SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

KANDUNGAN GLIKOSIDA JANTUNG DAN PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) DALAM MEDIA TUMBUH MURASHIGE - SKOOG

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Melissa Wijaya NIM : 038114112

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007


ii


iii


The fear of the LORD is the beginning of knowledge, But fools despise wisdom and instruction. ( Proverbs 1 : 7 ) Trust in the LORD with all your heart, And lean not on your own understanding. In all your ways acknowledge HIM, And He shall direct your paths. ( Proverbs 3 : 5‐6 )

I can do all things through Christ who strengthens me. ( Philippians 4: 13 )

I dedicated this masterpiece to : My Savior Jesus Christ My beloved Dad and Mom My Brother Samuel My Benny Bear My Almamater

iv


PRAKATA Puji syukur kehadirat Allah Bapa di surga, atas limpahan berkat dan kasih-Nya yang tak terhingga, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) Dalam Media Tumbuh Murashige-Skoog”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Skripsi ini dapat terselesaikan karena bantuan, bimbingan, saran, dukungan, cinta dan doa yang tulus dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1. Kedua orang tua penulis, Kusnadi Widjaja dan Tuti Setiawati, dan kakak penulis, Samuel Wijaya, terima kasih atas doa, cinta, kasih sayang dan pengorbanannya. 2. Rita Suhadi M, Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Ign.Y. Kristio Budiasmoro, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah berkenan membimbing, mengarahkan dan memberikan saran kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. 4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk menguji dan memberi saran dalam skripsi ini. 5. Christine Patramurti, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk menguji dan memberikan saran dalam skripsi ini.

v


6. Benny Sugientoro, S.Farm., buat cinta, dukungan, doa, perhatian, semangat dan kasih sayangnya. 7. Mas Sigit, Mas Wagiran, Mas Andri dan Pak Mukmin yang banyak membantu penulis selama bekerja di laboratorium. 8. Mbak Christin, Mbak Mina, Mbak Vero, Mas Didit, Donny, Ko Vekeh, Pak Eko dan Ci Vivien, terima kasih atas semua doa, dukungan dan bantuannya. 9. Teman-teman angkatan 2003 teristimewa kelas C, terima kasih buat kasih persahabatan dan kebersamaannya selama ini. 10. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah mendukung dalam penyusunan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih ada kekurangan yang harus diperbaiki, oleh karena itu saran dan kritik yang bersifat membangun sangat diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak

Yogyakarta, Februari 2007

Penulis

vi


vii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ..................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN.....................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN..................................................................

iv

PRAKATA .................................................................................................

v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA......................................................

vii

DAFTAR ISI ..............................................................................................

viii

DAFTAR TABEL ......................................................................................

xii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................

xiii

DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................

xiv

INTISARI...................................................................................................

xv

ABSTRACT ..................................................................................................

xvi

BAB I PENGANTAR ................................................................................

1

A. Latar Belakang ..............................................................................

1

1. Rumusan Permasalahan ..........................................................

2

2. Keaslian Penelitian ..................................................................

3

3. Manfaat Penelitian ..................................................................

3

B. Tujuan Penelitian ............................................................................

4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................

5

A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang ..................................................

5

viii


B.

Kultur Jaringan Tanaman .............................................................

5

1. Eksplan ......................................................................................

7

2. Media.........................................................................................

9

3. Lingkungan................................................................................

21

C. Glikosida Jantung............................................................................

23

D. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................

25

E. Landasan Teori ...............................................................................

28

F. Hipotesis..........................................................................................

29

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ...................................................

30

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................

30

B. Definisi Operasional .......................................................................

30

C. Alat dan Bahan Penelitian ...............................................................

31

1. Alat penelitian ...........................................................................

31

2. Bahan Penelitian........................................................................

33

D. Tata Cara Penelitian .......................................................................

35

1. Determinasi tanaman .................................................................

35

2. Pembuatan stok ..........................................................................

35

3. Pembuatan media.......................................................................

37

4. Sterilisasi alat dan ruangan ........................................................

38

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan ...........................................

38

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus ...............................................

39

7. Subkultur....................................................................................

39

8. Pemanenan .................................................................................

40

ix


9. Analisis pertumbuhan kalus.......................................................

41

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang .......

43

11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang ........................

43

12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang..................................

44

13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman asalnya. .........................................................................

44

E. Analisis Hasil .................................................................................

44

1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus ...............

45

2. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya .............................................................................

45

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................

47

A. Determinasi Tanaman .....................................................................

47

B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman..............................

47

C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus ......................................

50

D. Subkultur dan Panen........................................................................

52

E. Profil Pertumbuhan Kalus ...............................................................

54

1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. ..............

54

2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari. ................

58

F. Persen Kadar Air Kalus...................................................................

58

G. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................

60

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................

64

x


A. Kesimpulan .....................................................................................

64

B. Saran ...............................................................................................

64

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

65

LAMPIRAN ...............................................................................................

68

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

82

xi


DAFTAR TABEL I.

Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang.........................

II

Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v ) ......................

xii

51

61


DAFTAR GAMBAR 1.

Strukur glikosida jantung..................................................................

24

2.

Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun ...................................

49

3.

Inisiasi kalus daun kamboja jepang ..................................................

52

4.

Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah..............................................................................

56

5.

Persen kadar air kalus daun kamboja jepang ....................................

59

6.

Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat (97 %) ..

61

7.

Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde......................

62

8.

Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) ..............................................................................

69

9.

Foto daun kamboja jepang ................................................................

69

10.

Foto kalus siap subkultur ..................................................................

70

11.

Foto kalus siap panen........................................................................

70

12.

Foto kalus basah................................................................................

70

13.

Foto kalus kering...............................................................................

70

14.

Foto serbuk kalus ..............................................................................

70

15.

Foto hasil KLT secara visual ............................................................

71

16.

Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% ) ...........

72

17.

Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde ................................

73

xiii


DAFTAR LAMPIRAN 1.

Surat Determinasi Tumbuhan ..............................................................

68

2.

Foto-foto Hasil Penelitian ....................................................................

69

3.

Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ) ...........................

74

4.

Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam media tumbuh MS ................................................................................

5.

Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah ...........................................................................................

6.

7.

76

77

Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering ..........................................................................................

79

Data persen kadar air kalus kamboja jepang........................................

81

xiv


INTISARI Tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) selama ini biasanya digunakan sebagai tanaman hias. Penggunaan kultur jaringan untuk menghasilkan metabolit sekunder dari tanaman bertujuan untuk membuktikan bahwa jaringan dapat menggantikan tanaman asal secara fungsional, termasuk menghasilkan metabolit sekunder. Dalam penelitian ini, metabolit sekunder yang diteliti yaitu glikosida jantung dari kalus daun kamboja jepang. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang pertumbuhan in vitro kalus daun tanaman kamboja jepang dengan cara mengukur waktu inisiasi kalus dan profil pertumbuhan kalus serta membandingkan kandungan kimia kalus dengan tanaman asal. Eksplan untuk menghasilkan kalus didapat dari jaringan daun kamboja jepang yang ditanam secara in vitro pada media tumbuh MS (Murashige-Skoog) dengan penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4Diklorofenoksiasetat (analog auksin). Kalus kemudian diekstrak dengan campuran kloroform-metanol (1 : 10 v/v) Analisis profil pertumbuhan kalus dilakukan berdasarkan bobot kalus basah dan bobot kalus kering. Uji KLT dilakukan dengan membandingkan harga Rf bercak-bercak hasil pengembangan ekstrak kalus daun kamboja jepang dengan ekstrak daun kamboja jepang dalam fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat : metanol : aquadest ( 81 :11 : 8 v/v ) dengan jarak pengembangan 10 cm. Deteksi yang digunakan yaitu sinar UV 254 dan 365 nm, serta pereaksi Kedde dan pereaksi asam sulfat berdasarkan acuan (Wagner,1984). Dari hasil penelitian, diketahui bahwa waktu inisiasi kalus adalah 10,3 hari. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang mengikuti pola pertumbuhan sigmoid fase lag, fase eksponensial dan fase stasioner. Hasil KLT yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Kata kunci : Adenium obesum , kalus, glikosida jantung.

xv


ABSTRACT Kamboja jepang ( Adenium obesum ( Forssk.) Roem & Schult.) during the time is usually used as decorative plant. Usage of tissue culture to provide secunder metabolit from plant aim to prove that the tissue can act as a complete plant system functionally, including provide secunder metabolit. The experiment’s secunder metabolite is cardiac glycoside from callus of kamboja jepang leaf. The purpose of this experiment is to get information of growth callus kamboja jepang by in vitro by measuring callus initiation time and profile of callus growth and also compare chemical content of callus with the whole plant leaf. Explan to yield callus got from kamboja jepang leaf planted by in vitro at media growth MS ( Murashige-Skoog) with addition regulator of growth 2,4Dichlorophenoksiacetate (an auxin analogue). Then, callus be extracted with mixture of chloroform-methanol ( 1 : 10 v / v). Analysis of growth profile of callus based on wet callus weight and dry callus weight. Test of KLT be done by comparing Rf value of KLT spots of extract callus and the whole plant leaf at silica gel GF254 as stationary phase, ethyl acetate: methanol : aquadest ( 81 : 11 : 8 v / v ) as mobile phase with distance of elution is 10 cm. The detection include UV 254 and 365 light, and Kedde reagent and sulphate acid reagent according to Wagner (1984). From the result of experiment, it be known that callus initiation time is 10,3 days. Callus growth profile follow sigmoid pattern which consist of lag phase, exponensial phase and stasioner phase. From the result of TLC indicate that extract of callus kamboja jepang leaf which conducting by in vitro do not contain cardiac glycoside like its herbs. Keywords: Adenium obesum , callus, cardiac glycoside.

xvi


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) selama ini lebih dikenal sebagai tanaman hias ( Soenanto, 2005). Pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-Dthevetoside, neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe, 1990 ). Ekstrak dari daun tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung yang memiliki efek sitotoksik yang berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura et.al., 2000). Ekstrak akar dan kulit batang dari kamboja jepang juga berpotensi sebagai agen terapeutik untuk pengobatan trypanosomiasis ( Atawodi, et al., 2003; Freiburghaus et al., 1996). Ekstrak

kulit batang kamboja jepang juga

berpotensi sebagai acaricidal ( Mgbojikwe dan Okoye, 2001). Di dalam pencarian metode produksi metabolit sekunder dari tumbuhan berkhasiat obat, pendekatan bioteknologi, khususnya kultur jaringan, berpotensi sebagai alternatif di dalam produksi metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk skala industri ( Ramachandra dan Ravishankar, 2002). Kultur jaringan tanaman merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan menggunakan potongan kecil jaringan atau sel atau organ, yang dipelihara dalam suatu medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik. Organ, jaringan dan sel tanaman yang ditumbuhkan tersebut disebut eksplan ( Katuuk, 1989 ). 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena daun lebih mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan memiliki jaringan parenkim yang akan berdediferensiasi serta mudah untuk disterilisasi. Eksplan yang telah ditumbuhkan dalam media dapat membentuk kalus yaitu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ). Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil organ, jaringan atau sel tersebut dilakukan berdasarkan teori totipotensi sel yaitu : setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang utuh, jika kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ). Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Murashige-Skoog (MS) karena menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) media tersebut cocok sebagai media kultur untuk membudidayakan tanaman hias. Penelitian ini bertujuan untuk mengkulturkan tanaman kamboja jepang dari bagian daun serta mengidentifikasi metabolit sekunder glikosida jantung yang dihasilkan oleh kalus yang dibentuk dari hasil budidaya in vitro. Kultur kalus yang dihasilkan oleh teknik kultur jaringan ini diharapkan memiliki profil pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan kandungan glikosida jantung yang optimum. 1. Rumusan Permasalahan Berdasarkan latar belakang yang telah disebutkan di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:


a. Apakah eksplan yang berasal dari daun kamboja jepang dapat menghasilkan kalus jika dikembangkan secara in vitro dalam media Murashige-Skoog ( MS ) ? b. Bagaimana pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang yang dikulturkan? c. Apakah kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya ? 2. Keaslian Penelitian Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang kandungan glikosida jantung dan profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) dalam media tumbuh MS belum pernah diteliti. 3. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan memiliki beberapa manfaat antara lain: a. Manfaat Teoritis Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam mengembangkan bidang ilmu kefarmasian, khususnya dalam mengeksplorasi kandungan glikosida jantung dari tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) yang ditumbuhkan secara in vitro. b. Manfaat Praktis Penelitian ini juga diharapkan dapat membantu para peneliti selanjutnya untuk mempelajari secara lebih mendalam mengenai kultur jaringan tanaman sehingga mempermudah dalam produksi metabolit sekundernya.


B. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah : a. Menumbuhkan kalus dari eksplan daun kamboja jepang. b. Mengetahui pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang. c. Membuktikan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang Kamboja jepang dengan nama spesies Adenium obesum (Forssk) Roem & Schult berasal dari famili Apocynaceae dan memiliki nama sinonim yaitu Plumeria rubra L.cv. acutifolia.( Anonim, 2006 ). Secara morfologis tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) memiliki akar yang mampu membesar seperti umbi dan diselimuti oleh rambut-rambut akar yang sangat banyak; berbatang lunak dan tidak berkayu; daunnya berbentuk lanset dengan ujung membulat, tebal dan berserat, berwarna hijau, tampak mengkilap dan licin; bunganya berwarna merah muda sampai merah tua, memiliki 5 helai mahkota bunga yang bagian tengahnya berwarna putih; buahnya tumbuh secara berpasangan, terletak di ujung tunas, berbentuk pipih panjang, berwarna hijau waktu masih muda dan kemudian berangsur-angsur berubah menjadi cokelat; bijinya berada dalam buah, berwarna cokelat. Tanaman ini dapat tumbuh hingga dua meter ( Soenanto, 2005). Tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside, neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe, 1990 ).

B. Kultur Jaringan Tanaman Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel cultuur atau Gewebe kultur. Kultur artinya budidaya dan jaringan artinya 5


sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Maka kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat yang sama dengan induknya ( Dixon, 1985). Kultur jaringan in vitro (mikropopagasi) adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan potongan kecil jaringan atau sel yang dipelihara dalam satu medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik ( Katuuk, 1989). Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil jaringan atau organ muncul dari pendapat bahwa tanaman tinggi terdiri dari sekumpulan sel. Sel-sel yang sama membentuk jaringan yang melakukan tugas tertentu pada setiap organ dalam tubuh tanaman. Sel-sel ini mempunyai kemampuan untuk melakukan seluruh proses hidup. Kemampuan sel ini disebut “totipotency” ( Katuuk, 1989). Teori totipotensi sel dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden pada tahun 1838. Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang utuh, jika kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ). Kultur jaringan dalam skala besar ditemukan sebagai pendekatan alternatif yang menarik terhadap metode penanaman tradisional dimana kultur jaringan dapat menyediakan metabolit-metabolit sekunder yang terkontrol ( Sajc et al., 2000 ). Keuntungan dari sistem kultur jaringan ini sebagai berikut: a. Kandungan–kandungan zat yang berguna dapat diproduksi di bawah kondisi yang terkontrol, terbebas dari perubahan iklim dan keadaan tanah.


b. Hasil kultur akan terbebas dari mikroba dan serangga. c. Sel-sel kebanyakan tumbuhan mudah untuk berkembangbiak dalam menghasilkan metabolit-metabolit yang spesifik. d. Kontrol automatis dari pertumbuhan sel dan proses pengaturan metabolit yang rasional dalam bioreaktor akan mengurangi

biaya tenaga kerja dan

meningkatkan produktivitas. e. Substansi organik dapat diekstrak dari kultur kalus. ( Dicosmo dan Misawa, 1995 ). Faktor-faktor yang menentukan keberhasilan dalam kultur jaringan tanaman antara lain: 1. Eksplan Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan. Berhasil tidaknya pengkulturan eksplan tergantung pada faktor yang dimiliki oleh eksplan itu sendiri. Faktor-faktor itu meliputi: a. Ukuran eksplan. Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian tanaman yang dikerat masih mengandung suplai makanan serta hormon untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Ukuran eksplan yang paling baik adalah 0,5 sampai 1,0 cm, namun ukuran ini dapat


bervariasi, tergantung pada material tanaman yang dipakai serta jenis tanaman ( Katuuk, 1989). b.Umur eksplan. Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis. Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada bagian meristematik. Dari semua jenis tanaman bagian inilah yang paling banyak berhasil. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk beregenerasi tetap ada, sedangkan sel-sel tua, kesanggupan untuk beregenarasi sudah berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik yang berkurang, jaringan yang sudah tua ada kemungkinan sudah mengandung banyak patogen ( Katuuk, 1989 ). c. Sumber eksplan. Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman yang sehat, yang bertumbuh baik / normal. Pengaruh perubahan suhu, cahaya, musim serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk berkecukupan zat hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon tumbuh. Pendek kata pertumbuhannya harus optimum ( Katuuk, 1989 ). d.Genotip eksplan. Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat


pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro (Katuuk, 1989 ). 2. Media Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Murashige dan Skoog mempublikasikan formulasi media MS (singkatan dari Murashige dan Skoog) yang sampai sekarang terbukti cocok untuk kultur jaringan banyak tanaman dan banyak digunakan di laboratorium kultur jaringan di seluruh dunia ( Yusnita, 2003 ). Komponen media kultur yang digunakan dalam kultur jaringan adalah sebagai berikut : a. Air. Air memegang peranan penting dalam proses kultur jaringan karena 95% dari media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan dalam media serta dalam seluruh proses kultur jaringan adalah air suling. Hal ini karena di dalam air ledeng atau air sumur terlarut sejumlah kontaminan yang dapat merusak proses perkembangan kultur eksplan. Kontaminan yang dimaksud adalah substansi atau mikroorganisme yang mengganggu kultur. Air suling


disimpan dalam kondisi steril dengan tidak memberi peluang pada bakteri untuk hidup dan berkembang ( Katuuk, 1991 ). b. Garam anorganik. Beberapa garam anorganik yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah takaran yang banyak dikenal sebagai unsur makro. Unsur makro adalah unsur yang dibutuhkan dalam jumlah yang besar. Jenis-jenis yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Sulfur (S), Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg). Unsur NPK adalah unsur yang mutlak dibutuhkan oleh tanaman, yang berarti harus selalu tersedia sedangkan unsur S,Ca, dan Mg boleh ada dan boleh tidak. Namun, karena fungsinya sangat mendukung pertumbuhan jaringan maka akan lebih baik apabila unsur-unsur tersebut juga tersedia ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Adapun kegunaan dari unsur makro tersebut adalah unsur N dipergunakan terutama untuk pertumbuhan vegetatif tanaman dan juga berperan di dalam pembentukan hijau daun yang mana berguna untuk proses fotosintesis dalam menghasilkan karbohidrat; unsur P dibutuhkan tanaman untuk pembentukan karbohidrat; unsur K berfungsi berguna untuk pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat; unsur S berperanan untuk pembentukan beberapa jenis protein seperti asam amino dan vitamin B1; unsur Ca bertugas merangsang pembentukan bulu-bulu akar dan bersama-sama dengan Mg akan memproduksi cadangan makanan sedangkan unsur Mg dapat


meningkatkan kandungan fosfat yang berguna untuk pembentukan sejumlah protein ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Selain unsur makro, ada pula unsur mikro, yaitu unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah sedikit namun harus tersedia. Unsurunsur tersebut adalah Besi(Fe), Mangan(Mn), Boron (B), Seng (Zn), Cobalt (Co), Tembaga(Cu), dan Molibdenum (Mo) ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Kegunaan dari unsur mikro tersebut adalah unsur Fe berfungsi dalam pembentukan hijau daun (chlorophyl); unsur Mn berguna untuk pemebentukan membran kloroplas; unsur B memegang peran penting dalam perombakan gula; unsur Zn berperan dalam pembentukan protoplas; unsur Co berguna untuk mengikat N dan untuk pembentukan asam inti; unsur Cu berperan dalam konversi energi; unsur Mo berperan dalam pembentukan klorofil ( Katuuk, 1989 ). Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H20, MgSO4.7H2O dan KH2PO4. Sedangkan unsur-unsur mikro biasa diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMo4.2H2O, CuSO4.5H2O dan CoCl2.6H2O ( Hendaryono dan Wijayani, 1994). c. Sumber karbon dan energi. Media kultur jaringan memerlukan bahan sebagai sumber tenaga. Biasanya yang merupakan sumber tenaga adalah bahan kimia organik yang mengandung karbon. Karbohidrat adalah kimia karbon yang meliputi gula,


pati, dan selulosa. Karbohidrat memiliki 2 fungsi utama yaitu sebagai sumber energi untuk jaringan dan untuk menjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial minimum dalam media. Ada banyak jenis karbohidrat yang dipakai dalam kultur jaringan namun yang paling banyak digunakan adalah sukrosa atau D-glukosa ( Katuuk, 1989). d. Myo-inositol, Vitamin dan asam amino. Penambahan myo-inositol pada media bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myo-inositol diberikan bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus ( Hendaryono dan Wijayani, 1994). Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan antara lain adalah Tiamin (vitamin B1), Piridoksin (vitamin B6), dan asam nikotinat. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat. Asam nikotinat juga penting dalam reaksi-reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Sedangkan fungsi dari vitamin B6 adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia dalam proses metabolisme ( Katuuk, 1989 ).


Asam-asam amino

berperanan penting untuk pertumbuhan dan

diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbedabeda. Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena dapat menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asamasam amino baru dalam jaringan ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). e. Hormon dan zat pengatur tumbuh. Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur jaringan adalah mutlak karena budidaya kultur jaringan adalah budidaya terkendali. Proses tumbuh dan berkembangnya eksplan dapat disesuaikan dengan harapan, menjadi kalus saja, organogenesis ataupun embryogenesis. Pengaturan ini dapat dilakukan dengan mengatur macam dan konsentrasi zat pengatur tumbuh sehingga menghasilkan kombinasi yang tepat sesuai dengan harapan. Macam hormon dan zat pengatur tumbuh yang sudah dikenal hingga saat ini adalah sebagai berikut : 1) Auksin Auksin pertama kali ditemukan oleh Went, dan diketahui sebagai asam indolasetat (IAA). Selanjutnya, nama auksin digunakan untuk nama kelompok hormon dan zat pengatur tumbuh yang menimbulkan respons khas IAA. Tumbuhan mengandung tiga senyawa lain yang mirip dengan IAA baik struktur maupun respon yang diakibatkannya, yaitu : asam 4-kloroindolasetat (4kloroIAA), asam fenilasetat (PAA), dan asam indolbutirat (IBA) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).


Hormon sintetik

atau zat pengatur tumbuh yang digolongkan

sebagai auksin yaitu : asam a-naftalenasetat (NAA), asam 2,4diklorofenoksiasetat

(2,4-D),

asam

2-metil

4-klorofenoksiasetat

(MCPA), asam 2-naftalosiasetat (4-CPA), asam p-klorofenoksiasetat (PCPA),

asam

dikloroanisik

2,4,5-triklorofenoksiasetat

(dikamba),

asam

4-amino

(2,4,5-T),

asam

3,6-

3,5,6-trikloropikolinik

(pikloram) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ). Dalam aktivitas kultur jaringan, auksin berperan menginduksi terjadinya kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau tunas, mendorong proses embryogenesis, dan mempengaruhi kestabilan genetis tanaman ( Santoso dan Nursandi, 2001 ). 2) Sitokinin Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuhan yang sangat penting sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan. Seperti auksin, selain sitokinin alami juga terdapat sintesisnya yang tergolong dalam zat pengatur tumbuh. Sitokinin sintetik yang umum digunakan dalam kegiatan kultur jaringan adalah FAP (6furfurilaminopurin), BAP (Benzylaminopurin), Thidiazuron (N-phenilN-1,2,3-thiadiazol-5-penylurea) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ). Dalam kegiatan kultur jaringan sitokinin berperan di dalam menstimulasi terjadinya pembelahan sel, proliferasi kalus, pembentukan


tunas, menghambat pembentukan akar, mendorong pembentukan klorofil pada kalus ( Santoso dan Nursandi, 2001 ). 3) Gibberilin (GA) Gibberilin merupakan kelompok lain dari ZPT atau hormon yang dapat mempengaruhi pemanjangan batang atau ruas batang, mendorong pembungaan, induksi buah, dan tumbuhnya mata tunas yang dorman. Secara umum dalam kegiatan kultur jaringan tanaman tanpa penambahan GA, sesungguhnya kegiatan telah dapat berjalan dan proses induksi serta diferensiasi

dapat

dilakukan,

meski

demikian

tidak

menutup

kemungkinan bahwa GA endogen dalam eksplan walaupun dalam kadar yang relatif kecil diduga tetap merupakan komponen yang essensial, contoh GA sintetik adalah gibberillic acid (Santoso dan Nursandi, 2001). 5) ABA (Abcisic acid) ABA merupakan hormon tanaman yang secara alamiah disintesis tanaman bila tanaman berada dalam keadaan stress. ABA tergolong dalam zat penghambat tanaman atau inhibitor karena kerjanya berlawanan dengan hormon pendorong seperti auksin, sitokinin, dan giberelin. Dalam kultur jaringan, ABA dapat menghambat proses inisiasi dan pertumbuhan sel ( Santoso dan Nursandi, 2001 ). f. Bahan pemadat media Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran komponen-komponen zat kimia dengan air suling,


