Stanovení cytokinů v nitrooční tekutině pomocí multiplexové xMAP analýzy Sobotová M.1, Hecová L.1, Vrzalová J.2, Rusňák Š.1, Říčařová R.1, Topolčan O.2 1. Oční klinika FN a LF UK Plzeň přednosta: doc. MUDr. Říčařová Renata, CSc., FEBO 2. Oddělení nukleární medicíny, Imunoanalytická laboratoř, FN a LF UK Plzeň přednosta: prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc.
Stanovení cytokinů v nitrooční tekutině pomocí multiplexové xMAP analýzy • Studie č. I - pacienti s komplikacemi proliferativní diabetické retinopatie (PDR) • Studie č. II - pacienti s odchlípením sítnice s přítomnou proliferativní vitreoretinopatií (PVR)
Proliferativní diabetická retinopatie – studie č. I • Nejčastější příčinou slepoty pacientů v produktivním věku (oslepnou až 2% diabetiků) • Hlavním projevem – neovaskularizace sítnice a zrakového nervu
Proliferativní diabetická retinopatie • Hypoxie stimuluje tvorbu pro-angiogenních růstových faktorů a cytokinů • Novotvořené cévy jsou fragilní a nezajišťují dostatečné krevní zásobení sítnice • Komplikace PDR - krvácení do sklivce - trakční odchlípení sítnice - neovaskulární glaukom
Diagnostika a monitorace proliferativní diabetické retinopatie • Biomikroskopické vyšetření očního pozadí na štěrbinové lampě • Fluorescenční angiografie
Diagnostika a monitorace proliferativní diabetické retinopatie • Závažnost hypoxie sítnice - lze určit na základě koncentrací biomarkerů v nitrooční tekutině
Cíl studie č.I • Stanovení pro-angiogenních, anti-angiogenních, prozánětlivých a neurotropních faktorů v nitrooční tekutině pacientů v různých stádiích PDR pomocí multiplexové xMAP analýzy
Soubor pacientů - studie č.I • 62 očí 56 pacientů (33 mužů a 23 žen ve věku 2679 let) léčených pro komplikace PDR v letech 2007-2010 • 1. skupina: 41 očí 37 pacientů s PDR bez nutnosti opakované chirurgické intervence • 2. skupina: 11 očí 9 pacientů s recidivujícím krvácením do sklivce
Soubor pacientů - studie č.I • 3. skupina: 10 očí 10 pacientů s neovaskulárním glaukomem refrakterním na léčbu
• Kontrolní skupina (skupina 0): 50 očí 50 pacientů před operací senilní katarakty bez jiné oční patologie
Metodika - studie č. I • Aspirace 0,05ml nitrooční tekutiny z přední komory oka za aseptických kautel před plánovanou nitrooční operací pro komplikace PDR a před operací šedého zákalu
• Bezprostředně po odběru vzorek zmražen na - 70°C
xMAP Multiplexová analýza • Metoda kombinující průtokovou cytometrii a imunoanalýzu • Umožňuje stanovit až 96 analytů ve vzorcích o velmi malém objemu
Metodika - studie č. I • Pro-angiogenní cytokiny – Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), Epidermální růstový faktor (EGF), Fibroblast growth factor 2 (FGF 2), Platelet derived growth factor (PDGF) AA, PDGF AA / AB, Interleukin 8 (IL-8) • Anti-angiogenní cytokiny – y – interferon inducible protein (IP-10), Transforming growth factor beta (TGFβ)
Metodika - studie č. I • Prozánětlivé cytokiny – Interleukin 6 (IL-6), Monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), Tumor necrosis factor alpha (TNFa), RANTES
• Neurotropní cytokiny - Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
