S KENOVACÍ ELEKTRO CHEMICKÁ MIKROSKOPIE Výukový materiál
Tyto materiály vznikly díky finanční podpoře Fondu rozvoje vysokých škol v rámci grantového projektu FRVŠ G4 916/2012 „Zavedení techniky skenovacího elektrochemického mikroskopu do výuky oboru analytické biochemie“. Řešitel: Mgr. David Kovář Spoluřešitelé: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc., Mgr. Jana Mrázková
Verze 12-2012 Materiály jsou průběžně doplňovány. Jakékoliv dotazy, chyby či faktické nedostatky konzultujte, prosím, s autorem
[email protected]
Obsah Úvodem ............................................................................................................................................................... 5 I
Teorie .............................................................................................................................................................. 6 1
Stručný úvod do elektrochemických metod ............................................................................................... 7 1.1
Základní elektrochemické pojmy........................................................................................................... 7
1.2
Elektrody ............................................................................................................................................... 8
1.3
Elektrochemický článek ...................................................................................................................... 11
1.4
Rozdělení elektroanalytických metod .................................................................................................. 11
2
Mikroskopie skenující próbou ................................................................................................................. 17 2.1
Skenovací tunelovací mikroskopie ...................................................................................................... 19
2.2
Mikroskopie atomárních sil ................................................................................................................. 20
2.3
Mikroskopie v blízkém optickém poli ................................................................................................. 21
3
Skenovací elektrochemická mikroskopie ................................................................................................. 23 3.1
Poziční systém ..................................................................................................................................... 24
3.2
Elektrochemická instrumentace ........................................................................................................... 25
4
Mikroelektrody ........................................................................................................................................ 26 4.1
Základní charakteristiky ...................................................................................................................... 26
4.2
Pracovní módy SECM a elektrochemie na ME ................................................................................... 26
4.3
Výroba mikroelektrod.......................................................................................................................... 29
5
Aplikace metody ...................................................................................................................................... 31
6
Použitá literatura ...................................................................................................................................... 37
II
Praktické cvičení ........................................................................................................................................... 39 1
Příprava měřených povrchů ..................................................................................................................... 40
2
Příprava mikroelektrod ............................................................................................................................ 41 2.1
Výroba ................................................................................................................................................. 41
2.2
Charakterizace ..................................................................................................................................... 42
3
Průběh měření .......................................................................................................................................... 43
4
Vyhodnocení naměřených dat .................................................................................................................. 44
III
Practical workshop ........................................................................................................................................ 46
1
Preparation of measured surfaces............................................................................................................. 47
2
Preparation of microelectrodes ................................................................................................................ 48 2.1
Production............................................................................................................................................ 48
2.2
Characterisation ................................................................................................................................... 49
3
The measurement ..................................................................................................................................... 50
4
Data evaluation ........................................................................................................................................ 51
IV Přílohy ........................................................................................................................................................... 53 Příloha I. – Bezpečnostní listy chemikálií používaných ve cvičení .................................................................. 54
3
Příloha II. – Seznam vyučovaných předmětů na PřF MU ve vztahu k předkládané problematice.................... 55
4
Úvodem Předkládaný text si klade za cíl seznámit čtenáře se základy metodiky skenovacího elektrochemického mikroskopu, nastínit široké pole aplikací a v neposlední řadě jednoduchou formou přiblížit praktické aspekty metody ve cvičení, které je hlavní součástí tohoto výukového bloku. Pojem nanotechnologie je skloňován v posledních letech stále častěji a dopady této vědní disciplíny můžeme pozorovat v každodenním životě. Pro pochopení dějů, které většinou v makrosvětě probíhají naprosto odlišně, musíme často nahlédnout do detailů mikrosvěta. Nástroji, které nám umožňují tyto vědecké výpravy na „území lvů“ jsou často nejrůznější druhy mikroskopií, které s klasickým pojmem optického nebo elektronového mikroskopu mají pramálo společného. V optickém mikroskopu (OM) lze studovaný objekt pozorovat přímo soustavou skleněných čoček. Jiná situace už nastává v případě elektronového mikroskopu (EM), kde jsou fotony nahrazeny proudem elektronů a skleněné čočky pomocí elektromagnetických čoček. Zvětšení dosahuje hodnoty 103× v případě OM a 106 v případě transmisní EM, přičemž užitečné zvětšení bývá v reálu nižší. Obě uvedené metody poskytují pouze 2D pohled na vzorek a 3D zobrazení je výsledkem časově náročného a pracného procesu skládání řady 2D. Při použití EM již nelze hovořit o „přímém“ pozorování, neboť pozorovaný obraz je výsledkem digitálního zpracování signálu a je nám tedy pouze zprostředkován. Obdobně je signál vyhodnocován u metodik, které využívají sondy (próby) pro skenovaní studovaného povrchu. Právě tyto techniky představují drtivou většinu metodik používaných v nanotechnologiích. Jejich výhodou je dosažení většího zvětšení (až na úroveň atomů a vazeb mezi nimi) a často pseudo-3D zobrazení zkoumaného vzorku. Skenovací elektrochemická mikroskopie svou „jednoduchostí“ a instrumentální nenáročností představuje ideální techniku pro seznámení s těmito metodami. Většina těchto zařízení jsou robustní a drahé přístroje a práce s nimi je vyhrazena akademickým pracovníkům a několika málo vyvoleným studentům, kteří si prostřednictvím nich plní své povinnosti. Hlavní náplní tohoto cvičení je praktické seznámení studentů se zařízením SECM. Studenti tak budou mít příležitost provést vlastní modelové měření: od přípravy vzorku, přes práci s mikroskopem až po finální vyhodnocení dat. Teoretické přednášky a cvičení s demonstrační ukázkou nemohou konkurovat skutečným praktickým cvičením byť by byla sebelépe koncipována. O metodě skenovacího elektrochemického mikroskopu pojednává již druhé vydání poměrně obsáhlé monografie [1] a celá řada rešeršních prací [REF]. Pro potřeby výuky jsou však zbytečně obsáhlé a zejména rešerše neposkytují ideální materiál pro začátečníky. Tento materiál se snaží skloubit teoretický úvod do metody spolu s rešerší o aplikacích samotné metody. Text není zcela vyčerpávající a vzhledem ke svému zaměření snad ani být nemůže. Případné zájemce odkazuje autor na literaturu a jiné elektronické zdroje. Prvá kapitola teoretického textu se věnuje teorii elektrochemických metod. Další kapitola již pojednává o teorii skenovací elektrochemické mikroskopie. Poslední teoretická kapitola stručně shrnuje možnosti použití metody a publikované praktické aplikace. Praktická část je psána jak v českém, tak anglickém jazyce a obsahuje protokoly pro práci ve cvičení. V příloze III lze nalézt seznam předmětů vyučovaných na PřF MU ve vztahu k předkládané problematice, které mohou prohloubit znalosti v dotčených oblastech.
5
I TEORIE
6
1
Stručný úvod do elektrochemických metod
Vzhledem ke značné nehomogenitě studentů předkládáme stručný úvod do elektrochemie a elektroanalytických metod. Pro neznalé není uvedený přehled zcela kompletní a pro další informace je třeba sáhnout po jiné odborné literatuře. Naopak znalý čtenář jistě promine a následující kapitolu přeskočí. Kapitola však může sloužit jako stručný přehled pro rychlé opakování.
