN N0

N  N 0 e ct

log

kde

c  Ae (  E / RT )

N c c  kt   t t N0 ln 10 2,303

D hodnota

6

D  (t 2  t1 )(log N1  log N 2 )  1 / k

Log počtu živých buněk

5

4

3

2

D 1 0

1

2

3

4

5 Čas (m in)

6

7

8

9

10

Tepelná rezistence mikroorganismů Mikroorganismus (z~5C)

D (min)

Salmonella sp.

D65

0,02-0,25

Staphylococcus aureus

D65

0,8-1,0

Escherichia coli

D65

0,1

plísně

D65

0,5-3,0

Campylobacter jejuni

D55

1,1

B. stearothermofilus

D121

1,5

C. botulinum typ A a B

D121

0,1-0,2

C. sporogenes

D80

0,1-3.0

C. botulinum typ E

D110

<1 sekunda

bakteriální endospory (z~10 C)

Tepelná rezistence mikroorganismů  

   

bakterální spory > vegetativní buňky spory  termofilní MO > psychotrofní MO > psychrofilní MO > askospory = vegetativní buňky fáze růstu (logaritmická  stacionární) nízký obsah vody, dipikolinát vápenatý (spory) pH <6 a >8 přítomnost tuků a sacharosy v prostředí  konc. ethanolu

z hodnota

3.0 2.8 2.6

z  (T2  T1 )(log D1  log D2 )

2.4

Log D

2.2 2.0 1.8 1.6 1.4

z

1.2 1.0 1

2

3 Teplota

4

5

Sterilita farmaceutických produktů

Sterilizace teplem  

 

teplo – nejspolehlivější a nejvíce využívaný prostředek sterilizace destrukce enzymů a dalších buněčných komponent sterilisace vlhkým teplem (121 – 134 C) sterilizace suchým teplem (160 – 180 C)

Teplotní profil sterilizačního procesu

F-hodnota   

 

tepelné procesy nejsou ani rovnoměrné ani konstatní F-hodnota vyjadřuje celkový lethální efekt tepelného procesu v minutách při dané teplotě (dolní index) má-li nějaký proces tepelné sterilizace hodnotu F121 = 4 znamená to, že zvolená kombinace teplot je ekvivalentní konstatnímu zahřátí produktu na teplotu 121 C, zahřívání při této teplotě po dobu 4 minut a následnému ochlazení F hodnota závisí na teplotní rezistenci mikroorganismu referenční mikroorganismus: spory B. stearothermophylus (z~10 C)

F121  D121(log N 0  log N ) kde D121 je D hodnota pro teplotu 121 C, N0 je počáteční a N finální počet živých mikroorganismů na jednotku objemu

F0  t 10 (T 121) / z kde Δt je časový interval mezi měřením teploty, T je teplota produktu v čase t z je 10 C

Sterilizace vlhkým teplem    

nasycená pára – kontakt s chladnějšími předměty způsobí kondensaci → uvolnění cca 85 % celkové tepelné energie pára se vyvíjí přímo ve sterilizátoru, nebo odděleně ve vyvíječi páry přehřátá pára se chová jako horký vzduch → méně účiné sterilizační médium přítomnost vzduchu omezuje průnik tepla do sterilizovaného materiálu

Teplota (C)

Čas (min)

Tlak (kPa)

115

30

69

121

15

103

126

10

138

134

3

207

Sterilizátory    

přenosné sterilizátory velkoobjemové sterilizátory (400-800 l) sterilizátory pro porésní materiály (minimální teplota 134 C) sterilizátory pro sterilizaci kapalin (minimální teplota 121 C)

Sterilizátory

Průběh sterilizace vlhkým teplem 

odstranění vzduchu a vhánění páry  vytlačení vzduchu parou (lahvované roztoky)  mechanické odsávání vzduchu (obvazový materiál, 2,5 kPa)  kombinace obou metod  intravenosní roztoky ve flexibilních plastových obalech – nucené promíchávání vzduchu a páry, kontinuální zkrápění horkou vodou  po odstranění vzduchu je pronikání páry do materiálu velmi rychlé a zahřátí je téměř okamžité



zahřívání a exposice po dosažení provozní teploty a tlaku



sušení a chlazení  obvazový materiál – evakuace a zahřívání (pára v plášti sterilizátoru), obnovení atm. tlaku vháněním sterilního vzduchu  lahvované roztoky – chlazení vodou v plášti sterilizátoru, rozprašování kondenzátu, vhánění filtrovaného stlačeného vzduchu



vyjmutí sterilizovaného materiálu po dosažení atm. tlaku ve vnitřním prostoru a teplot <80 C

