Úvod do farmaceutické mikrobiologie Igor Hochel & Kateřina Demnerová
Kontakty
Doc. Ing. Igor Hochel, CSc. místnost č.: V02, B244, (2. patro, budova B) telefon: 220 443 019, 220 445 166 e-mail:
[email protected]
Prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. místnost č.: Y01A, (chodba Y, 2. patro, budova B) telefon: 220 443 025 e-mail:
[email protected]
Náplň předmětu
Viry Bakterie Mikromycety Protozoa Principy mikrobiální pathogenity Struktura a popis imunitního systému Mechanismy účinků imunitního systému a antiinfekční imunita Vakcíny Mechanismy účinků antimikrobiálních látek Mechanismy rezistence k antibiotikům Laboratorní vyhodnocování účinnosti antimikrobiálních látek a dezinfekčních prostředků Mikrobiologické aspekty farmaceutické výroby Fyzikální metody sterilizace, posuzování sterilizačních procesů Chemické metody sterilizace, dezinfekční prostředky
Farmaceutická mikrobiologie
posuzování mikrobiologické kvality farmaceutických výrobků
kontrola surovin kontrola meziproduktů a finálních výrobků kontrola výrobního prostředí (výrobní haly, strojní zařízení) kontrola produkčních mikroorganismů, substrátů
posuzování účinnosti sterilizačních postupů, dezinfekčních agens
identifikace nežádoucích a pathogenních mikroorganismů
studium rezistence klinicky významných mikroorganismů k antibiotikům a dezinfekčním prostředkům
Hlavní skupiny mikroorganismů Organismus je jednotka složená z dílčích prvků, zřetelně ohraničená vzhledem ke svému okolí, strukturně a funkčně integrovaná, obsahující nukleovou kyselinu, která autonomně kontroluje svoji vlastní reprodukci a nezávisle reaguje na evoluční síly.
viry, viroidy, satelity a priony prokaryota
bakterie a archea
eukaryota kvasinky a plísně protozoa
Dva pohledy na mikroorganismy
člověkem využitelné mikroorganismy výroba organických kyselin (kys. citronová, glukonová, itakonová, giberelová, mléčná, lysin, kys. glutamová), enzymů (proteasy, amylasy, glukosaisomerasy, chymosin, glukosaoxidasa), léčiv (antibiotika, insulin, interferon, somatostatin), biomasy, paliv (ethanol, methan, vodík) rozpouštědel (aceton, butanol, glycerol) vitaminů (riboflavin, vitamin B12) výroba potravin bioloužení kovů a minerálů (měď, uran) odstraňování ekologických havárií, biodegradace pululantů výroba vakcín (živé, inaktivované, subjednotkové, rekombinantní)
mikroorganismy škodící člověku parazitické (pathogenní) mikroorganismy mikroorganismy atakující produkty vyráběné člověkem
Význam jednotlivých skupin mikroorganismů ve farmaceutické mikrobiologii Mikroorganismus
Kontaminace & degradace
Viry Priony
Pathogen
Rezistence k antibiotikům
Rezistence k dez. prostředkům
+
Výroba farmaceutických přípravků +
+
+
+
Gram-negativní
+
+
+
Gram-positivní
+
+
+
mykobakterie
+
+
Streptomyces
+
Rickettsie
+
Mycoplasma
+
Bakterie + + (spory)
+
+
Houby
kvasinky
+
+
+
+
plísně
+
+
+
+
Protozoa
+
Viroidy
jednořetězcové kruhovité molekuly RNA
velikost 300 nukleotidů (nekódují žádný enzym)
nemají bílkovinný obal, ani jiný protein není jejich součástí
rostlinné pathogeny
Satelity
malé molekuly RNA
vyžadují přítomnost jiného viru (rostlinné nebo živočišné viry – Dependovirus, bakteriofágy) kódují nabo nekódují proteiny nukleokapsidy využívají RNA dependentní polymerasy (jen rostliny) velikost genomu: 500 – 2000 nukleotidů, jednořetězcová RNA minimální nebo žádná shoda nukleotidové sekvence pomocného viru a satelitu (oproti defektním virům) vyvolávají inekci rostlin pouze a přítomnosti pomocného viru v hostitelských buňkách replikace satelitu obvykle interferuje s replikací pomocného viru (oproti defektním virům) – neplatí u satelitů rostlin
Priony
PrPc:
glykoprotein kódován buněčnou DNA mol. hm. 33-35 kDa štěpitelné proteasami začleňován do cytoplasmatické membrány
PrPSc
glykoprotein vzniká postranslační úpravou PrPc (konformační změny) mol. hm. 27 kDa není štěpen buněčnými proteasami hromadí se v cytoplasmatických vesikulách
scrapie, leukoencefalopatie norků (1947, Wisconsin), kočičí sponigiformní encefalopathie (1990, UK), devastující chronické onemocnění daňků a jelenů (1967, západ USA), encefalopatie hovězího dobytka (1986, UK)
Kuru (kmen Fore, Nová Guinea), Creutzfeldova-Jacobova presenilní demencie, Gertsmann-Straussler-Scheinkova nemoc
Viry, struktura virů
viry se od ostatních mikroorganismů odlišují svou velikostí (20 – 300 nm) a biologickou povahou
nepřítomnost buněčných struktur, absence enzymů nutných k replikaci NK → neshopnost nezávislé replikace → všechny viry jsou striktními intracelulárními parazity
virová částice (virion) je tvořena nukleovou kyselinou (RNA, DNA) a kapsidou genom virů
genom viru může být cirkulární nebo lineární DNA viry obsahují jedno nebo dvě komplementární vlákna (Parvoviridae jednovláknová DNA) RNA viry obsahují obvykle jednovláknovou NK (Reoviridae obsahuji dsRNA), +RNA, -RNA velikost genomu: 5,5 – 200 kbp (10 – 100 i více genů), segmentovaný genom (Reoviridae, Orthomyxoviridae)
Struktura virů
kapsida
kapsida je tvořena několika druhy polypeptidů (proteiny kapsidy) virové polypeptidy s regulační nebo enzymovou aktivitou proteiny hostitelského původu (histony, ribosomy) helikoidální symetrie kubická (ikosahedrální) symetrie (autoagregace kapsomer, pentonů a hexonů, pseudokrystaly)
neobalené viry přenos přímým kontaktem (člověk-člověk, člověk-zvíře), zprostředkovaně (kontaminované věci) snadný průnik z nosohltanu do dolních oddílů zažívacího traktu, vylučovány stolicí, přetrvávají dlouhodobě v zevním prostředí (odpadní vody monitorování adenovirů, enterovirů, hepatitidy B) resistentní k etheru a org. rozpouštědlům, nízkému pH
Základní typy uspořádání virových částic
Helikoidální symetrie viru tabákové mosaiky: (a) snímek virové částice, (b) uspořádání virionu.
Symetrie dvanáctistěnu: (a) model dvanáctistěnu, (b) symetrie dvanáctistěnu, (c) mikrofotografie lidského papillomaviru, (d) 3D model lidského papillomaviru.