1.1
Základní elektrochemické pojmy
Elektrický proud „I“ patří mezi základní jednotky SI. Elektrický proud je roven celkovému množství elektrického náboje, které projde průřezem vodiče za jednotku času. Jednotkou je ampér (A): 1 A je takový proud, který při průchodu dvěma rovnoběžnými přímkovými vodiči, nekonečně dlouhými, zanedbatelného kruhového průřezu, umístěnými ve vakuu ve vzájemné vzdálenosti 1 m, vyvolá mezi těmito vodiči sílu rovnou 2·10-7 N (newton) na 1 m délky. Proud v běžných elektrických rozvodech může být stejnosměrný nebo střídavý. Dohodnutý směr toku stejnosměrného proudu je od kladného pólu zdroje k zápornému. Skutečný směr toku elektronů v pevných vodičích je však opačný!!! Elektrický proud se měří ampérmetrem, který se v obvodu zapojuje sériově. Elektrické napětí „U“ je definováno jako práce vykonaná elektrickou silou při přemístění kladného jednotkového elektrického náboje mezi dvěma body v prostoru. Lze ho chápat i jako rozdíl elektrických potenciálů v obou bodech v prostoru. Jednotkou je volt (V): 1 V je takové napětí, které je mezi konci vodiče, do kterého konstantní proud 1 A dodává výkon 1 W. Odpor vodiče je v tomto případě 1 Ω. Jednotka volt je odvozena z jednotek soustavy SI: V (volt) = m2·kg·s-3·A-1. Napětí (součástky) se měří voltmetrem, který se v obvodu zapojuje paralelně. Elektrický náboj „Q“ vyjadřuje velikost schopnosti působit elektrickou silou. Elektrický náboj vyjadřuje určitou vlastnost částic, která je spojována se vznikem vzájemného působení mezi tělesy (částicemi) podobným způsobem jako je hmotnost spojována s existencí gravitačního pole. Přítomnost elektrického náboje je tedy nutná pro vznik elektrického nebo magnetického pole. Jednotkou je coulomb (C). Jednotka odvozená z SI: C (coulomb) = A·s. Elektrický náboj se měří pomocí elektrometru, nebo elektroskopu. Elektrický odpor „R“ charakterizuje schopnost elektrických vodičů vést elektrický proud. Velikost odporu je dána materiálem, tvarem i teplotou vodiče. Velikost odporu je přímo úměrná délce vodiče a nepřímo úměrná průřezu vodiče, materiálu a teplotě. Odpor nabývá vždy kladných hodnot. Jednotkou je ohm (Ω). Také je jednotkou odvozenou: Ω (ohm) = V·A-1 = m2 kg·s-3 A-2 Elektrická vodivost „G“ je převrácenou hodnotou odporu. Jednotkou je siemens (S): S (siemens) = Ω-1. Siemens je odvozená jednotka: S (siemens) = s3 A2·m-2 kg-1
7
1.2
Elektrody
Elektroda (poločlánek) je soustava tvořená vodivými fázemi (pevnými, kapalnými, plynnými), které jsou ve vzájemném kontaktu. Na styku těchto fází (fázových rozhraních) i uvnitř těchto fází se mohou pohybovat ionty, elektrony i molekuly a mohou zde probíhat reakce (chemické, redoxní) případně výměna nabitých částic – výsledkem je pak potenciálový rozdíl mezi fázemi. Vodivost jednotlivých fází je zpravidla odlišná. Jako poločlánek (elektrodu) lze označit i soustavu tvořenou dvěma vodiči - vodičem 1. druhu (přenašečem jsou elektrony – kovy) a vodičem 2. druhu (přenašečem jsou ionty – elektrolyty). Rozlišujeme několik základních druhů elektrod. V grafickém vyjádření poločlánku vyjadřujeme jednotlivá fázová rozhraní svislou čarou „|“ (dle konvence IUPAC). Z hlediska polarizovatelnosti lze elektrody dělit na elektrody polarizovatelné (lze jim udělit z vnějšího zdroje určitý potenciál), a elektrody nepolarizovatelné, jež si udržují svůj potenciál na konstantní hodnotě bez ohledu na zvnějšku vkládané napětí. Jako polarizovatelné elektrody se používají elektrody 1. druhu s malým povrchem. Jako nepolarizovatelné pak elektrody 2. druhu (proto se používají jako referentní) nebo elektrody 1. druhu s velkým povrchem. Jako depolarizátor pak označujeme látku, která se při určitém potenciálu může oxidovat / redukovat (depolarizují elektrodu) a elektrodou může téci proud. Dle konstrukce lze dělit elektrody následujícím způsobem: 1.2.1
Elektrody 1. druhu
Jsou kovové elektrody (ve formě drátku, tyčinky, plíšku) ponořené do roztoku obsahující ionty téhož kovu. Mohou být zhotoveny i z platiny, která se elektrolyticky pokoví požadovaným kovem. Kovové ionty z roztoku se redukují volnými elektrony z kovové elektrody a dochází k vyloučení elementárního kovu na povrchu elektrody, současně však běží opačná reakce, kdy ionty kovu přechází z elektrody do roztoku. Při prvním ději se elektroda díky úbytku elektronů nabíjí kladně, ve druhém případě se nabíjí záporně v důsledku ztráty kladně nabitých iontů. Nutno podotknout, že oba děje jsou ve vzájemné rovnováze a celkový výsledný náboj elektrody závisí na převládajícím ději. Potenciál elektrody 1. druhu lze popsat Nernstovou rovnicí:
·
(1.1)
E0 . . . . standardní elektrodový potenciál R . . . . plynová konstanta (8,314441 J.K-1.mol-1) F . . . . Faradayova konstanta (96485 C.mol-1) T . . . . termodynamická teplota z . . . . počet vyměňovaných elektronů . . . . aktivita iontů kovu v roztoku. Do této kategorie patří i elektrody plynové. Jsou tvořeny plynem, který je v kontaktu se svými ionty obsaženými v roztoku. Méně používanými jsou kyslíková a chlórová elektroda. Nejznámější a patrně také nejdůležitější plynovou elektrodou je vodíková elektroda. Je realizována platinovým drátkem pokrytým elektrochemicky vyloučenou amorfní platinou (platinovou
8
černí) ponořeným eným do roztoku HCl (1,18 M, je pod tlakem 0,1 MPa sycena plynným vodíkem.
). Standardní vodíková elektroda (SHE)
Amorfní platina katalyzuje následující reakci:
Popis poločlánku je naznačen čen zde:
Obrázek 1: Různé ůzné konstrukce standardní vodíkové elektrody
Standardní redoxní potenciál vodíkové elektrody je dle definice roven nule při p všech teplotách! (1.2) Elektrodový potenciál jakékoliv jiné elektrody je definován jako rovnovážné napětí nap článku (EMN) tvořeného měřenou ěřenou elektrodu (jako katodou - vpravo)) a standardní vodíkovou elektroelektr dou (jako anodou - vlevo).
Standardní elektrodové potenciály jsou tabelovány a pro každý druh kovu jsou neměnnou nem konstantou. V tabulkách jsou tyto hodnoty doplněny dopln ny uvedením formální poloreakce, vyjádřevyjád né jako redukce daného redoxního páru. Při P jednotkové aktivitě iontů v roztoku, je potenciál roven standardnímu elektrodovému potenciálu.
9
1.2.2
Elektrody 2. druhu
Jsou kovové elektrody potažené málo rozpustnou solí tohoto kovu ponořené do roztoku dobře rozpustné soli se společným aniontem. Aktivita kovového kationtu je pak dána součinem rozpustnosti málo rozpustné soli. Nernstova rovnice má proti předchozímu případu mírně odlišný tvar: ·
(1.3)
Ks . . . . součin rozpustnosti málo rozpustné soli . . . . aktivita aniontu Elektrody 2. druhu jsou využívány jako referátní elektrody. Mezi nejčastější patří elektroda argentchloridová tvořena stříbrným drátkem pokrytým elektrolyticky vyloučeným chloridem stříbrným vnořeným do roztoku chloridových iontů. Kalomelová elektroda je tvořena rtutí (do níž je ponořen svodný platinový drátek) s vrstvičkou chloridu rtuťnatého (kalomelu) a je taktéž vnořena do roztoku chloridových iontů. 1.2.3
Elektrody 3. druhu
Jako elektrody 3. druhu označujeme oxidačně-redukční elektrody realizované ušlechtilým kovem (Pt, Au), nebo grafitem (uhlíková elektroda) ponořeným do roztoku obsahující redukovanou i oxidovanou formu dané látky. Potenciál těchto elektrod je odvislí od vzájemného poměru aktivit obou forem látky (Ox + ze Red). Nernstova rovnice je ve tvaru: (1.4)
· kde: 1.2.4
a
jsou aktivity složek daného redoxního páru.
Iontově selektivní elektrody
Jako iontově selektivní elektrody (ISE) označujeme ty, které vykazují selektivitu jen vůči určitým iontům. Jedná se o membránové elektrody. Tyto membrány mohou být tuhé (málo rozpustné sloučeniny jako Ag2S, AgCl, LaF3) nebo kapalné (porézní destička s kapalným iontoměničem). Membrána odděluje vnitřní roztok definované koncentrace analyzovaných iontů od vnějšího roztoku vzorku. V důsledku rozdílných koncentrací iontu na obou stranách membrány dochází k přenosu elektrického náboje membránou. Mechanismus iontové výměny zajišťuje výměnu iontů mezi vzorkem a membránou a to bez změny oxidačního čísla. Na obou stranách membrány se tak vytváří tzv. membránový (Donnanův) potenciál. Tento potenciál je na vnitřní straně konstantní a rozdíl obou potenciálů tak určuje pouze koncentraci sledovaného iontu ve vzorku. Tvar Nernstovi rovnice je následující: /
/
·
(1.5)
. . . . není standardní, pro každou elektrodu je individuální . . . . aktivita iontů ve zkoumaném roztoku
10
1.3
Elektrochemický
Elektrochemický článek (cela) je tvo kladním prvkem všech elektroanalytických metod. Dle konvence IUPAC je elektroda, na níž dochází k a v článku se zakresluje vlevo. Redukce pak probíhá na katod se zakresluje vpravo. Elektromotorické n katody a anody:
Elektrody obsahující kapalnou fázi (roztok elektrolytu) musí být propojeny pomocí solného můstku umožňující vodivé spojení. Solný m elektrod!!! V anotaci článku to vyjád
1.4
Rozdělení elektroanalytických metod
Elektroanalytické metody dělíme na základ se dále dělí dle zvolených kriterií. V základní elektroanalytické metody v chemii. Na následujících schématech je patrné d
Metody založené na elektrodovém ději Ox + ne- <--> Red
Obrázek 2: Dělení elektroanalytických metod založených na elektrodovém d
Měř se vodivost Měří roztoků
Konduktometrie
Měř se kapacita Měří
Dielektrometrie
Metody založené na měření elektrických vlastností roztoků
Obrázek 3: Dělení lení elektroanalytických metod založených na m měření ení elektrických vlastností roztoků roztok
1.4.1
Potenciometrie
Elektrochemický článek lánek užívaný v potenciometrii se skládá ze dvou elektrod. Měrné (indikační) elektrody,, jejíž potenciál je závislý na koncentraci stanovované látky (iontu) a referentní elektrody,, jejíž potenciál je za daných podmínek konstantní. Měření Měření je prováděno provád za nulového lového procházejícího proudu (užívá se voltmetr s vysokým vstupním odporem). Měrnou M elektrodou může být buď ď kovová elektroda ponořená pono ená do analyzovaného roztoku, v němž jsou obsaženy ionty tohoto kovu (viz elektrody 1. druhu kapitola 1.2.1)) nebo tzv. iontověiontov selektivní elektroda (ISE) založená na měření m ení membránového potenciálu (viz kapitolu 1.2.4). Nejznámější a patrněě i nejrozšířenější nejrozšíř jší membránovou elektrodou je skleněná elektroda použípouž vaná pro měření pH. Stanovujeme-li li koncentraci sledované látky (iontu) přímo p z hodnot EMN (nutná kalibrace pro přepočet et na koncentraci) jedná se o přímou potenciometrii. Sledujeme-li li změny zm napětí článku v závislosti na přídavku ídavku titračního titrač činidla, jedná se o potenciometrickou titraci. titraci Přímá ímá potenciometrie Rovnovážný (absolutní) potenciál kovové elektrody E závisí na n aktivitěě iontů kovu v roztoku podle Nernstovy rovnice: (1.6) E0 – standardní elektrodový potenciál z – náboj kovového iontu M a – aktivita iontu kovu (je přímo římo úměrná úm jeho koncentraci) T – termodynamická teplota (v Kelvinech) -1 F – Faradayova konstanta 96485 C·mol C R – plynová konstanta 8,314 J·K J -1·mol-1 Pro praktická měření ení se obvykle zavádějí zavád některá která zjednodušení. Protože měření měř probíhá ve zředěných ných roztocích, nahrazuje se aktivita iontu jeho analytickou koncentrací. koncentrací Dále se pak nahrazuje přirozený irozený logaritmus logaritmem dekadickým a předpokládá p edpokládá se, že teplota roztoku je konstantní a rovná teplotěě laboratorní 25°C (T=298 K). Výsledný vztah pak je
12
, !" ⁄
#$ %
(1.7)
V tomto tvaru je „0,059/z“ konstantní a tato konstanta je směrnicí kalibrační přímky. Zároveň vidíme z rovnice, že přímé stanovení pomocí ISE není vhodné pro ionty s vyšším nábojem, neboť se pak hodnota směrnice výrazně snižuje. V ideálním případ má směrnice této závislosti pro 25°C a z=1 hodnotu 59,2 mV. 1.4.2
Voltametrie
Elektrochemický článek ve voltametrii se skládá ze dvou elektrod (pracovní a referentní), častější a univerzálnější je použití tříelektrodového uspořádání (pomocná elektroda). Pří tříelektrodovém uspořádání potřebujeme navíc potenciostat, takže se relativně navýší pořizovací náklady. Na pracovní elektrodu je vkládáno lineárně rostoucí napětí (∆E/∆t = konst.). Měřenou veličinou je procházející proud v závislosti na tomto potenciálu. Je-li v blízkosti elektrody látka, která je při dosažení jisté hodnoty potenciálu nastaveném na elektrodu schopna tuto elektrodu depolarizovat tzn., že tato látka se oxiduje nebo redukuje, dochází v průběhu tohoto redoxního děje k průchodu elektrického proudu elektrochemickým článkem. Jedná se o základní elektrochemickou metodu, kterou lze detekovat celou řadu anorg. či org. látek ve vodných, organických či směsných rozpouštědlech. Ze získaných naměřených dat lze určit počet přenesených elektronů, reverzibilitu elektrodové reakce, stabilitu případných meziproduktů, podrobný mechanismus děje, měřit kinetiku a celou řadu dalších parametrů. Polarografie Objevena roku 1922 profesorem Jaroslavem Heyrovským (1959 Nobelova cena za chemii) Její zavedení do elektrochemické praxe způsobilo celosvětovou revoluci v oblasti elektrochemické analýzy. Voltametrické metody s pomalým nárůstem potenciálu, kdy se na elektrodě stačí ustavit rovnováha odpovídající okamžitému potenciálu (měří se výhradně limitní difuzní proud, tj. proud úměrný koncentraci analytu danou pouze difuzí k povrchu elektrody) se historicky nazývají polarografie: voltametrie na rtuťové kapající elektrodě nebo rotující diskové elektrodě.
