Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
Dr Bélteki Gusztáv
Új módszerek a transzgénes egér technológiában
Témavezető:
Prof. Dr. Falus András
Opponensek:
Dr Prohászka Zoltán Dr Polgár Beáta
Szigorlati Bizottság:
Prof. Dr. Schaff Zsuzsa Prof. Dr. Dinnyés András Dr. Tóth Sára
Budapest és Cambridge (UK), 2005
Tartalomjegyzék 1
Bevezetés
7
1.1
A transzgénes egér technológia jelentősége a posztgenomikus korban
7
1.2
Az embrionális őssejtek (ES sejtek) szerepe a transzgénes
8
technológiában 1.2.1
Az embrionális őssejtek eredete és jellemzői
8
1.2.2
Az ES sejteken alapuló transzgenezis előnyei az egyéb technikákkal
10
szemben 1.3
Az ES sejtek genetikai módosításának lehetőségei
10
1.3.1
„Klasszikus” transzgenezis ES sejtek segítségével
11
1.3.2
Gén „targeting”
11
1.3.2.1
Null mutáció létrehozása egérben: „knock-out”
12
1.3.2.2
Specifikus genetikai változások létrehozása: „knock-in”
12
1.4
Nagyléptékű mutagenezis egérben
14
1.4.1
Kémiai mutagenezis egérben
14
1.4.2
Géncsapdázás („gene trapping”)
15
1.4.3
RNS interferencia
17
1.5
Feltételes (kondicionális) genetikai módosítások egérben
17
1.5.1
A klasszikus „knock-out” technológia korlátai
17
1.5.2
A helyspecifikus rekombinázok jellemzői
18
1.5.3
A kondicionális módosítás példái
20
1.5.3.1
Kondicionális gén „targeting”
20
1.5.3.2
Transzgének kondicionális overexpressziója
20
1.5.4
A kondicionális rendszerek korlátai
23
1.5.4.1
Nemkívánatos rekombináz expresszió
23
1.5.4.1.1 Liganddal indukálható Cre rekombinázok
23
1.5.4.1.2 Tetraciklinekkel indukálható transzgénes rendszerek
24
1.5.4.1.3 Egyéb inducibilis rendszerek
24
1.5.4.2
26
Genomiális integrációra építő stratégiák
1.5.4.2.1 A „pop-in” integráció
26
2
1.5.4.2.2 A rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE)
27
1.6
A φC31 integráz rendszer
29
1.6.1
A φC31 integráz jellemzői
29
1.6.2
A φC31 integráz felismerési helyei
30
1.6.3
A φC31 integráz működése heterológ környezetben
30
2
Célkitűzések
32
3
Módszerek
33
3.1
Transzgénes vektorok létrehozása
33
3.1.1
φC31 integráz kísérlet
33
3.1.1.1
Felismerési helyek
33
3.1.1.2
Dokkoló vektorok
33
3.1.1.3
Inszerciós plazmidok
36
3.1.2
Reverz tetraciklin transzaktivátor kísérlet
38
3.1.2.1
Target vektor készítése
38
3.2
Sejtkultúra protokoll
38
3.2.1
ES sejtek tenyésztése, passzálása, tárolása
39
3.2.1.1
ES sejtek tenyésztése
39
3.2.1.2
ES sejtek passzálása
39
3.2.1.3
ES sejtek tárolása
39
3.2.2
ES sejtek genetikai módosítása
41
3.2.2.1
DNS bejuttatása ES sejtekbe
41
3.2.2.2
ES sejtek drogszelekciója és a kolóniák expanziója
42
3.2.3
Genomiális DNS izolálása ES sejtekből
42
3.2.4
ES sejtek előkészítése az embrió aggregációra
43
3.2.5
ES sejtek transzfekciója lipofekcióval
43
3.3
Southern blotting
43
3.4
Polimeráz láncreakció
44
3.5
Embriológiai módszerek
45
3.5.1
ES sejt – diploid morula aggregáció
45
3
3.5.2
Pronukleáris mikroinjekció
46
3.5.3
Egérembriók X-gal festése
46
3.5.4.