Struktura virů
kapsida
kapsida je tvořena několika druhy polypeptidů (proteiny kapsidy) virové polypeptidy s regulační nebo enzymovou aktivitou proteiny hostitelského původu (histony, ribosomy) helikoidální symetrie kubická (ikosahedrální) symetrie (autoagregace kapsomer, pentonů a hexonů, pseudokrystaly)
neobalené viry přenos přímým kontaktem (člověk-člověk, člověk-zvíře), zprostředkovaně (kontaminované věci) snadný průnik z nosohltanu do dolních oddílů zažívacího traktu, vylučovány stolicí, přetrvávají dlouhodobě v zevním prostředí (odpadní vody monitorování adenovirů, enterovirů, hepatitidy B) resistentní k etheru a org. rozpouštědlům, nízkému pH
Struktura virů
obalené viry
lipoproteinový obal (lipoproteinová dvojvrstva hostitelského původu) jaderná membrána (Herpesviridae) cisterny ER (Arenaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae) cytoplasmatická membrána (Paramyxoviridae) membránový protein M, specifický pro každý druh výběžky (peplomery) tvořené biologicky aktivními glykoproteiny (ukotvení v M proteinu, nebo v lipidové membráně) přenos kapénková infekce, přímý kontakt sliznic (sexuálně přenosné infekce) desintegrace virů org. rozpouštědly, inaktivace nízkým pH
viry s atypickou strukturou
dvojitá kapsida (Reoviridae) arenaviry – NK uložena v aorfní proteinové matrix, dřeň virionů obsahuje granula (hostitelské ribosomy)
Klasifikace virů
čeleď – stejný typ NK, stejné uspořádání virionu, stejná strategie replikace NK (přípona -viridae). podčeleď – skupiny virů téže čeledi, sdružené podle společných vlastností, bez ohledu na antigenní příbuznost (přípona -virinae) rod – příslušníci čeledi antigenně příbuzné (přípona -virus) druh – příslušníci rodu lišící se biologickými vlastnostmi čeleď: Paramyxoviridae rod: Paramyxovirus, Morbillivirus, Pneumovirus druh: virus parainfluenzy, v. příušnic, v. Newcastelské choroby, v. spalniček, lidský respirační synciální virus, atd. čeleď: Poxviridae podčeleď: Chordopoxvirinae, Entomopoxvirinae rody podčeledi Chordopoxvirinae: Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus druhy rodu Orthopoxvirus: v. varioly, v. vakcinie, v. kravských neštovic, v. králičích neštovic, atd.
Vztah viru a hostitelské buňky
hostitelské organismy: bakterie, rostliny, živočichové
vnímavost buňky – přítomnost vhodných receptorů na buněčném povrchu permisivita buňky – metabolická výbava buňky nutná pro realizaci úplného replikačního cyklu viru
replikaci viru umožňují v daném organismu jen určité typy buněk což podmiňuje pathogenezi virových infekcí a tropismus virů (pneumotrofní, neurotropní, lymfocytotropní, dermatotropní)
Replikace virů
kaskáda nutných dějů, které se navzájem podmiňují a zabezpečují:
syntézu nestrukturálních regulačních proteinů (přesmyk buněčného metabolismu ve prospěch syntézy virových NK) produkci enzymů pro syntézu komplementárních vláken NK (matrice pro nukleové kyseliny nově vytvořených genomů) syntézu strukturálních proteinů
strukturální i nestrukturální proteiny vznikají translací virové iRNA na ribosomech v cytoplasmě a odtud putují do místa určení u DNA virů putuje iRNA do cytoplasmy k ribosomům, nově vytvořené polypeptidy jsou transportovány zpět do jádra DNA viry se replikují vždy v jádře hostitelské buňky (vyjímka: čeleď Poxviridae), RNA viry se replikují v cytoplasmě (vyjímka: virus chřipky)
Obecné schéma replikace virů 1. 2. 3. 4. 5.
6. 7.
adsorpce virionu na povrch buňky průnik virionu do buňky destrukce proteinových obalů a obnažení genomu (virovou infekci nelze prokázat imunohistochemickým vyšetřením – fáze eklipsy) časná transkripce a translace virových genů (nestrukturální polypeptidy) replikace virového genomu pozdní transkripce a translace (strukturální proteiny) maturace a uvolnění virových částic z hostitelské buňky
Adsorpce virionu na povrch buňky Adsorpce virionu na cytoplasmatickou memránu představuje první stádium interakce viru s hostitelskou buňkou. Jako receptory fungují glykoproteiny buněčné membrány jejichž složení je podmíněno druhově, ale i geneticky, věkem a některými dalšími okolnostmi (hemagglutininový antireceptor-virus chřipky, CD4+ receptor T lymphocytů-virus HIV). Ztráta receptorů nebo jejich exprese na povrchu buňky vede k přirozené rezistenci nebo naopak ke zvýšené vnímavosti popř. k odlišnému průběhu infekce. Tři fáze adsorpce: a) počáteční kontakt závislý na Brownově pohybu, b) reversibilní vazba (překonání odpudivých elektrostatických interakcí, c) ireversibilní změny v konformaci dvojice ligand-receptor).
Průnik virionu do buňky
obalené viry (paramixoviry) fúze virového obalu s cytoplasmatickou membránou hostitelské buňky (herpesviry, HIV)
neobalené a některé obalené viry endocytosa – aktivní pohlcení adsorbovaného virionu (proces analogický fagocytose) pinocytosa – interakce virionu s receptory buňky vedou k obalení viru cytoplasmatickou membránou a jeho uzavření ve vakuole
Obnažení genomu Částečné (reovirus) většinou však uplné obnažení genomu je předpokladem zahájení virové replikace. Kapsida virionu je desintegrována buněčnými proteasami podle povahy viru v lysozomech, v cytoplasmě nebo v jádře. Dezintegrace obalu může být zprostředkována také virem kódovanými enzymy (poxviry). V některých případech je destrukce kapsidy podmíněna konformačnímí změnami kapsidových polypeptidů při adsorpci virionu na buněčný povrch (picornaviry).
picornaviry, kaliciviry – kapsida je destruována buněčnými proteasami asociovanými s cytoplasmatickou membránou. Obnažený genom (+RNA) se váže na ribosomy a je překládán.
DNA viry – transport virionu do jádra buňky (mikrotubuly adenoviry) destrukce kapsidy probíhá v blízkosti jádra a obnažená DNA prostupuje jadernými póry papovaviry – virion postupuje ve vakuole k jádru, membrána vakuoly splývá s vnější jadernou membránou, virus se adsorbuje na jadernou membránu, invaginací proniká do jádra, a teprve poté dochází k destrukci kapsidy
Adhese bakteriofága T4 na buněčný povrch a uvolnění virové DNA
Elektronová mikrofotografie bakteriofága T4 bakterie Escherichia coli
Adhese bakteriofága T4 na buněčnou stěnu Escherichia coli a uvolnění virové DNA do bakteriální buňky
Replikace virového genomu
replikace virového genomu je iniciována nestrukturálními virovými polypeptidy
DNA viry každé vlákno DNA je přepisováno buněčnými DNA polymerasami do kompementárních řetězců hepadnaviry -DNA vlákno je přepisováno do komplementární +RNA, které je jako progenom transportováno do cytoplasmy kde je spolu s reversní transkriptasou uzavřen do kapsidy. Zde je RNA přepisována do DNA.