sedangkan media padat adalah media cair tersebut dengan ditambah zat pemadat ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Zat pemadat yang digunakan untuk membuat media padat adalah berupa agar-agar. Agar adalah campuran berbagai polisakarida dari galaktosa yang diekstrak dari ganggang laut, terutama Gellidium amansii dan ganggang lain dari golongan Rhodophyta. Umumnya agar dapat membentuk gel pada suhu 40-45°C dengan titik cair 80-90°C. Kemampuan agar dalam memadatkan media tergantung pada cara pengekstrakannya dari ganggang dan pH larutan media sebelum diautoklaf. Dalam larutan media dengan pH rendah (kurang dari 4,5), gel yang terbentuk oleh agar sangat encer, sedangkan larutan dengan pH tinggi (lebih dari atau sama dengan 5,5) akan berbentuk padat ( Yusnita, 2003 ). Media kultur jaringan merupakan sumber makanan yang baik untuk bakteri dan fungi, semua prosedur in vitro harus memuat pencegahan terhadap kontaminasi mikroba ( Wetherell, 1982 ). Beberapa teknik sterilisasi yang lazim digunakan dalam kultur jaringan tanaman, yaitu: a. Sterilisasi panas basah Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah autoklaf. Hampir semua mikroba mati sesudah diberi uap air dengan suhu 121°C selama 10-15 menit. Cara sterilisasi ini dapat digunakan untuk mensterilkan media kultur, air, alat / instrumen, gelas serta peralatan plastik yang tahan akan suhu panas. Lama sterilisasi ada aturannya, untuk mensterilkan media 20-75 ml dibutuhkan


waktu 15-20 menit, media 75-500 ml dibutuhkan waktu 20-25 menit, media 500-5000 ml dibutuhkan waktu 25-35 menit, yang semuanya dilakukan pada suhu 121°C; sedangkan untuk mensterilkan peralatan gelas dibutuhkan waktu 30 menit dengan suhu 130 °C ( Katuuk, 1989 ). Manfaat dari sterilisasi ini adalah prosesnya cepat, sederhana, dan sanggup membasmi virus tertentu. Namun autoklaf juga mempunyai kekurangan, yaitu: 1) Bila pemanasan terlalu tinggi, gula akan membatu sehingga dapat menjadi racun dalam media. 2) Bila terlalu lama disterilkan, garam akan mengendap sehingga terjadi dipolimerisasi agar. 3) Dapat menurunkan pH sekitar 0,3 - 0,5 unit. 4) Dapat merusak substansi yang mudah menguap, misalnya ethrel dan ethylene ( Katuuk, 1989 ). b. Sterilisasi panas kering Cara sterilisasi panas kering adalah dengan menggunakan suhu tinggi dan dalam kondisi kering. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah oven. Oven digunakan untuk mensterilkan alat- alat yang tidak mudah terbakar, antara lain: alat-alat gelas dan alat-alat dari logam. Namun dalam keadaan tertentu dimana suhu tidak terlalu panas, alat dapat dibungkus dengan kertas kemudian disterilkan. Bukan pula berarti semua alat dari bahan logam harus disterilkan dengan cara ini. Alat-alat seperti pisau serta


skalpel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak ketajaman pisau / alat ( Katuuk, 1989 ). Lama pemanasan tergantung pada suhu. Biasanya sterilisasi untuk suhu 160°C, memerlukan waktu 45 menit, 170°C-18 menit, 180°C-7,5 menit, dan 190°C selama 1,5 menit. Suhu harus dikontrol, sebab pada suhu 170°C, kertas mulai hancur. Setelah selesai disterilisasi, alat / instrument dikeluarkan dan dibawa ke ruang transfer, dimana mereka dapat disterilkan lagi dengan menggunakan sinar ultraviolet ( Katuuk, 1989 ). c. Sterilisasi dengan pemijaran Alat / instrument berupa pisau dan skalpel, dikeluarkan dari bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70% dan dilewatkan pada nyala lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer (LAF) ( Katuuk,1989). d. Sterilisasi dengan bahan kimia Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba dengan jalan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk mensterilkan permukaan saja, yang meliputi: material tanaman dapat disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air brom, sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% ( Katuuk, 1989 ). Banyak jenis bahan pencuci yang boleh digunakan untuk sterilisasi material tanaman. Jenis serta lamanya sterilisasi tergantung pada kepekaan


material tanaman. Banyak kali terjadi bila terlalu lama dan dengan konsentrasi bahan pencuci yang tinggi, berakibat bukannya mematikan mikroba tetapi bahkan merusak jaringan tanaman yang disterilkan. Di samping itu bahan pencuci hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila tidak demikian, sisa zat pencuci ini akan tetap pada material tanaman, yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan ( Katuuk, 1989 ). e. Sterilisasi dengan sinar ultraviolet Ruang dan kotak transfer sukar untuk disterilkan hanya dengan menggosok dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu digunakan lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium yang sudah memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan maksud agar semua bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan sinar ultraviolet adalah pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya, proses sterilisasi tidak terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu mematikan bentuk fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora (Katuuk, 1989 ). Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium cair yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu, tergantung spesiesnya akan terbentuk massa kalus yaitu suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ).


Kalus terbentuk melalui 3 tahapan, yaitu : induksi, pembelahan sel dan diferensiasi. Untuk memelihara kalus, maka perlu dilakukan subkultur secara berkala, misalnya setiap 30 hari ( Yuwono, 2006 ). Subkultur adalah usaha mengganti media tanam kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau protokormus dapat terpenuhi. Subkultur pada media padat mudah dilakukan dengan cara meletakkan kalus yang sudah terbentuk di atas cawan petri, kemudian membelah-belahnya menjadi bagian-bagian kecil lagi. Setelah menjadi potongan kecil, kalus dimasukkan kembali dalam media yang memiliki komposisi sama dengan media lama. Proses ini juga dilakukan dalam suasana steril ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Ada 3 tahapan perkembangan dan pertumbuhan kalus, mulai dari waktu subkultur atau penaburan inokulum, yaitu: induksi pembelahan sel, pembelahan sel aktif dan tahap pembelahan sel lambat atau sel berhenti membelah. Laju pertumbuhan kalus umumnya ditetapkan secara kuantitatif dengan parameter indeks pertumbuhan bobot kalus basah. Pertambahan bobot kalus basah merupakan selisih antara bobot kalus basah pada periode tertentu dikurangi bobot kalus mula-mula atau bobot inokulum. Selanjutnya dari kurva pertumbuhan kalus yang menyatakan hubungan antara pertumbuhan bobot kalus basah dengan umur dapat diketahui fase-fase pertumbuhan kalus antara lain: a. Fase lag, yaitu fase dimana belum terjadi pertumbuhan secara nyata, keadaan ini terjadi selama beberapa waktu setelah kalus disubkultur, serta


merupakan waktu adaptasi kalus dengan media yang baru. Pada fase ini pertambahan bobot kalus hanya sedikit dan terlihat hampir mendatar pada kurva. b. Fase eksponensial, yaitu fase dimana mulai terjadi pertumbuhan kalus. Pertambahan bobot kalus mulai terlihat nyata dan diikuti fase linier dimana pertumbuhan kalus terus menaik secara eksponensial seperti garis lurus ke atas dan berhenti. c. Fase stasioner, yaitu fase dimana pertumbuhan kalus sama dengan kematian sel-sel kalus. Kalus tidak dapat bertahan hidup pada fase ini dalam waktu yang lama. Sel-sel mulai mati, media pertumbuhan kelebihan muatan dan nutrien telah habis digunakan, sehingga kematian sel menjadi lebih cepat ( George dan Sherrington, 1984 ). 3. Lingkungan Faktor lingkungan utama yang harus dipenuhi antara lain : a. Cahaya. Cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut fotomorfogenenesis. Jenis cahaya yang paling sering digunakan dalam kultur jaringan adalah cahaya dari lampu neon. Hal ini disebabkan oleh kemampuannya yang dapat menyebarkan cahaya yang lebih luas dan merata, serta lebih hemat pemakaian listrik ( Katuuk, 1989 ).


b. Suhu. Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-30°C. Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada setiap spesies, serta jenis eksperimen ( Katuuk, 1989 ). c. pH. Pada umumnya nilai pH yang paling disukai untuk pertumbuhan sel antara 5-6. Walaupun pH media akan berubah selama pengkulturan, pH harus diatur lebih dulu sebelum diautoklaf, yaitu apabila semua komponen media sudah dicampurkan. Manfaat pH dalam media adalah untuk menjaga kestabilan membran sel, mengatur garam-garam agar tetap dalam bentuk terlarut, membantu penyerapan hara dan mengatur sifat gel agar (dalam media padat) ( Katuuk,1989 ). d. Kelembaban. Faktor kelembaban relative humidity (RH) tidak banyak dibahas dalam kultur jaringan. Hal ini disebabkan oleh kondisi dalam botol kultur yang selalu lembab karena media. Namun demikian kelembaban di luar botol kultur juga perlu diperhatikan. Kondisi iklim dalam hal ini sangat berpengaruh terhadap kelembaban kultur. Untuk itu disarankan agar RH dalam ruang kultur berkisar 70% ( Katuuk,1989 ). e. Wadah / botol kultur. Ukuran wadah kultur biasanya juga mempengaruhi pertumbuhan serta morfogenesis in vitro. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan konsentrasi CO2 yang tersedia, etilen serta gas lain yang berada dalam ruang


wadah. Besar kecilnya wadah tergantung pada jenis serta ukuran eksplan yang digunakan, dan fase perkembangan eksplan sehingga pemindahan eksplan ke botol yang lebih besar sangat diperlukan. Biasanya untuk eksplan yang berukuran kecil, pada permulaan pengkulturan dapat menggunakan tabung kultur yang berdiameter 1,5 cm, kemudian untuk pertumbuhan akar maka diameter tabung kultur dapat diganti menjadi 2,5 cm. Wadah kultur jaringan tidak hanya tergantung pada botol kultur buatan pabrik. Banyak macam wadah yang boleh dijadikan tempat kultur, antara lain: botol-botol bekas obat-obatan, jam, atau bekas

bahan makanan lainnya. Biasanya

wadah terbuat dari gelas adalah yang paling baik, karena dapat dengan mudah dicuci untuk digunakan lagi.

C. Glikosida Jantung Glikosida jantung ditemukan dalam beberapa famili tumbuhan seperti Apocynaceae, Liliaceae, Moraceae, dan Ranunculaceae. Sumber niaga utama kardenolida ialah genus Digitalis dan Strophantus. Digitalis mempunyai efek langsung pada jantung yaitu memberi kekuatan bila jantung melemah. Glikosida jantung biasanya mempunyai sifat peluruh air seni (diuretik) yang berakibat menurunkan tekanan darah dan mengobati bengkak. Keberadaan senyawa ini dalam tumbuhan mungkin memberi perlindungan kepada tumbuhan tersebut dari gangguan beberapa serangga ( Robinson, 1995 ). Glikosida jantung merupakan suatu glikosida yang memiliki kepolaran yang tinggi, oleh karena itu isolasi glikosida jantung murni dalam tanaman sulit


dilakukan. Berdasarkan polaritasnya, glikosida jantung dapat diekstrak dengan menggunakan pelarut yang polar antara lain: etanol, etil asetat, campuran etanol dan air serta campuran etanol dan kloroform ( Samuelsson, 1999 ). Glikosida jantung diklasifikasikan sebagai steroid (sterol), karena memiliki inti cyclopentanoperhydrophenanthrene, sebuah cincin ∝-β-unsaturated lactone(no. 5 atau 6) pada C17, sebuah β-oriented hydroxyl pada C14, sebuah cis fusi dari cincin C dan D pada C13-C14 dan tambahan satu atau lebih gula pada C3, biasanya deoxyhexomethyloses ( Farnsworth, 1966 ).