13
Obrázek 4:: Historicky náčrt ná rt polarografu jak byl zkonstruován J. Heyrovským
E
I
t
E
Obrázek 5:: Voltametrie charakterizovaná změnou zm potenciálu na čase ase (vlevo); Závislost proudu na vloženém potenciálu v přítomnosti ítomnosti depolarizátoru (vpravo)
Cyklická voltametrie Základní dynamická voltametrická metoda. Na pracovní elektrodu je od počáteční po poč hodnoty Ein vkládán rychle se měnící ěnící lineárně rostoucí potenciál do koncové hodnoty Efin, odtud potenciál klesá stejnou rychlostí až do výchozí hodnoty Ein. Závislost napětí na čase má typický „trojú„troj helníkový“ průběh. h. Tento proces lze libovolně libovoln opakovat, proto „cyklická“ voltametrie. Pro elektrody o malé ploše se používají rychlosti změny zm potenciálu v rozmezí 20 mV/s – 1 V/s. Proudová odezva má dvěě větve: ětve: dopřednou a zpětnou. Elektrodový děj ěj se na obou větvích v projeví nesymetrickým píkem, vznikajícím součtem sou esovité křivky řivky rovnovážné závislosti
14
proudu na potenciálu a poklesem proudu způsobeným vyčerpáním analytu v těsné blízkosti elektrody. Nutnou podmínkou je tedy schopnost analytu oxidace/redukce v oblasti vkládaných potenciálů (pro daný typ elektrody a rozpouštědla) a jeho dostatečná koncentrace (ideálně v rozmezí 1·10-5 M - 1·10-3 M). Studovaný roztok musí být dostatečně vodivý a musí potlačit vliv migrace (pohyb částic v el. poli) studované látky. Používá se přídavek základního elektrolytu, což je anorg. či org. sůl, jejíž žádná složka nesmí být elektrochemicky aktivní. E
Red → Ox + z e-
I
> < Ox + z e- → Red t
E
Obrázek 6: Cyklická voltametrie: cyklická změna potenciálu v čase (vlevo); ideální tvar CV voltamogramu s dopřednou a zpětnou vlnou s charakteristickýmu píky (vpravo)
Pohyb molekul analyzované látky je v důsledku: konvekce – mechanické míchání vzorku (třepáním, mícháním, …) migrace – pohyb molekul vlivem elektrického pole difuze – pohyb molekul v důsledku difuze Při voltametrických studiích je žádoucí první dva vlivy eliminovat (roztok nebudeme míchat; přidáme elektrolyt o vhodné koncentraci), aby pohyb molekul k povrchu elektrody byl pouze v důsledku difuze (odtud limitní difuzní proud). Mimo klasickou voltametrii (polarografii) a cyklickou voltametrii existuje celá řada modifikací, které umožňují mnohem citlivější detekci: Tast polarografie Polarografie se superponovaným sinosovým napětím (A.C. polarografie) Square wave polarografie Pulsní polarografie Diferenční pulsní polarografie (voltametrie) Rozpouštěcí (stipping) voltametrie Případného zájemce odkazuji na kterékoliv elektrochemické skriptum, nebo internet. 1.4.3
Amperometrie
Jedná se o odvozenou voltametrickou metodu, díky tomu můžeme použít stejnou instrumentaci. Potenciál se nemění v čase jako je tomu u voltametrie, ale jeho hodnota je nastavena jako konstantní a v čase se nemění. Měří se závislost proudu tekoucí elektrodou na čase. Hodnota
15
vloženého potenciálu je volena tak aby elektrodou tekl v přítomnosti analytu (depolarizátoru) limitní proud, jehož velikost je úměrná koncentraci analytu. Vhodná konstrukce měřících cel umožňuje detekci elektrochemicky aktivních látek v plynné i kapalné fázi.
16
2
Mikroskopie skenující próbou
V poslední době neustále skloňovaný skloň pojem nano(bio)technologie přináší řináší nové poznatky téměř do všech odvětví ětví tví lidského zájmu. Dle definice, nanotechnologie zkoumá objekty o vev likosti menší než 100 nm (dle některých n méně než 1000 nm) až řřádověě po velikost atomů. atom Abychom tyto objekty mohli vytvářet vytvá a studovat, musíme ovládat instrumentaci o vhodném rozlišení, přii kterém se vzorek (zejména biologického původu) p nachází pokud možno v (pseudo)fyziologickém ologickém prostředí. prostř Často asto využívané techniky elektronové mikroskopie (SEM, TEM) sice poskytují kvalitní rozlišení, avšak za cenu ztráty fyziologických podmínek (biolo(biol gické vzorky je nutné pokovit). Oproti tomu techniky známé jako mikroskopie skenující sonso dou (SPM; scanning probe microscopy) poskytují stejné i lepší rozlišení a mnohdy je lze vyuvy žít i v kapalinách (ve fyziologickém roztoku). Techniky SPM využívají interakce sondy (pró(pr by) se zkoumaným povrchem a tuto interakci převádějí p na měřitelný ěřitelný signál. Sonda skenuje povrch rastrovacím pohybem, tedy řádek po řádku (režim line-by-line). První představenou p technikou SPM byla skenovací tunelovací tunelov mikroskopie (STM; scanning tunelling microscomicrosc py) za kterou její autoři ři Binning a Rohrer obdrželi Nobelovu cenu. Následoval rozvoj těchto t technik až do současnosti, asnosti, kdy existují desítky technik a jejich kombinací postavených na nejne různějších jších interakcích sondy se zkoumaným povrchem. Tabulka 1 uvádí jen zlomek metod používaných v praxi.
Obrázek 8:: Obecné schéma mikroskopu skenujícího sondou. Sonda zprostředkovává zprost edkovává informaci o vlastnostech zkoumaného povrchu. Interakce sondy s povrchem je převáděna na měřitelný ěřitelný signál, který je dále zpracováván. SPM techniky mohou pracovat ve dvou základních režimech: skenování vzorkem a skenosken vání sondou. Zpětná tná vazba pak kontroluje vzájemný pohyb a uplatňuje uplat se při ři volbě jiných dvou režimů: režim skenovaní v konstantní výšce v a skenování při konstantní hodnotěě měřené ěřené veličiny. veli
17
Obrázek 9:: Schéma profilometru, který zkonstruoval Schmalz v roce 1929.
Ačkoliv koliv je za první SPM techniku považována STM, myšlenka studovat „hrubost povrchů“ povrch pomocí ostrého ho hrotu je poněkud poně starší. Pionýrskou metodou byla konstrukce profilometru (stylus profilometer)) Schmalzem v roce 1929 [2].. Svou podstatou se jedná o předchůdce p AFM. Tenký hrot se pohyboval po povrchu v ose X. Malé zrcátko na povrchu hrotu odráželo úzký svazek zaostřeného řeného světla světla na fotografický papír. Vzorek se pohyboval spolu s fotopapírem a vychylování hrotu na drsném povrchu povrc vedlo k záznamu na fotopapír. Předchůdcem STM byl topografiner [3, 4], který pracoval v nekontaktním módu. Vodivý hrot skenoval ve vzdálenosti 100 nm od vodivého povrchu. Dosahoval rozlišení 3 nm vertikálně a 400 nm horizontálně,, což se v podstatě podstat blíží rozlišení optické mikroskopie. skopie. Kvůli Kv problémům se zpětnou tnou vazbou a udržením správné pozice hrotu docházelo k výraznému rušení, což se nepodařilo vyřešit. ešit. Práce však nastínila možnost tunelování a otevřela otevř příležitost říležitost k vytvoření STM.