RNA viry RNA je přpisována v celé délce RNA polymerasami do komplementárního řetězce (antigenomu), který slouží jako matrice pro produkci nových genomů retroviry +RNA je přepisována virovou reversní transkriptasou do komplementárního – DNA řetězce, násldne je dosytnetizováno koplementární +DNA vlákno a takto vytvořená DNA je začlenena do genomu hostitelské buňky. Buněčná RNA polymerasa využívá DNA vlákno pro syntézu nových +RNA řetězců (genom viru)
Exprese virové genetické informace
virový genom je přepisován buněčnými nebo virovými polymerasami do iRNA (informační RNA) iRNA jsou přepisovány najednou z celého vlákna, nebo postupně z různých úseků genomu transkripty jsou dodatečně upravovány (polyadenylace 3’-konce, 7-methylguanosinová čepička na 5’-konci, vystřižení intronů) jednovláknová +RNA (picornaviry, kaliciviry, flaviviry, coronaviry) RNA je jako iRNA překládána okamžitě buď v plné délce nebo z větší části do jedné molekuly polypeptidu, která je postranslačně štěpena do nestrukturálních i strukturálních polypeptidů
Exprese virové genetické informace
jednovláknová –RNA (orthomyxoviry, paramyxoviry, rhabdoviry) -RNA je přepisována do komplementárního řetězce iRNA virovými RNA dependentními DNA polymerasami je-li virový genom segmentován jsou segmenty přepisovány do jednotlivých iRNA (výsledný produkt kóduje maximálně 2 polypeptidy) paramyxoviry, rhabdoviry – monocistronická iRNA
dvouvláknová RNA reovirů monocistronická iRNA je přepisována virovou polymerasou z negativního vlákna RNA virového genomu
dvouvláknová DNA virová iRNA je přepisována buněčnou nebo virovou DNA dependentní RNA polymerasou z negativního vlákna DNA
Exprese virové genetické informace
Exprese virové genetické informace
jednovláknová DNA parvovirů syntéza komplementárního vlákna DNA překlad genetické informace do iRNA adenoasociované viry genom neobsahuje informace pro vznik všech regulačních polypeptidů virus dokončí celý cyklus jen v přítomnosti pomocného viru v nepřítomnosti pomocného viru se integruje do genomu hostitelské buňky (latentní perzistence) RNA retrovirů genom: 2 vlákna +RNA je přepisován virovou reversní transkriptasou do DNA transkriptu DNA transkript (provir) je integrován do genomu hostitelské buňky genetická informace proviru je přepisována pomocí buněčné RNA polymerasy do polycistronické iRNA
Maturace a uvolňování virionů z buňky
molekuly strukturních polypeptidů putují do místa replikace virového genomu a autoagregací vytvářejí kapsidy kapsidy asociují s virovým genomem a dřeňovými proteiny virem kódované glykoproteiny jsou glykosilovány v Golgiho aparátu a jsou transportovány do membrán M-protein se ukládá na vnitřní straně cytoplasmatické membrány a interaguje s hydrofobní částí glykoproteinů kapsidy, což má za následek vyboulení membrány a obalený virion opouští místo svého vzniku pučením. další způsoby uvolnění virionu mezibuněčnými kanálky (herpes viry) fúze membrán způsobená virovými glykoproteiny obrácená pinocytosa (neobalené viry) buněčná lyze
Nepermisivní buňky a latentní infekce
nepermisivní buňky přítomnost povrchových receptorů umožní průnik virionu do buňky po destrukci kapsidy dojde k obnažení genomu genom perzistuje v hostitelské buňce ve formě plasmidu nebo se integruje do genomu změna permisivity buňky (zvýšená metabolická aktivita - lymfokiny, hormony, prostaglandiny, neurotransmitery; vnější faktory) indukuje aktivaci latentní infekce nervové buňky a lymfocyty DNA viry a retroviry RNA viry (subakutní sklerotizující panencefalitida)
Transformační účinek virů na buňku
hromadění nestrukturálních polypeptidů v buňce (nepermisivní buňky) stimulace syntézy buněčné a virové DNA, integrace virové DNA do buněčného genomu zrychlené dělení, kontaktní inhibice, změny fluidity a struktury cytoplasmatické membrány, ztráta kontaktní inhibice (B-lymfocyty + virus Epsteina a Barrové imortalisace buněk v kultuře in vitro)
exprese onkogenů živočišných buněk: začleněním priviru obsahující onkogen (oncornaviry) virový promotor aktivuje virový i buněčný onkogen začlenení virového genomu do blízkosti onkogenu translokace onkogenu do oblasti aktivní exprese genetického kódu (B lymfocyty - produkce protilátek na chromosomu 2, 12 a 14; Burkittův lymfom translokace onkogenu z chromosomu 8 na chromosom 14)
Účinek virové infekce na buňku
rušivý vliv replikace viru na životní pochody a morfologii hostitelské buňky:
adsorpce viru na povrch buňky změny konzistence, permeability a fluidity cytoplasmatické membrány změny v propustnosti iontů, hypertonisace prostředí buňky, změny vazebných vlastností ribosomů ve prospěch iRNA (picornaviry) nestrukturální polypeptidy vazbou na ribosomy potlačují nebo inhibují buněčnou proteosytézu produkty translace virové DNA v jádře stimulují nebo potlačují syntézu buněčné DNA (rychlost buněčného dělení) změny v antigenním složení cytoplasmatické membrány (začleňování strukturálních a nestrukturálních polypeptidů do membrány, presentace virových antigenů proteiny MHC-I rozpoznání infikované buňky NK buňkami) produkce interferonů zpomalené dělení nebo buněčná hyperplazie splývání buněk (protein F paramyxovirů) vznik vícejaderných syncycií poruchy buněčných funkcí (virus vztekliny ovlivňuje vznik neurotransmiterů, množení virů v buňkách imunitního systému poruchy imunity oslabením fagocytárních schopností leukocytů, ztráta citlivosti leukocytů k chemotaktickým podnětům)
Produkce interferonů infikovanou buňkou
Účinek virové infekce na buňku
rušivý vliv replikace viru na životní pochody a morfologii hostitelské buňky:
adsorpce viru na povrch buňky změny konzistence, permeability a fluidity cytoplasmatické membrány změny v propustnosti iontů, hypertonisace prostředí buňky, změny vazebných vlastností ribosomů ve prospěch iRNA (picornaviry) nestrukturální polypeptidy vazbou na ribosomy potlačují nebo inhibují buněčnou proteosytézu produkty translace virové DNA v jádře stimulují nebo potlačují syntézu buněčné DNA (rychlost buněčného dělení) změny v antigenním složení cytoplasmatické membrány (začleňování strukturálních a nestrukturálních polypeptidů do membrány, presentace virových antigenů proteiny MHC-I rozpoznání infikované buňky NK buňkami) produkce interferonů zpomalené dělení nebo buněčná hyperplazie splývání buněk (protein F paramyxovirů) vznik vícejaderných syncycií poruchy buněčných funkcí (virus vztekliny ovlivňuje vznik neurotransmiterů, množení virů v buňkách imunitního systému poruchy imunity oslabením fagocytárních schopností leukocytů, ztráta citlivosti leukocytů k chemotaktickým podnětům)
Propagace infekčního procesu brána vstupu
brána vstupu: porušenou kůží (vzteklina, hepatitida B, C, D, HIV, arboviry) sliznicemi místo primárního pomnožení (rhinoviry, rotaviry – lokalizovaná infekce) manifestace příznaků v průběhu 2-5 dní
průnik do submukosy (v. chřipky, adenoviry)
průnik do lymfatických uzlin a krve (primární a sekundární virémie)
průnik do cílových orgánů (sytémové nebo disseminované infekce) manifestace příznaků po 14-21 dnech
virus vztekliny
místo primárního pomnožení
průnik do lymfatické tkáně (primární virémie)
sekundární virémie
cílové orgány (játra, kůže, CNS)