Gambar 1. Struktur glikosida jantung ( Moffat, 2004 )

Identifikasi glikosida jantung dapat dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) secara kualitatif. Reaksi identifikasi terhadap glikosida jantung dapat dilakukan menggunakan uji dengan pereaksi Baljet (2,4,6trinitrophenol), uji dengan pereaksi Kedde (3,5-dinitrobenzoic acid), uji dengan pereaksi Raymond (m-dinitrobenzene), uji dengan pereaksi Legal (sodium nitroprusside) dimana pereaksi tersebut akan bereaksi dengan grup methylene aktif yang ditemukan dalam cincin C17-unsaturated lactone. Pereaksi ini akan


memberikan warna oranye, ungu, biru, dan violet, yang menunjukkan adanya glikosida jantung ( Farnsworth, 1966 ). Di dalam skrining fitokimia untuk glikosida jantung, uji pendahuluan yang positif pada ekstrak tanaman dengan menggunakan salah satu pereaksi yang dikonfirmasikan dengan pereaksi yang spesifik untuk tambahan 2 sisi reaktif (vide supra). Sebagai contoh , sebuah uji pendahuluan yang positif dengan pereaksi Keller menunjukkan adanya gula deoksi. Ini harus diikuti dengan uji yang ke dua yaitu uji dengan pereaksi Liebermann, hasil positif, menunjukkan adanya inti steroid ( Shoppee, 1964 ).

D. Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi

merupakan

proses

diferensiasi

komponen-komponen

cuplikan yang ditahan secara selektif oleh fase diam. Pada dasarnya semua kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahanpemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fase ini. Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan sifat-sifat fase diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Apabila fase diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan, sedangkan untuk fase diam yang berupa cairan dikenal sebagai kromatografi partisi ( Sastrohamidjojo, 2001 ). Kromatografi lapis tipis termasuk ke dalam kromatografi serapan. Prinsip dari kromatografi serapan adalah kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada berapa besarnya komponen tersebut tertahan oleh fase diam (Sastrohamidjojo, 2001 ).


Fase diam yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah bahan penyerap atau adsorben ( Stahl, 1969 ). Zat penyerap merupakan lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Dua sifat penting yang perlu diperhatikan dalam pemilihan bahan penyerap adalah ukuran partikel dan homogenitas partikel penyerap. Kedua sifat ini sangat berpengaruh pada gaya adhesi. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Fase diam yang umum dan paling banyak digunakan adalah silika gel yang dicampur dengan CaSO4 untuk menambah daya lengket partikel silika gel pada pendukung (pelat). Adsorben lain yang juga biasa digunakan adalah alumina, kieselguhr, celite, serbuk selulosa, serbuk poliamida, kanji dan sephadex ( Mulja dan Suharman, 1995 ). Fase diam yang digunakan untuk analisis secara kromatografi lapis tipis untuk glikosida jantung adalah silika gel GF 254 ( Wagner, 1984 ). Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase ini bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multi-komponen harus berupa campuran sesederhana mungkin terdiri atas maksimum tiga komponen ( Stahl, 1969 ). Pemilihan fase gerak untuk glikosida jantung ada beberapa macam alternatif, yaitu: etil asetat-metanol-air (100:13,5:10 v

/v); etil asetat-metanol-etanol-air (81:11:4:8 v/v); metiletil keton-toluena-air-asam

asetat glasial (40:5:3:2,5:1 v/v); kloroform-metanol-air (65:35:10 v/v) ( Wagner, 1984 ).


Campuran yang dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan berupa bercak. Setelah itu pelat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama pengembangan. Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus dideteksi ( Stahl, 1969 ). Identifikasi dari senyawa yang terpisah (bercak / noda) pada lapisan tipis dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi kimia dan disemprot dengan reagen. Identifikasi senyawa glikosida jantung dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi kimia yaitu dengan menggunakan sinar ultraviolet 254 dan 365 nm, sedangkan reagen penyemprot yang digunakan untuk identifikasi senyawa glikosida jantung adalah reagen Kedde, Legal, Baljet, Raymond, antimony (III) chloride, chloramine-trichloroacetic acid / CTA, sulphuric acid ( Wagner, 1984 ) dan vanillin-phosporic acid ( Jork, et al., 1990 ). Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak antara senyawa dari titik awal dengan jarak tepi muka pelarut dari awal. Rf =

jarak bercak dari awal pengembangan jarak pengembangan

Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan kromatografi kertas. Oleh karena itu, pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat yang akan diuji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran yang hampir sama. Angka Rf berkisar antara 0,01 – 1,00 dan hanya dapat ditentukan


dengan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berkisar antara 0 – 100 ( Stahl, 1969 ).

E. Landasan Teori Di dalam pencarian metode produksi kandungan obat dari tumbuhan, pendekatan kultur jaringan, potensial sebagai alternatif di dalam produksi metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk skala industri. Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil jaringan atau organ berdasarkan teori totipotensi. Pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi juga oleh zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2,4-D (auksin) dengan tujuan untuk merangsang pertumbuhan kalus. Selain itu, 2,4-D juga berfungsi dalam perkembangan sel dengan menaikkan tekanan osmotik dan menurunkan tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam sel disertai kenaikkan volume sel. Pada penelitian ini, kalus terbentuk dari daun kamboja jepang yang mengalami pelukaan pada bagian tepi. Menurut Salisbury dan Ross (1995) bahwa kurva pertumbuhan dihasilkan dengan memplotkan ukuran atau bobot organisme terhadap waktu. Kurva tersebut dijelaskan dengan fungsi matematis sederhana, misalnya garis lurus atau kurva berbentuk-S yang sederhana. Oleh karena itu, pada penelitian ini diharapkan bahwa profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang dapat dijelaskan dengan menggunakan kurva sigmoid dengan adanya fase lag, fase eksponensial dan fase stasioner.


Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan bahwa daun kamboja jepang dapat tumbuh secara in vitro untuk menghasilkan kalus yang mengandung glikosida jantung yang sama dengan glikosida jantung pada daun tanaman asalnya.

F. Hipotesis 1. Daun tanaman kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4 Diklorofenoksiasetat pada media MS. 2. Kultur kalus yang dihasilkan melalui teknik kultur jaringan ini memiliki profil pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan kandungan glikosida jantung yang optimum. 3. Ekstrak kalus daun tanaman kamboja jepang memiliki kandungan glikosida jantung yang sama dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asalnya.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif yaitu tidak ada perlakuan atau manipulasi pada subyek uji dan penelitian ini hanya bertujuan menunjukkan fakta yang ada.

B. 1.

Definisi Operasional

Daun yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah daun yang segar dan sehat, terletak pada nomor 3-5 dari ujung batang atau cabang.

2.

Waktu inisiasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh eksplan untuk membentuk kalus dihitung mulai dari saat penanaman eksplan sampai hari pertama kalus mulai terbentuk berupa bintik putih dari tepi irisan daun eksplan.

3.

Subkultur adalah suatu kegiatan pemeliharaan kalus dengan memindahkan kalus ke dalam media baru sehingga kalus tidak kekurangan nutrisi.

4.

Bobot kalus basah awal adalah hasil pengurangan antara bobot botol + media + kalus dengan bobot botol + media pada saat subkultur.

5.

Bobot kalus basah akhir adalah bobot kalus yang ditimbang pada saat pemanenan.

30


6.

Bobot kalus kering adalah bobot kalus pada saat pemanenan dan sesudah mengalami proses pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 40500C, sampai diperoleh kalus dengan bobot konstan yaitu antara penimbangan yang pertama dan berikutnya selama 1 jam tidak berbeda 0,5 mg.

7.

Laju pertumbuhan kalus adalah laju pertumbuhan kalus yang ditandai adanya pertambahan berat kalus dari waktu ke waktu dengan memanen setiap 6 hari sekali sebanyak 6 botol selama 42 hari.

8.

Profil pertumbuhan kalus adalah rasio antara pertumbuhan kalus ( bobot kalus basah akhir- bobot kalus basah awal) dengan waktu pemanenan serta rasio antara bobot kalus kering dengan waktu pemanenan.

9.

Persen kadar air adalah rerata bobot kalus basah dikurangi dengan rerata bobot kalus kering lalu dibagi dengan rerata bobot kalus basah dikali dengan 100%.

10.

Konsentrasi zat pengatur tumbuh yaitu asam 2,4-Diklorofenoksiasetat yang digunakan adalah 4 ppm 2,4-D yang terkandung dalam satu liter media.

C. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat penelitian a. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman: 1) Alat-alat gelas, Pyrex 2) Autoklaf, YX 400Z Shanghai Sanshen, Medical Inst, Co, LTD. 3) Oven, Marius Instrument, German.


4) Pemanas listrik, Ika Combimag, RCT, German. 5) Timbangan analitik, Scaltec. 6) Glassfirn. 7) Magnetic stirrer. 8) Pinset. 9) Skapel. 10) Kertas pH indikator. 11) Kertas saring. 12) Laminar air flow. 13) Lampu UV. 14) Inkubator, Heraeus Tamson, Holland. 15) Botol kultur. 16) Aluminium foil,Heavy-Duty, Diamond-Wrap. 17) Referigerator, Sharp. 18) Sprayer. 19) Mortir & stamper. b. Alat untuk penyarian : alat gelas (pyrex), kertas saring, dan waterbath c. Alat untuk Kromatografi Lapis Tipis: 1) Bejana gelas. 2) Lempeng kaca. 3) Lemari asam. 4) Pipa kapiler. 5) Penyemprot bercak.


6) Lampu TL Day Light” 20 watt. 7) Lampu UV 254 dan 365 nm. 2. Bahan Penelitian a. Bahan eksplan : daun yang segar dan sehat terletak no. 3-5 dari ujung batang atau cabang tanaman kamboja jepang diambil dari Fakultas Farmasi

Universitas

Sanata

Dharma,

Dusun

Paingan,

Desa

Maguwohardjo, Kecamatan Depok, Kabupaten Sleman, Yogyakarta. b. Bahan kimia Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1) Agar, Mkr Chemicals. 2) Garam anorganik (makronutrien) yang terdiri dari : a) Kalium nitrat, Merck, Germany. b) Ammonium nitrat, GPR, BDH. c) Kalsium dikloro dihidrat, Merck, Germany d) Magnesium sulfat heptahidrat, Merck, Germany e) Kalium dihigrogen fosfat, Merck, Germany. 3) Garam anorganik mikronutrien yang terdiri dari : a) Mangan sulfat tetrahidrat, BDH limited Poole, England. b) Seng sulfat heptahidrat, Merck, Germany. c) Asam borat, GPR, BDH, Merch, Germany d) Kalium iodide netral, Merck, Germany e) Tembaga (II) sulfat pentahidrat, Bratako chemika, Bandung. f) Natrium molibdat dihidrat, Riedel dehaen, Germany.


g) Kobalt (II) klorida heksahidrat, GPR, BDH. h) Besi (II) sulfat heptahidrat, Merck, Germany i) Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat, GPR,BDH, Merck, Germany. 4) Vitamin dan asam amino yang terdiri dari: a) Myo inositol, Biochemical, BDH, Merck, Germany. b) Tiamin hidroklorida, Biochemical, BDH, Merck, Germany. c) Asam nikotinat, BDH, Merck, Germany. d) Piridoksin hidroklorida, Biochemical, BDH, Merck, Germany. e) Glisin, Biochemical, BDH, Merck, Germany. 5) Sumber karbon : sukrosa, BDH, Merck, Germany. 6) Zat pengatur tumbuh : Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat, GPR, BDH. 7) Desinfektan a) Natrium hipoklorida, Bayclin, Johnson. b) Alkohol 70% derajat kemurnian teknis. c) Tween 80, Merck-Sohuchardt. 8) Akuades c. Bahan untuk penyarian: Metanol (J.T. Baker, Germany) dan Kloroform (J.T. Baker, Germany) d. Kromatografi Lapis Tipis : a) Metanol, J.T. Baker, Germany b) Etil asetat, J.T. Baker, Germany. c) Kedde reagent, Merck, Germany.


d) Asam sulfat, Merck, Germany. e) Silica-Gel GF 254, Merck, Germany.