18
Tabulka 1: Přehled některých mikroskopií skenujících próbou – metody AFM, MFM, SNOM, SECM jsou dostupné i na našem pracovišti
2.1
Technika
Rok objevu
STM Scanning Tunneling Microscopy
1981
NSOM/SNOM/NFSOM Near-field scanning optical microscopy
1928 (1984)
AFM Atomic force microscopy
1986
MFM Magnetic Force Microscopy
1987
BEEM Ballistic electron emission microscopy
1988
ESTM Electrochemical scanning tunneling microscope
1988
SECM Scanning electrochemical microscopy
1989
MRFM Magnetic resonance force microscopy
1991
CFM Chemical force microscopy
1994
Skenovací tunelovací mikroskopie
Technika byla vyvinuta v laboratořích IBM počátkem 80. let 20. století. Využívá tunelového průchodu elektronu mezi kovovou sondou a vodivým povrchem (limitující podmínka). Navíc je nutné pracovat v hlubokém vakuu, i když tuto podmínku lze s rozvojem elektroniky do jisté míry obejít. Elektrony v kovech mají menší energii než elektrony ve vakuu. Vakuum tak vytváří energetickou bariéru, ve které dochází k částečnému překrytí vlnových funkcí atomů vzorku a sondy. Aplikace napětí poruší symetrii bariéry a dojde k průchodu proudu. Z uvedeného tedy vyplívá, že není skenována přímo topografie, ale jen statistické rozložení vlnových funkcí atomů. Velikost měřeného proudu je ovlivňována vzdáleností sondy od povrchu.
19
Obrázek 10:: Schéma interakce STM hrotu se vzorkem. Čárkovaně je naznačen čen tunelový efekt.
Manipulace s atomy pomocí STM je sice možná, je však v počátcích átcích a praktické využití zatím 1 nenalézá. Na stránkách IBM můžete mů nalézt galerii struktur , které byly vytvořeny. vytvoř Prozatím se jedná spíše o demonstrační ční ukázky.
Obrázek 11: V roce 1990 demonstrovali vědci v z IBM možnost manipulace jednotlivých atomů atom pomocí STM. Na kovovém povrchu sestavili z jednotlivých atomů Xe akronym firmy IBM. [5]
2.2
Mikroskopie atomárních sil
Mikroskopie atomárních sil (AFM; atomic force microscopy) využívá interakce mezi atomy zkoumaného povrchu a sondy. Interakcí atomů vzniká přitažlivá itažlivá nebo odpudivá síla, která způsobuje vychylování chylování nosníku (cantilever) sondy. Přitažlivá itažlivá síla je uplatňována uplatň van der Waalsovými silami zatímco odpudivé síly mají svou podsatu v Pauliho vylučovacím vyluč principu. Přitažlivé síly tak působí sobí ve větších větších vzdálenostech, zatímco odpudivé síly v menších. Vychýlení nosníku je snímáno nejčastěji nejč ji opticky pomocí laserového snímače, snímač čímž dochází k převodu interakce na měřenou ěřenou veličinu. veli inu. Metoda není omezena vlastnostmi povrchu – lze skenovat vodiče, nevodiče č či biologické materiály. Díky shora uvedeným principům principů lze metodu provádět v následujících režimech:
1
http://researcher.watson.ibm.com/researcher/view_project.php?id=4245
20
•
Kontaktní mód – hrot je v jemném kontaktu se zkoumaným povrchem. Nosník se ohýbá a měřený signál poskytuje přímou informaci o topografii vzorku. V průběhu měření může dojít k poškození hrotu.
•
Nekontaktní mód – hrot se pohybuje v určité vzdálenosti nad povrchem. Sleduje se změna amplitudy kmitajícího hrotu v důsledku přitahování a oddalování od povrchu. S využitím zpětné vazby lze udržet nosník v konstantním ohnutí a zaznamenávat dorovnání v ose z.
•
Poklepový mód – kombinuje předchozí dva módy
V roce 2009 se vědcům z IBM podařilo zobrazit strukturu pentacenu za pomoci nekontaktního módu AFM [6]. Struktura byla získána za hlubokého vakua a teploty kolem 5 K, použitý hrot byl modifikovaný oxidem uhelnatým. V roce 2012 se pak stejnému týmu podařilo detailně zobrazit meziatomové vazby v molekulách hexabenzocoronenu a fullerenu C60 [7].
Obrázek 12: Vědcům z IBM se v roce 2009 podařilo zobrazit molekulu pentacenu (dole) pomoci nekontaktního módu AFM a hrotem modifikovaným oxidem uhelnatým (vlevo nahoře). Stejnému týmu se v roce 2012 podařilo zobrazit jednotlivé meziatomové vazby ve velkém rozlišení (vpravo nahoře).
2.3
Mikroskopie v blízkém optickém poli
Světlo, které se šíří prostorem může interagovat s určitým objektem v tzv. blízkém nebo dalekém poli. Klasická optická mikroskopie využívá dalekého pole. Rozlišení je dáno Rayleighovým kritériem a v praxi je rovno cca polovině použité vlnové délky. Optická mikroskopie tedy dosahuje rozlišení přibližně 200 nm. Oproti tomu mikroskopie blízkého pole využívá krátké vzdálenosti sondy od měřeného povrchu. Vzdálenost musí být menší než vlnová délka
21
použitého záření. Navíc se používá sonda, jejíž numerická apertura je menší než výše uvedená vlnová délka. Takto malá výstupní numerická apertura dává vzniknout bariéře, kterou světelné záření nemůže překonat. Dochází k jevu podobnému úplnému odrazu světla a současnému vybuzení evanescentní vlny. Analogicky s elektronovým tunelováním v případě STM tu hovoříme o tzv. optickém tunelování. Opět lze pracovat v několika režimech: •
Osvitový transmisní mód - sonda je zdrojem záření, dochází k zaostření paprsku hrotem. Prošlé světlo je sbíráno inverzním mikroskopem pod vzorkem
•
Osvitový reflexní mód - sonda je opět zdrojem. Odražené světlo je snímáno fotodetektorem v okolí sondy.
•
Sběrný transmisní mód - vzorek je prosvětlován zdrojem světla. Sonda slouží výhradně pro sběr prošlého světla.
•
Sběrný reflexní mód - vzorek je osvětlován se shora. Sonda slouží pro sběr odraženého světla od neprůhledného vzorku.
Nutno podotknout, že SNOM pracuje pouze v nekontaktním módu, jinak by mohlo dojít k poškození sondy. Používají se sondy s aperturou v rozmezí 50 – 100 nm. Tato hodnota je zároveň mezním rozlišením pro metodu, ačkoliv teoretické rozlišení je bez omezení.
22
3
Skenovací elektrochemická elektrochemick mikroskopie
Myšlenka obdobné metody k STM z aplikací elektrochemie byla realizována již koncem 80. let minulého století. Skupina kolem prof. A. J. Barda, zkonstruovala elektrochemický mikromikr skop, který využíval mikroelektrodu (ME) pro měření interakce s povrchem [8]. Ačkoliv nezávisle na sobě pracovala i skupina kolem prof. Engströma [9]. Je právěě skupině skupin prof. Barda připisováno prvenství, neboťť právě práv tato skupina dokázala přijatelněě vysvětlit vysvě teorie ohledně aplikace mikroelektrod a zavedla a teoreticky rozvinula pojem zpětné ětné vazby [10]. Sondou je v tomto případě ř ě mikroelektroda, m která je umístěna ve výšce Z a pohybuje se nad zkoumaným povrchem v osách X a Y. Záznam měřeného proudu pak poskytuje celou řadu informací (topografii, elektrochemickou aktivitu, prostupnost iontů iontů přes řes membrány, atd.). Díky tomu lze analyzovaný povrch pozorovat v pseudo-3D s mikrometrovým trovým rozlišením, při p některých metodách (kombinace AFM/SECM) dokonce s nanometrovým až atomárním rozlišením. Proudy měřené ené pomocí ME jsou velmi nízké a řádově dosahují hodnoty nA až a pA. Zkoumaným povrchem pak může mů být prakticky jakýkoliv povrch (vodič, č, izolant, polovodič, polovodi biologický materiál, membrána apod.). apod. V literatuřee se pro zkoumaný povrch používá označení ozna „substrát“, ale v kombinaci s měřením měřením enzymové aktivity se toto jeví jako matoucí a v dalším textu bude užíváno termínu „zkoumaný povrch“. Anglický výraz „scanning electrochemical ectrochemical microscopy“ je zastoupen zkratkou SECM a oznaozn čuje uje jednak metodu skenovací elektrochemická mikroskopie a také přístroj přístroj skenovací elektroelektr chemický mikroskop. V literatuře literatuř se můžeme setkat i s označením ením „chemický mikroskop“. Více jak dvacetiletá historie techniky přinesla p řadu možností využití. Široké uplatnění nalézá technika zejména v (bio)chemii, chemii, biologii a materiálových vědách. v Postupný nárůst nár zájmu stran uživatelů je spojen s výrobou a prodejem komerčních komer zařízení. Ř Řada vědeckých ědeckých týmů tým však využívá vlastní řešení, ešení, podobně jako v našem případě. V následujícím textu budou popsány základní součásti sou ásti mikroskopu SECM. Jádrem každého mikroskopu jsou mikroelektrody, kterým bude věnována v nována samostatná kapitola 4.
Obrázek 13:: Obecné schéma uspořádání uspořádání skenovacího elektrochemického mikroskopu. ME - mikroelektroda je pohybována pozičním čním systémem ve 4D. Schéma vyobrazuje tříelektrodové t ektrodové měřící měř uspořádání s referenční ní elektrodou R a pomocnou elektrodou C. (Bi)potenciostat zajišťuje zajiš uje hodnotu potenciálu pracovní elektrody.
