Návod pro vypracování úlohy
SG - Příprava křemičitých částic metodou sol-gel Laboratoř přípravy nano a mikromateriálů Úvod V přírodě se vyskytují organismy (např. rozsivky), které jsou chráněny před okolím pomocí schránek z oxidu křemičitého (SiO2). Stejně jako křemenné sklo, které je rovněž z oxidu křemičitého, jsou tyto schránky dosti odolné jak mechanicky, tak vůči mnoha chemikáliím - kyselinám i louhům - a proto o nich mikro- a nanotechnologové uvažují jako o reakčních nádobách. Mikro- a nanočástice o různých porozitách (Obr. 1 B), částice s dutým jádrem (Obr. 1 A) nebo částice poskládané jako puzzle z několika menších částic dohromady (Obr. 1 C) jsou hojně syntetizovány a neustále zkoumány. Nanočástice nebo filmy z oxidu křemičitého jsou rovněž využívány k pokrývání částic z jiných materiálů, čímž se snažíme vytvořit jakousi umělou schránku podobnou té, co mají již zmíněné rozsivky. Tím se v této úloze budeme zabývat i my.
Obr. 1 Snímky křemičitých mikro- a nanočástic z elektronového mikroskopu. A) TEM snímek dutých křemičitých nanočástic připravených z polystyrenových šablon [1], B) TEM snímek křemičitých nanočástic se zřetelnou porozitou [1], C) SEM snímek křemičitých nanočástic poskládaných do větších celků [1].
Pro časovou nenáročnost a snadnost manipulace se zaměříme na přípravu alginátových makročástic, které následně metodou sol-gel layer-by-layer pokryjeme tenkou vrstvou SiO2. Pro srovnání připravíme i částice ze samotného alginátu, bez přidané SiO2 vrstvy, a budeme studovat vliv této vrstvy na vlastnosti částic. Alginát sodný je sodná sůl kyseliny alginové (polysachacharid), která se získává z hnědých řas. Používá se běžně v potravinářství (pod označením E401) jako stabilizátor, zahušťovadlo, emulgátor a želírující látka. Jeho uplatnění nalezneme i v kosmetice a jiných odvětvích. Alginát sodný je ve vodě rozpustná látka, která se v přítomnosti vápenatých iontů (či jiných dvoumocných iontů) vysráží a vzniká tak nerozpustný gel (zesíťovaný polysacharid) alginátu vápenatého (Obr. 2).
Obr. 2 Schema řetězce zesíťovaného alginátu vápenatého1. 1
(převzato z http://2013.igem.org/, licence creative commons)
Toho se využívá biotechnologiích, např. k imobilizaci buněk či enzymů (buňka přítomná v roztoku alginátu se v něm po vysrážení již dále nepohybuje a je uvězněna v polymerní síti). V naší úloze budeme částice vytvářet kapáním alginátu do roztoku chloridu vápenatého pomocí stříkačky s jehlou, ovšem v praxi se pro docílení co nejmenších velikostí kapek používá například technologie Ink-jet nebo mikrofluidní čipy. (Obr. 3)
Obr. 3 Přípava alginátových mikročástic v mikrofluidním čipu zachycená optickým mikroskopem 2.
Křemičitou schránku na alginátových částicích je možné vytvořit např. metodou sol-gel. Tímto termínem je označována skupina postupů přípravy skelných, skelně krystalických nebo krystalických materiálů, jejichž společným znakem je homogenizace výchozích složek ve formě roztoku ve vhodném rozpouštědle, hydrolýzou převod na pevnou látku (sol) a následně kondenzací a polymerizací systému převod na gelovou strukturu (gel). Sol-gel metody se široce používá při přípravě materiálů pro elektroniku, optiku, bioaplikace a dalších. Výchozími surovinami pro přípravu křemičitých koloidních roztoků jsou nejčastěji alkoxidy (tetramethoxysilan – TMOS a tetraethoxysilan – TEOS; Obr. 4, Rovnice 1 a 2) pro jejich snadnou reakci s vodou. Vedle alkoxidů jsou používány i jiné anorganicko-organické sloučeniny (např. acetylacetonáty), anorganické soli (např. chloridy nebo dusičnany) nebo stabilizované vodné soli (např. Ludox, Tosil). Jako pomocné látky mohou být použity deriváty alkoxidů, jejichž funkční skupiny zajistí atrakci k povrchům, které mají být pokryty křemičitou schránkou (např. amino skupina (3-aminopropyl)triethoxysilanu – APTES, Obr. 2B).