D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan di laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan pustaka acuan (Anonim, 2006). 2. Pembuatan stok a. Pembuatan larutan stok hara mikro Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades 300 ml. Mangan (II) sulfat tetrahidrat sebanyak 2,23 g, seng sulfat heptahidrat sebanyak 0,86 g, asam borat sebanyak 0,62 g, kalium iodida sebanyak 0,083 g, natrium molibdat dihidrat sebanyak 0,025 g, tembaga (II) sulfat pentahidrat 0,0025 g, kobalt (II) klorida heksahidrat sebanyak 0,0025 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa tiap 1 liter media membutuhkan 5 ml stok hara mikro. b. Pembuatan larutan stok besi Stok untuk bahan ini terpisah dari unsur hara mikro lainnya, karena komponen natrium etilen diamin tetra asetat dan besi (II) sulfat heptahidrat sukar larut dalam akuades, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl,


kemudian dipanaskan. Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades 300 ml. Besi (II) sulfat heptahidrat sebanyak 0,278 g dan natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat sebanyak 0,373 g dimasukkan ke dalam gelas piala tersebut, lalu ditambahkan beberapa tetes HCl sambil diaduk dengan menggunakan magnetis stirer hingga larut dan agar cepat larut dibantu dengan pemanasan. Kemudian ditambahkan akuades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok besi. c. Pembuatan larutan stok vitamin dan asam amino Dua ratus milliliter aquades dimasukkan ke dalam gelas piala dengan volume 500 ml, kemudian asam nikotinat sebanyak 0,05 g, piridoksin hidroklorida sebanyak 0,05 g, tiamin hidroklorida sebanyak 0,01 g dan glisin sebanyak 0,2 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok vitamin dan asam amino. d. Pembuatan larutan stok myoinositol Untuk membuat larutan myoinositol, diperlukan 10 g myoinositol yang dilarutkan dalam 500 ml aquades dalam gelas piala sampai larut kemudian akuades ditambahkan sampai volume 1 liter. Dalam membuat satu liter media dibutuhkan larutan stok myoinositol sebanyak 10 ml.


e. Pembuatan larutan stok ZPT ZPT yang digunakan adalah asam 2,4 Diklorofenoksiasetat. Untuk membuat larutan stok 2,4-D (4 ppm), larutkan 2,4-D sebanyak 100 mg ke dalam 2-5 ml etanol, panaskan sebentar lalu tambahkan 100 ml akuades. Dalam membuat satu liter media dengan konsentrasi 2,4D sebesar 4 ppm dibutuhkan larutan stok sebanyak 4 ml. 3. Pembuatan media Media yang digunakan adalah media Murashige-Skoog. Pembuatannya adalah sebagai berikut : mula-mula 500 ml akuades dipanaskan di dalam gelas piala 1000 ml. Sambil terus diaduk, dimasukkan bahan-bahan anorganik makro sesuai dengan komposisi yang ada (daftar terlampir). Setelah semua hara makro larut, dimasukkan berturut-turut 5 ml larutan stok hara mikro, 5 ml larutan stok besi-EDTA, 5 ml stok vitamin dan asam amino dan 10 ml stok myoinositol. Sedikit demi sedikit dimasukkan campuran sukrosa 30 g dan agar 11 g sambil diaduk hingga larut. Sementara itu, ditambahkan juga akuades sedikit demi sedikit untuk membantu kelarutan hingga volume mencapai 1000 ml. Campuran tersebut dipanaskan hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah jernih, suhu pemanas diturunkan dan stok zat pengatur tumbuh dimasukkan sesuai konsentrasi yang diinginkan. Setelah itu, dilakukan pengaturan pH media 5,2 – 5,6. jika terlalu basa ditambahkan HCl encer dan jika terlalu asam ditambahkan larutan KOH encer. Penyusutan air karena pemanasan diatasi dengan penambahan akuades hingga 1000 ml kemudian media dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan kurang lebih 1 cm.


Botol yang berisi media kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Media yang aman digunakan adalah media yang telah disimpan dalam inkubator selama kurang

lebih

1

minggu

dan

tidak

tampak

adanya

pertumbuhan

mikroorganisme kontaminan seperti : jamur, dan bakteri. 4. Sterilisasi alat dan ruangan a. Sterilisasi alat Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan alumuniumfoil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan pada temperatur 120 °C selama 20 menit. b. Sterilisasi ruangan Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow (LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 % atau spiritus. Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF dinyalakan selama ± 2 jam. 5. Sterilisasi dan penanaman eksplan a. Sterilisasi eksplan Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir dengan diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat di permukaan terluar eksplan Eksplan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit dan Tween-80 selama 5 – 10 menit kemudian dibilas dengan


akuades. Di dalam LAF eksplan juga disterilkan dengan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit-Tween-80 selama 5 menit. Eksplan dibilas 3 kali dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf). Eksplan yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam. b. Penanaman eksplan Potongan eksplan yang akan ditanam yang sudah disterilkan sebelumnya dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan untuk memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur. Media yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 18 °C serta disinari dengan lampu TL ”Day Light” 20 watt dengan ketinggian 40 cm. 6. Pengamatan waktu inisiasi kalus Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada bagian pelukaan eksplan. 7. Subkultur Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman dimana tanaman telah menampakkan gejala kurang nutrisi (berwarna kecoklatan) atau bobotnya tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi bagian yang lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses subkultur ini dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset, skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan botol-botol yang


berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air flow dan disterilkan selama ± 2 jam dengan lampu UV. Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70% kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset dengan ukuran kalus awal, yaitu 3 – 5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis. Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 180C serta disinari dengan lampu TL “Day Light” 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 42 botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus. 8. Pemanenan Setelah dilakukan subkultur, tiap 6 (enam) hari sekali dilakukan pemanenan sebanyak 6 (enam) buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan dari sisa-sisa agar yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang telah dipanen kemudian dikeringkan pada suhu 40-500C hingga didapatkan perbedaan bobot sebesar 0,5 mg bobot zat dari 2 penimbangan berurutan berselang 1 jam atau dengan kata lain setelah didapatkan berat kalus kering


yang konstan. Catat bobot kering kalus hasil setiap pemanenan. Kalus kering yang diperoleh kemudian digerus dengan menggunakan mortir dan stamper . Selanjutnya serbuk kalus yang diperoleh, disimpan di dalam flakon dan dikumpulkan sebanyak ± 2 gram untuk dibuat ekstrak sehingga dapat diketahui metabolit sekunder dalam kalus. 9. Analisis pertumbuhan kalus Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan dua cara, yaitu : a. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. Perhitungan bobot kalus basah tiap-tiap waktu tertentu yakni setiap 6 (enam) hari sekali. Pertambahan bobot kalus basah pada tiap-tiap waktu pemanenan didapatkan dari penjumlahan dari tiap-tiap botol yang dipanen pada hari yang sama. Analisis pertumbuhan kalus dilakukan dengan menggunakan kurva sigmoid yang menyatakan hubungan antara umur kalus dengan pertambahan bobot kalus basah ( pertumbuhan kalus ) sehingga diperoleh gambaran fase-fase pertumbuhan kalus. Rumus regresi linier menurut Budiasmoro (2003) adalah sebagai berikut :

a=

((Σ r ) (Σ p ) − (Σ p )(Σ p.r )) n (Σ p ) − (Σ p )

b=

(n Σ (p.r ) − (Σ p )(Σ r )) 2 n (Σ p 2 ) − (Σ p )

2

2

r = Δp/(Δh.p)

2


Persamaan kurva sigmoid menurut Budiasmoro (2003) adalah sebagai berikut :

Y' =

a a(tN+1 − x)

(a/ N + b). e

−b

Y' = pertumbuhan sebagai fungsi umur kalus pada persamaan sigmoid a = nilai intercept dari rumus regresi linier b = nilai slope dari rumus regresi linier N = data bukan nol yang terukur pertama kali X = umur kalus Untuk membuktikan bahwa kurva sigmoid yang dihasilkan dapat mewakili profil pertumbuhan kalus dilakukan uji t terhadap nilai b dan nilai pertumbuhan yang diperoleh dari persamaan kurva sigmoid. ( y − y' ) 2 n−2

Sy.x =

Sb =

tb =

Syx

∑x

2

b Sb

Syx = simpangan relatif data penimbangan dengan hasil perhitungan kurva sigmoid Y = nilai pertumbuhan yang didapat dari selisih bobot akhir dan bobot awal kalus Y' = nilai pertumbuhan yang didapat dari persamaan sigmoid


n = jumlah data x = simpangan Y terhadap rerata Y Sb = simpangan b b = nilai slope persamaan sigmoid yang didapat dari hasil regresi linier tb = nilai t hitung dari b yang akan dibandingkan dengan t tabel. b. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot biomassa kalus. Kemudian

dibuatkan

grafik

pola

pertumbuhan

kalus,

dengan

menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus. 10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-500C. Kemudian

daun

yang

telah

dikeringkan

tersebut,

digerus

dengan

menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di dalam flakon. 11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml campuran kloroform-metanol (1:10

v

/v), selama 10 menit. Larutan

didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) ( Dwiatmaka dan Wulandari, 2005). Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl ( Wagner, et al., 1984 ).


12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang Satu gram serbuk daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1

v

/v) ( Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005) . Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl ( Wagner, et al., 1984 ). 13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman asalnya. Ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman asalnya ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan fase diam silica gel GF254 dan fase gerak berupa etil asetat – metanol - air (81 : 11 : 8 v/v) dengan jarak pengembangan 10 cm. Deteksinya menggunakan sinar UV 254 dan 365 nm, serta disemprot dengan dua macam pereaksi yaitu Kedde ( bercak diamati di bawah sinar tampak) dan asam sulfat 97% ( lempeng dipanaskan pada suhu 1000C selama 3-5 menit, amati bercak di bawah sinar tampak) ( Wagner, et al., 1984 ). E. Analisis Hasil Analisis waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual sebagai munculnya titik-titik tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama kalinya pada eksplan dengan menggunakan rata-rata waktu inisiasi kalus. Analisis pertumbuhan kalus di dalam penelitian ini menggunakan dua cara, yaitu :


1. Pembuatan

grafik

profil

pertumbuhan

kalus

berdasarkan

data

penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. Pertumbuhan kalus diperoleh berdasarkan pertambahan bobot kalus basah yakni dengan cara mengurangkan bobot kalus basah akhir dengan bobot kalus basah awal. Kemudian data yang diperoleh dimasukkan ke dalam rumus regresi linier untuk memperoleh nilai a ( intercept ) dan b ( slope ). Setelah itu, nilai a dan b yang diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan kurva sigmoid dan dibuat grafik pertumbuhan kalus dengan memplotkan umur kalus dengan pertumbuhan kalus. Untuk mengamati apakah data dapat digambarkan dengan kurva sigmoid dilakukan uji t dengan membandingkan nilai t hitung dengan t tabel ( Budiasmoro, 2003 ). 2. Pembuatan

grafik

profil

pertumbuhan

kalus

berdasarkan

data

biomassanya. Data penimbangan bobot kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik profil pertumbuhan kalus, dengan menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus. Data profil pertumbuhan kalus berdasarkan biomassa kalus tersebut digunakan sebagai data pendukung bagi profil pertumbuhan kalus berdasarkan pertambahan bobot kalus basah. Untuk mengetahui apakah dengan adanya penambahan zat pengatur tumbuh ( 2,4-D ) selama dilakukannya proses kultur terhadap kadar air yang


terkandung di dalam kalus maka diperlukan perhitungan persen kadar air. Persen kadar air kalus dihitung dengan mengurangkan rerata bobot kalus basah akhir dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot basah akhir dikali 100%. Analisis kandungan kimia kalus, dalam hal ini glikosida jantung dilakukan uji KLT dengan membandingkan bercak kalus kamboja jepang dengan bercak daun tanaman asalnya.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan dengan mencocokkan tanaman kamboja jepang yang digunakan dalam penelitian dengan ciri-ciri morfologi tanaman kamboja jepang berdasarkan pustaka acuan ( Anonim, 2006 ). Berdasarkan hasil determinasi, diperoleh keterangan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum ( Forssk.) Roem & Schult) . Kamboja jepang yang dipergunakan dalam penelitian ini termasuk dalam familia Apocynaceae ( Anonim, 2006 ).