23
3.1
Poziční systém
Přesné pohyby elektrody v těsné sné blízkosti povrchu zkoumaného vzorku v navzájem kolmých rovinách (x, y, z) jsou zajištěny ěny ny polohovacím systémem. Pohyb ME musí být reprodukovatelreprodukovate ný a pohyb v jedné ose musí být nezávislý na pohybu ve zbylých dvou osách. Hrubý pohyb v řádech mikrometrů je zajištěn ěn pomocí krokových motorů, motor , piezoelektrické elementy (PZ) zajišťují jemný posun v řádech nanometrů. nanometr To, který pohybový element využijeme, záleží na požadované velikosti skenované oblasti. Nutnou podmínkou je velikost elektrody, neboť nebo rozlišení je dáno právěě touto hodnotou. Pro ME o velkých průměrech ěrech je plně dostačující využití krokových motorů – takto lze s výhodou skenovat velké oblasti. Naopak ME s malým průměrem rem budou vyžadovat jemnější jemn posun zajišťovaný ovaný piezoelektrickými elementy. Na průměru ru elektrody záleží i rozsah skenované oblasti. Obvykle se jako nejmenší nejmenš rozsah volí dvojnásobek tohoto průměru ů ěru ru (2×d). Nejvyšší rozsah je limitován použitým polohovacím zaříza zením a také časovými asovými možnostmi, nemalou roli hraje i stabilita zkoumaného zkoumané vzorku a postupné stárnutí ME. Pro názornost, zornost, oblast 100d x 100d 100 skenovaná rychlostí lostí 8,3d/s 8,3 vyžaduje přibližně hodinu času. Pro ME obvyklé velikosti 1-25 1 25 um se skenovaná oblast běžně b volí v rozmezí 100-1000 čtverečních čních µm při maximální rychlosti 50 µm/s – zde nalézají uplatnění uplatn zejména polohovací systémy s krokovými motory. Významnouu roli hraje uchycení ME na rameno polohovacího systému. Přídavné Přídavné anti-vibrační anti zařízení ízení má smysl pouze u ME malých průměrů, pr , které jsou polohovány PZ. Vibrace zvyšují měřený ený šum a snižují kvalitu signálu a rozlišení. V našem případě je jako polohovací zařízení za ízení použit mikromanipulátor MP-285 MP firmy Sutter Instrument, který pro pohyb ve třech osách využívá jednotky poháněné ěné krokovými motory. Detail mikromanipulátoru je znázorněn znázorn na Obrázek 14.
Obrázek 14:: Mikromanipulátor MP-285 MP 285 firmy Sutter Intsrument
Rozsah pohybu je 25 mm v každé ose. Jemný pohyb zařízení za umožňuje ňuje teoretické rozlišení (bez ohledu na ME) 0,2 µm v hrubém posuvu a 40 nm v jemném posuvu.
24
3.2
Elektrochemická instrumentace
Základní instrumentaci tvoří potenciostat a elektrody spolu s elektrochemickou celou. Funkcí potenciostatu je nastavení a kontrola potenciálu mezi referentní (R) a pracovní elektrodou (W). Druhou funkcí potenciostatu je měření proudu s dostatečnou citlivostí. Proud v případě tříelektrodového uspořádání prochází mezi pracovní a pomocnou elektrodou (A). Na potenciostat je kladena řada požadavků. Odezva potenciostatu musí být dostatečně rychlá, aby byla zachycena každá změna v průběhu chemické reakce a potenciostat tak mohl včas zareagovat. Dostatečná přesnost měření je zvláště důležitá s ohledem na práci s mikroelektrodami a měřenými proudy v řádech pA. Kvalitu potenciostatu a jeho signálu ovlivňuje hlavně konstrukce, proto se volí takové konstrukční provedení, aby byl vliv elektronického šumu pokud možno nejmenší.
25
4
Mikroelektrody
V úvodu do elektrochemických metod (kapitola 1) byla popsána role pracovní elektrody. Technika SECM využívá jako pracovní elektrodu tzv. mikroelektrodu (ME). Tento zvláštní typ vyniká oproti klasickým elektrodám (makroelektrodám) celou řadou odlišných vlastností a výhod. V literatuře se ovšem můžeme setkat i s označením ultramikroelektroda (UME), označujícím mikroelektrodu menších rozměrů. Pojem UME odráží spíše historický vývoj výroby (dosažení menších průměrů) a formování elektrochemického názvosloví, obecně však není důvod zavádět jiné označení než mikroelektroda. Ostatně oficiální definice IUPAC [11] zahrnuje pouze pojem mikroelektroda. Dle této definice je mikroelektrodou taková elektroda, jejíž rozměr je za daných experimentálních podmínek menší nebo roven tloušťce difuzní vrstvy (δ) a dochází tak k ustálení rovnovážného stavu. I přes definici je pojem UME stále užíván a to i dokonce v aktualizovaném vydání knihy „Scanning electrochemical microscopy“ [1].
4.1
Základní charakteristiky
Mezi základní charakteristiky patří poloměr elektrody. Hodnota RG představuje bezrozměrné číslo poměru průměru elektrody a šířky jejího izolantu &
'()/
(1.8)
Měřený proud je v tomto případě do jisté míry nezávislý na poloměru izolantu elektrody r(g). Poměr rychlosti pohybu elektrochemicky aktivní látky O k povrchu ME je poměrně vysoká (cca Dc/a) tzn., že proud není ovlivněn pohybem kapaliny (mícháním). K ustálení proudu v případě ME dochází poměrně rychle *
/+
(1.9)
a proto můžeme skenovat při vysokých rychlostech. Získaný voltamogram má typický průběh (Obrázek 15) a je odlišný od klasického CV voltamogramu, na který jsme zvyklí u makroelektrod (Obrázek 16).
4.2
Pracovní módy SECM a elektrochemie na ME
Pro pochopení základního principu metody SECM je nutné znát teorii a elektrochemické pochody na malých elektrodách. V úvodu do elektrochemických metod již byla zmínka o společném znaku rtuťové kapající elektrody, rotující diskové elektrody a mikroelektrody. Pokud je mikroelektroda ponořena v roztoku redox-aktivní látky a zároveň je dostatečně vzdálena od povrchu (dvacetinásobek poloměru elektrody), prochází elektrodou faradický proud čistě v důsledku prosté difůze. V případě diskové kruhovité elektrody má difuzní vrstva polokulovitý tvar. Velikost proudu pro plochou elektrodu kruhového tvaru o poloměru „a“ je dána rovnicí 1. ,
,-
.
+%
(1)
26
Přičemž platí, že D je difuzní koeficient reaktantu O, F je pak Faradayova konstanta. Dále platí, že proud je přímo úměrný koncentraci c, poloměru elektrody „a“ a počtu elektronů n. Rovnice 1 se liší pro různé tvary elektrody a byla odvozena pro celou řadu základních tvarů. 0,012
0,010
I [µA]
0,008
0,006
0,004
0,002
0,000
-0,002 -0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
U [mV]
Obrázek 15: Cyklický voltamogram platinové mikroelektrody (25 µm) - ferrokyanidu draselného (3 mM) při rychlosti polarizace 50 mV s-1. 6
4
I [mA]
2
0
-2
-4 -0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
U [V]
Obrázek 16: Cyklický voltamogram sítotiskové elektrody se zlatou pracovní elektrodou - ferrokyanidu draselného (3 mM) při rychlosti polarizace 50 mV s-1.
27
Měření je uskutečňováno v několika možných módech. V prvém z nich je elektrochemicky aktivní reaktant (redox-reaktant) generován na mikroelektrodě (tip) a detekován pomocí substrátu (TG/SC; tip generation-substrate collection). Produkt redukce vznikající na ME je tak například zpětně oxidován na substrátu. Tento děj je obdobný reakci probíhající na rotující diskové elektrodě. Tento mód je užíván metodou SECM zejména při studiu homogenních chemických reakcí. Ve většině případů je povrch substrátu mnohem větší než povrch hrotu. Efektivita měření dosahuje téměř 100% pro stabilní přeměnu. Podobně lze použít opačné uspořádání, kdy je reaktant generován substrátem, jenž je zpracováván na ME (SG/TC; susbtrate generation-tip collection) – toto uspořádání je častější a využívá se zejména ke studiu imobilizovaných enzymů, kdy se na ME měří produkt enzymové reakce. V případě SG/TC je odezva menší v důsledku menšího povrchu hrotu. Skenování substrátu v ose „z“ však poskytuje informaci o koncentračním profilu. Pokud je skenován povrch v ploše XY získáme informaci o aktivních spotech. V případě, že ME je v těsné blízkosti nevodivého povrchu, dochází k uplatnění „negativní zpětné vazby“. Při přibližování ME k povrchu dochází k postupnému snížení procházejícího proudu v důsledku omezení difuze redox-aktivní látky k povrchu elektrody. Difuze je bráněna samotným nevodivým povrchem, ale také izolantem obklopujícím elektrodu. Čím blíže bude ME povrchu, tím menší proud bude procházet. ,/,
,-
(2)
Výrazný nárůst proudu pak můžeme pozorovat v případě vodivých povrchů, kdy dochází k „zacyklení“ molekul redox-aktivní látky mezi ME a zkoumaným povrchem. Látka je na tomto povrchu regenerována a může opětovně reagovat na povrchu ME. Dochází k zacyklení redoxreaktantu mezi ME a povrchem za současného masivního nárustu proudu. Hovoříme o tzv. pozitivní zpětné vazbě. ,0,
,-
(3)
Vynesením měřeného proudu v závislosti na vzdálenosti ME od povrchu získáme tzv. přibližovací křivku (approach curve) znázorněnou schematicky na obrázku níže. V literatuře se můžeme setkat i z kombinací obou měřících přístupů. Např. aktivita GOX byla měřena v kombinovaném režimu pozitivní zpětné vazby a SG/TC.