Kultivace virů
tkáňové kultury kuřecí embrya (10 - 12 dní stará) experimentální zvířata
Antivirová terapie
imunizace: živé atenuované, mrtvé, subjednotkové a rekombinantní vakciny terapie: inhibice adsorpce virů na povrch vnímavé buňky polynionické látky (dextrasulfát, heparin, polysulfáty) mění náboj povrchu buněk, solubilizované receptory (benzyl-, fenylaminované CD4)
zábrana uvolnění virové NK chalkonamidy, dichlorflavany – váží se na centrální prohlubeň kapsomer picornavirů a tím se stávají odolnými k desintegraci buněčnými proteasami Amantadin, Rimantadin – interagují protonový kanál M2 virů chřipky typu A, brání vstupu protonů do kapsidy a blokují tak její desintegraci interference s transkripcí a translací virových genů analoga nukleosidů – 5-jód-deoxyuridin (herpetické viry), acyclovir (vázán na virovou thimidin kinasu, učinkuje pouze v infikovaných buňkách, proti herpetickým virům), ganciclovir inhibitory DNA-polymeras - kyselina fosfonmravenčí a fosfonoctová, proti HIV
Amantadin
Rimantadin
O
O
HN H2N HO
NH2
H3C
NH2
N N 5'
HN
N
H2N HO
O
N N 5'
N O 3'
acyclovir
OH gancyclovir O I HN O
N
O
HO
HO
O
O
P OH
OH
kyselina fosfononmravenčí
OH 5-jód-2'-deoxyuridin
O
Antivirová terapie
O
H2N
N
CH3
HN
N N
terapie: (pokračování) interference s transkripcí a translací virových genů inhibitory RNA-polymeras – ribavirin analog guanosinu, široké spektrum účinku (respirační synciální virus, adenoviry, viry parafluenzy, v kombinaci s IFN-α proti chronickým hepatitidám, arenaviry-Lassa, filoviry-Ebola, Marbourg) inhibitory reverzní transkriptasy – proti HIV, zidovudin, dideoxycitidin (zalcitabin), dideoxyinosin (didanosin), didehydrodideoxythimidin (stavudin) IFN-α – infekce chronických hepatitid B a C (eliminace nákazy u 25% léčených, aplikace v kombinaci s ribavirinem) komplementární oligonukleotidy – vazba na významné úseky NK, inhibice transkripce a translace (exp. stádium)
HO
O HO
O
OH
O
OH
N3
O
ribavirin
H3C
NH N
HO
zidovudin
O
O
didehydro-dideoxythimidin O
NH2
HN
N
problémy antivirové terapie: opožděná aplikace terapeutik toxicita preparátů degradace a penetrace terapeutik rozvoj rezistence
N
N HO
O
dideoxycitidin
N N
O
HO
N O
dideoxyinosin
DNA viry – čeleď Poxviridae
charakteristika největší a nejsložitější viry obratlovců oválný virion (230300 nm), 2 lineární vlákna DNA 100 strukturních polypeptidů replikace poxvirů probíhá v cytoplasmě přirození hostitelé: obratlovci, hmyz
rody: Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus, Capripoxvirus, Avipoxvirus
význam v medicině: Orthopoxvirus: virus varioly (hostitel člověk), virus vakcinie, viry primárně pathogenní pro různé savce (opice, králíci velbloudy, hovězí dobytek) Parapoxvirus: viry vyvolávající přirozené nákazy skotu, ovcí a koz, u člověka vyvolávají profesionální nákazy viry ostatních rodů nejsou pro člověka infekční
poxviry jsou odolné k chemickým a fyzikálním vlivům, vysychání odolávají několik měsíců, odolávají org. rozpouštědlům, z desifekčních prostředků jsou nejúčinější jsou oxidační halogenové preparáty
Virus varioly
lidský poxvirus příbuzný viru vakcinie a dalším virům rodu Orthopoxvirus člověk je jediným hostitelem, u kterého vyvolává onemocnění pravými neštovicemi (variolou) s úmrtností 15-40 % experimentální infekce: vnímavé jsou pouze opice, virus je možné kultivovat na chorioalantoidní membráně kuřecích zárodků replikace: virion pohlcen do vakuoly destrukce obalů lysozomálními enzymy přepis gen. informace do iRNA syntéza proteasy štěpící kapsidu syntéza nestrukturálních a strukturálních polypeptidů syntéza virionů v cytoplasmě (Guarnieriho tělíska) dvouvláknová DNA (180 kb) kóduje až 200 polypeptidů (u řady z nich není známa jejich funkce), dříve označované jako antigeny L a S produkce hemagglutininu (lipoproteinové částice o průměru 65 nm; není součástí virionu)
Patogeneze a klinický obraz varioly
přenos: vzduchem (prach ze zashlých krust), kapénkovým přenosem, kontaktem
patogeneze: v průběhu 10-12 dnů se virus množí v orofaryngu, buňkách lymfatických uzlin a poté se šíří do dalších orgánů (játra, slezina plíce, kostní dřeň) sekundární virémie (vysoká horečka) množení viru v endotelu kapilár průnik viru k vnímavým buňkám kůže lokalizace viru v kůži (pokles horečky) infekce zasahuje všechny vrstvy kůže (s vyjímkou stratum coleum) zduřením a leukocytární infiltrací vznikají papuly, degenerací buněk které praskají a splývají s rohovou vrstvou vznikají neštovice (pustuly) mléčně zakalené detritem rozpadlých buněk a leukocyty sliznice: ulcerace (zdroj infekce) vývoj neštovic na kůži: makuly a papuly (4 dny) vezikuly (další 4 dny) v pustuly (2-6 dní), Po 10-14 dnech zasychání pustul tvorba krust, po odloučení charakteristické jizvy hemorrhagie pustul (černé neštovice) nepříznivá prognóza komplikace kontaminace neštovic stafylokoky, stafylokoková sepse
Diagnostika, terapie a prevence
diagnostika:
nález Guarnieriho tělísek v nátěrech buněk podezřelých lézí izolace viru z puchýřků, krusty, seškraby z lézí a kultivace viru na kuřecích zárodcích (charakteristická morfologie hyperplastických uzlíků), nebo v buněčné kultuře (po 18 h prokazatelné IF technikami) stanovení specifických protilátek (4.-7.den po infekci)
terapie: prevence a léčba nemoci v časné fázi inkubace N-methylisatin-thiosemikarbazon (blokování virových RNA polymeras) imunizace živým antigenně příbuzným kmenem vakcinie
eradikace neštovic (WHO, 1966-1978): očkováno 83 mil. osob v oblastech endemického výskytu varioly (Afrika, Asie); 1967 registrováno 15 mil. nemocných poslední nákazy variolou Bangladéš, Barma, Indie (1977)
Virus vakcinie
samostatný druh rodu Orthopoxvirus 1796 Jenner aplikoval v. vakcinie při vakcinaci proti variole geneticky stabilní hybrid antigenně bližsí variole než v. kravských neštovic
experimentální infekce: cytopatický účinek v různých buněčných kulturách růst v chorioalantoidní dutině kuřecího zárodku patogen pro myš a morče
očkování proti variole: zdroj živé vakcíny lymfa vezikul (kůže ovcí a telat); kuřecí zárodky očkuje se intradermálně, do 9. dne se vyvine charakteristická neštovice, která se do 2 týdnů hojí a zanechává trvalou jizvu imunita po prodělané variole je trvalá, získaná vakcinací trvá 3-5 let komplikace (oslabení jedinci): neštovice se šíří do šířky a hloubky (vakcinia gangrenosum); virus může být leukocyty přenesen do ekzémového zánětu; transplacentární přenos na plod
nosič genů důležitých pro navození imunity proti některým virům
RNA viry – čeleď Orthomyxoviridae
viry chřipky – sférické nebo vláknité částice o průměru 80 – 120 nm virová -RNA je obsažena v helikoidální kapsidě virová RNA sestává z 8 (7) segmentů jediného vlákna s negativní polaritou nukleokapsida je obalena hostitelskou cytoplasmatickou membránou s glykoproteinovými výběžky (membrána je ukotvena ke kapsidě proteinem M) nukleokapsida obsahuje 3 proteiny (RNA transkriptasy)
povrchové antigeny (v. chřipky typu A a B): hemaglutinin (glykoproteiny HA1 a HA2) neuramidasa povrchové antigeny v. chřipky typu C relativně stabilní antigeny (hemaglutinin, enzym destruující receptory s neuraminát-Oacetylesterasová aktivitou) proteiny nukleokapsidy a membránové proteiny (M1 a M2) jsou druhově specifické a relativně neměnné