Obr. 4 Molekuly: TEOS - tetraethoxysilan (vlevo) a APTES (3-aminopropyl)ethoxysilan (vpravo)
Si(OC2H5)4 + 2 H2O → Si(OH)4 + 4 C2H5OH (hydrolýza) Si(OH)4 ↔ SiO2 + 4 H2O (kondenzace)
Rovnice 1 Rovnice 2
Vytvořením křemičité schránky na alginátových částicích se zvyšuje jejich mechanická odolnost (odolnost proti opotřebení nebo smykovým silám) a chemická stabilita (především odolnost vůči změnám pH). Dále pokrytí alginátových částic křemičitou schránkou umožňuje modifikaci povrchu funkčními skupinami, které následně například umožňují specifickou adhezi k substrátům či navázání dalších polymerních řetězců či jiných látek. Přítomnost ochranné vrstvy také ovlivňuje difúzi molekul z/do částic, čehož může být využito například při řízeném vylučování látek. V této úloze budeme sledovat vliv křemičité vrstvy na rychlost difuze měřením desorpce z připravených částic s vrstvou a bez vrstvy a rovněž budeme pozorovat vliv ochranné vrstvy na chování částice při jejím vysoušení a následné rehydrataci.
2
A. Pittermanová, Laboratoř chemické robotiky, UCHI, VŠCHT Praha
Cíle práce 1. 2. 3. 4. 5.
Příprava alginátových částic v roztoku modelové účinné látky (barviva) Pokrytí části připravených částic vrstvou nanočástic oxidu křemičitého metodou sol-gel Příprava čistých alginátových částic (bez barviva) a jejich pokrytí vrstvou SiO2 Porovnání kinetiky vylučování účinné látky (barviva) z částic s vrstvou SiO2 a z částic bez ní Porovnání vlivu sušení a rehydratace na oba typy částic
Popis zařízení Pro přípravu částic budeme používat běžné laboratorní vybavení. Pro měření kinetiky vylučování barviva z částic budeme používat UV-VIS spektrofotometr, jelikož barvivo absorbuje světlo ve viditelné oblasti spektra. Pro sledování sušení a rehydratace použijeme optický mikroskop Olympus BX41 vybavený fotoaparátem pro digitální záznam obrazu a snímky budeme vyhodnocovat v softwaru Quick Photo Camera.
UV-VIS spektrofotometr Kinetika vylučování bude sledována na malém UV/Vis spektrofotometru WPA Lightwave II (Obr. 5), který umožňuje až hodinové kontinuální sledování absorbance (přístroj v daných intervalech měří absorbanci vzorku při stále stejné vlnové délce). Jak se do roztoku bude uvolňovat barvivo z částic, jeho absorbance bude narůstat. V menu a při zadávání parametrů použijeme čísla a pohybujeme se pomocí šipek nahoru/dolů. Vybranou položku potvrzujeme tlačítkem START. Do menu se vracíme pomocí tlačítka STOP. Před měřením (pokud došlo ke změně nastavení parametrů měření) je nutné změřit referenci – zvolenou nulovou hodnotu měření. Jako reference se volí buď kyveta s čistým rozpouštědlem (v našem případě demineralizovaná voda) nebo se volí reference na vzduch a od zaznamenaných absorbancí se poté dodatečně odečítá absorbance kyvety s čistým rozpouštědlem. Poté co si zvolíte referenci, ji jednoduše změříte stisknutím tlačítka Reference. Následně již lze vložit kyvetku se vzorkem a začít měření stisknutím tlačítka START. Kyvetka se vkládá čirými okénky ve směru měřícího paprsku, který je u měřící cely naznačený. Pokud možno se těchto okýnek nedotýkáme prsty a případné kapky či nečistoty stíráme pouze pomocí buničiny. Spektrofotometr v současné konfiguraci neumožňuje Obr. 5 WPA Lightwave II UV/Vis spektrofotometr ukládání a export dat, proto je nutné si hodnoty každého měření opsat.