28
Obrázek 17: 17 Schematicky znázorněné přibližovací křivky
4.3
Výroba mikroelektrod
Tradiční ní mikroelektrody se vyrábějí vyráb zatavením tenkých drátků (Pt, Au, C) do skleněných sklen kapilár. Hrot skleněné né kapiláry je pak zbroušen do konického tvaru a povrch elektrody je vylešvyle těn. Skleněný ný povrch kapiláry lze navíc pokovit (Au, Ag) a využít jako kombinovanou elekele trodu – pracovní čii pseudoreferentní. Obvyklé průměry ry kovových drátků drátk se pohybují v rozmezí 5 – 25 µm. Průmě ůměr hrotu kovového drátku lze zmenšit díky elektrochemickému odleptání např. nap . v hydroxidu sodném nebo chloridu vápenatém.. Drátek se pak zataví výše uvedeným způsobem, bem, nebo zalije do plastu případně p pryskyřice. Výroba kvalitních sub-mikrometrových mikrometrových ME není triviální záležitost. Zatavení drátků drátk lze realizovat i bez následného zbroušení skleněné sklen kapiláry, jak uvádějí autoři ři publikace [12] a jak je uvedeno na Obrázek 18. Využitím speciálních přístrojů jů (puller) lze vyrobit ME tavením za současného časného tažení kapiláry. Puller se také používá pro výrobu mikrokapilár a intově-selektivních selektivních mikroelektrod. Iontověselektivní mikroelektrody jsou v podstatě kapiláry s velmi úzkým hrotem, které jsou naplněny napln ionoforem. Modernějšími postupy py lze vyrobit kombinované SECM/AFM SECM/AFM hroty, které dosahují miniaturminiatu ních rozměrů a dovolují v reálném čase měřit odlišné charakteristiky zkoumaného povrchu. Velmi hrubé povrchy lze měřit ěřit it za pomoci tzv. "soft stylus prób". Technicky se jedná o miniaturní pružný polyethylenový nosič nosi s vrstvičkou uhlíkového inkoustu. Nutno poznamenat, že toto je jediný případ ípad kontaktního módu. Ve všech ostatních případech p ípadech se v SECM využívá výhradně nekontaktní mód.
29
Obrázek 18: Obrázek pořízený optickou mikroskopií (a–c) a SEM (d) mikroelektrody zbroušene velice jemně pouze v laterálním směru. [12]
30
5
Aplikace metody
Zobrazování Zobrazování pomocí metodiky SECM je možné pomocí dvou režimů. Při obou ME skenuje dvojrozměrnou plochu X-Y kartézské soustavy. V prvém a častějším režimu je měřen proud ME při konstatní výšce ME od zkoumaného povrchu. Změna velikosti proudu pak odráží topografii zkoumaného povrchu. Ve druhém režimu je na ME udržována konstantní hodnota proudu a vzdálenost ME se mění v ose „z“ v závislosti na topografii. Tento režim vyžaduje elektronickou zpětnou vazbu2. V obou uvedených režimech je samozřejmě možné měřit vodivé i nevodivé povrchy. Rozlišení je dáno průměrem ME, ale i průměrem jejího izolantu (a and d). Využitím tohoto skenování je "chemické zobrazování", pomocí něj je možné stanovit rozdíly v rychlostech reakce v různých lokalitách zkoumaného povrchu. S výhodou lze studovat biologické materiály (enzymové spoty) nebo povrchy z aktivní a pasivní stranou. Charakterizace tvaru ME Tvar mikroelektrody je obtížné stanovit běžnými zobrazovacími technikami, jako jsou optická nebo elektronová mikroskopie. Elektroda může být v izolantu různě deformována, přičemž nejčastěji může být zapuštěna, nebo naopak může jemně vystupovat pod/přes okraje jejího izolantu. Elektrody o průměru menším než 1 um je zvláště obtížné charakterizovat. V těchto případech není efektivní ani proměření voltamogramu. Všechny ME vykazují typický tvar voltamogramu ze kterého nelze určit jakoukoliv závislost na průměru ME. Naproti tomu proměření přibližovací křivky (závislost iT versus d) může odhalit zahloubení elektrody do izolantu. Heterogenní kinetika Pomocí přibližovací křivky nebo voltamogramu lze určit rychlost přenosu elektronů reakce probíhající na elektrodě. Rychlost přenosu hmoty je při malých elektrodách vysoká. Díky tomu lze měřit rychle probíhající reakce bez nežádoucího ovlivnění rychlosti přenosu hmoty. Lze tak hrubě odhadnout k0 (cm/s) která je přímo úměrná D/d, kde D je difuzní keficient (cm2/s). Např. k0 pro oxidaci ferocenu na Pt mikroelektrodě průměru 1um a vzdálenosti 0,1um má hodnotu 3,7cm/s. Značnou výhodou je použití malých hrotů a velmi malých proudů pro odstranění vlivu nekompenzovaných odporů. (resistance effectes). Homogenní kinetika Studium aktivity imobilizovaných enzymů Pomocí SECM byla studována řada enzymů, které byly různým způsobem imobilizovány na pevné povrchy. Oyamatsu a jeho tým studovali aktivitu diaforasy [13] Proteomika Jako zajímavé řešení se jeví použití SECM při detekci elektroforeticky dělených proteinů barvených stříbrem [14]. Proteiny separované na SDS-PAGE byly elektricky blotovány 2
Zde má zpětná vazba zcela jiný význam.
31
(electroblotting) na PVDF3 membránu a obarveny stříbrem. Pro skenování byla použita platinová ME průměru 20 µm.
Obrázek 19: Vlevo: Schématické uspořádání detekce stříbrem barvených proteinů Vpravo: SECM sken proužku blotovaného BSA (10 mg/ml) barveného stříbrem. Měřeno v 1 mM [Os(bpy)3]Cl2 pomocí 20µ µm Pt ME rychlostí 50 µm/s. [14]
Single cell analysis Kombinovaný hrot AFM-SECM lze použít pro studium jednotlivých buněk a dokonce i organel [15, 16] Respirace HeLa buněk a její ovlivnění buněčnými jedy, jako KCN nebo etanol, bylo též předmětem zájmu [17]. Na základě této studie lze konstatovat, že SECM je citlivější než fluorescenční techniky využívající Calcein při kontrole působení léčiv a jiných látek. V tomto případě byla použita platinová ME o průměru 5 µm.
Obrázek 20: Respirační aktivita HeLa buněk (a) před podáním a po podání 200 µg/ml Antimycinu A v časech (b) 30 min, (c) 60 min, a (d) 90 min. [17]
3
PVDF – poly(vinyliden difluorid)
32
(Bio)energetika Zajímavě shrnuje trendy z oblasti výzkumu energetiky zejména palivových článků a baterií následující recenze [18]. Přehledně je zpracován vývoj uplynulých let a je mapováno využití techniky SECM právě v této oblasti s důrazem na využití kovových nanočástic. Využití techniky SECM lze nalézt i v bioenergetice, respektive studiích zabývajících se získáváním obnovitelné energie. Jedním ze směrů bioenergetiky je získávání energie přeměnou slunečního záření spojeného s nárůstem biomasy a jejím dalším zpracováním. Tato přeměna se děje pomocí fotosyntézy. Pomyslná účinnost je však velmi nízká (cca 27%), protože energie fotonu je z velké části ztracena při tvorbě meziproduktů fotosyntézy. Přímé odčerpávání elektronů pomocí velmi ostré mikroelektrody ukazuje zajímavý směr pro další rozvoj vysoko účinné metody sloužící k získávání obnovitelné energie [19].
Obrázek 21: Schematické znázornění přímého odčerpávání elektronů při fotosyntéze [19]
33
Obrázek 22: Potvrzení odčerpávání elektronů při fotosyntéze [19]
Leptani skloviny Kyselé leptání nebo eroze materiálů je taktéž zkoumána napříč různými disciplínami a výjimkou není ani zubní lékařství. Narušování zubní skloviny v důsledku bakteriální produkce kyseliny mléčné je jedním z nejčastějších lidských onemocnění. Rychlost s jakou dochází k porušení skloviny, nebo zkoumání vhodných ochranných prostředků je v zájmu moderní medicíny. Technika SECM byla v tomto případě použita ke kvantitativnímu studiu kyselého rozpouštění skloviny [20].
Obrázek 23: Vyleptaná hovězí sklovina v důsledku galvanostaticky generovaných protonů (100 nA) po dobu (a) 20 s a (b) 300 s. Obrázky byly pořízeny pomocí interferometrie v bílém světle (WLI).
Lokální oxidace polystyrenu Lokálně oxidovaný polystyren, který může sloužit jako vhodný nosič pro buňky, nebo k dalším imobilizacím byl rovněž vyroben za pomocí SECM [21, 22].
34
Litografie Elektrochemické rozpouštění (leptání) kovových povrchů hraje důležitou roli při studiu korozivních jevů [23], ale také při výrobě miniaturních integrovaných obvodů. Druhý zmíněný případ je užíván při leptání povrchů. Techniky přesného leptání kovů byly použity např. na mědi [24] nebo polovodičích [25] již v počátcích užívání metody. Demonstrace litografického použití SECM byla použita při anodickém rozpouštění měděného povrchu [26].
Obrázek 24: Chemické leptání měděného povrchu elektricky generovaným IrCl62- pomocí SECM [27]
Obrázek 25: SEM povrchu GaAs leptaný elektrochemicky generovaným bromem. Průměr ME 50 µm. [25]
Koroze a její předcházení spadá spíše do oblasti materiálové chemie, ale za zmínku patří výhradní uplatnění SECM v této oblasti. Neméně důležitá je i ochrana povrchů proti korozi – v uvedeném článku je příklad ochrany mědi pomocí 2-mercaptobenzimidazolu zkoumaná pomocí SECM [28]. Leptání lze využít i při vzorkování (micropatterning) – tedy vytváření matic bodů, které jsou přístupné imobilizaci nejrůznějších molekul. Tímto způsobem lze vytvořit jednoduchá pole (microarrays) na kterých lze studovat např. katalytickou nebo enzymovou aktivitu. Ufheil a jeho tým využili leptání niklové masky vytvořené na zlatém povrchu [29]. Na zpřístupněné zlato se navázala SAM vrstva 11-merkaptoundekanové kyseliny sloužící pro další imobilizaci.