Fluoreszcens detektálás
47
4
Eredmények
48
4.1
φC31 integráz kísérlet
48
4.1.1
Dokkoló helyet tartalmazó ES sejtvonalak létrehozása és molekuláris
48
jellemzése 4.1.2
A φC31 integráz működőképes egér ES sejtekben
49
4.1.2.1
Helyspecifikus integráció a φC31 integrázt expresszáló ES sejtekben
49
4.1.2.2
A rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) echanizmusának elemzése
52
4.1.2.2.1 A helyspecifikus integráció lehetőségei
52
4.1.2.2.2 Az integrációs termékek elemzése
53
4.1.2.3
A rekombinációs helyek molekuláris vizsgálata
57
4.1.3
A φC31 integráz expressziója nem befolyásolja az ES sejtek fejlődési
59
potenciálját 4.1.4
A φC31 integráz használata szelekciót igényel
59
4.1.4.1
Genomiális integráció vizsgálata a zigótában
59
4.1.4.2
Genomiális integráció ES sejtekben nem szelektív körülmények között
61
4.2
Reverz tetraciklin transzaktivátor kísérlet
62
4.2.1
Rosa26-rtTA knock-in ES sejtvonal létrehozása
62
4.2.2
A tetraciklinnel indukálhatóság vizsgálata ES sejtekben
64
4.2.3
Rosa26-rtTA knock-in egér létrehozása
66
4.2.4
A Cre-kondicionalis Rosa26-rtTA egértörzs tesztelése in vivo
67
4.2.4.1
A Rosa26-rtTA egértörzs használatának elvi sémája
67
4.2.4.2
A VEGF-A embrionális konstitutív overexpressziója embrionális
69
letalitást okoz 4.2.4.3
Peliosis hepatis és thymus atrophia a VEGF-A posztnatális
72
overexpressziója esetén 4.2.4.4
A VEGF-A központi idegrendszeri overexpressziója az embrionális életben idegrendszeri vérzések kialakulásához vezet 4
72
4.2.4.5
A VEGF-A overexpressziója a vese podocytáiban nephrosis szindrómát
73
okoz 5
Megbeszélés
74
5.1
φC31 integráz projekt
74
5.1.1
A φC31 integráz működése és annak korlátai ES sejtekben
74
5.1.1.1
A helyspecifikus rekombináció lehetséges iránya
74
5.1.1.2
A genomiális integráció mechanizmusáról
76
5.1.1.3
A φC31 integráz mediálta genomiális integráció hatékonysága
77
5.1.1.4
A φC31 integráz lehetséges káros hatásai az ES sejtekre
78
5.1.2
A φC31 integráz rendszer lehetséges alkalmazásai az ES sejt
79
technológiában 5.1.2.1
Géncsapda inszerciók másodlagos módosítása
79
5.1.2.2
Transzgének kiszámítható expressziója jól jellemzett genomiális
81
dokkoló helyeken 5.1.3
A φC31 integráz egyéb alkalmazási területei
81
5.2
Reverz tetraciklin transzaktivátor projekt
84
5.2.1
Az indukálható génexpressziós rendszerek sajátságai
84
5.2.2
A Rosa26-rtTA stratégia alkamazhatóságának elemzése
84
5.2.2.1
A genom manipuláció és az induktor hatása
85
5.2.2.2
Alacsony háttéraktivitás és gyorsan indukálható génexpresszió
85
5.2.2.3
A szövetspecificitás biztosítása
86
5.2.3
A VEGF-A overexpressziójának következményei egérben
87
5.2.4
A Rosa26-rtTA stratégia korlátai és továbbfejlesztési lehetőségei
88
6
Következtetések
90
6.1
φC31 integráz projekt
6.2
Reverz tetraciklin transzaktivátor projekt
91
7
Köszönetnyilvánítás
92
8
Irodalomjegyzék
93 5
9
Saját közlemények jegyzéke
101
10
Összefoglaló
102
11
Summary
103
12
Ábrák és táblázatok jegyzéke
104
13
A dolgozatban használt rövidítések
106
6
1. Bevezetés 1.1 A transzgénes egér technológia jelentősége a posztgenomikus korban A XX. század utolsó és a XXI. század első évtizedének legjelentősebb biológiai felfedezése a genom projektek kidolgozása és megvalósítása. A genom projekt elnevezés élőlények genetikai programjának DNS szekvencia-szintű meghatározását jelenti. Legismertebb a saját fajunk genetikai információját felderítő Humán Genom Projekt (1,2,3), ezzel egy időben folyik azonban kísérleti modellként szolgáló élőlények (pl. Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus) és fontos kórokozó organizmusok (pl. Mycobacterium tuberculosis) genom projektje is (4,5,6,7). E munkák eredményeképpen nagy számú új gén válik ismertté – becslések szerint az emberi és az egér genomban egyaránt kb. 20000-30000 a fehérjét kódoló gének száma. E gének jelentős részének funkciója ismeretlen (8). A szekvencia-adatbázisok segítségével a DNS-szekvenciából megjósolható a kódolt fehérje aminosav-sorrendje, abból azonban csak általában csak durva becslés tehető a működésre nézve. A korábbiakban két módon lehetett kísérleti betekintést nyerni egy emberi gén működésébe: a kódolt fehérje tulajdonságainak vizsgálatával és a gén mutációja által eredményezett kóros állapot vizsgálatával. Sok fehérje azonban igen nehezen izolálható, és az in vitro funkcionális vizsgálatokkal csak korlátozott információ nyerhető. Az örökletes emberi betegségek csak génjeink kis részét jellemzik működési szempontból. Számos gén nélkülözhetetlen az egyedfejlődés igen korai szakaszában, és működésének kiesése az embrió pusztulását okozza, vagyis beteg egyed nem születik meg. Az is gyakori, hogy a kieső funkciót más gének képesek teljességgel átvenni, és ezért nem jelentkezik kóros fenotípus. A fenti meggondolások teszik szükségessé a transzgénes egerek létrehozását és vizsgálatát a gének funkcionális jellemzése céljából. A gének szerkezete és szerveződése valamint
a
legtöbb
biológiai
mintázatképzés) nagyfokú
folyamat
(pl.