Optický mikroskop K charakterizaci dehydratace a rehydratace obou typů částic použijeme optický mikroskop Olympus BX41 (Obr. 6) vybavený fotoaparátem Olympus E-410, který je připojen k počítači a programu pro externí ovládání Olympus E-system (Obr. 7). Ten je spojen s programem pro správu snímků Quick PHOTO CAMERA (Obr. 8). Na obrazovce Olympus E-system je zobrazen živý náhled a snímky pořízené kliknutím na Capture se otevírají v programu Quick PHOTO CAMERA, ve kterém je možno přidat měřítko a ručně změřit rozměry částic. Ty se následně dají exportovat kliknutím na tlačítko Save ve spodní části pod výpisem změřených rozměrů. V exportovaném souboru je vedle hodnot uvedena i střední hodnota a odchylka.
Obr. 6 Optický mikroskop Olympus BX41
Obr. 7 Program Olympus E-System SLR Camera
Obr. 8 Program QUICK PHOTO CAMERA
Postup práce – příprava částic Při práci s chemikáliemi vždy používejte ochranné brýle Při veškeré manipulaci se vzorky používejte ochranné rukavice (při práci s n-hexanem raději použijte silnější nitrilové) a noste laboratorní plášť Před prací si na obalech chemikálií prohlédněte, které z nich jsou nebezpečné, a s tímto vědomím s nimi také pracujte. Pokud při práci přijdete s některou z těchto chemikálií do přímého kontaktu, ihned si postižené místo omyjte proudem vody a neprodleně uvědomte asistenta!
Příprava Nejprve si připravíme roztoky, které budeme k syntéze částic potřebovat. Používáme pouze demineralizovanou vodu.
1% alginát sodný (cca 10 ml) 2% chlorid vápenatý (cca 50 ml) roztok barviva (druh barviva a koncentrace bude určena asistentem) tetraethoxysilan – TEOS (3-aminopropyl)triethoxysilan – APTES n-hexan Nikdy nepipetujeme přímo z lahve! Z lahví si vždy odléváme přiměřené množství do kádinky. Vzhledem k cenám použitých chemikálií jimi šetříme a používáme malá, asistentem schválená množství.
Příprava alginátových částic bez barviva Do kádinky nalejeme asi 50 ml 2% chloridu vápenatého, vložíme magnetické míchadlo a umístíme na magnetickou míchačku. Do injekční stříkačky natáhneme několik mililitrů 1% alginátu sodného a pomalu 1 ml nakapeme do roztoku CaCl2. Pokud budete mít k dispozici od asistenta lineární pumpu, použijte pro kapání ji. Vzniklé gelové částice necháme několik minut v CaCl2, potom je přes sítko scedíme a propláchneme vodou. Takto připravené částice uchováváme ve vodě. S částicemi vždy manipulujeme opatrně, jsou totiž poměrně měkké a snadno se rozmáčknou.
Příprava alginátových částic s barvivem Příprava probíhá naprosto shodně jako příprava neobarvených částic jen s tím rozdílem, že všechny používané roztoky (chlorid, alginát, proplachovací i skladovací voda) budou obsahovat stejnou, asistentem zvolenou koncentraci vybraného barviva.