35
SECM-AFM Imobilizace proteinů na pevné povrchy nachází uplatnění při konstrukci miniaturních sensorů a zařízení používaných v medicíně i při studiu životního prostředí. Zejména imobilizace enzymů je v popředí zájmu. Pomocí technik SPM lze studovat způsoby imobilizace a jejich vhodnost pro daný účel. Technika SECM s výhodou poskytuje také informaci o samotné enzymové aktivitě, jak bylo publikováno v řadě prací [30-32]. Aplikace souběžného měření SECM-AFM byla rovněž publikována [33]
Obrázek 26: Souběžný záznam výškové topografie (AFM) a proudu (SECM) peroxidasové aktivity. Výšková topografie (a) a (c) v kontaktním módu AFM. (b) Proud měřený v nepřítomnosti H2O2 jako substrátu a (c) v přítomnosti 0,5 mmol l-1 H2O2 [30].
36
6
Použitá literatura
[1] Scanning electrochemical microscopy, second ed., CRC Press, Boca Raton, 2012. [2] G. Schmalz, Verein Deutscher Ingenieure, (1929) 1461-1467. [3] R. Young, J. Ward, F. Scire, Physical Review Letters, 27 (1971) 922-924. [4] J.W. R. Young, and F. Scire, Review of Scientific Instruments, 43 (1972) 999-1011. [5] A.J. Mayne, G. Dujardin, Chapter 14 STM Manipulation and Dynamics, in: E.H.a.B.I. Lundqvist (Ed.) Handbook of Surface Science, North-Holland, 2008, pp. 681-759. [6] L. Gross, F. Mohn, N. Moll, P. Liljeroth, G. Meyer, Science, 325 (2009) 1110-1114. [7] L. Gross, F. Mohn, N. Moll, B. Schuler, A. Criado, E. Guitián, D. Peña, A. Gourdon, G. Meyer, Science, 337 (2012) 1326-1329. [8] S. Amemiya, A.J. Bard, F.R.F. Fan, M.V. Mirkin, P.R. Unwin, in, 2008, pp. 95-131 031207.112938. [9] R.C. Engstrom, M. Weber, D.J. Wunder, R. Burgess, S. Winquist, Analytical Chemistry, 58 (1986) 844-848. [10] J. Kwak, A.J. Bard, Analytical Chemistry, 61 (1989) 1221-1227. [11] K. Štulík, C. Amatore, K. Holub, V. Mareček, W. Kutner, Pure and Applied Chemistry, 72 (2000) 1483-1492. [12] H.L. Bonazza, J.L. Fernández, Journal of Electroanalytical Chemistry, 650 (2010) 75-81. [13] D. Oyamatsu, Y. Hirano, N. Kanaya, Y. Mase, M. Nishizawa, T. Matsue, Bioelectrochemistry, 60 (2003) 115-121. [14] M. Zhang, G. Wittstock, Y. Shao, H.H. Girault, Analytical Chemistry, 79 (2007) 48334839. [15] S.J. Bai, T. Fabian, F.B. Prinz, R.J. Fasching, Sensors and Actuators, B: Chemical, 130 (2008) 249-257. [16] R.J. Fasching, S.J. Bai, T. Fabian, F.B. Prinz, Microelectronic Engineering, 83 (2006) 1638-1641. [17] T. Kaya, Y.-s. Torisawa, D. Oyamatsu, M. Nishizawa, T. Matsue, Biosensors and Bioelectronics, 18 (2003) 1379-1383. [18] P. Bertoncello, Energy & Environmental Science, 3 (2010) 1620-1633. [19] W. Ryu, S.-J. Bai, J.S. Park, Z. Huang, J. Moseley, T. Fabian, R.J. Fasching, A.R. Grossman, F.B. Prinz, Nano Letters, 10 (2010) 1137-1143. [20] C.-A. McGeouch, M.A. Edwards, M.M. Mbogoro, C. Parkinson, P.R. Unwin, Analytical Chemistry, 82 (2010) 9322-9328. [21] N. Ktari, C. Combellas, F. Kanoufi, Journal of Physical Chemistry C, 115 (2011) 1789117897. [22] N. Ktari, P. Poncet, H. Sénéchal, L. Malaquin, F. Kanoufi, C. Combellas, Langmuir, 26 (2010) 17348-17356. [23] J. Izquierdo, L. Nagy, A. Varga, I. Bitter, G. Nagy, R.M. Souto, Electrochimica Acta, 59 (2012) 398-403.
37
[24] D. Mandler, A.J. Bard, Journal of the Electrochemical Society, 136 (1989) 3143-3144. [25] D. Mandler, A.J. Bard, Journal of the Electrochemical Society, 137 (1990) 2468-2472. [26] R. Cornut, S. Nunige, C. Lefrou, F. Kanoufi, Electrochimica Acta, 56 (2011) 1070110707. [27] M. Sheffer, D. Mandler, Journal of Electroanalytical Chemistry, 622 (2008) 115-120. [28] J. Izquierdo, J.J. Santana, S. González, R.M. Souto, Progress in Organic Coatings, 74 (2012) 526-533. [29] J. Ufheil, F.M. Boldt, M. Börsch, K. Borgwarth, J. Heinze, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 52 (2000) 103-110. [30] C. Kranz, A. Kueng, A. Lugstein, E. Bertagnolli, B. Mizaikoff, Ultramicroscopy, 100 (2004) 127-134. [31] C. Kranz, G. Wittstock, H. Wohlschläger, W. Schuhmann, Electrochimica Acta, 42 (1997) 3105-3111. [32] G. Wittstock, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 370 (2001) 303-315. [33] J.V. Macpherson, P.R. Unwin, Analytical Chemistry, 72 (1999) 276-285.
38
II PRAKTICKÉ CVIČENÍ
39
1
Příprava měřených povrchů A)
Sítotisková elektroda se zlatou WE se ponoří na 30 minut do acetonu. Opláchne se vodou a volně osuší na vzduchu Zlatá WE se inkubuje s cysteaminem (20 mg/ml) po dobu 2 hodin Po oplachu vodou se nanese glurataldehyd (3% v PBS) a inkubuje se 1 hodinu Po oplachu vodou se nanese kapička enzymu – glukosooxidasy (10 nkat/µl), cholinesterasa (10 nkat/µl). Inkubuje se přes noc při 4 °C. B) Krycí sklíčko se ponoří na 30 minut do acetonu Opláchne se vodou a volně osuší na vzduchu Povrch se může modifikovat APTES v etanolu Na modifikovaný povrch se nanese směs GA a libovolného enzymu (může se doplnit 1 mg/ml BSA) – inkubuje se 2 hodiny při 4 °C. Jemně se opláchne vodou a osuší C) Sítotisková elektroda se zlatou WE se ponoří na 30 minut do acetonu. opláchne se vodou a volně osuší na vzduchu na zlatý povrch se elektropolymerací vyloučí polypyrol, který může sloužit pro další imobilizaci
40
2 2.1
Příprava mikroelektrod Výroba Do skleněné kapiláry (10 cm) s jedním zataveným koncem se vloží kovový drátek (délka cca 1 cm) požadovaného průměru Kapilára se připojí na vakuum a umístí do smyčky z odporového drátu Smyčku připojíme ke zdroji DC, zdroj zapneme (s přednastavenou hodnotou) a pozorujeme její rozžhavení Kontrolujeme zatavení konce kapiláry – natavená část se nesmí příliš prohnout – zdroj DC vypneme Vychladlou kapiláru brousíme do požadovaného tvaru – drátek by měl být ve středu Nejlépe symetrický tvar kontrolujeme mikroskopem Vybroušený hrot leštíme postupně pomocí leštících prášků (1 mm; 0,3 mm; 0,05 mm) Finální ME opláchneme důkladně destilovanou vodou, následně acetonem a necháme oschnout Do kapiláry aplikujeme uhlíkovou vodivou pastu a vložíme kontaktní drátek – vše pevně spojíme pomocí bužírky
Pozor! Elektrické zařízení! Pracujte obezřetně – na DC zdroji je nastaveno 16 A! Tímto způsobem jste si vyrobili ME v hodnotě cca 5000,- Kč ☺ Na Obrázek 27 je mikroelektroda vyrobená dle tohoto postupu. Můžete si všimnout, že tvar není ideálně symetrický. Otázka: Pokuste se odhadnout hodnotu RG?
41
Obrázek 27: Vyrobená mikroelektroda (nahoře). (naho Platina průměru 25 µm. Detail hrotu ME (dole).
2.2
Charakterizace
Před vlastním měřením je třeba řeba ověřit ov kvalitu vyrobené mikroelektrody. V optickém mikroskopu a pomocí příslušného p SW vytvoříme íme detail hrotu ME. Vložíme měřítko m a z hodnot průměrů „r (g)“ a „a“ určíme poměr RG dle rovnice 1.8.. 1.8. Bezrozměrná hodnota RG je vždy větší tší než jedna a obvyklé hodnoty se pohybují v rozmezí 2 - 10. Nutno tno podotknout, že každá takto ručně ru vyrobená ME bude svými parametry a vlastvlas nostmi specifická! Po vizuální kontrole tvaru a čistoty istoty ME následuje charakterizace pomocí cyklické voltametrie. Připravíme čerstvý erstvý roztok 3 mM K4[Fe(CN)6] v 0,5 M KCl Provedeme měření ěření CV v rozmezí potenciálu -100 mV – +600mV Voltamogram má typický tvar (viz Obrázek 15) V případě neideálního voltamogramu se povrch ME musí přeleštit! p Pokud má cyklický voltamogram správný průběh, pr změříme íme limitní difuzní proud v nekonečném přiblížení.. Amperometrické měření m provedeme přii potenciálu pro daný mediátor, který si cvičně určíme z výše naměřeného ěřeného cyklického voltamogramu. Měřený Měřený proud by měl m být v čase stabilní, aby měřená ená odezva odrážela očekávané. o Pokud se hodnota proudu pohybuje v rozmezí očekávaného ekávaného šumu a nevykazuje výraznější výrazn odchylky je ME použitelná. V opačném případě překontrolujeme čistotu povrchu, jeho kvalitu a překontrolujeme ekontrolujeme všechny kontakty.
