Úvod do farmaceutické mikrobiologie. Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Úvod do farmaceutické mikrobiologie Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Kontakty 

Ing. Igor Hochel, CSc. místnost č.: V02, B244, (2. patro, budova B) telefon: 220 443 019, 220 445 166 e-mail: [email protected]



Prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. místnost č.: 245, (2. patro, budova B) telefon: 220 443 025 e-mail: [email protected]

Náplň předmětu     

        

Viry Bakterie Mikromycety Protozoa Principy mikrobiální pathogenity Struktura a popis imunitního systému Mechanismy účinků imunitního systému a antiinfekční imunita Vakcíny Mechanismy účinků antimikrobiálních látek Mechanismy rezistence k antibiotikům Laboratorní vyhodnocování účinnosti antimikrobiálních látek a dezinfekčních prostředků Mikrobiologické aspekty farmaceutické výroby Fyzikální metody sterilizace, posuzování sterilizačních procesů Chemické metody sterilizace, dezinfekční prostředky

Farmaceutická mikrobiologie 

posuzování mikrobiologické kvality farmaceutických výrobků 

kontrola surovin  kontrola meziproduktů a finálních výrobků  kontrola výrobního prostředí (výrobní haly, strojní zařízení)  kontrola produkčních mikroorganismů, substrátů 

posuzování účinnosti sterilizačních postupů, dezinfekčních agens



identifikace nežádoucích a pathogenních mikroorganismů



studium rezistence klinicky významných mikroorganismů k antibiotikům a dezinfekčním prostředkům

Hlavní skupiny mikroorganismů Organismus je jednotka složená z dílčích prvků, zřetelně ohraničená vzhledem ke svému okolí, strukturně a funkčně integrovaná, obsahující nukleovou kyselinu, která autonomně kontroluje svoji vlastní reprodukci a nezávisle reaguje na evoluční síly.  

viry, viroidy a priony prokaryota 



bakterie a archea

eukaryota kvasinky a plísně  protozoa 

Viry, viroidy a priony 

viry se od ostatních mikroorganismů odlišují svou velikostí (20 – 300 nm) a biologickou povahou



virová částice (virion) je tvořena nukleovou kyselinou (RNA, DNA), kapsidou popř.      



genom viru může být cirkulární nebo lineární DNA viry obsahují jedno nebo dvě komplementární vlákna RNA viry obsahují obvykle jednovláknovou NK (Reoviridae obsahuji dsRNA) velikost genomu: 5,5 – 200 kbp (10 – 100 i více genů) kapsida je tvořena několika druhy polypeptidů lipoproteinový obal (lipidová dvojvrtva hostitelského původu – jaderná membrána, cisterny ER, cytoplasmatická membrána)

nepřítomnost buněčných struktur, absence enzymů nutných k replikaci NK → neshopnost nezávislé replikace → všechny viry jsou intracelulárními parazity

Viroidy 

jednořetězcové kruhovité molekuly RNA



velikost 300 nukleotidů (nekódují žádný enzym)



nemají bílkovinný obal, ani jiný protein není jejich součástí



rostlinné pathogeny

Priony 

unikátní infekční částice



savčí proteiny s atypickou konformací



interagují s normálními proteiny a mění jejich konformaci a narušují tak jejich funkci



extrémní rezistence k konvenčním sterilizačním postupům a činidlům (vlhké teplo, γ-záření, desinfekční činidla)



původci “kuru”, spongiformní encefalopathie (Creutzfeld-Jacobova nemoc), bovinní spongiformní encefalopathie u lidí, scrapie u zvířat

Vlastnosti prokaryotních mikroorganismů 

organisace buněčného jádra    



nepřítomnost buněčných organel  



morfologicky zřetelný útvar, neoddělený od cytoplasmy membránou kruhovitá dvouvláknová DNA (1 chromosom) haploidní buňky, nepohlavní rozmnožování jediný chromosom

absence mitochondrií, chloroplastů, endoplasmatického rutikula cytoplasmatická membrána je jediný membránový útvar

vlastnosti ribosomů (70S)  

malá podjednotka (30S) 1 molekula 16 S RNA + 21 molekul bílkovin velká podjednotka (50S) 2 molekuly 5S a 23S RNA + 34 molekul bílkovin

Vlastnosti prokaryotních mikroorganismů 

přítomnost peptidoglykanu v buněčné stěně 



   

mykoplasmata

jednoduchá stavba bičíků striktní nebo fakultativní anaerobiosa schopnost vázat vzdušný dusík nepřítomnost sterolů v buněčné membráně neschopnost vytvářet funkčně i morfologicky diferencované tkáně

Bakterie a archea 

jednobuněčné mikroorganismy



bakterie  



značné rozdíly v metabolismu, pathogenicitě, výskytu atd. klinicky významné bakterie patří do skupiny eubakteria

archea  

extrémofilní mikroorganismy, přežívající v prostředí s vysokými teplotami, extrémní salinitou nebo hodnotami pH mikroorganismy se specialisovanými adaptacemi metabolismu (získávání energie oxidací sirných a železnatých sloučenin, produkce methanu)