B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman kamboja jepang. Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena daun lebih mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan daun memiliki jaringan parenkim yang akan berdediferensiasi yaitu proses perkembangan terbalik dari bagian tanaman atau organ tanaman menjadi sekelompok sel yang terus-menerus membelah berupa kalus dalam media tanam yang digunakan. Selain itu, di dalam proses pengkulturan mudah untuk disterilisasi. Daun yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang segar dan sehat, terletak nomor 3-5 dari ujung batang atau cabang karena pada bagian 47


tersebut masih banyak dijumpai jaringan meristem dan parenkim muda yang mempunyai sifat totipotensi sehingga dapat tumbuh dan berkembang menjadi kalus. Pada bagian ujung batang atau cabang, sel-sel daun masih terlalu muda dan tidak tahan terhadap sterilisasi secara kimiawi dengan menggunakan larutan hipoklorit-Tween 80. Campuran senyawa kimia tersebut menyebabkan kerusakan banyak jaringan daun sehingga gagal terbentuk kalus bahkan eksplan dapat mati. Sedangkan pada bagian pangkal batang atau cabang, sel-sel daun sudah tidak aktif membelah karena pada daun hanya memiliki sedikit jaringan meristem sehingga pembentukan kalus akan butuh waktu yang sangat lama. Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa ekstrak dari daun tanaman Adenium obesum mengandung glikosida jantung yang memiliki efek sitotoksik yang berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura et.al., 2000 ). Oleh karena itu, pada penelitian ini diharapkan kalus daun kamboja jepang juga mempunyai kandungan glikosida jantung yang sama dengan tanaman asalnya. Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media yang digunakan adalah Murashige-Skoog. Media tersebut mengandung berbagai nutrisi sehingga dapat menimbulkan resiko kontaminasi. Kontaminan yang paling sering dijumpai adalah jamur dan bakteri. Untuk menghindari kontaminasi, dilakukan sterilisasi pada peralatan, media, eksplan maupun ruang transfer. Sterilisasi peralatan dan media menggunakan metode uap panas bertekanan yaitu menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15-20 menit. Sterilisasi eksplan berlangsung dalam 3 tahap, yaitu pencucian, sterilisasi


di luar dan sterilisasi di dalam ruang transfer. Pencucian dilakukan dengan tujuan menghilangkan kotoran pada daun dengan menggunakan detergen kemudian dibilas dengan akuades. Sterilisasi di luar dan di dalam ruang transfer dilakukan secara kimiawi yaitu dengan campuran larutan hipoklorit-Tween 80 kemudian dibilas menggunakan akuades steril. Ruang transfer disterilisasi dengan disemprot alkohol 70% dan radiasi sinar UV selama ± 2 jam. Ukuran eksplan sangat menentukan dalam proses pengkulturan. Bagian tanaman yang dikerat, masih mengandung suplai makanan serta hormon untuk potongan tanaman itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi (Katuuk,1989). Ukuran daun yang digunakan adalah 0,5-1 cm. Ukuran tersebut diperoleh dari hasil orientasi yaitu pada ukuran tersebut mempunyai daya regenerasi yang paling baik.

Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun

Eksplan ditanam dalam bentuk irisan melintang daun. Dengan bentuk ini, diharapkan permukaan eksplan yang dapat kontak dengan media semakin luas


sehingga nutrisi dapat diserap dengan lebih baik oleh eksplan. Pada saat pengirisan dan pemindahan eksplan ke dalam botol kultur, digunakan pisau dan pinset yang telah disterilkan dan didinginkan untuk meminimalkan resiko kematian eksplan karena panas.

C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus Kalus adalah suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ). Pada hasil penelitian, kalus dari daun kamboja jepang yang diperoleh berwarna putih kekuningan dan bersifat “freeable” yaitu antara satu kumpulan sel dengan sel yang lain mudah dipisahkan. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MurashigeSkoog yang mengandung nutrisi yang cukup lengkap untuk mendukung pertumbuhan kalus. Penambahan zat pengatur tumbuh auksin dalam media juga merupakan salah satu faktor yang digunakan untuk menumbuhkan kalus. Dalam aktivitas kultur jaringan tanaman, auksin terkenal dalam berperan sebagai hormon yang mampu berperan menginduksi terjadinya kalus (George dan Sherrington, 1984). Pada penelitian digunakan ZPT berupa 2,4-D yang termasuk dalam golongan auksin sehingga 2,4-D berfungsi dalam menginduksi terjadinya kalus. Pada penelitian, konsentrasi 2,4-D yang ditambahkan ke dalam media adalah 4 ppm. Konsetrasi 2,4-D tersebut diperoleh dari hasil orientasi di mana pada konsentrasi tersebut ZPT sudah dapat menginduksi terjadinya kalus.


Waktu inisiasi kalus adalah waktu yang diperlukan oleh eksplan untuk menumbuhkan kalus yang dihitung mulai saat penanaman eksplan hingga kalus teramati pertama kali tumbuh berupa bintik putih pada tepi irisan eksplan atau pada pelukaan eksplan ( Puspitasari dan Soegihardjo, 2002). Idealnya, waktu inisiasi kalus ditandai dengan pertambahan bobot eksplan yang telah ditanam dari bobot awalnya. Namun, pengamatan bobot media dan eksplan dari hari ke hari menunjukkan terjadinya penurunan bobot eksplan dan media berbanding lurus dengan umur penanaman. Penurunan bobot tersebut terjadi karena laju pertumbuhan kalus lebih lambat daripada laju pengurangan kadar air media akibat penguapan dan penyerapan air oleh eksplan. Oleh karena itu, penentuan waktu inisiasi kalus tidak dapat diamati dengan cara tersebut. Pada penelitian ini, inisiasi kalus diamati sebagai munculnya titik-titik tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama kalinya pada eksplan. Waktu inisiasi kalus rata-rata yang diperoleh dari hasil penelitian adalah 10,3 hari, dapat terlihat pada tabel I.

Tabel I. Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang

Jumlah botol sumber inokulum

Waktu inisiasi kalus ( hari )

6

9

3

12

1

13

Waktu inisiasi kalus rata – rata ( hari )

10,3


Waktu inisiasi kalus menunjukkan komposisi media yang sesuai untuk menumbuhkan kalus. Dalam penelitian ini, waktu inisiasi digunakan juga sebagai parameter waktu pemanenan kalus yang nantinya data pemanenan ini akan digunakan untuk analisis pola pertumbuhan kalus.

Gambar 3. Inisiasi kalus daun kamboja jepang

Waktu inisiasi kalus ini tidak dapat menggambarkan pertumbuhan kalus. Karena selama proses orientasi yang dilakukan oleh peneliti menunjukkan bahwa walaupun eksplan tanaman yang dipilih diperlakukan pada kondisi percobaan yang sama, namun eksplan tanaman yang satu dan yang lainnya memiliki kepotensialan yang berbeda untuk tumbuhnya kalus. Maka dari itu diperlukan analisis pertumbuhan kalus baik secara visual maupun penimbangan berat kalus selama pemanenan.

D. Subkultur dan Panen Subkultur dilakukan setelah kalus berumur 36 hari. Hal tersebut dilakukan untuk menjaga konsistensi pasokan nutrisi. Apabila subkultur terlambat dilakukan, massa kalus akan mati kehabisan nutrisi. Tanda-tanda kalus kehabisan


nutrisi dan harus segera dipindah ke dalam media yang baru adalah warna kalus menjadi coklat, media retak, dan selanjutnya sedikit demi sedikit kalus akan mengering. Waktu 36 hari yang digunakan dalam penelitian ini didapat dari hasil orientasi, di mana pada umur 36 hari kalus telah mulai menunjukkan tanda kekurangan nutrisi. Pada penelitian ini, kalus disubkultur cukup 1 kali sebelum dilakukan pemanenan. Kalus yang dipanen adalah hasil dari subkultur pertama. Hal ini dilakukan karena pada subkultur yang pertama eksplan sudah membentuk kalus seluruhnya. Bagian kalus yang disubkultur adalah bagian yang masih sehat yaitu bagian kalus yang belum mengalami kecoklatan atau “browning” dan memiliki titik tumbuh yang baik yaitu di bagian kalus terluar. Kalus yang telah mengalami“browning”

apabila ditanam tidak dapat tumbuh dan berkembang

membentuk kalus baru. Kalus bagian luar merupakan kalus yang masih tersusun oleh sel-sel meristem sehingga dapat tumbuh dan berkembang membentuk kalus baru. Dengan pemilihan ini, diharapkan kalus akan cepat berkembang setelah dipindah ke media baru. Dari hasil orientasi, ditemukan bahwa kalus bagian dalam terdiri dari sel-sel tua yang memiliki waktu dormansi sebelum mulai tumbuh apabila dipindahkan ke media baru. Tidak jarang, kalus tua ini justru mati setelah dipindah karena tidak mampu menyerap nutrisi dari media. Bobot kalus awal sebelum subkultur tidak dapat ditimbang karena resiko kontaminasi. Oleh karena itu, jumlah kalus awal dikendalikan dengan menyamakan ukuran kalus awal, yaitu ± 3 – 5 mm. Ukuran ini ditetapkan dengan


cara orientasi. Ukuran kalus awal yang lebih kecil menghasilkan pertumbuhan yang lebih pesat karena penyerapan nutrisi lebih optimal. Pemanenan dilakukan pada setiap 6 hari sekali selama 42 hari. Tujuan pemanenan adalah untuk mengetahui profil pertumbuhan kalus dan untuk mendapatkan kalus kering untuk dianalisis kandungan kimianya. Pemanenan dilakukan sampai hari ke-42, karena pada hari ke-36 hingga hari ke-42 kalus menunjukan fase stasioner, yang mana pada fase tersebut diharapkan kalus memiliki kandungan metabolit sekunder berupa glikosida jantung yang optimum.

E. Profil Pertumbuhan Kalus Pertumbuhan kalus tidak dapat diamati dengan penimbangan kalus setiap periode waktu tertentu karena adanya pengurangan bobot media akibat penguapan yang akan mengacaukan data. Kadang-kadang, bobot kalus terlihat berkurang semu karena laju penguapan media lebih besar daripada laju pertumbuhan kalus. Untuk mengatasi hal tersebut, analisis pertumbuhan kalus di dalam penelitian ini menggunakan dua cara, yaitu: 1.

Pembuatan

grafik

pola

pertumbuhan

kalus

berdasarkan

data

penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. Pada penelitian, dilakukan panen setiap 6 hari sekali sehingga didapatkan data bobot kalus awal dan akhir pada hari ke 6, 12, 18, dan seterusnya. Pertumbuhan dihitung sebagai selisih bobot kalus basah akhir ( n hari setelah penanaman) dengan bobot kalus basah awal (bobot kalus pada saat ditanam). Pola pertumbuhan kalus mengikuti persamaan kuva sigmoid dengan adanya fase lag,


fase eksponensial, dan fase stasioner. Kurva sigmoid menggambarkan hubungan antara umur kalus dengan pertambahan bobot kalus basah. Profil pertumbuhan kalus yang akan digunakan untuk melihat fase-fase pertumbuhan kalus dibuat dengan menghitung pertumbuhan sebagai fungsi pada persamaan kurva sigmoid yaitu :

Y =

a ⎛ a ⎞ (t N +1 − x ) + b ⎟e a −b ⎜ N ⎝ ⎠

Y adalah pertumbuhan menurut fungsi sigmoid dan X adalah umur kalus. Nilai a dan b diperoleh dari persamaan regresi linier pertumbuhan versus umur kalus sebagai nilai intercept dan slope. Dengan memasukkan nilai a dan b ke dalam persamaan maka diperoleh persamaan :

Y =

0 ,1730 (t N + 1 − x ) ⎛ 0 ,1730 ⎞ + 0 ,1494 − 0 ,1494 ⎟ e 0 ,1730 ⎜ ⎠ ⎝ N

Hasil dari perhitungan tersebut akan membentuk kurva sigmoid yang menggambarkan profil pertumbuhan.


Pertambahan Bobot Kalus Basah (Δg)

Profil Pertumbuhan Kalus Berdasarkan Bobot Kalus Basah 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

6

12

18

24

30

36

42

48

Umur Kalus (hari) Profil Pertumbuhan Kalus Hasil Penimbangan Profil Pertumbuhan Kalus Menurut Kurva Sigmoid Gambar 4. Profil pertumbuhan kalus kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah

Berdasarkan hasil plot antara umur kalus dan nilai y’ yang diperoleh dari persamaan kurva sigmoid, dilakukan uji t terhadap slope untuk menentukan keterwakilan data dari kurva sigmoid tersebut mampu mewakili pertumbuhan kalus yang diperoleh dari penimbangan dengan membandingkan antara t hitung dengan t tabel ( sebagai H1 ). Sy.x =

( y − y' ) 2 = 0,1501 n−2

Sb =

Syx

∑x

2

= 0,1138

tb =

b = -1,3128 Sb

t tabel = ± 1,943 Nilai t hitung yang diperoleh adalah -1,3128 , sedangkan nilai t tabel adalah ± 1,943. Nilai t hitung lebih besar daripada t tabel pada rentang penerimaan H0 sebelah kiri sehingga kurva sigmoid berada pada daerah penerimaan (H1 diterima ). Kurva sigmoid ini dapat mewakili pertumbuhan kalus yang diperoleh dari penimbangan.