biokémiai
reakcióutak,
fejlődési
hasonlóságot mutat emberben és egérben, így az
egérmodellen nyert adatok - megfelelő kritikával - emberre is átvihetők. Az egér génjei célzottan vagy random módon megváltoztathatók, s a mutációk következményei kísérletesen vizsgálhatók. Embriológiai vizsgálatok végezhetők az embrionális letalitással járó mutációk funkcionális jellemzésére. Az utóbbi két évtized technológiai haladásának 7
(l. lentebb) eredményeképpen ma már gyakorlatilag bármilyen kívánt genetikai változtatás előidézhető az egér genomjában. Nincs pontos adat arról, hány gén mutációját idézték már elő egérben, de a szám bizonyosan meghaladja a 3000-et (9). 1.2 Az embrionális őssejtek (ES sejtek) szerepe a transzgénes technológiában 1.2.1 Az embrionális őssejtek eredete és jellemzői Az embrionális őssejtek (ES sejtek) pluripotens őssejtek, melyek az embrionális fejlődés korai szakaszában izolálhatók. A blasztula stádiumú embrióban két sejttípus található: a külső sejtréteget képező trophoectoderm és a belül elhelyezkedő embriócsomó (más néven belső sejttömeg). Utóbbi sejteket megfelelő körülmények között in vitro tenyésztve ES sejtvonal hozható létre (10, 11). E sejtek táptalajon sok generáción át fenntarthatók és szaporíthatók, közben genetikai állományuk célzottan megváltoztatható és a megfelelő mutációt hordozó klónok izolálhatók (1A. ábra). Az in vitro manipuláció közben az ES sejtek megőrzik eredeti fejlődési potenciáljukat, és képesek az embrió valamennyi szervévé illetve szövetévé differenciálódni (de nem képesek részt venni a trophoectoderm és a visceralis endoderm képzésében). Amennyiben injekció vagy aggregáció segítségével az ES sejteket egy blasztula stádiumú embrióval hozzuk össze, a születendő egyed kiméra lesz, vagyis szervezete tartalmazni fog az eredeti zigótából és az ES sejtekből származó sejteket egyaránt (1B. ábra). Amennyiben az egyed ivarsejtjei között is található ES sejt eredetűek, akkor azok révén az ES sejt genetikai állománya az utódra átörökíthető; ezt nevezik germinális transzmissziónak. Ily módon a genetikailag megváltoztatott sejtből genetikailag megváltoztatott (transzgénes) élőlény hozható létre (12).
8
1. ábra: ES-sejtek és alkalmazásuk A. ES-sejtek izolálása, módosítása, transzgénes egér létrehozása
Blasztula ES-sejt izolálás
DNS
Transzgénes egér
Drogszelekció Germinális transzmisszió
Szubklónok izolálása, expanziója és genetikai jellemzése
Kiméra egér
Kiméra embrió
ES-sejt – embrió aggregáció
B. ES-sejtek és diploid egérembrió aggregációjából származó kiméra
9
1.2.2 Az ES sejteken alapuló transzgenezis előnyei az egyéb technikákkal szemben Transzgénes élőlények létrehozásának alternativ módja az egyed sejtjeinek in vivo genetikai módosítása. Ennek két fő lehetősége a sejtek transzdukciója rekombináns vírusokkal
illetve
a
DNS
közvetlen
bejuttatása
fizikai
módszerekkel
(pl.