Pokrytí alginátových částic vrstvou SiO2 Tuto proceduru provádíme v digestoři – n-hexan je těkavá zdraví škodlivá látka. Reakci provádíme ve 100 ml PTFE kádince – TEOS i APTES reagují se sklem. Protože je n-hexan velice těkavý, snažíme se reakci uskutečnit za snížené teploty. Pokryjeme část obarvených i neobarvených částic – budeme tedy mít dva vzorky Připravíme si vodní lázeň s ledem a do ní vložíme teflonovou kádinku s odměřeným množstvím n-hexanu a míchadlem. Potom část alginátových částic přecedíme, osušíme (jinak bude v hydrofobním
n-hexanu docházet k jejich aglomeraci. Nesušíme ale příliš a částice nenecháváme dlouho na vzduchu – pracujeme rychle), vložíme do vychlazeného n-hexanu a necháme také chvíli vychladit. Mícháme přiměřenou rychlostí na magnetické míchačce. Potom přidáme odměřené množství APTES a mícháme 1 minutu. Dále přidáme odměřené množství TEOS a mícháme také 1 minutu. Voda obsažená v alginátových částicích alkoxysilany hydrolyzuje a atraktivní síly mezi aminoskupinami APTES a alginátových řetězců zajišťují, že se SiO2 sráží přednostně na povrchu alginátových částic. Po tomto rychlém sol-gel procesu částice promyjeme 2% roztokem CaCl2 a vodou na sítku a uchováváme pro další experimenty ve vodě. Promývací a uchovávací roztoky pro částice s barvivem opět musí mít danou koncentraci barviva. Tloušťka vzniklé křemičité schránky je ovlivněna poměrem prekurzorů (TEOS a APTES) k alginátu. S rostoucím poměrem alkoxysilů k alginátu se vytváří tlustší vrstva. V této práci použijte stanovený objemový poměr alginát : n-hexan : APTES : TEOS, který vám zadá asistent (např. 10:14:0,8:0,6).
Postup práce – měření Měření kinetiky vylučování S kyvetami pracujeme opatrně – jsou velmi drahé Kyvety chytáme pouze za matné strany, abychom si neušpinili strany čiré Měříme celkem 3 vzorky – obarvené částice bez SiO2, obarvené částice s SiO2, neobarvené referenční částice s SiO2 s barvivem pouze v SiO2 vrstvě Po spuštění prvního měření začněte paralelně pracovat na měření vysoušní částic na mikroskopu, ušetříte si tím čas Budeme porovnávat rychlost vylučování z pokrytých a nepokrytých obarvených částic. Nejprve je třeba skenem přes široké rozmezí vlnových délek zjistit vlnovou délku, při které zvolené barvivo nejlépe absorbuje světelné záření. Vhodný je dobře viditelný a úzký pík. Software vám vhodné píky sám vyhledá a označí jejich vlnovou délku. K tomuto typu měření se dostaneme z hlavního menu UV-VIS spektrometru přes ① Applications a dále ③ Wavescan. Skenovat se bude absorbance v intervalu 300 - 700 nm vzorku se značně zředěnou koncentrací (poraďte se s asistentem, případně vyzkoušíme metodou pokus omyl – absorbance nesmí v celé škále skenu přesáhnout hodnotu 3). Zvolenou vlnovou délku si zapíšeme a můžeme se přesunout k samotnému měření kinetiky. Aplikaci pro opakované měření v čase najdeme v ① Applications a podmenu ④ Kinetics. Zadáme právě zjištěnou vlnovou délku, čas zdržení 0 s, trvání 30 min a interval měření 1 min. Změříme referenci (pokud zvolíme referenci na vzduch, musíme po ukončení měření ještě změřit absorbanci kyvety s čistou vodou a hodnotu od naměřených kinetických dat odečíst), do vody v kyvetce přemístíme několik připravených částic a stiskneme START. Během měření si zaznamenáme několik hodnot, hlavně v počáteční fázi (nedají se získat zpětně) a po měření si opíšeme počáteční a konečnou hodnotu absorbance. Oxid křemičitý je velmi dobrý sorbent a mnoho látek se ochotně sorbuje do jeho pórů. Tento jev by mohl snadno zanést značnou chybu do našeho měření částic s vrstvou SiO2 (Barvivo v uchovávacím roztoku se adsorbuje na oxid křemičitý a při měření kinetiky se desorbuje do měřeného objemu a tak navýší absorbanci. My ale chceme porovnávat rozdíl ve vylučování pouze toho množství barviva, které je přítomno v alginátu). Abychom tento vliv oddělili, připravíme si třetí vzorek. Částice čistého alginátu vápenatého pokryté oxidem křemičitým namočíme na 30 min do roztoku barviva (Pakliže jsme částice připravili správně, mělo by se barvivo naadsorbovat pouze na křemičitou vrstvu na povrchu částic a již by nemělo proniknout dále do alginátu). Takto připravený vzorek poté ihned měříme rovněž 30 minut.