Uspořádání virionů orthomyxovirů NA neuramidasa; HA hemaglutinin; LM lipidová membrána; M1, M2 membránové proteiny; NP nukleoprotein; P polymerasa
Orthomyxoviridae
rody: virus chřipky typu A a typu B RNA viru chřipky typu C má pouze 7 segmentů; virus má rozdílné biologické i morfologické vlastnosti (samostatný rod)
citlivost k vnějším vlivům: viry chřipky jsou citlivé k org. rozpouštědlům; jsou stabilní při pH 7-8, jsou inaktivovány teplem (odolávají účinkům pokojové teploty v sekretech a zaschlých kapénkách hlenu)
viry replikují v jádře, kde vznikají nukleokapsidy; obal získávají pučením virových částic z cytoplasmatické membrány
Orthomyxoviridae
Replikace viru chřipky NA neuramidasa; HA hemaglutinin; NK nukleokapsida; NP nukleoprotein; PA, PB1, PB2 virové polymerasy
Orthomyxoviridae
replikace: adsorpce – vazba hemaglutininu na receptory (glykoproteiny, gangliosidy) vnímavých buněk endocytosa virionu konformační změna HA2 interakce se stěnou endosomu a fúze transport nukleokapsidy do jádra, destrukce NP buněčnými proteasami syntéza polyadenylované iRNA a nepolyadenilované RNA (matrice pro nově vytvořené genomy) segmenty RNA jsou přepisovány jako jedn. iRNA (hemaglutinin vzniká jako jediná molekula, post-translačně štěpena na HA1 a HA2) vznikající proteiny kapsidy jsou transportovány do jádra protein M a povrchové proteiny jsou začleňovány do cytoplasmatické membrány nukleokapsidy opouštějí jádro, připojují se na vnitřní stranu cytoplasmatické membrány k proteinu M, pučením získávají lipoproteinový obal
Orthomyxoviridae
experimentální infekce: fretky: množení viru v horních cestách dýchacích opice, prasata, myši: množení viru v celém respiračním traktu (smrtelné pneumonie) buněčné kultury: primární kultury buněk opičích ledvin nebo kuřecích fibroblastů, stabilní linie psích ledvin Madin Darby kuřecí zárodky: množení viru v alantoidní nebo amniové dutině
proměnlivost virů chřipky: přirozený hostitel: člověk, vepř, kůň, lachtani, velryby všechny viry mají podobné vnitřní antigeny (protein nukleokapsidy, membránové proteiny) chřipka A hemaglutininy H1-H14 a neuramidasa N1-N9 antigenní zlom (chřipka typu A): zásadní změna ve struktuře hemaglutininu nebo neuramidasy nový subtyp se objevuje náhle, infekce nabývá pandemické podoby původ a příčina antigenního zlomu nejsou zcela jednoznačně vysvětleny (mezidruhový přenos/rekombinace lidských a zvířecích virů - ptáci prasata člověk; mnohočetné mutace) antigenní posun (chřipka typu A a B): bodové mutace s následujícími změnami v aminokyselinovém složení epitopu selekce mutantů (každý subtyp existuje jako heterogenní směs geneticky příbuzných virů) reinfekce osob které již nákazu daným subtypem překonaly
značení virů lidské chřipky: typ viru (A, B, C), číslo kmene a rok izolace. U virů chřipky A je číslem charakterizována povaha hemaglutininu a neuramidasy A/New Caledonia/20/99 (H1N1); A/Brisbane/10/2007 (H3N2); A/goose/Guangdong/1/96/ (H5N1)
Orthomyxoviridae
experimentální infekce: fretky: množení viru v horních cestách dýchacích opice, prasata, myši: množení viru v celém respiračním traktu (smrtelné pneumonie) buněčné kultury: primární kultury buněk opičích ledvin nebo kuřecích fibroblastů, stabilní linie psích ledvin Madin Darby kuřecí zárodky: množení viru v alantoidní nebo amniové dutině
proměnlivost virů chřipky: přirozený hostitel: člověk, vepř, kůň, lachtani, velryby všechny viry mají podobné vnitřní antigeny (protein nukleokapsidy, membránové proteiny) chřipka A hemaglutininy H1-H14 a neuramidasa N1-N9 antigenní zlom (chřipka typu A): zásadní změna ve struktuře hemaglutininu nebo neuramidasy nový subtyp se objevuje náhle, infekce nabývá pandemické podoby původ a příčina antigenního zlomu nejsou zcela jednoznačně vysvětleny (mezidruhový přenos/rekombinace lidských a zvířecích virů - ptáci prasata člověk; mnohočetné mutace) antigenní posun (chřipka typu A a B): bodové mutace s následujícími změnami v aminokyselinovém složení epitopu selekce mutantů (každý subtyp existuje jako heterogenní směs geneticky příbuzných virů) reinfekce osob které již nákazu daným subtypem překonaly
značení virů lidské chřipky: typ viru (A, B, C), číslo kmene a rok izolace. U virů chřipky A je číslem charakterizována povaha hemaglutininu a neuramidasyA/New Caledonia/20/99 (H1N1); A/Brisbane/10/2007 (H3N2); A/goose/Guangdong/1/96/ (H5N1)
Orthomyxoviridae
způsob šíření: kapénkovým přenosem
patogeneze: místo primárního pomnožení – sliznice dýchacích cest virová neuramidasa snižuje viskozitu ochranného hlenu přístup virionu k receptorům hemaglutininu množení viru vede ke vzniku zánětlivého infiltrátu edému a destrukci sliznice (obstrukce dýchacích cest, primární chřipková pneumonie – porucha oxidačněredukčních funkcí náhlá smrt postiženého jedince bez histopatologických příznaků)
komplikace: bakteriální infekce postižených sliznic (stafylokoky, streptokoky, hemofily) viry chřipky mají nepříznivý vliv na buňky imunitního systému (permisivita makrofágů) snížení fagocytární kapacity, snížená chemotaxe, nedostatečná kooperace makrofágů s T-lymfocyty imunologicky oslabení jedinci (malé děti, chronicky nemocní, gravidní ženy, senioři): viremie, šíření do dalších orgánů mimo dýchací trakt transplacentární přenos infekce
Orthomyxoviridae
klinické příznaky (virus chřipky typu A a B):
virus chřipky typu C:
inkubace 2-3 dny, vzestup teploty, bolesti hlavy a svalstva, končetin, zad, očí, rýma, zduřelá nosní sliznice, suchý kašel nekomplikované onemocnění trvá 3-7 dní onemocnění komplikované sekundární bakteriální infekcí – hnisavá rýma děti do 5 let: zánět středního ucha, bronchitida, bronchopneumonie, Reyův syndrom (encefalopatie, steatosa jater a ledvin) dospělí: encefalitida, myokarditida, pankreatitida
lehké infekce horních cest dýchacích převážně u dětí u dospělých většinou asymptomaticky
diagnostika: výtěry nebo výplachy nosohltanu inokulace materiálu do amniového vaku kuřecího embrya, nebo kultivací na tkáňových kulturách rychlá diagnostika je založena na průkazu virových antigenů (otisky, stěry) serologická diagnostika je založena na vzestupu hladiny protilátek v séru pacientů
Terapie, prevence a epidemiologie
terapie: inhibitory virové neuraminidasy: Zanamivir (Relenza) způsob aplikace: orální inhalace Laninamivir způsob aplikace: nasální inhalace Oseltaminir (Tamiflu) způsob aplikace: orální Peramivir (Rapivab) způsob aplikace: intravenosně Amantadin a Rimantadin interference s proteinem M2; blokuje transport protonů do virové částice (aktivace M2 v důsledku endosomální acidifikace) vakcinace: vakcína musí obsahovat povrchové antigeny aktuálních kmenů (monitoring WHO) příprava vakcín na rekombinantních kmenech adaptovaných na kuřecí zárodky celovirová formalinizovaná vakcína (vedlejší reakci způsobené lipidovými komponenty) subjednotková vakcína (slabší imunogen)
HO
O
OH
H3C HO
O OH
HO
O
H
OH
HO
HN HN CH3
O
H HN
NH2 O
NH
O
O
HN CH3
NH2 NH
Zanamivir
CH3
O
H3C
Laninamivir
CH3
HN
HN
H N
NH2
H OH
NH2
OH O
Peramivir
Amantadin
Terapie, prevence a epidemiologie Rok
Pandemie
Počet mrtvých
Subtyp viru
1918-1919
Španělská chřipka
20-100 mil.