mikroinjekcióval). Amennyiben örökölhető genetikai változtatást tervezünk, akkor annak germinális transzmissziója szükséges. Ez csak az ivarsejtek vagy az igen korai stádiumú embriók (optimálisan a zigóta) genetikai állományának megváltoztatásával érhető el. A gyakorlatban leggyakrabban a bejuttatandó DNS szakasz (transzgén) pronukleáris injekcióját végzik a megtermékenyített petesejt pronucleusába. A pronukleáris injekció (és az egyéb technikák) alkalmazhatóságát két tényező korlátozza, melyek az ES sejt technológiával áthidalhatók: 1. A bejuttatott DNS szakasz előre nem megjósolható helyen és példányszámban épül be a sejt saját DNS-ébe. Ez az esetek kb. 5-10 %-ában fenotípusosan megjelenő mutációt okoz. Ennél jelentősebb azonban, hogy a random módon beépült DNS-szakasz a szomszédos endogén génszabályozó elemek pozícióhatása alá kerül, és ilyen módon expressziója nem a kívánt módon alakul. Ahhoz, hogy megbízható transzgén expressziót érjünk, nagyszámú egértörzset kell létrehozni és expressziós szempontból jellemezni. 2. A fenti technikákkal csak a kívülről bevitt DNS-szekvenciák vizsgálatára van mód, a sejt saját génjeit nem lehet célzottan megváltoztatni. 1.3 Az ES sejtek genetikai módosításának lehetőségei Az ES sejtekben (és a belőlük létrehozott transzgénes egerekben) előidézhető genetikai változások fogalmilag két csoportba oszthatók. Az egyik lehetőség külső, idegen DNS-szakaszok beépítése a sejt genomjába. Ezzel az adott DNS-szakasz által előidézett fenotípusbeli változások vizsgálhatók in vitro és in vivo. Szűkebb értelemben e DNS-szakaszokat nevezik transzgéneknek. Tágabb értelemben azonban „transzgénes egérnek” neveznek minden, mesterségesen megváltoztatott genetikai állományú egértörzset. Közéjük sorolják tehát a másik fő lehetőséget, a saját DNS-állomány célzott megváltoztatását is. 10
1.3.1
„Klasszikus” transzgenezis ES sejtek segítségével Az ES sejteken alapuló transzgenezis több előnnyel rendelkezik a klasszikus
módszerrel, a pronukleáris microinjekcióval szemben. Pozitív drogszelekcióval kiválaszthatók azok a sejtek, melyek felvették és stabilan expresszálják a transzgént. Genetikai módszerekkel (pl. Southern hibridizáció) megállapítható, hány példányban épült be a transzgén a sejt DNS-ébe, kiválaszthatók az egyetlen kópiát tartalmazó sejtvonalak. Amennyiben a transzgénben található egy vizualizálható riportergén (pl. lacZ vagy eGFP), akkor képet kaphatunk a transzgén expressziójáról differenciálatlan ES sejtekben vagy in vitro valamely szöveti sejttípussá differenciált sejtekben (13, 14). Összességében tehát lehetőségünk van, hogy a különböző random inszerciókat tartalmazó sejtvonalakat előzetesen in vitro jellemezzük, s csupán az igéreteseket vizsgáljuk tovább in vivo transzgénes egér formájában. 1.3.2
Gén „targeting” Gén „targeting”-nek nevezzük valamely endogén DNS-szakasz megváltoztatását
egy külsőleg bejutatott DNS-molekula segítségével. A módszer alapja a homológ rekombináció jelensége: amennyiben a bejuttatott DNS-szakasz és valamely saját DNSszakasz között megfelelő hosszúságú átfedés van, akkor rekombináció (crossing over) következhet be a két szakasz között. Ennek eredményeként a külső DNS-szakasz a vele homológiát mutató lókuszra beépül, annak mutációját okozva (15). A homológ rekombináció ES sejtekben igen ritka esemény. A sejtek többségének genomjába egyáltalán nem épül be a bejuttatott DNS, és a beépülés a legtöbb esetben random és nem homológ módon történik. Ezért mindenképpen szükséges, hogy pozitív drogszelekcióval ki tudjuk választani a külső DNS-t a genomba beépítő sejtvonalakat, és hogy ezek közül genetikai analízissel azonosítsuk azokat, amelyekben homológ rekombináció zajlott le. 1.3.2.1 Null mutáció létrehozása egérben: „knock-out”
11