Naměřené hodnoty by měly odpovídat pouze množství, které se desorbuje z křemičité vrstvy, a pokud je odečteme od hodnot naměřených pro obarvené alginátové částice s vrstvou SiO2, dostaneme data odpovídající vyloučenému barvivu pouze z alginátu, která tak již budou porovnatelná s daty naměřenými s částicemi bez křemičité vrstvy.
Sledování změn vlastností částic během sušení a rehydratace Nejprve spustíme program Quick PHOTO CAMERA kliknutím na ikonu na ploše počítače a zapneme fotoaparát. Ten následně v softwaru incializujeme kliknutím na ikonku fotoaparátu vlevo nahoře a počkáme na spuštění programu Olympus E-system. Pokud zde není aktivní ikonka Capture vlevo dole, klikneme na Connect nacházející se pod ní. Na obrazovce se zobrazí živý náhled (v nízkém rozlišení). Zvolíme objektiv, většinou bude třeba použít ten s nejmenším zvětšním, vzhledem k velikosti částic, a zaostříme obraz. Obraz je lepší zaostřit přímo na mikroskopu. Snímek se pak sejme kliknutím na ikonu Capture. Paralelně prostudujeme chování během sušení a dehydratace nepokryté a pokryté alginátové částice. Vyjmeme jednu částici z vody, umístíme ji na podložní mikroskopické sklíčko (lépe s výbrusem) a vzorek vložíme pod mikroskop. Během celého měření používáme stejný objektiv (zvětšení) a nepřeostřujeme. Pokud změníme během měření objektiv, musíme později při vyhodnocování průměrů částic použít jinou kalibraci pro měření velikosti částice a vložení měřítka. Sejmeme obrázek v čase t = 0 (z něj vyhodnotíme počáteční průměr částice D0). Další obrázky snímáme vždy po pěti minutách (pokud budete stíhat častěji, tím lépe; například každé 2 minuty, tzn. snímání každou minutu při paralelním měření). Částici necháme volně schnout na vzduchu a snímáme obrázky v pravidelných časových intervalech. V čase t = 10 min uděláme snímek a částici zakápneme roztokem, ze kterého jsme ji původně vyjmuli. Ujistíme se, že je částice plně ponořená a dále snímáme v pravidelných intervalech bobtnání částice. V čase t = 30 min vyjmeme nabotnalou částici z roztoku na jiné sklíčko a necháme ji volně dalších 30 minut schnout. V čase t > 60 min opět sejmeme obrázek, částici vrátíme do vody a v pětiminutových intervalech 15 minut sledujeme bobtnání částice. Při vyhodnocování velikosti částic nejprve otevřeme obrázek v Quick PHOTO CAMERA a zvolíme kalibraci odpovídající použitému objektivu mikroskopu uprostřed prostředního řádku (Mag.). Do obrázku přidáme měřítko kliknutím na ikonu, která je hned za kalibrací, následně stisknutím Ctrl+E (sloučení vrstev) a potvzením. Rozměr částic zjistíme z několika měření (minimálně 3 měření; střední velikost lze nalézt v exportovaném souboru), které si zapneme předposlední ikonkou v prostředním řádku. Fotografie si uložíme a naměřená data si exportujeme do Excelu do vlastní složky na ploše.