Horkovdušná sterilizace  

letální efekt horkého vzduchu = oxidativní procesy sterilizační podmínky: 160 – 180 C, 2 hodiny



použití:  sklo, kovové chirurgické nástroje, termostabilní roztoky, termostabilní práškový materiál  eliminace pyrogenů – 250 C



FH-hodnota vyjadřuje letální efekt horkovzdušné sterilizace (v minutách) která je ekvivalentní počtu minut při expozici teplotou 170 C. z hodnota referenčního mikroorganismu (spory Bacillus subtilis) je 20 C



Horkovdušné sterilizátory   

horkovzdušná pec z leštěné nerezové oceli, kapacita 250 l mezi vnitřním a vnějším pláštěm – topná tělesa, ventilátor na cirkulaci vzduchu police – perforované z nerezové oceli



kontinuální horkovzdušné sterilizátory  infračervené záření  nucená laminární konvekce zahřátého vzduchu  sterilizační podmínky 250 – 300 C, několik minut



sterilovaný materiál je chráněn před post-sterilizační kontaminací balením do papíru, nebo uzavíráním do kontejnerů s dobrou tepelnou vodivostí teplo se v sterilizovaném materiálu šíří zářením a konvekčním prouděním kolísání teplot max. ± 5 C

 

Sterilizace UV světlem a ionisujícím zářením     

urychlené elektrony (β-částice) γ-záření UV záření cílová molekula: DNA letální efekt  přímé působení + poškození DNA volnými radikály vznikající v důsledku radiolýzy vody (γ-záření, urychlené elektony) = zlomy v řetězci DNA  absorpce a excitace (UV záření λ = 260 nm, pyrimidinové base) = thyminové můstky

O CH3

HN

2 O

O

N H

O CH3 CH3

hν

HN O

NH N H

N H

O

Sterilizace UV světlem a ionisujícím zářením 

ionisující záření  G- bakterie < G+ bakterie = plísně < spory = kvasinky < viry  Deinococcus (Micrococcus) radiodurans  radiolýza roztoků, poškození obalů (polypropylen, PTFE)  suchý materiál (chirurgický materiál, jednorázové stříkačky atd.)



UV záření (pigmenty)  G- bakterie < G+ bakterie = plísně < bakteriální spory < spory plísní << viry  nízká penetrace  sterilizace vzduchu, vody, pracovních ploch



referenční mikroorganismus spory Bacillus pumilus (D hodnoty) dávka: 25 kGy



Sterilizace γ-zářením zdroj záření: 60Co (137Cs) - poločas rozpadu 5,25 roku energie záření 1,33 MeV a 1,17 MeV kobaltové pelety uspořádané do prutů (740 TBq) celková aktivita zdroje: 3,7·104 TBq podmínky sterilizace: dávka závisí na výkonu zdroje doba sterilisace: cca 20 hodin

Sterilisace γ-zářením

Sterilizace urychlelnými elektrony a UV světlem    



maximální energie urychlených elektronů je 3 MeV a 10 MeV (podle typu urychlovače) vyšší energie → indukovaná radiace výhody: sterilizační dávka je dosažena velmi rychle omezení: malá balení sterilizovaného materiálu UV záření – rtuťové lampy 88 % záření představuje světlo o vlnové délce λ=254 nm ( tj. 85 % biol. aktivity záření o vlnové délce λ=260 nm )