„Knock-out”-nak nevezik valamely gén megváltoztatását ES sejtekben homológ rekombináció segítségével olyan módon, hogy a gén ne legyen képes működőképes fehérje termelésére. A klasszikussá vált technikát a 2. ábra mutatja be. A rekombináció helyéül a gén olyan szakaszát választják, mely a szekvenciából feltételezett funkció alapján létfontosságúnak tűnik a géntermék működőképessége szempontjából (pl. egy enzim esetében a katalitikus helyet kódoló exon). A két megfelelő hosszúságú (> 1 kb) homológ szakasz („homológ karok”) egy pozitív szelekciós markert fognak közre; a karokon kívül negatív szelekciós marker helyezkedik el. Pozitív szelekciós markerként használatos a neomycin foszfotranszferáz (neo) és a puromycin aciltranszferáz (puro) génje, a megfelelő antibiotikumok (G418 illetve puromycin) alkalmazásával. Negatív szelekciós marker a herpes vírus timidin kináz génje (tk) és a diphteria toxin A alegysége (DT-A); az előbbi gén expresszáló sejtek gancyclovir hatására elpusztulnak, a DT-A gént kifejező sejtek elpusztulásához nincs szükség drogra (16). Kettős (pozitív-negatív) szelekció alkalmazásával izolálhatók azok a sejtvonalak, amelyeknél mindkét homológ karban 1-1 rekombinációs esemény történt, és ezért a gén karok közötti szakasza a pozitív szelekciós markerre cserélődött. Az előidézett genetikai változás rendszerint a gén működésének kieséséhez vezet (pl. csak jelentősen rövidebb és/vagy instabil mRNS termelődik vagy a fehérje létfontosságú doménjei hiányoznak), ez azonban nem minden esetben jósolható meg biztonsággal. Fontos megjegyezni, hogy a beépülő szelekciós marker és annak promotere távoli DNS-szakaszok, így szomszédos gének kifejeződését is befolyásolhatja (17). Megszokott eljárás ezért a szelekciós marker in vitro deléciója a knock-out egér létrehozása előtt. Ez valamely helyspecifikus rekombináz-rendszer alkalmazásával érhető el (l. lentebb). 1.3.2.2 Specifikus genetikai változások létrehozása: „knock-in” A spontán mutációk csupán kis része okozza a gén működésének teljes kiesését. Hasonlóképpen, egy gén funkciójának tanulmányozásához a null mutáció okozta
12
2. Ábra: Knock-out allél létrehozása homológ rekombinációval
Genom DNS
* Target vektor
neo
tk
Megváltoztatott gén
neo
mRNS Fehérje
13
fenotípuson kívül egyéb genetikai változások következményét is meg kell vizsgálni. A fenti szakaszban részletezett technika módosításával erre lehetőség van: az így létrehozott alléleket nevezik „knock-in”-nek. Lehetőség van pl. hypomorph vagy hypermorph allélek létrehozására; adott esetben egy bizonyos pontmutáció is illeszthető a génbe. Olyan genetikai változások is létrehozhatók, melyek spontán nem fordulhatnak elő: a gén kódoló szekvenciája kicsélhető egy másik génével, amelynek expressziója így az eredeti gén szabályozó régióinak irányítása alá kerül. Ha a beépített DNS szakasz egy hisztokémiailag (pl. lacZ) vagy fluoreszcenciával (eGFP) vizualizálható fehérjét kódol, akkor az eredeti gén expressziója in vivo követhető (18). 1.4 Nagyléptékű mutagenezis egérben A homológ rekombináció segítségével elméletileg bármely gén tetszőlegesen megváltoztatható. A technika azonban általában igen munka- és eszközigényes. Egyrészt általában nagyszámú (több száz) drog-rezisztens sejtvonal közül kell kiválasztani a megfelelő genetikai eltérést hordozókat, másrészt a germinális transzmisszió elérése majd pedig a homozigóta egerek előállítása nagy számú egér keresztezését és genotípusvizsgálatát igényli. Ezért a hagyományos módszerekkel a knock-out technológia nem alkalmazható nagyszámú gén funkcionális szűrővizsgálatára, ami pedig a genom projektek során felszínre kerülő új kódoló szekvenciák elemzéséhez kívánatos lenne. Ennek áthidalása három, egymástól alapvetően eltérő módon lehetséges. 1.4.1
Kémiai mutagenezis egérben Ha hím egerek ivóvízébe erősen mutagén hatású etil-nitrozureát (ENU) teszünk,
