SLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO2 V CHLOROPLASTU
Nikola Burianová Experimentální biologie 2.ročník navazujícího studia Katedra Fyziky Ostravská univerzita v Ostravě
OBSAH Rubisco Tok CO2 do chloroplastu Obsah Rubisco a [CO2] Metody studia obsahu a aktivity enzymu Rubisco SDS-PAGE Spektrofotometrické stanovení aktivity Gazometrie
RUBISCO
Enzym ribulóza -1,5- bisfosfát karboxyláza/oxygenáza Až 50% všech rostlinných proteinů 2 funkce -karboxylační(CO2) -oxygenační(O2) Společná akceptorová molekula = ribulóza - 1,5 – bisfosfát Karboxylázová aktivita = Calvinův cyklus Oxygenázová aktivita = Obrázek č.1: Struktura enzymu Rubisco (dostupné z fotorespirace
http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/038/)
FOTORESPIRACE
Oxygenátová aktivita enzymu Rubisco Vznik 1molekuly 3 - fosfoglycarátu a 1 molekuly fosfoglykolátu Fosfoglykolát vstupuje do procesu fotorespirace Probíhá na třech místech: peroxyzomy, mitochondrie a chloroplasty = snížení účinnosti fotosyntetické fixace CO2 Významný je poměr koncentrací CO2 a O2 v chloroplastu Obrázek č.2: Fotorespirace (dostupné z http://www.tutorvista.com/content/biology/bio Chrání rostlinu před fotoinhibičním logy-iv/photosynthesis/photorespiration.php#) poškozením
TOK CO2 DO CHLOROPLASTU
Koncentrace CO2 v atmosféře 380ppm. Difúzní cesta oxidu uhličitého = Ca , Cs, Ci, Cias, Cc Koncentrace CO2 se na jednotlivých úrovních postupně snižuje Koncentrace O2 je všude stejná
400 300 [CO2]
Koncentrace CO2 na jednotlivých úrovních difúzní cesty z okolní atmosféry do chloroplastu
200 100 0 Ca
Obrázek č. 3: Tok CO2 z atmosféry do chloroplastu (převzato od J. Flexas et al., 2008)
Cs
Ci
Cias
Cc
Snižování koncentrace oxidu uhličitého je dáno řadou odporů v jednotlivých částech listu (hraniční vrstva, průduchy, mezibuněčné prostory, mezofyl) Opakem odporu je vodivost g=1/r gm = mezofylová vodivost
OBSAH RUBISCO A [CO2]
Rubisco x [CO2] Množství Rubisca u stinných a slunných listů se liší. Slunné listy mají větší množství tohoto enzymu.
AN = gm(Ci – Cc)
Cc = Ci – AN/gm Obrázek č.4: Vztah mezi obsahem enzymu Rubisco na plochu chloroplastů a koncentrací oxidu uhličitého v chloroplastech (převzato a upraveno od I. Terashima et al., 2011)
CÍL PRÁCE Množství a aktivita klíčového enzymu fotosyntézy musí být optimalizována na danou koncentraci CO2 v chloroplastu z důvodu maximálního využití energie generované v rámci primárních fotochemických reakcí.