Sterilizace filtrací  

filtrace odstraňuje živé i mrtvé buňky mikroorganismů z filtrovaného materiálu použití  sterilizace tepelně nestabilních roztoků  sterilizace vzduchu a technických plynů používaných v aseptických prostorách  součást fermentorů, odstředivek, autoklávů a sušáren  testování sterility



filtrační materiály  estery celulosy, polytetrafluorethylen, skleněná vlákna, skleněné nebo keramické sintrové filtry, infuzoriová hlinka  sintrové filtry se sterilují tlakovou párou nebo horkým vzduchem, obtížné čistění (horká kyselina sírová s příměsí kys. dusičné)



typy filtrů  filtrační materiál (celulosová, viskosová, skleněná vlákna ) je stlačen ve válci a tvoří homogenní vrstvu značné výšky. Náplň musí být plněna pečlivě (rovnoměrné rozptýlení) aby nevznikaly kanálky a filtrovaný materiál nemůže pronikat podél stěn. Sterilizace: tlakovou párou, sušení horkým vzduchem  jemná vlákna (plasty) jsou pro zpevnění podložena pevným textilním podkladem, filtrační jednotka je tvořena tenkou vrstvou. Používá se jedna filtrační vrstva nebo několik vrstev ve filtrech konstuovaných jako kalolis. Sterilizace formaldehydem (vlhké teplo)

Mechanismy záchytu částic  



adsorpce (porcelán, infuzoriová hlinka) záchyt  přímé zachycování částic na vlákna filtru  zachycování účinkem elektrostatických sil (velikost náboje častice a vlákna filtru, vliv vlhkosti, klesá s rychlostí toku filtrovaného materiálu)  zachycování difusními silami (Brownův pohyb) efekt síta záchyt částic, které dosahují určité velikosti

Filtrace kapalin    

memránové filtry (velikost pórů 0,2-0,22 μm) sintrové filtry (<1 μm) omezené použití na korozivní roztoky, viskosní kapaliny a organická rozpouštědla kombinace několika filtračních disků kombinace s filtry pro záchyt velkých částic (prodloužení životnosti filtrační jednotky)

Filtrace vduchu 

vysoce účinné filtry (HEPA High-Efficiency Particulate Air) zachytí 99.997 % částic o velikosti >0,3 μm (většina bakteriálních buněk vázaná na prachové častice, spory plísní)



použití:  filtrace vzduchu do místností se zvýšenými požadavky na mikrobiální čistotu  laminární boxy  sterilizace vzduchu pro tkáňové a mikrobiologické kultury  čištění a sterilizace plynů pro lékařské účely  čištění a sterilizace technických plynů ve farmaceutické výrobě

Sterilizace nízkoteplotní plasmou 

plasma – ionisovaný plyn (směs neutrálních částic, iontů a elektronů)



serilizátory:  objem 75 l  páry peroxidu vodíku, peroctové kyseliny, směs kyslíku, vodíku a inertního plynu  provozní teplota <50 C  délka sterilizačního cyklu: 60 – 90 minut



výhody: neexistence toxických residuí ve sterilizovaném materiálu, šetrná metoda nevýhody: nelze použít na sterilizaci kapalin a práškovitých materiálů použití: sterilizace lékařského materiálu (chirurgické nástroje, materiál pro jednorázové použití např. chirurgické rukavice, stříkačky atd.)





Sterilisace chemickými prostředky 

kritéria chemického sterilizačního agens  značný biocidní efekt již při nízkých koncentracích  neškodnost pro sterilizovaný materiál  účinnost za normálních teplot a tlaků  cenová dostupnost  nesmí být hořlavý, explozivní a toxický  snadná odstranitelnost reziduí sterilizačního agens



v průmyslovém měřídku - sterilisace chemicky reaktivními plyny (ethylenoxid (CH2)2O, formaldehyd CH2O) mechanismus účinku – alkylace sulfhydrylových, hydroxylových, karboxylových skupin a aminoskupin proteinů a iminových skupin nukleových kyselin použití: sterilizace chirurgického materiálu a nástrojů, některých lékařských a diagnostických zařízení a pomůcek, povrchová sterilizace práškových materiálů