akkor ivarsejtjeik jelentős része indukált pontmutációkat fog hordozni. Ezen egerek utódaiban a domináns mutációk fenotípusos következményeit már közvetlenül vizsgálhatjuk. További előny, hogy az így létrehozott pontmutációak túlnyomóan nem null mutációk, hasonlóan a spontán fellépő genetikai változásokhoz. A módszer fő hátulütője, hogy a fenotípus alapján nem tudjuk, melyik génben történt a mutáció. Ennek meghatározásához a gén pozicionális klónozására van szükség, mely ugyan a ma rendelkezésre álló nagyfelbontású genetikai és fizikai térképek birtokában jelentősen 14
leegyszerűsödött, de még mindig igen erőforrás-igényes. A másik probléma, hogy közvetlenül csak a domináns mutációk okozta fenotípusok vizsgálhatók; a recesszív mutációk analíziséhez keresztezési sémák végrehajtása szükséges. Jelenleg több nagyléptékű ENU mutagenezis program van folyamatban világszerte (19, 20, 21). Az ENU mutagenezis ES sejtekben is alkalmazható (22). 1.4.2
Géncsapdázás („gene trapping”) A géncsapdázás inszerciós mutagenezis ES sejtekben, amelynek során a sejtekbe
elektroporációval vagy retrovírus fertőzéssel bejuttatott DNS molekula (vektor) random módon épül be a sejt genomjába, mutációt idézve elő abban (23). A beépülő DNS szakasz tartalmaz egy vizualizálható fehérjeterméket kódoló riportergént és pozitív szelekciós markert (l. 3. ábra). A promoterrel nem rendelkező riportergént egy splice akceptor (SA) szekvencia előzi meg. Ha a vektor egy gén intronjába épül be, akkor a génnek az inszerciós helytől 5’ irányba eső részéből és a riporterből álló fúziós mRNS illetve fúziós fehérje jön létre, melyben a riporter fehérje általában megőrzi aktivitását. A szelekciós marker rendelkezhet saját promoterrel, vagy szintén alá lehet rendelve az endogén gén szabályozó elemeinek; utóbbi esetben csak azok a gének érhetők el mutagenezis céljából, amelyek expressziót mutatnak differenciálatlan ES sejtekben. A géncsapda-vektor beépülésének három lényeges következménye van (24): 1. A szóban forgó gén transzkripciója az inszerciónál általában megszakad, ami az esetek többségében a gén null mutációját eredményezi. 2. A létrejövő fúziós mRNS információt hordoz az endogén génről és a riporterről egyaránt, így izolálható, és megfelelő módszerrel a szóban forgó gén egyszerűen azonosítható. 3. A riporter gén expressziója híven tükrözi az endogén gén expresszióját, és az vizualizálható in vitro és in vivo egyaránt. Több nagyléptékű „gene trap” projekt van folyamatban jelenleg is (25, 26, 27). Ezek során nagyszámú (több ezer) mutáns sejtvonalat állítanak elő. A mutáns egerek létrehozása előtt az inszerciókat jellemzik, és érdekesség szerint rangsorolják. Ez
15
3. Ábra: Géncsapda mutagenezis ES sejtekben Az ábrán látható vektorok random beépülése valamely gén intronjába a gén null mutációját eredményezi. A poliadenilációs jel az mRNS szintézisének befejezéséhez vezet, így a további exonok nem íródnak át. A lacZ gén termékének hisztokémiai vizsgálatával lehetséges a gén expressziójának követése. A β-geo gént a lacZ és neo fúziójával hozták létre. Az „A” ábrán látható vektorral potenciálisan valamennyi gént vizsgálhatjuk, a „B” ábrán szereplő vektor csak a differenciálatlan ES sejtekben aktív gének elemzésére alkalmas. (Pr: promoter, SA: splice akceptor, a többi rövidítést l. a szövegben.) A Genom DNS
Pr Géncsapda vektor
Pr
SA-lacZ-pA
PGK-neo-pA
mRNS lacZ
B
pA
Genom DNS
Pr Géncsapda vektor
Pr
mRNS
SA-βgeo-pA
βgeo
pA
16
történhet az endogén gén szekvenciája alapján, és történhet a sejtvonalak funkcionális jellemzésével (pl. markergén-expresszió változása külső ágensek vagy in vitro differenciálódás hatására). A gene trap vektor módosításaival lehetőség nyílik speciális géncsoportok célzott keresésére is (28, 29). 1.4.3
RNS interferencia (RNAi) Az utóbbi években vált ismertté, hogy a sejtekbe bejuttatott vagy ott termelődő
rövid,
20-30 nukleotid hosszúságú kétszálú RNS (rövid interferáló RNS, siRNA)