Vlastnosti eukaryotních mikroorganismů 

organisace buněčného jádra    



přítomnost buněčných organel 



morfologicky zřetelný útvar, oddělený od cytoplasmy jadernou membránou lineární dvouvláknová DNA diploidní buňky, nepohlavní i pohlavní rozmnožování (mitosa a meiosa) více jak jeden chromosom

přítomnost mitochondrií, chloroplastů, endoplasmatického rutikula a dalších membránových struktur

vlastnosti ribosomů (80S)  

malá podjednotka (40S) 1 molekula 18S RNA + ~30 molekul bílkovin velká podjednotka (60S) 1 molekula 5S RNA, 1 molekula 5,8 RNA, 1 molekula 28S RNA + >50 molekul bílkovin

Vlastnosti eukaryotních mikroorganismů  

   

přítomnost celulosy nebo chitinu, absence peptidoglykanu v buněčné stěně složitá stavba bičíků anaerobiosa vzácná neschopnost vázat vzdušný dusík přítomnost sterolů v buněčné membráně schopnost vytvářet funkčně i morfologicky diferencované tkáně

Mikroskopické houby 

kvasinky 



jednobuněčné mikroorganismy (5 – 10 μm), nepohlavní rozmnožování pučením nebo dělením

plísně    



nepřesný termín pro mikroskopické houby, které nevytvářejí fruktifikační orgány viditelné pouhým okem vytvářejí mycelium tvořené septovanými nebo neseptovanými hyfami hyfy mohou být diferenciovány podle fyziologických funkcí (sorpce živin, reprodukce) u některých druhů plísní není známo pohlavní stádium saprofitní organismy

Protozoa 

eukaryotní jednobuněčné organismy považované za živočichy



volně žijící pohyblivé organismy, které se vyskytují v půdě a vodě



parazité rostlin zvířat a člověka (malárie, spavá nemoc, granulomatosní amébová encefalitida, amébová úplavice, toxoplasmosa)

Kultivační média 

minimální média obsahují jen nezbytné živiny popř. růstové faktory → média jsou chemicky definovaná  minerální médium – obsahuje anorganické soli a jediný zdroj uhlíku (glukosa)  minimální média kladou značné nároky na syntetický aparát buňky → nižší růstová rychlost 

glukosa

1g

NH4Cl

0,5 g

Na2HPO4

1,5 g

KH2PO4

0,5 g

MgSO4·7H2O

0,1 g

CaCl2

0,01 g

FeSO4·7 H2O

0,001 g

destilovaná voda

1000 ml

pH

7,2


komplexní média 





  



přesné chemické složení média není známo, složení média mírně kolísá v jednotlivých výrobních šaržích vodní roztoky hydrolysovaných proteinů živočišného nebo rostlinného původu (masový extrakt) peptony – proteiny hydrolysované trypsinem, nebo jinými proteolytickými enzymy kvasničný autolyzát – zdroj vitamínů sk. B NaCl – úprava osmotického tlaku pufry – stabilizace hodnoty pH během fermentace nutriční suplementy – mléko, krev, sérum

masový extrakt

10 g

pepton

10 g

NaCl

5g

destilovaná voda pH

1000 ml 7,0


pevné kultivační půdy mají složení tekutých médií s přídavkem zpevňovacího prostředku



agar     

zdroj: červené řasy rodu Gelidium (G. amansii), Gracilariae, Sphaerococcus euchema směs agarosy a agaropektinu agarosa: lineární polymer (1→3)-β-D-galaktopyranosyl-(1→4)-3,6anhydro-α-L-galaktopyranosy (mol. hmotnost 120 kDa) hysterese: bod tání 85 C, bod tuhnutí 32 – 40 C není ztekucován bakteriálními enzymy OH OH

O O OH

O

HO OH

O HO

Selektivní a selektivně-diagnostické půdy  

selektivní půdy mají složení a tedy i vlastnosti které podporují růst jedněch bakterií a brzdí růst jiných (inhibitor) selektivně-diagnostické půdy potlačují růst nežádoucí mikoflory, zároveň některé mikroorganismy budou měnit substrát (sacharidy, aminokyseliny)    

10 % NaCl (selektivní pro stafylokoky) žlučové soli (potlačení růstu G+ bakterií, McConkeyho půda) krystalová violeť (potlačení růstu G+ bakterií) fuchsin (potlačení růstu G+ bakterií, selekce salmonel a shigel, Endova půda)  teluričitan draselný K2TeO3 (potlačení růstu G- bakterií, Claubergova půda pro isolaci Corynebacterium diphteriae)  antibiotika 

kombinace selektivních médií a růstových podmínek (zvýšená teplota)