42
3
Průběh měření
Před vlastním měřením zkontrolujeme kvalitu ME proměřením cyklické voltametrie (kapitola II.2.2). Stejně proměříme voltamogram po skončení skenování. Úkol 1: Dle pokynů cvičícího změřte přibližovací křivku pro a) vodivý povrch – zlatou elektrodu sítotiskové elektrody b) nevodivý povrch – keramickou část sítotiskové elektrody, nebo krycí sklíčko Úkol 2: Oskenování libovolného vzorku v režimu zpětné vazby a) do Petriho misky vložte skenovaný povrch a přelijte mediátorem b) ponořte ME do roztoku mediátoru a určete hodnotu proudu c) zvolte přibližovací křivku a dle typu nastavte hodnotu proudu pro „přistání (landing)“ ME – 0,8 násobek , ,- pro nevodivý a 1,2 násobek , ,- pro vodivý povrch d) nastavte rozsah skenované oblasti a rychlost skenování e) naměřená data importujeme do Originu nebo Gwidionu a zpracujte grafickou mapu povrchu Úkol 3: Oskenování imobilizovaného enzymu v režimu SG/TC a) do Petriho misky vložte skenovaný povrch a přelijte substrátem (20 mM glukosa, 1 mM acetylthiocholin jodid obojí v150mM KCl) b) ponořte ME do roztoku substrátu a určete hodnotu proudu c) potenciál nastavte +600 mV pro vznikající H2O2 a +300 mV pro thiocholin d) přibližte se k povrchu a pozorujte, nastane-li změna v proudové odezvě e) nastavte rozsah skenované oblasti a rychlost skenování f) naměřená data importujeme do Originu nebo Gwidionu a zpracujte grafickou mapu povrchu
43
4
Vyhodnocení naměřených naměř dat
Soubor dat uložených v ASCII formátovaném textovém souboru se importuje do Originu4 nebo Gwyddionu5. Gwyddion je dostupný zdarma pod GNU GPL licencí. Postup práce a vyv hodnocení bude ukázáno ve cvičení. cvi Detaily k vyhodnocení a postupům ům zobrazování jsou předmětem tem samostudia obsáhlé nápovědy nápov programu. Na obrázku níže můžete vidět ět výsledek skenování v režimu zpětné tné vazby. Grafické vyhodnovyhodn cení bylo provedeno programem Gwyddion.
Obrázek 28:: Sítotisková elektroda se zlatou pracovní a pomocnou elektrodou. V rámečku ráme je znázorněna oskenovaná oblast pomocí SECM. Platinová mikroelektroda (25 mm) v 3 mM K4[Fe(CN)6] v 0,5 M KCl. Velikost skenované oblasti 50 × 350 px (px 25 × 25 µm).
4 5
Oficiální web produktu http://www.originlab.com Oficiální web svobodného software http://gwyddion.net/
44
Obrázek 29: Vlevo nahoře: ře: e: SECM sken pracovní elektrody SPE pokryté polypyrolem. Polypyrol byl ele elektrochemicky vyloučen 20 cykly (vpravo nahore) v rozmezí potenciálu -100 mV - +800 mV.
45
III PRACTICAL WORKSHOP
46
1
Preparation of measured surfaces A)
Immerse the screen printed electrode (SPE) with gold working electrode (WE) in acetone for 30 minutes Wash with water and allow drying Incubate Au WE with cysteamine water solution (20 mg/ml) for 2 hours Wash with water again and incubate the activated WE with glutardialdehyde solution (3% in PBS) for 1 hour Wash with water and drop small volume of enzyme solutions – glucose oxidase (10 nkat/µl), cholinesterase (10 nkat / µ l). Incubate overnight at 4 °C. B) Immerse a coverslip in acetone for 30 minutes Wash with water and allow drying The surface could be modified by APTES (5% in methanol) for 2 hours optionally Drop a mixture of enzyme and glutardialdehyde (add 1 mg/ml BSA optionally) - incubate for 2 hours at 4 °C. Gently rinse with water and allow drying C) Immerse the screen printed electrode (SPE) with gold working electrode (WE) in acetone for 30 minutes Wash with water and allow drying Electro-polymerase a polypyrrole suitable for further immobilisation
47
2 2.1
Preparation of microelectrodes Production Insert a wire (1 cm long) into a capillary (one side sealed, 10 cm length) Apply a vacuum in capillary and mount it in coil of resistance wire Connect a resistance wire to DC power supply and switch on – red-hot wire must be observed Check the sealing process of glass capillary – the melted end should not deflect – switch off the DC power supply Grind the capillary to the desired conical shape – the wire should be in the middle Observe the shape of the capillary microscopically Polish the tip gradually using alumina powders (1 µm, 0.3 µm and finally 0.05 µm) Rinse the final tip of ME thoroughly with distilled water and acetone – allow to dry Make a contact using copper wire and conductive carbon paste – cover all with spaghetti insulation
Danger! Electric shock risk! Work carefully – 16 A outputs on DC power supply! This way, you made ME amounting to about 200 euro. On Obrázek 27 is shown microelectrode made according to this procedure. You will notice that the shape is not perfectly symmetrical. Q: Try to guess the value of RG?
48
Figure 30: Typical in-house house ME (above). Detail of tip with platinum (25 µm) - (bottom).
2.2
Characterisation
Microelectrodes quality verification should be made before first measurements. The tip detail has to be created using optical microscope and appropriate software. Put the scale and determine RG value according Equation 1.8.. Use identified average values "r (g)" and "a". ". Dimensionless RG value is always greater than one, and typical values range from 2 to 10. It should be noted that each hand-made hand ME have specific parameters rameters and properties! properties The visual control is followed by characterisation of ME using cyclic voltammetry. voltammetry Prepare fresh solution of 3 mM K4[Fe(CN)6] in 0,5 M KCl Perform erform CV measurements in potential range -100 mV – +600mV Voltammogram should be have typical shape (Obrázek 15) In the case of non-ideal ideal shape, the surface shall be polished once more! more If the cyclic voltammogram is correct, corre the limiting diffusion current could be measured. Perform amperometric mperometric measurements at the potential for the used mediator. For practice, deterdete mine the potential from the cyclic voltammogram. The measured current should be stable over time. Microelectrode ode is applicable if i the current value is in the range of the expected noise, and does not show significant deviations. Otherwise, double-check double check surface cleanliness, its quality and see all contacts.
49
3
The measurement
Check the quality of ME by cyclic voltammetry (Section II.2.2) before measuring. In the same way, the CV is performed after scanning. Task 1: According to the tutor, measure approach curve for a) conductive surface - a gold electrode of screen-printed electrode b) non-conductive surface - ceramic part of screen-printed electrode or coverslip Task 2: Scan any sample in feedback mode a) Insert the scanned surface in a Petri dish and pour the mediator b) Dip ME in a solution of mediator and determine the current value c) Choose the approach according to the type curve and set the current for landing of ME - 0.8 times , ,- for non-conductive and 1.2 times , ,- for conductive surface d) Set the range of the scan area and scan speed e) Import measured data to Origin or Gwidion and process graphical map of the surface Task 3: Scanning of immobilized enzyme in the SG/TC mode a) Insert the scanned surface in a Petri dish and pour the substrate (20 mM glucose, 1 mM acetylthiocholine iodide both in150mM KCl) b) Dip ME in substrate solution and determine the current value Set the potential to +600 mV for emerging H2O2 and +300 mV for thiocholin c) Approach to the surface and see if there is a change in the current response d) Set the range of the scan area and scan speed e) Import measured data to Origin or Gwidion and process graphical map of the surface
50
4
Data evaluation
Data file stored in ASCII text file is imported into Origin6 or Gwyddion7. Gwyddion is available for free under the GNU GPL license. Work progress and evaluation will be demonstrated in practice. Details for evaluation and imaging procedures are subjected subject to self study of extensive help program. In the picture below you can see the result of SECM in the feedback mode. mode Graphical evaluation was done by Gwyddion. Gwyddion
Figure 31: Screen printed electrode with gold working and auxiliary electrode. The box shows the scanned area by SECM. Platinum microelectrode was used (25 mm) in 3 mM K4 [Fe (CN)) 6] in 0.5 M KCl. Size of the scanned area was 50 × 350 px (px ( 25 × 25 µ m).
6 7
Official website of Origin http://www.originlab.com Official website of free software http://gwyddion.net/
51
Figure 32: Top left: SECM scan of SPE working electrode covered polypyrrole. Polypyrrole was electrochemically excluded by 20 CV cycles (top ( right) in the potential range of -100 mV - +800 mV.
52
IV PŘÍLOHY
53
Příloha I. – Bezpečnostní listy chemikálií používaných ve cvičení Bezpečnostní listy jsou uloženy v laboratoři, ve které probíhá cvičení. Níže je uveden seznam nebezpečných chemikálií s doplňujícími GSH piktogramy, se kterými studenti přijdou do kontaktu v průběhu vlastní práce. Cysteamin Cysteamine
Glutaraldehyd Glutaraldehyde solution APTES
Metanol Methanol
Glukosaoxidasa Glucose Oxidase
Pyrol Pyrrole
Další chemikálie použité ve cvičení: Ferrokyanid; chlorid draselný; hovězí sérový albumin (BSA); cholinesterasa
54
Příloha II. – Seznam vyučovaných předmětů na PřF MU ve vztahu k předkládané problematice Bi8920 Fluorescenční mikroskopie http://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/BI8920
Bi3010 Elektronová mikroskopie http://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/BI3010
FA603 Elektronová mikroskopie v biologii http://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/FA603
F7850 Vybrané kapitoly z elektronové mikroskopie http://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/F7850
F7320 Mikroskopie atomové síly a další metody sondové rastrovací mikroskopie http://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2012/F7320
F3370 Úvod do nanotechnologií http://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2012/F3370
C4840 Metody značení a imobilizace biomolekul http://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/C4840
C5990 Aplikovaná enzymologie http://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2012/C5990
C6740 Elektrické vlastnosti atomů a molekul http://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/C6740
C7050 Elektroanalytické metody http://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2012/C7050
C7280 Elektrodová kinetika http://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2012/C7280
C9100 Biosenzory http://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2012/C9100
55