specifikusan képes gátolni a vele azonos szekvenciát tartalmazó gén expresszióját. A módszert először C. elegans-ban alkalmazták a génműködés külső befolyásolására (30). A technológia továbbfejlesztése mára lehetővé tette RNS interferencia könyvtárak létrehozását, melyek a vizsgált élőlény összes génjére (vagy azok jelentős hányadára) tartalmaznak siRNA-t. E könyvtár felhasználásával C. elegans-ban teljes genom screeneket végeztek, vagyis a genom összes génjét megvizsgálták, hogy a gén inaktiválása képes-e egy bizonyos fenotípusbeli eltéréshez vezetni (31). Tenyésztett emlős sejtekben is végezhetők hasonló screen-ek, amennyiben a keresett fenotípus sejtszinten azonosítható (pl. apoptosis) (32, 33). RNS interferencia alkalmazásával specifikus null mutáció idézhető elő ES sejtekben („knock-down”) is, mely a rövid RNS-ek stabil expressziója esetén a transzgénes egérben is megfigyelhető (34, 35). Nincs szükség nagy számú ES sejtvonal előzetes genetikai vizsgálatára, és recesszív mutációk esetén is azonnal (keresztezés nélkül) null fenotípust kapunk. E módszer még technológiai fejlesztésre szorul, de potenciálisan lehetővé teheti igen nagy számú gén funkcionális analízisét viszonylag kevés ráfordítással. 1.5
Feltételes (kondicionális) genetikai módosítások egérben
1.5.1
A klasszikus „knock-out” technológia korlátai Génjeink jelentős hányadára jellemző a pleiotrópia, vagyis a gén terméke a
különböző szervekben és szövetekben vagy az egyedfejlődés különböző szakaszaiban egyaránt jelentős feladatot lát el. E gének működése nehezen vizsgálható olyan egyedben, 17
amelynek minden sejtje a gén null mutációját tartalmazza. Ha például egy gén működése elengedhetetlen valamely létfontosságú szerv kifejlődéséhez az embrionális fejlődés során, akkor annak kiesése az egyed méhen belüli elhalásához vezet. A gén működése más szervekben és/vagy az egyedfejlődés későbbi szakaszaiban nem vizsgálható. E gének analíziséhez szomatikus mozaik élőlények előállítása szükséges, amelyekben a gén funkciója izoláltan vizsgálható valamely szövetben. További lehetőségeket nyit meg, ha a gén be- és kikapcsolása időben is szabályozható. E technikákat gyűjtőnéven kondicionális (feltételes) génmódosítási stratégiáknak nevezzük. (36). Alkamazásukat a helyspecifikus rekombinázok használata tette lehetővé. 1.5.2
A helyspecifikus rekombinázok jellemzői A helyspecifikus rekombinázok genetikai átrendeződések katalízisére képes
enzimek. Jelenleg két rekombináz használata terjedt el széleskörben ES sejtekben: az E. coli P1 fágjából származó Cre rekombináz (37, 38), és az élesztő (Saccharomyces cerevisae) Flp rekombináza (39, 40). Gazdaszervezetében mindkét rekombináz a genom megkettőződése során játszik fontos szerepet. A genetikai átrendeződés minden esetben a rekombináz két felismerési helye között történik. A Cre rekombináz felismerési helyét loxP helynek, Flp rekombinázét FRT helynek nevezzük. Mindkét felismerési hely 34 bp hosszúságú DNS szakasz, mely palindrom „karokból” és a közöttük elhelyezkedő „magból” áll (4A. ábra). A mag aszimmetrikus szekvenciájának iránya határozza meg a felismerési hely orientációját. A rekombináció eredménye a két felismerési hely relatív helyzetétől függően deléció, inszerció, inverzió és transzlokáció egyaránt lehet (4B. ábra és l. 40. hivatkozás). A lehetséges különböző reakcióutak azonban termodinamikai és reakció-kinetikai kontroll alatt állnak. Az intramolekuláris átrendeződések (pl. deléció) általában előnyt élveznek az intermolekulárisokkal (pl. inszerció vagy transzlokáció) szemben, és minél nagyobb a két felismerési hely távolsága, annál kevésbé valószínű az intramolekuláris reakció lezajlása is. Megfelelő szelekciós stratégiák alkalmazásával azonban lehetséges kedvezőtlen reakcióirányok megvalósítása is. (41, 42, 43)
18
4. ábra: A helyspecifikus rekombinázok jellemzői A. loxP és FRT felismerési helyek A nyilak a palindrom karokat jelzik, az aszimmetrikus központi szekvenciát aláhúzással jelöltük. A felismerési hely irányultságáért az utóbbi a felelős. Az FRT felismerési hely nagyobb betűmérettel jelölt timidinje szintén megtöri a szimmetriát.