Zakončení Po skončení laboratorní práce po sobě uklidíme na všech místech, kde jsme pracovali. Organická rozpouštědla (n-hexan) vylijeme do odpadní nádoby k tomu určené. Vodné roztoky a roztoky CaCl2 lze vylét do výlevky. Použité nádobí umyjeme nebo vložíme do myčky. Vypneme používaná zařízení.
Zpracování výsledků Během měření absorbance (vylučování) si zaznamenejte počáteční a konečnou hodnotu absorbance (zobrazí se po dokončení měření) a minimálně 4 hodnoty mezi. Do grafu vyneste závislost poměru absorbance počáteční k absorbanci v daném čase (A0/A) na čase. Porovnejte rychlost vylučování z pokrytých a nepokrytých částic a vlic adsorbce/desorbce barviva na křemičitou schránku. Za pomoci programu Quick PHOTO CAMERA změřte průměry (střední velikost) alginátových částic v jednotlivých časech (D) a do grafu vyneste závislost poměru průměru v daném čase k počátečnímu průměru (D/D0) na čase. Porovnejte rozdíl mezi alginátovými částicemi bez křemičité schránky a s ní.
Zaměřte se na jejich povrchovou strukturu, velikost a poměr D/D0. Dále diskutujte schopnosti těchto částic rehydratovat se, pokud jsou vysušeny jen částečně a pokud jsou zcela suché. Do protokolu popište velmi stručně postup práce a výsledky pozorování, vložte reprezentativní mikroskopické snímky připravených částic a grafy závislostí D/D0 a A0/A na čase.
Symboly a zkratky A A0 APTES D D0 t TEOS
absorbance v čase t počáteční absorbance (3-aminopropyl)triethoxysilan průměr částice v čase t počáteční průměr částice (v čase t = 0) čas tetraethoxysilan
Kontrolní otázky (po zpracování protokolu) 1. 2. 3. 4.
Jakým způsobem se vyrobí částice alginátu vápenatého z roztoku alginátu sodného (princip)? Proč se částice pokrývají vrstvou oxidu křemičitého? Jakým způsobem se vyrobí křemičitá slupka na částicích (princip)? Jak vysvětlíte rozdílnou/stejnou rychlost difuze z pokrytých a nepokrytých částic? Jaký vliv má adsorpce vitaminu B12 na křemičitou slupku? 5. Jak se liší smršťování a bobtnání pokrytých a nepokrytých částic? Jak se liší schopnost zpětné rehydratace při částečném a úplném vysušení? 6. Jaké znáte další techniky přípravy částic?
Doporučená literatura
Haufová P., Knejzlík Z., Hanuš J., Zadražil A., Štěpánek F., “Reversible buckling and diffusion properties of silica-coated hydrogel particles”, J. Coll. Interf. Sci. 357, 109-115 (2011)
Reference [1] Z. Deng, Z. Zhen, X. Hu, S. Wu, Z. Xu a P. Chu, „Hollow chitosanesilica nanospheres as pHsensitive targeted delivery carriers in breast cancer therapy,“ Biomaterials, č. 32, pp. 4976-4986, 2011. [2] X. Mei, D. Chen, ,. N. Li, Q. Xu, J. Ge, H. Li a J. Lu, „Hollow mesoporous silica nanoparticles conjugated with pH-sensitive amphiphilic diblock polymer for controlled drug release,“ Microp. Mesop. Mater., č. 152, pp. 16-24, 2011. [3] T. Taniguchi, S. Obi, Y. Kamata, T. Kashiwakura, M. Kasuya, T. Ogawa, M. Kohri a T. Nakahira, „Preparation of organic/inorganic hybrid and hollow particles by catalytic deposition of silica onto core/shell heterocoagulates modified with poly[2-(N,N-dimethylamino)ethyl methacrylate],“ Journ. Coll. Interf. Sci., č. 368, pp. 107-114, 2012.