Sterilizace ethyleoxidem ethylenoxid (oxiran) je bezbarvý plyn, pod bodem varu bezbarvá kapalina. mol. hmotnost: 44,05 teplota varu: 10,7 C teplota tání: -112 C rozpustnost: rozpustný ve většině organických rozpouštědel a vodě vysoce hořlavý plyn, explosivní ve směsi se vzduchem v poměru 3-100 % pro sterilizaci se používá ve směsi s CO2 (10 %) nebo HFC124 (8,6 %) [HFC – 2-chloro-1,1,1,2-tetrafluorethan], nebo čistý plyn po odstranění vzduchu účinná koncentrace: 800 – 1200 mg·l-1 operační teplota: 45 – 63 C výhody: snadná penetrace obalovým materiálem (papír, plasty, tkaniny) nevýhody: výbušný a toxický (karcinogenní) plyn, nutnost odstraňovat toxická rezidua (nucená cirkulace teplého vzduchu 2 – 24 h)

Sterilizace ethyleoxidem 

sterilizátory  ocelové komory odolné proti úniku plynu (100 – 300 l) a zabezpečené proti explozi  nucená cirkulace plynu, subatmosferický tlak  obalový materiál musí být propustný pro páru, vzduch i použité sterilizační agens

Sterilizace formaldehydem formaldehyd jako sterilizační plyn se připravuje zahříváním 37 % roztoku párou na teplotu 70 – 75 C, účinná koncentrace: 15 – 100 mg·l-1 toxicita: podobná jako u ethylenoxidu nevýhody: nízká penetrace → obalové materiály papír, bavlněná tkanina

Podmínky sterilizace farmaceutických produktů Sterilizační metoda

Podmínky

sterilizace vlhkým teplem

121 C, 15 min 134 C, 3 min

horkovzdušná sterilizace

160 C, 120 min 170 C, 60 min 180 C, 30 min

γ-záření, urychlené elektrony

25 kGy

filtrace

velikost pórů: 0,22 μm, sterilní membránové filtry

ethyleoxid

koncentrace: 800 – 1200 mg·l-1 teplota: 45 – 63 C

vlhkost: 30 – 70 % doba sterilizace: 1 – 4 h formaldehyd

koncentrace: 15 – 100 mg·l-1 teplota: 73 C doba sterilizace: 40 - 180 min

Validace sterilizačních postupů  



validace znamená jednoznačný průkaz že sledovaný proces trvale poskytuje výsledky pro které byl navržen proces validace metody sterilizace vlhkým teplem zahrnuje  kalibrace a testování všech měřících zařízení, které slouží k monitorování procesu  sledování kvality produkované páry  testy netěsnosti autoklávu, testy penetrace páry (prázdný autokláv, autokláv naplněný materiálem)  testování účinnosti sterilačního cyklu pomocí biologických indikátorů  testy opakovatelnosti  vedení odpovídající dokumentace způsoby validace sterility jsou voleny podle termostability sterilizovaného produktu a celkového počtu mikroorganismů před sterilizací  biol. indikátor obsahující 106 testovacího mikroorganismu bude inaktivován v polovině předepsané doby exposice (tzn. že k dosažení hladiny 10-6 proběhne redukce živých zárodků o 12 řádů v předepsané době exposice)

Monitorování sterilizačních postupů 

soustavné ověřování efektivity sterilizačního procesu spolu s kontrolou sterility produktů slouží ke stanovení mikrobiologické nezávadnosti daného lékového přípravku



fyzikální indikátory  měření teploty (termočlánky) tlaku (tlakoměry) vlhkosti, koncentrace sterilizačního média nezávisle na tlaku, aplikované dávky záření (filmové dozimetry)  měření účinnosti filtrů (dioktylftalátové částice)



chemické indikátory  založeny na schopnosti tepla, páry, ionisujícího záření měnit fyzikálně-chemické vlastnosti indikátoru (změna nastává pouze při dosažení požadovaných podmínek)  indikátory monitorující několik parametrů (teplota, saturace páry, čas)  indikátory monitorující jediný parametr – použitelné k rozlišení sterilizovaného a nesterilizovaného materiálu  chemické indikátory procházejí procesem tání nebo změnou barvy