A/H1N1
1957-1958
Asijská chřipka
1-1,5 mil.
A/H2N2
1968-1969
Honkongská chřipka
0,75-1 mil.
A/H3N2
1977-1978
Ruská chřipka
?
A/H1N1
Současnost: subtypy H1N1 a H3N2; 33% obyvatel infikováno virem chřipky, 26% symptomatická infekce, 1% nutná hospitalizace, 8% hospitalizovaných umírá
Rhabdoviridae
rostlinné a živočišné viry genom: nesegmentované vlákno -RNA místo replikace: cytoplasma viriony: cylindrické, na jednom konci zakulacené 130-24070-80 nm lipidový obal (hostitelská cytoplasmatická membrána) s glykoproteinovými výběžky fixovaná ke kapsidě M proteinem dva rody: Vesiculovirus – infekce koní, krav a vepřů (přenašeč komáři), profesionální infekce člověka Lyssavirus – virus vztekliny a přibuzné viry, Lagobat virus (netopýr), Obodhiang, Kotonkan (moskyt), Mokola (rejsek, likvor osob s postižením CNS), Duvenhage (z mozku člověka po kousnutí netopýrem)
Virus vztekliny
charakteristika:
citlivost k vnějším vlivům:
inaktivován etherem, org. rozpouštědly, kyselým pH, teplem a UV zářením
replikace:
charakteristická morfologie rhabdovirů, velikost virionu 180-75 nm virová částice obsahuje 5 strukturálních proteinů glykoprotein tvoří povrchové výběžky (adsorpce, hemaglutinační vlastnosti viru) protein M je tvořen 2 polypeptidy antigeny protein kapsidy, virová RNA polymerasa virus existuje v řadě variant divokých i laboratornách kmenů (identifikace MAb proti nukleoproteinu)
k ireversibilní adsorpci viru dochází během vteřin, fůzi vnějšího obalu s cytoplasmatickou membánou proniká virion do buňky, replikace probíhá v cytoplasmě (tvorba inkluzí – Negriho tělíska), buňku viriony opouštějí pučením z cytoplasmatické membrány
experimentální infekce:
neurotropní viry, způsobující smrtelnou infekci většiny zvířat inkubační doba má různou délku fixní virus – pasážování viru zvířatům do CNS mutanty vyvolávající příznaky infekce po konstantní době inkubace, ale neinfekční při periferní aplikaci
Virus vztekliny
ekologie:
nepřítomen v Austrálii, vymýcen v Anglii, Irsku, Španělsku, Portugalsku, Japonsku a Taiwanu rozšíření mezi teplokrevnými obratlovci v různých částech světa různá rezervoárová zvířata (psovité, kočkovité a kunovité šelmy, netopíři, primáti) Evropa: vlci a lišky (ČR: lišky a hlodavci) Americký kontinent: skunk, mýval, netopýři
patogeneze:
virus proniká do organismu kousnutím nebo škrábnutím nakaženým zvířetem (američtí netopýři vylučují virus sekrety nosní sliznice aerosol) jediná replikace ve svalových buňkách, přestup do nervového zakončení postup axoplasmou do regionálních ganglií množení průnik do CNS CNS: průnik do všech buněk mozku, přes nervová vlákna do všech tkání množení ve slinných žlázách ještě před projevy klinických příznaků rezervoárová zvířata: dlouhé období vylučování viru bez příznaků infekce
Virus vztekliny
klinické příznaky:
virus se šíří axoplasmou neuronů viremie se nerozvíjí specifiké protilátky se objevují současně se symptomy infekce replikace viru gangliové buňky morfologicky nepoškozuje změny v mozku zemřelých neodpovídají závažnosti onemocnění doba inkubace: 20-60 dní (kratší než 10 dnů, několik měsíců až let) únava. anorexie, bolesti hlavy horečka, podráždění nespavost postižení CNS – záchvaty hyperaktivity, poruchy vegetativních funkcí (slinění, pocení), zvýšená tenze svalů, křeče postihující polykací svaly, asymetrická nebo generalizovaná obrna, po 2-10 dnech zástava srdce a dýchání
onemocnění zvířat:
odmítání potravy, změna chování (agrese, apatie), paralýza končetin pokleslá čelist, dýchací obtíže, smrt během několika dnů
Virus vztekliny
diagnostika: imunofluorescenční průkaz Negriho tělísek v řezech mozkové tkáně izolace viru z CNS nebo slin na novorozených myších (průkaz inkluzí v mozku) imunofluorescenční průkaz virových antigenů ve slinách, v buňkách z otisků ústní sliznice, rohovky nebo svalové tkáně nemocného nález specifických protilátek v mozkomíšním moku
terapie: ošetření rány vymytím dezinfekce alkoholem nebo preparáty obsahující kvarterní báze infiltrace okolí rány antirabickýchm sérem aktivní imunizace 12-24 dávek vakcíny denně, upomínací dávka po 10-20 dnech od poslední infekce vyšeření odchyceného zvířete (10 denní karanténa domácích zvířat, vyšetření mozku zvířete)
prevence:
očkování psů, perorální vakcinace lišek, likvidace toulavých zvířat
Filoviridae
filoviry jsou původci akutních fatálních hemorrhagických horeček u lidí a opic
taxonomické zařazení:
řád: Mononegavirales čeleď: Filoviridae rod: Ebolavirus druh: Zaire ebolavirus, Sudan ebolavirus, Côte d’Ivoire ebolavirus, Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus rod: Marburgvirus druh: Marburg marburgvirus rod: Cuevavirus druh: Lloviu cuevavirus (virová pneumonie netopýrů Miniopterus schreibersii v Evropě)
Filoviridae
charakteristika:
3’
filoviry jsou obalené vláknité viry o jednotném průměru ale rozdílnou délkou 700 1400 nm 80 nm genom je tvořen jednořetězcovou nesegmentovanou RNA s negativní polaritou (18,9 kb) neinfekční RNA viru kóduje 7 strukturálních a jeden nestrukturální protein v pořadí: 3’ nekódující oblast NP VP35 VP40 GP/sGP VP30 VP24 L (RNA dependentní RNA polymerasa) 5’ nekódující oblast s vyjímkou genu kódující glykoprotein jsou všechny geny monocistronické tj. kódují jeden strukturní protein vnitřní ribonukleoproteinový komplex virionu je tvořen komplexem RNA, nukleoproteinu, VP35 (kofaktor RNA polymerasy, anagonista IFN α, INF β), VP30 a RNA dependentní RNA polymerasou (transkripce a replikace) dřeň virionu obsahuje proteiny VP40 (utváření nukleokapsidy, pučení virionu), VP24 (membránový protein blokující signální dráhu pro INF α, INF β a INF γ a znemožňuje tak ustavení antivirového stavu buňky. Podílí se na vytváření nukleokapsidy a pučení virionové částice) glykoprotein je jediný transmembránový protein, tvoří trimery skládající se ze dvou disulfidovou vazbou propojených fragmentů GP1 a GP2 NP
VP35
VP40
GP/sGP VP30
VP24
L RNA polymerasa
5’
Filoviridae
glykoprotein GP: GP-1 - adhese viru na hostitelskou buňku prostřednictvím buněčných receptorů cílové buňky GP-2 - učinkuje jako virový fusní protein třídy 1, fúze membrán endocytovaného viru a membrány endosomu průnik viru do cytoplasmy komplex GP-1,2 - zprostředkovává aktivaci endotheliálních buněk a makrofágů, potlačuje buněčné obranné mechanismy. V zavěrečné fázi virové infekce potlačuje expresi různých povrchových molekul hostitelské buňky (např. integrinů ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGAV, ITGB1), adhesinů (cytotoxický efekt) narušení integrity cév hemorrhagie (při masivním uvolnění virionů) a MHC-I změna v rozpoznání napadených buněk buňkami imunitního systému
citlivost k vnějším vlivům: inaktivace rozpouštědly, UV a -zářením, dezinfekčními prostředky, fenoly odolné k účinkům tepla
Filoviridae - replikace
WhiteJ.M., Schornberg K.L. (2012): A new player in the puzzle of filovirus entry. Nature Reviews Microbiology 10, 317-322.