Výsledky - studie č.I • Výsledky – zpracovány pomocí KruskalWallis a Mann-Whitney testu • Hladina statistické významnosti p < 0,0001 • Hraniční hladina významnosti p = 0,05-0,0001
Výsledky - studie č.I Skupina 0
1
2
3
Median
5 - 95 P
Median
5 - 95 P
Median
5 - 95 P
Median
5 - 95 P
BDNF (pg/ml)
12.00
12.00 59.67
12.00
12.00 49.37
12.00
12.00 103.23
30.00
12.00 81.43
CNTF (pg/ml)
122.00
122.00 2667.92
393.19
122.00 1787.45
276.19
122.00 573.63
388.29
197.96 578.61
EGF (pg/ml)
24.88
13.893 115.99
36.22
14.02 133.31
96.47
4.23 120.42
37.48
3.95 114.20
IL-6 (pg/ml)
3.20
3.200 196.312
37.19
3.992 4577.38
25.22
3.37 299.13
384.74
22.63 9982.69
IL-8 (pg/ml)
3.20
3.20 - 15.49
25.28
13.21 184.62
27.96
13.84 53.67
33.76
20.04 96.37
IP-10 (pg/ml)
105.92
12.93 307.68
460.68
159.49 2237.28
365.35
150.90 758.61
874.06
463.94 1698.36
MCP-1 (pg/ml)
962.59
3.20 2931.63
2772.21
353.18 3249.45
2336.77
2020.39 2653.15
661.23
3.20 2881.94
PDGF AA (pg/ml)
111.26
5.85 212.85
227.96
104.57 756.34
208.36
151.58 344.62
192.66
79.91 316.61
TGF β1 (pg/ml)
49.00
49.00 49.00
49.00
49.00 220.41
49.00
49.00 84.71
414.40
119.85 955.58
VEGF (pg/ml)
69.85
16.00200.63
211.62
48.10 1990.98
187.96
4.28 523.25
352.82
132.847052.89
Výsledky studie č. I - skupina č. 1 vs. kontrolní skupina 0 Skupina
VEGF (pg/ml) PDGF AA (pg/ml) IL-8 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) IL-6 (pg/ml)
Statistická významnost p < 0.0001
0 Median
1 Median
Mann-Whitney test
69.85
211.62
p <0.0001
111.26
227.96
p <0.0001
3.20
25.28
p <0.0001
105.92
460.68
p <0.0001
3.20
37.19
p <0.0001
Výsledky studie č. I- skupina č. 1 vs. kontrolní skupina 0
Výsledky studie č. I – skupina č. 3 vs. skupina č.1 Statistická významnost p <0.0001
Skupina
Mann-Whitney test
1
3
Median
Median
IL-6 (pg/ml)
37.19
384.74
p = 0.0096
TGF β1 (pg/ml)
49.00
414.40
p = 0.0017
VEGF (pg/ml)
211.62
352.82
p = 0.0454
Výsledky studie č. I • Mezi skupinou č. 1 a skupinou č. 2 nebyly zaznamenány statisticky signifikantní rozdíly • V jednotlivých skupinách nebyly zaznamenány signifikantní rozdíly v koncentracích BDNF, CNTF, EGF, MCP-1 • Koncentrace PDGF AA/AB, FGF-2, IL-10, TNF α a RANTES byly ve všech skupinách pod limitem detekovatelnosti
Souhrn - studie č. I •
U pacientů s PDR byla prokázána vyšší koncentrace pro-angiogenních, antiangiogenních a prozánětlivých biomarkerů oproti kontrolní skupině (IL-6, IL-8, IP-10, PDGF AA, VEGF, TGF β1)
Souhrn studie č. I • U pacientů s refrakterním neovaskulárním glaukomem byla prokázána vyšší koncentrace IL-6, VEGF a TGF β1 v porovnání s ostatními pacienty s PDR • Lze předpokládat, že koncentrace těchto 3 faktorů koreluje se závažností PDR
Odchlípení sítnice s proliferativní vitreoretinopatií – studie č. II • Defektem v sítnici proniká tekutina, která způsobí elevaci sítnice • Léčba – pouze chirurgická, pokud není včas zahájena, dojde k trvalé ztrátě zraku
Odchlípení sítnice s proliferativní vitreoretinopatií • Proliferativní vitreoretinopatie - proliferací gliálních buněk nebo buněk retinálního pigmentového epitelu dochází na povrchu sítnice k tvorbě membrán, které kontrahují sítnici