Monitorování sterilizačních postupů 

biologické indikátory  standardisovaný preparát bakteriálních spor referenčního mikroorganismu suspendované ve vodě, v suchém stavu na papíru, hliníku nebo plastovém nosiči  po sterilizaci asepticky přeneseny do kultivačního média a pravidelně kontrolovány známky růstu



požadavky na referenční mikroorganismus  spory nepathogenních druhů mikroorganismů  nadprůměrná rezistence k dané sterilizační metodě  krátká inkubační doba

Biologické indikátory doporučené Evropskou farmakopedií (2002) Sterilizační metoda

Druh

sterilizace vlhkým teplem (121 C)

Inokulum

D

B. stearothermophylus

>5·105

>1,5 min

horkovzdušná sterilizace (160 C)

B. subtilis var. niger

>1·105

5-10 min

H2O2, kys. peroctová

B. stearothermophylus

>5·105

-

ethylenoxid (54 C, 60 % rel. vlhkost, 600 mg·l1)

B. subtilis var. niger

>5·105

>2,5 min

formaldehyd

B. subtilis var. niger

>5·105

-

ionisující záření

B. pumilus

>1·107

1,9 kGy

filtry: velikost pórů 0,45 μm, mikroorganismus: Serratia marcescens (0,5 μm) velikost pórů 0,22 μm, mikroorganismus: Brevundimonas diminuta (0,3 μm) standardisované inokulum: 107 buněk·cm-2 počáteční validace, charakteristiky výrobní dokumentace

Testy sterility farmaceutických výrobků 

sterilní produkt neobsahuje žádné živé zárodky mikroorganismů



testy – kultivace testovaného materiálu v živném médiu problémy:  destruktivní test (omezené množství testovaného materiálu)  média podporující růst nutričně nenáročných bakterií, kvasinek a plísní  podmínky kultivace



Testy sterility farmaceutických výrobků 

metody  přímá inokulace na  thioglykolátové médium (anaerobní organismy inkubace 30 – 35 C)  tryptosové médium (anaerobní organismy: inkubační teplota inkubace 30 – 35 C, kvasinky a plísně: inkubace 20 – 25 C)  druhé alternativní médium 

membránová filtrace  filtrace přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm, promytí filtry, dělení a inkubace v odpovídajících médiích  rozpouštění past a prášku při 45 C ve fysiologickém roztoku, filtrace



přídavek koncentrovaného kultivačního média k roztoku  intravenosní roztoky

Testy sterility farmaceutických výrobků Antimikrobiální činidla Antimikrobiální činidlo

inaktivační činidlo

fenol, kresol

žádné (ředění)

alkoholy

žádné (ředění)

parabeny

ředění a Tween

rtuťnaté sloučeniny

SH-sloučeniny

kvartérní ammonné sloučeniny

lecithin a Tween

benzylpenicilin, ampicilin

β-laktamasa (B. cereus)

ostatní antibiotika

žádné (filtrace)

sulfonamidy

kyselina p-aminobenzoová

Positivní testy  



průkaz že se mikroorganismus bude pomnožovat za podmínek testu použitý mikroorganismus musí být citlivý na antimikrobiální agens v léčivém přípravku (růst mikroorganismu indikuje dostatečnou inaktivaci aktivní složky) Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus niger

Testy na přítomnost vybraných pathogenů 

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae  pomnožení v médiu obsahující sojový a kaseinový hydrolyzát (37 C, 24 h)  očkování na selektivní a diagnostické půdy



anaerobní pathogeny (kultivace v Columbia agaru a thioglykolátovém médiu)



při záchytu je nutná jednoznačná identifikace

Vzorkování 

šarže – všechna balení jednoho přípravku současně připravená a sterilizovaná  900 lahví infuzního roztoku sterilizované ve 3 autoklávech = tři šarže



normované postupy (20 vzorků pro šarže o velikosti >500 položek)

Kvalita sterilizované látky Měřítkem zachování kvality sterilizovaného produktu Q je koncentrace důležité (aktivní) složky po sterilizaci:

Q  ln

C1 C2

kde C1 je koncentrace důležité složky před sterilizací, C2 je koncentrace složky po sterilizaci. V rovnici se neobjevuje faktor objemu a proto je měřídko zachování kvality látky nezávislé na rozměru použitého zařízení