Filoviridae - replikace
adhese na cílové buňky
GP1-S-S-GP2 se váže na různé receptory na povrchu cílových buněk (DC-SIGN, L-SIGN, β1-integrin, ICAM3)
pohlcení virionu procesem připomínajicí makropinocytosu
fuse membrán endosomu a virionu štěpení glykoproteinu catepsinem L a catepsinem B vede k odstranění 60 % aminokyselinového řetězce GP1, glykanové čepičky, mucinové domény a β-řetězce z receptor vázající podjednotky (RBR podjednotka) nízké pH endosomu vede ke konformačním změnám a k uvolnění hydrofobní fúzní smyčky, která se váže na cílovou membránu endosomu (můstek tvořený trimery G2) RBR vazebná doména interaguje s endosomálním proteinem Nieman-Pick C1 (NCP1) TIM1 konformační změny vedou k ohybu G2 zhruba v polovině řetězce fúsního proteinu G2 → přiblížení a splývání membrán virionu a endosomu → vytvoření kanálku pro přestup nukleokapsidy
uvolnění nukleokapsidy do cytoplasmy
White J.M., Schornberg K.L. (2012): A new player in the puzzle of filovirus entry. Nature Reviews Microbiology 10, 317-322.
WhiteJ.M., Schornberg K.L. (2012): A new player in the puzzle of filovirus entry. Nature Reviews Microbiology 10, 317-322.
Filoviridae - replikace
transkripce virové RNA do monocistronických mRNA mRNA glykoproteinu GP se váže na hrubé endoplasmatické rutikulum glykoprotein je syntetisován jako jeden polypeptidový řetězec který je štěpen furinivou proteasou na podjednotku vázající receptor a fúsní protein vzájemně propojené disulfidovým můstkem. Komplex G1-S-S-G2 tvoří homotrimery, které jsou po glykosilaci váčky Golgiho aparátu transportovány k buněčné membráně vznikající VP35 blokuje synthesu IFNα/β, VP24 blokuje signální dráhu pro aktivaci sythesy interferonů
vzrůstající koncentrace virových proteinů vede k přesmyku z translace na replikaci
+ssRNA slouží jako templát pro sythesu virové –ssRNA
vznik virových inkluzí v místě shromažďování nuklokapsid pučení virionu z hostitelské cytoplasmatické membrány
Filoviridae
experimentální infekce: opice, morčata (pouze horečka), myši (na myši adaptovaný Zaire ebolavirus) myš
morče
opice
člověk
nutná adaptace
+
+
-
-
vyrážka
-
-
+
+
hemorrhagické projevy
nevýrazné
-
+
+
abnormální koagulace
nevýrazná
protichůdná data
+
+
trombocytopenie
+
+
+
+
apoptosa
-
-
+
+
cytokinová odpověď
+
+
+
+
4-6 dnía)
6-9 dnía)
6-9 dnía)
6-16 dníb)
doba smrti
a)doba smrti po infekci, b)doba smrti po prvních symptomech
Filoviridae
ekologie: tropické oblasti Afriky (10 s.š. a 10 j.š.), Zaire ebolavirus, Sudan ebolavirus, Budibugyo ebolavirus, Côte d’Ivoire ebolavirus (jediný případ), Marburg marburgvirus (dříve Lake Victoria marburgvirus) Filipíny (Reston ebolavirus) USA (1989-1996, Philadelphia, PA, Reston, VA, San Antonio TX), Itálie (1992, Sienna) původ: importovaní makakové z jediného zařízení na Filipínách (farma Ferlite) infikovaní druhem Reston ebolavirus Německo (1967 Marburg), Jugoslávie (Bělehrad) manipulace s orgány a tkáněmi kočkodanů dovezených z Ugandy (Marburg marburgvirus)
konečný hostitel: člověk, opice, prasata (Filipíny), jiní savci? reservoár kaloni a netopýři (Hypsignatus monstrosus, Epomops franqueti, Epomops gambianus, Myonycteris torquata, Roussetus amplexicaudatus [REBOV], Roussetus aegyptiacus [MMARV]), myši (Mus setulosus, Praomys sp. RNA ZEBOV)? rejsci (Sylvisorex ollula, RNA ZEBOV)? neprokázáno
Funk S., Piot P. (2014): Mapping ebola in wild animalsfor better disease control. eLife 2014:3 e4565.
Filoviridae
pathogenese:
zoonosa (rezervoárová zvířata, ostatní hostitelé), kontaktem s krví, sekrety a exkrety zvířat nebo nemocných lidí, konzumace masa čerstvě ulovených zvířat (kaloni, opice), kapénkový přenos, přenos mateřskám mlékem, přenos přes oční sliznici? inkubační doba: 4 – 10 dní (podle způsobu přenosu) úmrtnost: 50 – 90 % podle druhu viru a přijaté infekční dávky. max. množství viru v krvi: 3,4109 kopií genomu na ml krve (fatální případy), 4,3107 kopií genomu na ml krve (u přeživších)
cílové buňky: monocyty, makrofágy, dendritické buňky (infikované buňky migrují do mízních uzlin a sleziny a tak šíří infekci), endotheliální buňky (terminální stádium onemocnění) lymfocyty podléhají apopoptose (mechanismus není znám, indukce Fas, produkce NO) progresivní lymfopedie cílové orgány: játra (hepatocelulární nekrosa), adrenokortikoidní systém, (hypotense, ztráta Na+, hypovolaemia) potlačení imunitní odpovědi: inhibice produkce IFNα/β (VP35 blokuje fosforilaci IFN regulačního faktoru 3) blokování signalisace pro aktivaci synthesy IFN (VP24) abnormální produkce NO apoptosa lymfocytů, poškození tkání, narušení integrity cév hypotense, šok, smrt intravaskulární koagulace krve a fibrinolysa petechie, ekchymóza (tečkovité krvácení), nekontrolované krvácení z cév a vlásečnic (masivní krvácení do gastrointestinálního traktu) fatální případy: minimální produkce IgM (jen v 30% fatálních případů), žádné IgG mírné symptomy: IgM 2 dny po objevení symptomů, IgG 5 - 8 dní pro prvních projevech nemoci
Feldmann H., Geisbert T.W. (2011): Ebola hemorrhagic fever. The Lancet 377, 849-862.