Proliferativní vitreoretinopatie • Je hlavní příčinou neúspěchu operace odchlípené sítnice • Může být přítomna před oční operací či vzniknout po operaci • Předpokládá se, že přítomnost a aktivita PVR u odchlípené sítnice je ovlivněna koncentrací prozánětlivých cytokinů a růstových faktorů
Cíl studie č. II • Stanovení pro-angiogenních, anti-angiogenních, prozánětlivých a neurotropních faktorů v nitrooční tekutině pacientů s odchlípenou sítnicí s různým stupněm závažnosti proliferativní vitreoretinopatie pomocí multiplexové xMAP analýzy
Soubor pacientů - studie č. II • Skupina č. 1 (celkový soubor) - 27 očí 26 pacientů s odchlípením sítnice operovaných v letech 2008-2010
• Skupina č. 2 - 12 očí s odchlípením sítnice s proliferativní vitreoretinopatií stádia C a D
Soubor pacientů - studie č. II • Skupina č. 3 – 15 očí s odchlípením sítnice s proliferativní vitreoretinopatií nižšího stádia (A,B) • Kontrolní skupina – 31 očí 31 pacientů před operací šedého zákalu
Metodika - studie č. II • Aspirace 0,05ml nitrooční tekutiny z přední komory oka za aseptických kautel před nitrooční operací odchlípené sítnice a před operací šedého zákalu • Bezprostředně po odběru vzorek zmražen na - 70°C • Vzorky byly zpracovány xMAP multiplexovou analýzou
Metodika - studie č. II • Analyzované faktory: - VEGF, EGF, FGF 2, PDGF AA, IL-8, IP-10, TGF β1, IL-6, MCP-1, CNTF, BDNF, IL-10
Výsledky - studie č. II • Výsledky – zpracovány pomocí KruskalWallis a Wilcoxonova testu • Hladina statistické významnosti p < 0,05
Výsledky - studie č. II Cytokin
EGF EGF FGF2 FGF2 IL-6 IL-6 IL-8 IL-8 IL-10 IL-10 IP-10 IP-10 MCP-1 MCP-1 PDGF AA PDGF AA VEGF VEGF BDNF BDNF CNTF CNTF TGF B1 TGF B1
Kontrolní neparametrická ANOVA Skupina č.1 Skupina č.2 Skupina č.3 skupina (0) (p faktor) x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
0,0021 0,4139 0,0006 0,2321 0,0001 0,6657 0,0001 0,5471 0,3041 0,3063 0,0001 0,1142 0,0001 0,7905 0,3526 1,0000 0,1453 0,0151 0,2019 0,6775 0,0314 0,4818 0,0085 0,6908
Výsledky - studie č. II
Kontrolní skupina
Skupina č. 2
Skupina č. 3
Souhrn - studie č. II • U pacientů s PVR byla prokázána signifikantně vyšší koncentrace MCP-1, IP-10, IL-8, IL-6, FGF 2, EGF, TGF β1 a CNTF oproti kontrolní skupině • Statisticky byla prokázána závislost výše uvedených faktorů i na věku pacienta, pouze hladina MCP-1 byla na věku nezávislá. Lze předpokládat, že právě tento faktor je vhodný ke stanovení rizika rozvoje PVR
Souhrn - studie č. II • Mezi pacienty s PVR a kotnrolní skupinou nebyl zjištěn signifikantní rozdíl v koncentracích IL-10, PDGF AA, BDNF
• U pacientů s PVR vyššího stádia je signifikantně vyšší pouze koncentrace VEGF v porovnání s pacienty s PVR nižšího stádia
Závěr • Stanovení koncentrace biomarkerů v nitrooční tekutině je významné pro management léčby některých očních onemocnění - umožňuje lepší stratifikaci pacientů a tím vhodnější načasování terapie i volbu terapeutického postupu
Závěr • Stanovení koncentrace nitroočních cytokinů umožňuje efektivnější monitoraci průběhu onemocnění pacientů s PDR
• Multiplexová analýza se jeví jako vhodná metoda ke stanovení koncentrací velkého množství analytů ve vzorku o velmi malém objemu (10-50ul)
Děkuji za pozornost