Selektivní a selektivně-diagnostická média 

chromogenní půdy obsahují chromogeny tj. běžné substráty s navázanou barevnou molekulou (chromoforem) nebo fluorogenní molekulou  bakterie absorbuje a rozštěpí substrát a chromofor se v bakterální buňce hromadí (kolonie získávají charakteristické zbarvení)  Rambachův agar (salmonely)  Chromocult coliform agar (koliformní bakterie) 

Citrobacter freundii (β-galactosidasa štěpí 6-chloro-3-indoxyl-β-D-galaktopyranosid

E. coli (β-galactosidasa štěpí 6-chloro-3-indoxyl-β-D-galaktopyranosid a β-D-glukuronidasa) štěpí 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukuronovou kyselinu)

Diagnostické půdy  

jsou určeny k průkazu některé vlastnosti mikroorganismů (důkaz přítomnosti určitého enzymu) živný základ (bujon, peptonová voda) + substrát (sacharidy, aminokyseliny, látky schopné tvořit snadno detekovatelné produkty H2S, indol)        

zkvašování cukrů (dulcitol, maltosa, melibiosa, myo-inositol, trehalosa, sacharosa) fenolová červeň, bromthymolová modř deaminace fenylalaninu (Proteus) dekarboxylace argininu, lysinu ornithinu bromkresolová červeň štěpení močoviny (Proteus, Morganella) fenolová červeň (CO2, NH3) tvorba acetoinu (Pseudomonas, Staphylococcus) utilisace citrátu (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) bromthymolová modř tolerance ke KCN (Citrobacter) test na pohyblivost

Obecné složení kultivačních médií Typ média

Základ

Inhibitor

Substrát

Indikátor

základní

+

-

-

-

selektivní

+

+

-

-

(+)

-

+

(+)

+

+

+

(+)

diagnostické selektivně diagnostické

základní půdy – peptonová voda (1% pepton); živný bujon (masový extrakt, pepton, NaCl); živný (masopeptonový) agar

Stanovení počtu mikroorganismů     

stanovení hladiny kontaminace surovin nebo finálních farmaceutických přípravků vyhodnocení účinosti antimikrobiálních látek, nebo dekontaminačních procesů při použití mikroorganismů ve výrobním procesu validace růstových médií výroba vakcín – celkový počet mikrobiálních buněk (živých i mrtvých)

Metody stanovení počtu mikroorganismů Tradiční metody Stanovení počtu živých buněk

Rychlé (nepřímé metody)

Stanovení celkového počtu buněk

zalévání do pevných půd

mikroskopické počítání buněk

aplikace epifluorescenčních barviv (akridinová oranž, živé buňky)

roztěr na povrchu pevných půd

turbidimetrické stanovení buněčné sušiny

měření produkce ATP (luciferin v přítomnosti ATP emituje světlo, luciferasa)

filtrační metoda stanovení počtu mikroorganismů

stanovení buněčné sušiny vážovou metodou

měření změn odporu, kapacitance nebo impedance

stanovení nejpravděpodobnějšího počtu ikroorganismů

stanovení koncentrace dusíku, proteinů, nukleových kyselin

manometrické metody (spotřeba O2, produkce CO2)

Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Počet positivních kultur

MPN

Liminty MPN

0,1 g

0,01 g

0,001 g

g-1

dolní

horní

0

0

0

<3

.

.

0

0

1

3

0,5

9

0

1

0

3

<0,5

13

1

0

0

4

<0,5

20

1

0

1

7

1

21

1

1

0

7

1

23

1

1

1

11

3

36

1

2

0

11

3

36

2

0

0

9

1

36

2

0

1

14

3

37

2

1

0

15

3

44

2

1

1

20

7

89

2

2

0

21

4

47

2

2

1

28

10

150

[…]

[…]

[…]

[…]

[…]

[…]
















Omezení tradičních metod stanovení počtu mikroorganismů 

relativně pracné metody



časově náročné



obtížná automatisace



značná spotřeba médií, laboratorního plastu, požadavky na prostor (inkubátory)
















Omezení rychlých metod stanovení počtu mikroorganismů 

nároky na nákladné přístrojové vybavení



malá adaptabilita metody na některé typy vzorků



detekční limit



metody poskytují vyšší hodnoty počtu mikroorganismů ve srovnání s tradičními technikami (metabolizující avšak nemnožící se buňky)

Význam jednotlivých skupin mikroorganismů ve farmaceutické mikrobiologii Mikroorganismus

Kontaminace & degradace

Viry Priony

Pathogen

Rezistence k antibiotikům

Rezistence k dez. prostředkům

Výroba farmaceutických přípravků

+ +

+

+

Gram-negativní

+

+

+

Gram-positivní

+

+

+

mykobakterie

+

+

Streptomyces

+

Rickettsie

+

Mycoplasma

+

Bakterie + + (spory)

+

+

Houby kvasinky

+

+

+

+

plísně

+

+

+

+

Protozoa

+

Úvod do farmaceutické mikrobiologie. Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Recommend Documents