Filoviridae
klinické příznaky:
prvních 2 – 21 dní: únava, zimnice, horečka, nevolnost, malátnost, gastrointestinální potíže (anorexie, zvracení, bolesti v krajině brišní, průjem), respirační potíže (bolesti hrudníku, dýchavičnost, kašel), vaskulární potíže, neurologické problémy (bolesti hlavy, koma) kolem 5 dne: makulopapulózní vyrážka, bolestivá faryngitida s ulceracemi, suchý kašel, myalgie a artritidy hemorrhagické projevy – krvácení z dásní nosu a vagíny (70 % případů), hemorhagie do kůže a gastrointestinálního traktu terminální stav onemocnění: šok, křeče, metabolický rozvrat, dehydratace, smrt úmrtnost: Zaire ebolavirus: 60 – 90 % Sudan ebolavirus: 40 – 60 % Bundibugyo ebolavirus: 25 % (jediný případ nákazy) Côte d’Ivoire ebolavirus: ? (jediný případ) Marburg marburgvirus: 70 – 85 % (Afrika), 22 % (Evropa, 1967)
Filoviridae
diagnostika:
zvláštní bezpečnostní opatření (pathogen 4 třídy, tepelná inaktivace, γ-záření, ošetření materiálu guanidinisothiokyanátem [amplifikace RNA]) isolace viru na buňkách linie Vero průkaz RNA pomocí RT-PCR detekce virových antigenů ELISA metodami průkaz protilátek v séru pacientů pomocí ELISA: IgM se objevují 2 dny po objevení symptomů onemocnění a mizí 30-168 dní po infekci IgG se objevují 6-18 dní po prvních projevech onemocnění a persistují v organismu mnoho let
terapie a prevence:
známá antivirová chemoterapie neexistuje, vakcína
Retroviridae
charakteristika:
genom: dvě identická lineární, nesegmentovaná vlákna +RNA spojená vodíkovými vazbami
virová částice: 100-200 nm lipidový obal s výčnělky na vnější straně, na vnitřní straně je vrstva membránového proteinu pod obalem zevní kapsida (kulovitá, ikosahedrální) virová DNA je obalena proteinem vytvářejícím helikoidální kapsidu v kapsidě je přítomna reversní transkriptasa (+RNA vlákno –DNA syntéza komplementálního vlákna +DNA integrace DNA do genomu hostitelské buňky syntéza iRNA)
podčeled: Oncovirinae: lidský T-buněčný leukemický virus 1 (HTLV-1), HTLV-2 (leukémie sarkomy, lymfomy) Lentivirinae: virus lidské imunologické nedostatečnosti (HIV) Spumavirinae: přirozený hostitel savci, člověk; tvorba syncicií
Lentivirinae – viry HIV
lidské viry imunologické nedostatečnosti:
vyvolávají progresivní ubytek obranyschopnosti organismu (syndrom získané imunodeficience AIDS) HIV-1 centrální Afrika a ostatní kontinenty HIV-2 pouze západní Afrika (pomalejší rozvoj AIDS)
AIDS:
poprvé zaznamenán americkou zdravotní službou v r. 1981 existence nákazy cca od počátku 70. let infekce persistovala v izolovaných oblastech v průběhu 70. let se rozšířila do střední Afiky a Karibiku. V r. 1979 se v Evropě a sev. Americe objevují první nemocní v současnosti má šíření nákazy virem HIV-1 charakter pandemie předpokládá se že nový patogení druh viru existuje mezi 30-100 lety
Viry HIV
morfologické vlastnosti: obalené viry (100-120 nm) lipidový obal – výběžky tvořený 2 glykoproteiny Gp41 tvoří část ukotvenou v membráně, Gp120 je receptorem (rozpoznání CD4 a adsorpce viru) pod membránovým obalem se nachází membránový protein p18 zevní kapsida (p24) má kónický asymetrický tvar dřeň nukleitidu obsahuje 2 vlákna +RNA na kterou jsou navázány polypeptidy p7 a p9 a dohromady tvoří vnitřní helikoidální kapsidu dřeň rovněž obsahuje reversní transkriptasu a integrasu
citlivost k vnějším vlivům: HIV-1, HIV-2 jsou velmi labilní, jsou inaktivovány rozpouštědly a detergenty, nízkým pH, teplem, chlorovanými desinfekčními prostředky a UV zářením (25% Et-OH, 1% glutaraldehyd, 0,2% chlornan sodný, teplota 56°C/30 min.)
Viry HIV
replikace:
vazba Gp120 na D-doménu povrchového receptoru CD4+ Th-lymfocytů fúze virového obalu s cytoplasmatickou membránou desintegrace kapsidových polypeptidů a přepis +RNA reversní transkriptasou do dvouvláknové DNA migrace virové DNA do jádra a její integrace do genomu buňky (integrace podmiňuje expresi virových genů) rychlost a intenzita replikace resp. navození stavu latentní infekce je řízena produkty translace virových autoregulačních genů (tento proces závisí na metabolické aktivitě hostitelské buňky) tat kóduje vznik nestrukturálního proteinu, který po aktivaci T-lymfocytu indukuje transkripci virových genů rev, vif, nef řídí přesmyk okamžitých, časných a pozdních genů, synchronisují sytnézu strukturních proteinů, blokují jejich expresi v klidových, latentně infikovaných buňkách T-lymfocytů vznik četných mutantů (povrchové antigeny – pod selekčním tlakem protilátek, rozdílné populace lišící se antigenními a biol. vlastnostmi v průběhu onemocnění
experimentální infekce:
člověk je jediným přirozeným hostitelem infekce je přenositelná na šimpanze bez zjevného defektu imunity a projevů onemocnění
Viry HIV
patogeneze: zdroj nákazy - krev a sekrety nemocných, transplacentární přenos (20% děti), transfuse krve HIV-1 a HIV-2 mají selektivní tropismus k buňkám s povrchovou molekulou CD4 po primární infekci je virus transportován do mízních uzlin intenzivní replikace v CD4+ T-lymfocytech nárůst populace CD8+ cytotoxických T- lymfocytů nízká hladina virionů v krvi a obnovení populace CD4+ T-lymfocytů (asymptomatická fáze 1-15 let dlouhá/postižený je infekční – produkce až 1010 virionů/den) s průběhem let nestačí organismus nahrazovat ztrátu CD4+ T-lymfocytů nárůst počtu virových částic v krvi; při poklesu počtu T-lymfocytů pod 200 buněk μl-1 selhání imunitního systému; při rozvinutém AIDS dochází k omezenému pomnožení viru v buňkách svalové tkáně a nervových buňkách makrofágy funkční poruchy (snížená chemotaktická a fagocytární aktivita)
klinické projevy: po 2-3 týdenní inkubaci – primární syndrom (únava, zvětšené lymfatické uzliny, aseptické meningitidy) během několika týdnů vymizí (někdy nejsou příznaky zaznamenány) období latence perzistentní generalizovaná lymfadenopatie: únava, průjmy, pocení, pozvolná progrese příznaků AIDS stádium ARC (AIDS-related complex): horečky, hubnutí, průjmy, dermatitidy, kandidosa sliznic, projevy aktivace herpes virů a papilomavirů (opary na kůži a sliznicích) stádium rozvinutého AIDS: doba trvání 2-8 let, rozvoj oportunních infekcí vyvolaných Candida albicans, Pneumocystis carinii, Mycobacterium tuberculosis, cytomegaloviry, vznik maligních nádorů, lymfomy často v CNS, Kaposiho sarkom (bérce, horní končetiny, sliznice), u 20-40% nemocných postižení CNS – letální demence (někdy jediný příznak; atrofie mozkové kůry, zvětšení mozkových komor, mnohojaderné syncycie, demyelinizace, atd.), selhání mozkových funkcí, menigoencefalitidy
O
Viry HIV
diagnostika: detekce specifických protilátek v séru nebo mozkomíšním moku (ELISA) interval mezi expozicí a protilátkovou odpovědí 2-3 měsíce (5% osob 6 měsíců a více) stanovení p24 v séru nebo likvoru serologický průkaz virové reversní transkriptasy stanovení virových iRNA metodou PCR
CH3
HN O HO
N O
N3 zidovudin
terapie: neléčitelná choroba zpomalení destrukce imunitního systému a omezení komplikací antimikrobiální terapií strategie: blokáda buněčných receptorů (analoga CD4 a gp120) inhibice reversní transkriptasy blokáda integrace proviru komplementárními oligonukleotidy neutralizace účinku aktivátorů virové replikace (tat protein) málo specifická, toxické preparáty, rozvoj rezistence inhibitory RT a buněčných DNA polymerasy (Zidovudin, Didanosin, Zalcitabin, Stavudin) + profylaktická aplikace antibiotik (co-trimoxasol), antimykotik (Fluconazol) + tuberkulostatik (Rifabutin)
prevence: vakcíny? osvěta + kontrola krevní plasmy a krevních derivátů
Viry systematická část (domácí příprava)
DNA viry Herpesviridae virus herpes simplex virus varicella-zoster virus Epstaina a Barrové
RNA viry Picornaviridae polioviry
Flaviviridae viry komplexu klíšťové encefalitidy
Picornaviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Caliciviridae původci virové hepatitidy (A-E)