METODY STUDIA OBSAHU A AKTIVITY ENZYMU RUBISCO Spektrofotometrické stanovení SDS-PAGE – stanovení obsahu
Gazometrie
aktivity
SDS-PAGE Nejefektivnější a nejužívanější metoda pro dělení makromolekul Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu = elektromigrační metoda Nosič – gel (koopolymerace dvou monomerů akrylamidu a N,N´-methylen-bis(akrylamidu) za účasti peroxodisíranu amonného) Stabilizátor volných radikálů - N,N,N´,N´tetramethylethylendiamin (TEMED)
SDS-PAGE
V našem případě se jedná o elektroforézu s přídavkem SDS=dodecyl sulfát sodný Váže se na bílkoviny v určitém poměru a udává jim záporný náboj Bílkoviny jsou separovány pouze na základě jejich molekulové hmotnosti Diskontinuální elektroforéza = zaostřovací a separační gel Zaostřovací gel – zkoncentrování bílkovin do tenké lajny Separační gel – samotná separace bílkovin
Obrázek č.5: Schéma SDS-PAGE (dostupné z http://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/b Course_Information/4581/techniques/gel_ elect/page_protein.html)
VYHODNOCENÍ SDS-PAGE Elektroforéza probíhá při 80V cca 1h 45min Po ukončení elektroforézy je třeba bílkoviny zviditelnit Gel postupně vkládáme do: - stabilizační roztok (5min) - barvící roztok (30min) - odbarvovací roztok
OBSAH ENZYMU RUBISCO 25
Obsah Rubisco [mg * g-1]
20
15
10
5
0 1
2
3
4
Line
5
6
7
KALIBRACE METODY
100
Obsah Rubisco [mg * g-1]
R2 = 9.9119
R2 = 9.934
R2 = 9.886 80
60
40
20
0 0
20
40
60
Ředění [%]
80
0 100
20
40
60
Ředění [%]
80
0 100
20
40
60
Ředění [%]
80
100
OBSAH RUBISCA U VÍCE A MÉNĚ OZÁŘENÝCH LISTŮ
AKTIVITA RUBISCO
ribosa-5-fosfát …............(ribosa -5fosfátisomerasa) ………ribulosa-5-fosfát (I)
ribulosa-5-fosfát + ATP ……………(ribulosa -5fosfátkinasa) ……….ribulosa-1,5-bisfosfát + ADP + H+ (II)
ribulosa-1,5-bisfosfát + CO2 + H2O ……. (Rubisco)…….. 2(3-fosfoglycerát) + 2H+ (III)
3-fosfoglycerát + ATP ……………(fosfoglyce rátkinasa)…….. 1,3-bisfosfoglycerát + ADP (IV)
1,3-bisfosfoglycerát + NADH + H+ ……………….(glyceralde hyd-3fosfátdehydrogenasa )…………glyceraldehyd-3fosfát + NAD+ + HPO4 (V)
2-fosfokreatin + 2 ADP ………. (kreatinfos forkinasa )………….2-kreatin + 2 ATP (VI)
Založeno na spřažení prvních tří reakcí Calvinova cyklu Jako substrát byla použita ribosa-5-fosfát, která se v reakční směsi transformuje na ribulosa-1,5-bisfosfát enzymy obsaženými v extraktu (rovnice I a II) Do reakční směsi byly přidány enzymy, které katalyzují reakce (III – V), NADH a ATP Konečným produktem reakce je glyceraldehyd-3-fosfát (reakce III-V) Aby se zabránilo hromadění ADP je ,který inhibuje enzym fosfoglycerátkinázu, je ATP fosforylováno v reakci (VI) Aktivita Rubisca byla stanovena z úbytku absorbance při oxidaci NADH
SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMU RUBISCO
Změna absorbance při oxidaci NADH při 340nm, kdy dochází k oxidaci NADH na NAD+ Měříme rychlost oxidace NADH
Obrázek č. 6: Oxidace NADH na NAD sledováno poklesem absorbance (dostupné z http://www.wikiskripta.eu/index.php/Spektr ofotometrie)
GAZOMETRIE Měření asimilace CO2 Změna koncentrace CO2 v okolní atmosféře listu pomocí IRGA AN = gm(Ci – Cc) --------> Cc = Ci – AN/gm
GAZOMETRIE AN = F *(cI − co)/S E = F (wo − wI )/S ci = ca − (1.6AN/gsw)
Výsledkem jsou A/Ci křivky
gsw = E/(w sTl− wO)
METODA VARIABILNÍHO ELEKTRONOVÉHO TRANSPORTU AN = gm(Ci – Cc)
-------->
Cc = Ci – AN/gm
Závisí na základním vztahu mezi rychlostí fotosyntetického elektronového transportu(fluorescence), rychlostí asimilace CO2 a koncentrací CO2 v místě karboxylace (gazometrie). 4e/ CO2
NÁVRH EXPERIMENTU Mezidruhové změny Adaptace struktury listu na různou ozářenost Rostliny: - řepeň durkoman - špenát - fazol - slunečnice - paprika nebo tabák
DĚKUJI ZA POZORNOST