Berdasarkan hasil plot antara kurva sigmoid dan grafik pertumbuhan kalus

yang

diperoleh

dari

penimbangan

dapat

menggambarkan

profil

pertumbuhan kalus. Fase-fase pertumbuhan kalus daun kamboja jepang dapat dilihat dari kurva sigmoid tersebut, yaitu: a. Fase lag. Fase lag yaitu fase penyesuaian dimana laju pertumbuhan kalus sangat kecil. Pada penelitian ini, fase lag terjadi pada hari ke-0 hingga hari ke-18. Pada fase lag, terjadi penyesuaian diri daun kamboja jepang dengan lingkungan sehingga laju pertumbuhan sangat kecil. Pada fase ini, kalus mulai tumbuh yang ditandai dengan adanya bintik berwarna putih kekuningan pada bagian pelukaan daun. b. Fase eksponensial. Fase eksponensial yaitu fase dimana laju pertumbuhan kalus sangat besar. Pada fase ini kalus dapat menyerap nutrisi dengan baik yang diperlukan untuk pembelahan sel. Fase eksponensial terjadi setelah hari ke-18 hingga hari ke-36 . c. Fase stasioner. Fase stasioner yaitu fase dimana laju pertumbuhan kalus mulai konstan. Pada fase ini nutrisi dalam media mulai berkurang sehingga penyerapan nutrisi juga berkurang dan laju pertumbuhan kalus sebanding dengan laju kematian. Pada penelitian ini fase stasioner dimulai pada hari ke-36 hingga hari ke-42. Metabolit sekunder diproduksi pada fase stasioner sehingga untuk memperoleh metabolit sekunder yang optimum panen perlu dilakukan mulai hari ke-36 hingga hari ke-42.


2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari. Kurva sigmoid yang menggambarkan hubungan antara umur kalus dengan pertambahan bobot kalus basah didukung oleh kurva pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot biomassa kalus. Data profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot biomassa kalus ditunjukkan pada lampiran 6.

F. Persen Kadar Air Kalus Persen kadar air adalah nilai persen dari pengurangan rerata bobot kalus basah dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot kalus basah. Persen kadar air kalus meningkat secara drastis pada hari ke-0 hingga hari ke-6. Hal tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap lebih banyak air pada fase awal pertumbuhan kalus yaitu pada fase lag akibat adanya penambahan ZPT (2,4-D) ke dalam media yang mana 2,4-D dapat menurunkan tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam disertai dengan kenaikan volume sel, sehingga kalus membesar dan persen susut pengeringanpun mengalami kenaikan. Selanjutnya persen kadar air kalus mulai konstan pada hari ke-6 hingga hari ke-42. Hal tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap sedikit air akan tetapi kalus lebih banyak melakukan aktivitas pembelahan sel. Persen kadar air kalus yang diperoleh dari hasil penelitian ditunjukkan pada gambar 5.


Pertambahan Kadar Air Kalus ( % )

% Kadar Air Kalus Pada Pertumbuhan Kalus Selama 42 Hari Pemanenan 100 80 60 40 20 0 0

10

20

30

40

50

Umur Kalus (hari) % Kadar Air Kalus Gambar 5. Persen kadar air kalus daun kamboja jepang

Kaitan antara data persen kadar air dengan data profil pertumbuhan adalah sebagai berikut: a. Fase lag ( hari ke 0 - 18 ) . Pada fase lag, kalus memiliki sel yang besar dan mengandung banyak air. b. Fase eksponensial ( hari ke 18 – 36 ). Pada fase eksponensial, sel kalus mulai membelah dengan ukuran sel yang kecil serta memiliki kandungan air yang banyak. c. Fase stasioner ( hari ke 36 – 42 ). Pada fase stasioner, kalus memiliki massa sel yang besar dan kandungan air yang banyak. Pada fase stasioner, apabila dilakukan pembudidayaan dalam media cair, diduga kalus daun kamboja jepang akan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang optimal karena media yang digunakan optimum dalam pertumbuhan.


G. Kromatografi Lapis Tipis Analisis kandungan kimia kalus dilakukan untuk membuktikan bahwa kalus mampu memproduksi glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Dengan demikian, kalus daun kamboja jepang dapat dikembangkan sebagai penghasil metabolit sekunder. Analisis kandungan kimia kalus dalam penelitian ini dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) berdasarkan pada pustaka Wagner (1984). Fase diam yang digunakan pada penelititan sistem KLT ini yaitu silika gel GF254. Fase gerak yang digunakan dalam analisis ini adalah campuran etil asetat : metanol : air dengan perbandingan 81 : 11 : 8 v/v . Karena fase diam lebih polar daripada fase gerak, maka kromatografi ini merupakan kromatografi fase normal. Pereaksi semprot yang digunakan dalam penelitian ini adalah pereaksi asam sulfat 97 % dan peraksi Kedde (Wagner et al., 1984). Glikosida jantung bersifat polar karena memiliki gugus gula (glikon). Namun kepolaran fase diam yang digunakan dalam penelitian lebih tinggi dibandingkan dengan glikosida jantung. Berdasarkan sifat fase gerak, fase diam, dan analit, diperkirakan bercak akan dapat bergerak mengikuti fase gerak. Dari pengamatan bercak hasil KLT, didapatkan data yang tercantum dalam tabel II.


Tabel II. Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v )

Totolan Ekstrak

Daun Kamboja Jepang

Kalus Kamboja Jepang

No. Bercak

Pereaksi Asam Sulfat (97%)

Perekasi Kedde

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 B1

Rf 0,09 0,40 0,50 0,75 0,80 0,90 0,12

Warna Kuning-coklat Hijau muda Hijau tua Coklat Hijau tua Hijau tua Kuning-coklat

Rf 0,09 0,40 0,50 0,65 0,71 0,80 0,90 0,12

Warna Kuning Kuning Kuning Merah muda Merah muda Kuning Hijau tua Kuning

B2

0,90

Hijau muda

0,90

Hijau muda

B

B

Keterangan gambar : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak: etil asetat : metanol :air (81 : 11 : 8 v/v) A : Ekstrak daun kamboja jepang B : Ekstrak kalus daun kamboja jepang Deteksi

:asam

sulfat

97

%,

pemanasan selama 1000C selama 3-5 menit Jarak pengembangan : 10 cm Gambar 6. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat ( 97 % )

Diketahui bahwa larutan penyemprot asam sulfat 97% mempunyai sifat positif terhadap steroid, glikosida jantung, alkaloid, gibberellin, dan lain-lain (Jork


et all, 1990). Wagner (1984) menyatakan bahwa reaksi warna yang terjadi pada identifikasi senyawa glikosida jantung positif bila timbul gradasi warna dari merah atau coklat sampai hijau. Dari hasil penelitian di atas, ekstrak kalus daun kamboja jepang menghasilkan 2 bercak yaitu B1 dan B2 dengan warna kuning-coklat dan hijau muda. Kedua bercak tersebut mirip dengan bercak ekstrak daun kamboja jepang tanaman asalnya yaitu A1 dan A8 dengan warna kuning-coklat dan hijau tua. Namun bercak-bercak yang diperoleh memiliki warna yang berbeda dari pustaka acuan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tidak dibuktikan ekstrak kalus daun kamboja jepang mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Keterangan gambar : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak: etil asetat : metanol :air (81 : 11 : 8 v/v) A : Ekstrak daun kamboja jepang B : Ekstrak kalus daun kamboja jepang Deteksi : pereaksi Kedde Jarak pengembangan : 10 cm

Gambar 7. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde

Diketahui juga bahwa pereaksi semprot Kedde mempunyai sifat positif terhadap glikosida jantung (Anonim, 1978). Wagner (1984) menyatakan bahwa


reaksi warna yang terjadi pada identifikasi senyawa glikosida jantung positif bila timbul warna dari biru sampai merah. Dari hasil KLT dengan pereaksi semprot Kedde, ekstrak kalus daun kamboja jepang menghasilkan 2 bercak yaitu B1 dan B2 dengan warna kuning dan hijau muda. Kedua bercak tersebut mirip dengan bercak ekstrak daun kamboja jepang tanaman asalnya yaitu A1 dan A8 dengan warna kuning dan hijau tua. Namun bercak-bercak yang diperoleh memiliki warna yang berbeda dari pustaka acuan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tidak dibuktikan ekstrak kalus daun kamboja jepang mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Secara morfologi pertumbuhan kalus daun kamboja jepang pada media Murashige – Skoog menunjukkan hasil yang baik, hal ini ditunjukkan dengan pertumbuhan kalus mengikuti kurva sigmoid. Namun secara fisiologis kalus yang dihasilkan pada media MS tidak dapat memproduksi metabolit sekunder berupa glikosida jantung, hal ini ditunjukkan pada hasil uji KLT. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pemilihan media tanam dalam penelitian ini tidak sesuai di dalam menghasilkan metabolit sekunder berupa glikosida jantung.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN Berdasarkan data yang dikumpulkan dalam penelitian ini, maka dapat ditarik kesimpulan : 1. Penanaman eksplan daun kamboja jepang dapat membentuk kalus yang dapat tumbuh dengan baik dalam media tumbuh Murashige-Skoog dengan penambahan ZPT berupa 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan waktu inisiasi kalus rata-rata yang diperoleh dari hasil penelitian adalah 10,3 hari. 2. Pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan penimbangan bobot kalus basah dan kering mengikuti pola pertumbuhan kurva sigmoid : fase lag, fase eksponensial dan fase stasioner. 3. Hasil KLT dengan menggunakan pereaksi semprot asam sulfat 97% dan pereaksi semprot Kedde menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

B. Saran Dari penelitian ini, perlu dilakukan lanjutan penelitian tentang : 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemilihan media yang tepat untuk budidaya secara in vitro daun kamboja jepang sehingga dapat dihasilkan metabolit sekunder berupa glikosida jantung .

64


DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1978, Dyeing Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography, no.112 dan 305, E. Merck, Darmstadt, Federal Republic of Germany. Anonim, 2006, Adenium, http://en.wikipedia.org/wiki/Adenium, diakses pada tanggal 27 November 2006. Atawodi, S.E., Bulus T.I.S., Ameh D.A., Nok Aj., Mamman M., Galadima M., 2003, In vitro trypanocidal effect of methanolic extract of some Nigerian savannah plants, Afr.J.Biotechnol. 2(9): 317-321. Backer, C.A. and R.C.Bakhuizen, 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only), Vol.II, 218-221,225, N.V.P.Noordhoff-Groningen-The Netherlands. Dicosmo, F. and M. Misawa, 1995, Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolit production, Biotechnol, Adv.13(3): 425-453. Dixon, R.A., 1985, Plant Cell Culture, A practical Approach, 3-11, IRL Press, Oxford, Washington DC. Doods, J.H. dan Roberts, L.W., 1985, Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge University Press, Cambridge. Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Journal Of Pharmaceutical Sciencis, Vol.55, No. 3., p.260-262.

Plants,

Freiburghaus F., Kaminsky R., Nkuna M.H.N., Brun R., 1996, Evaluation of African medicinal for their in vitro trypanocidal activity, J.Ethnopharmacol. 55: 1-11. George, E.F., and Sherrington, P.D.., 1984, Plant Propagation by Tissue Culture, p.301-310, Eastern Press, Reading. Hendaryono, D.P. Sriyanti dan A. Wijayani, 1994, Teknik Kultur Jaringan, 5967,69, 89-94, Kanisius, Yogyakarta. Jork,H., W. Funk, W. Fischer and H. Wimmer, 1990, Thin-Layer Chromatography : Reagent and Detection Methods, Vol. 1a., p.410-415, Trans: Frank & Jennifer A. Hampson, VCH Publishers, New York. Katuuk, J.R.P., 1989, Tehnik Kultur Jaringan Dalam Mikropropagasi Tanaman, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Proyek Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan, Jakarta, Hlm:3,37-62,90-109.


Mgbojikwe, L.O. and Z.S.C. Okoye, 2001, Acaricidal Efficacy of the Aqueous Stem Bark Extract of Adenium obesum on the Various Life Stages of Cattle Ticks, Nig.J.Exptl.Appl.Biol. Vol. 2, No. 1, pp. 39-43. Moffat, A.C., 2004, Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, http://www.medicinescomplete.com/mc/clarke/current/images/clk0536c001. gif, diakses pada tanggal 12 Februari 2007. Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 223-227, Airlangga University Press, Surabaya. Nakamura, M., M. Ishibashi, E. Okuyama, T. Koyano, T. Kowithayakorn, M. Hayashi and K. Komiyama, 2000, Cytotoxic Pregnanes from Leaves of Adenium obesum, Natural Medicines 54(3): 158-159. Puspitasari, A. dan Soegihardjo, C.J., 2002, Optimasi Media Penumbuh Kalus Sebagai Langkah Awal Upaya Budidaya In vitro Tanaman Vitex trifolia L., Majalah Farmasi Indonesia, 21-25. Ramachandra Rao, S. and G.A. Ravishankar, 2002, Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites, Biotechnol, Adv 20:101-153. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 152-158, ITB Press, Bandung. Sajc, L., D. Grubisic, and G. Vunjak-Novakovic, 2000, Bioreactors for plant engineering: an outlook for further research, Biochem. Eng. J. 4: 89-99 Salisbury, F.B., and Ross, C.W., 1995, Fisiologi Tumbuhan : Perkembangan Tumbuhan dan Fisiologi Lingkungan, Jilid III, Edisi IV, hal 14-16, ITB, Bandung. Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, 4th Ed., 326, Swedish Pharmaceutical Press, Sweden. Santoso,U. dan Nursandi,F., 2001, Kultur Jaringan Tanaman, Ed. I, 15 – 139, UMM Press, Malang. Sastrohamidjojo, H., 2001, Kromatografi, 26-36, Laboratorium Analisis Kimia Fisika Pusat UGM, Yogyakarta. Shoppee, C.W., 1964, in “ Symposium on Phytochemistry,” Athur, H.R., ed., p.86, Hongkong University Press, Hongkong,. Soenanto, H., 2005, Pesona Adenium, 3,10-13, Kanisius, Yogyakarta.


Stahl, E. (Ed), 1969, Thin Layer Chromatography : A Laboratory Handbook, 2nd Ed., 6, 341-346 , diterjemahkan oleh M.R.F. Ashworth, Springer-Verlag, New York. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, p.195-223, (Transl: Scoot, Th.A.), Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo. Wetherell, D.F., 1982, Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro, diterjemahkan oleh dra. Koensoemardiyah S. Su., Apt., 39-44, Avery Publishing Group Inc., USA. Yamauchi T. and Abe F., 1990, Cardiac glycosides and pregnanes from Adenium obesum (studies on constituents of Adenium. I)., Chem Pharm Bull, 38 (3):669-72. Yusnita, 2003, Kultur Jaringan: Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien, 5,56-62, PT Agromedia Pustaka: Jakarta. Yuwono, T., 2006, Bioteknologi Pertanian, 169, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.


Lampiran 1. Surat Determinasi Tumbuhan


Lampiran 2. Foto-foto Hasil Penelitian

Gambar 8. Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)

Gambar 9. Foto daun kamboja jepang


Gambar 10. Foto kalus siap subkultur

Gambar 12. Foto kalus basah

Gambar 11. Foto kalus siap panen

Gambar 13. Foto kalus kering

Gambar 14. Foto serbuk kalus


Gambar 15. Foto hasil KLT secara visual

Keterangan gambar: A. Ekstrak daun kamboja jepang. B. Ekstrak kalus daun kamboja jepang.


Gambar 16. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% )



Gambar 17. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde.



Lampiran 3. Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ). Makronutien

mg / L

Kalium nitrat ( KNO3 )

1900

Ammonium nitrat ( NH4NO3 )

1650

Kalsium dikloro dihidrat ( CaCl2.2H2O )

440

Magnesium sulfat heptahidrat ( MgSO4.7H2O )

370

Kalium dihigrogen fosfat ( KH2PO4 )

170

Mikronutien

mg / L

Mangan sulfat tetrahidrat ( MnSO4.4H2O )

22,3

Seng sulfat heptahidrat ( ZnSO4.7H2O )

8,6

Asam borat ( H3BO3 )

6,2

Kalium iodide ( KI )

0,83

Tembaga (II) sulfat pentahidrat (CuSO4.5H2O )

0,025

Natrium molibdat dihidrat ( NaMoO4.2H2O )

0,25

Kobalt (II) klorida heksahidrat (CoCl2.6H2O )

0,025

Besi (II) sulfat heptahidrat ( FeSO4.7H2O )

27,8

Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat ( NaEDTA.2H2O )

37,3

Vitamin dan asam amino

mg / L

Myo-inositol

100

Thiamin HCl

0,1

Asam nikotinat

0,5

Piridoksin HCl

0,5

Glisin

2

Sumber karbon

mg / L

Sukrosa

30000

Zat pengatur tumbuh

mg / L

Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat

4


Zat pemadat dan pelarut

mg / L

Agar

11000

Akuades

ad 1 L

pH

5,2 – 5,6


Lampiran 4. Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam media tumbuh MS. Umur No. kalus Botol (hari)

6

12

18

24

30

36

42

1 7 13 19 25 31 2 8 14 20 26 32 3 9 15 21 27 33 4 10 16 22 28 34 5 11 17 23 29 35 6 12 18 24 30 36 37 38 39 40 41 42

Bobot kalus basah awal (g) 0,2275 0,2585 0,2459 0,1989 0,2565 0,2815 0,1645 0,2649 0,3307 0,2743 0,2699 0,2543 0,2139 0,3497 0,2909 0,2269 0,2501 0,2925 0,2481 0,4097 0,3091 0,2522 0,3047 0,2715 0,4108 0,3809 0,3221 0,3279 0,2097 0,2850 0,2332 0,3325 0,4520 0,3918 0,3345 0,2603 0,3719 0,3296 0,3516 0,3413 0,2289 0,2334

Rata-rata bobot kalus basah awal (g)

0,2448

0,2598

0,2707

0,2992

0,3227

0,3341

0,3094

Bobot kalus basah akhir (g) 0,2594 0,3163 0,3041 0,2832 0,2946 0,3176 0,2648 0,3444 0,3504 0,3369 0,3024 0,2571 0,2769 0,3702 0,4903 0,279 0,462 0,3242 0,9372 0,7350 0,5389 0,5608 0,6888 0,5797 1,4450 1,0869 0,9751 0,9851 0,9654 1,1467 1,8759 1,4615 1,5795 1,8697 1,3046 1,4878 1,2136 1,0095 1,4478 1,7060 1,1165 1,4607

Rata-rata bobot kalus basah akhir (g)

0,2959

0,3093

0,3671

0,6734

1,1007

1,5965

1,3257

Bobot kalus kering (g) 0,0226 0,0277 0,0276 0,0254 0,0222 0,0248 0,0173 0,0290 0,0292 0,0256 0,0230 0,0195 0,0211 0,0299 0,0385 0,0197 0,0393 0,0284 0,0698 0,0532 0,0437 0,0469 0,0514 0,0479 0,0892 0,0728 0,0717 0,0641 0,0694 0,0735 0,1007 0,0901 0,0957 0,1026 0,0913 0,1007 0,0782 0,0710 0,1049 0,1059 0,0807 0,1022

Rata-rata bobot kalus kering (g)

Pertumbuhan (g)

0,0251

0,0511

0,0239

0,0496

0,0295

0,0964

0,0522

0,3742

0,0735

0,7780

0,0968

1,2624

0,0905

1,0162


Lampiran 5. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah. Hari Pemanenan 0 6

p 0,0000 0,0511

p2 0,0000

Δp

Rs = Δp/(Δh.p)

p.Rs

0,0511

0,0000

0,0000

0,0026

0,0433 -0,0015

12 18 24

0,0496 0,0964 0,3742

-0,0049

0,7780

0,1144 0,0469

0,1576

0,0078

0,2778

0,4800

0,0463

0,0093

0,2736

0,1400

0,5399 0,1799

0,0673

0,6052

0,8239 0,4845

36

1,2625

1,5938

42

1,0162

1,0327

0,1038

0,0807 1,0126

-0,2462

-0,0325

a = 0,1730 ( nilai intercept dari rumus regresi linier ) b = -0,1494 ( nilai slope dari rumus regresi linier )

Y =

-0,0003

0,0025

0,4038 30

Y’ 0,0157

0 ,1730 (t N + 1 − x ) ⎛ 0 ,1730 ⎞ − 0 ,1494 ⎟ e 0 ,1730 + 0 ,1494 ⎜ ⎝ N ⎠

-0,0410 1,1020


Data Uji t profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah. No

X

Y

Y’

( Y-Y’ )

( Y-Y’ )²

X=Y-Yrata-rata

X²

1

0

0,0000

0,0157

-0,0157

0,0002465

-0,4535

0,2057

2

6

0,0511

0,0433

0,0078

6,094E-05

-0,4024

0,1619

3

12

0,0496

0,1144

-0,0648

0,0041984

-0,4039

0,1632

4

18

0,0964

0,2736

-0,1772

0,0313913

-0,3571

0,1275

5

24

0,3742

0,5399

-0,1657

0,027466

-0,0793

0,0063

6

30

0,7780

0,8239

-0,0460

0,0021129

0,3245

0,1053

7

36

1,2625

1,0126

0,2499

0,0624293

0,8090

0,6544

8

42

1,0162

1,1020

-0,0857

0,0073482

0,5627

0,3167

Sy.x =

Sb =

tb =

( y − y' ) 2 = 0,1501 n−2 Syx

∑ x2

= 0,1138

b = -1,3128 Sb

t tabel = ± 1,943


Lampiran 6. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering. Hari Pemanenan 0 6 12

p 0,0000 0,0251 0,0239

p2 0,0000

Δp

Rs = Δp/(Δh.p)

p.Rs

0,0251

0,0000

0,0000

-0,0011

-0,0074

-0,0002

0,0056

0,0386

0,0009

0,0006

0,0242

0,0006

18

0,0295

0,0009

24

0,0522

0,0027

30

0,0735

0,0054

36

0,0969

0,0094

0,0299 0,0363 0,0227

0,0681

0,0036

0,0531

0,0039 0,0587

-0,0064

-0,0110

0,0082

a = 0,0467 ( nilai intercept dari rumus regresi linier ) b = -0,4239 ( nilai slope dari rumus regresi linier )

Y =

0,0038 0,0510

0,0234 0,0905

0,1281

0,0434 0,0213

42

Y’ 0,0193

0 , 0467 (t − x ) ⎛ 0 , 0467 ⎞ − 0 , 4239 ⎟ e 0 , 0467 N +1 + 0 , 04239 ⎜ ⎝ N ⎠

-0,0011 0,0662


Data Uji t profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering. No 1 2 3 4 5 6 7 8

X 0 6 12 18 24 30 36 42

Sy.x =

Sb =

tb =

Y 0.0000 0.0251 0.0239 0.0295 0.0522 0.0735 0.0969 0.0905

Y’ 0.0193 0.0242 0.0299 0.0363 0.0434 0.0510 0.0587 0.0662

( y − y' ) 2 = 0,0227 n−2

Syx

∑ x2

= 0,2444

b = -1,7344 Sb

t tabel = ± 1,943

( Y-Y’ ) -0.0193 0.0009 -0.0059 -0.0068 0.0087 0.0225 0.0382 0.0243

( Y-Y’ )² 0.0003721 7.954E-07 3.501E-05 4.67E-05 7.608E-05 0.0005054 0.0014580 0.0005884

X=Y-Yrata-rata -0.0489 -0.0239 -0.0250 -0.0194 0.0032 0.0245 0.0479 0.0416

X² 0.0024 0.0006 0.0006 0.0004 0.0000 0.0006 0.0023 0.0017


Lampiran 7.Data persen kadar air kalus kamboja jepang Persen kadar air kalus dihitung dengan rumus: % Kadar air = rerata bobot kalus basah – rerata bobot kalus kering x 100% rerata bobot kalus basah Hari pemanenan

Rerata bobot kalus basah (g)

Rerata bobot kalus kering (g)

Kadar air (%)

0

0

0

0

6

0,2959

0,0251

91,5333

12

0,2998

0,0239

92,0178

18

0,3671

0,0295

91,9686

24

0,6734

0,0522

92,2557

30

1,1007

0,0735

93,3270

36

1,5965

0,0969

93,9336

42

1,3257

0,0905

93,1746


BIOGRAFI PENULIS

Nama lengkap penulis adalah Melissa Wijaya, dilahirkan di Cirebon pada tanggal 13 Oktober 1985, anak kedua dari dua bersaudara pasangan Kusnadi Widjaja dan Tuti Setiawati. Penulis menyelesaikan pendidikan TK Kristen BPK Penabur Jamblang tahun 1989-1991, pendidikan SD Kristen BPK Penabur Jamblang tahun 1991-1997, kemudian pendidikan SLTP Kristen BPK Penabur Cirebon tahun 1997-2000, dilanjutkan SMU Kristen BPK Penabur Cirebon tahun 2000-2003, selepas SMU penulis masuk ke perguruan tinggi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis pernah aktif sebagai asisten praktikum, antara lain adalah praktikum farmakologi dasar dan toksikologi dasar pada tahun 2006/2007. Pada tahun 2005/2006 penulis mengerjakan Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian dengan judul Optimasi Komposisi 2,4 Diklorofenoksi Asetat dan Furfuryl Amino Purine dalam Penghasilan Glikosida Jantung secara In Vitro dari Kalus Kamboja Jepang ( Adenium Obesum ). Penulis telah menyelesaikan skripsi dengan judul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Frossk.) Roem. & Schult. ) Dalam Media Tumbuh Murashige-Skoog”.

SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Recommend Documents