loxP: ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT FRT: GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC B. Helyspecifikus rekombinázokkal létrehozható genetikai átrendeződések
Deléció
Transzlokáció szelek ció
szelek
ció
Inverzió
= loxP or FRT
19
1.5.3 A kondicionális módosítás példái 1.5.3.1 Kondicionális gén „targeting” A kondicionális gén targeting során az adott gént nem inaktiváljuk az ES sejtekben, hanem az csak a sejtekből létrehozott egér bizonyos szöveteiben történik meg egy helyspecifikus rekombináz segítségével (44). Az ES sejtekben homológ rekombináció segítségével elhelyezzük a gén két intronjában a helyspecifikus rekombináz két felismerési helyét. Ez általában nem befolyásolja a gén működését. Utóbbi épségéhez rendszerint szükséges a homológ rekombináció során beépült szelekciós marker kazetta deléciója, ez ES sejtekben in vitro történik ugyanazon vagy másik helyspecifikus rekombináz segítségével (l. 5A. ábra). Az ilyen módon megváltoztatott ES sejtekből származó egerek általában nem mutatnak fenotípusbeli eltérést. Ha azonban keresztezzük őket egy olyan transzgénes egértörzzsel, melyben a Cre rekombináz expresszióját egy szövetspecifikus promoter irányítja, a mindkét genetikai változást hordozó utódok megfelelő szöveteiben a felismerési helyek között elhelyezkedő létfontosságú szakaszok kivágódnak. Ezzel a gént csupán az adott szövetféleségben inaktiváltuk, és ennek következményei a gén más hatásaitól izoláltan vizsgálhatók (5A. ábra). Az utóbbi években lehetővé vált a génexpresszió időbeli szabályozása is külső ágensekkel (pl. doxiciklin, tamoxifen) indukálható Cre rekombinázok segítségével (45, 46). 1.5.3.2 Transzgének kondicionális expressziója A helyspecifikus rekombinázok segítségével lehetséges a klasszikus transzgének expressziójának térben vagy időben szabályozott bekapcsolása. Ehhez a transzgén és annak ubiquitaer promotere közé egy felismerési helyekkel közrefogott poliadenilációs (pA) jelet kell elhelyezni (5B. ábra). Alapállapotban a transzgénről nem termelődik fehérje, mert az mRNS szintézisét a pA szignál megszakítja. Ha azonban az utóbbit a rekombináz szövetspecifikus expressziója eltávolítja, a szóban forgó szövet(ek)ben lehetővé válik a transzgén kifejeződése. Hasonló módon lehetséges „molekuláris
20
5. ábra: Kondicionális genetikai változások létrehozása egérben A. Kondicionális knock-out Az ábra részletes magyarázatát l. a szövegben. A szelekciós marker exciziójára in vitro kerül sor Cre-expressziós vektor transzfekciójával, amiben Cre gén kifejeződését az erős CMV promoter irányítja. A csillaggal jelölt, a gén működéséhez nélkülözhetetlen exon deléciója szövetspecifikusan történik in vivo. A nestin promoter az idegszövet progenitor sejtjeiben fejeződik ki, ezért ebben az esetben a gén az idegszövetben inaktiválódik. Más szövetspecifikus promotereket tartalmazó Cre egértörzsekkel a legkülönfélébb szövetekben érhető el a gén működésének kiesése. A háromszög loxP (vagy FRT) felismerési helyet jelöl. Az egyéb rövidítések értelmezését l. a 2. ábrán.
Genom DNS
* Target vektor
*
neo
*
neo
tk
Megváltoztatott gén
CMV
Kondicionális allél
Cre
* Nestin
Null allél
21
Cre
B. Transzgén szövetspecifikus overexpressziója Az erős és konstitutív CMV promoter jelenléte ellenére alapállapotban a gén által kódolt fehérje nem termelődik, mivel a három példányban jelenlevő poliadenilációs jel (3xpA) leállítja az mRNS szintézisét. A nestin gént expresszáló sejtekben Cre rekombináz termelődik, ez eltávolítja a loxP helyekkel közrefogott poliadenilációs jeleket. A géntermék képződése e sejtekben és utódsejtjeikben (a nestin esetében az idegszövetben) megindul.
CMV
Gén
3xpA
pA
Nestin
Szövetspecifikus excizió Gén
CMV
Cre
pA
kapcsoló” beépítése is az egér genomjába, mely a rekombináz hatására egyik gén kifejeződésről a másikéra kapcsol át (47). A jelenleg használt kondicionális rendszerek két fő problémáját a nemkívánatos rekombináz-expresszió és a genomiális integrációval kapcsolatos nehézségek jelentik. Ezeket elemezzük az alábbiakban. 1.5.4
A kondicionális transzgénes rendszerek korlátai 22
1.5.4.1 Nemkívánatos rekombináz expresszió A fent részletezett stratégiák során a Cre és a Flp rekombináz bizonyítottan jól teljesít, azaz távolítja el a felismerési helyei közötti DNS-szakasz. E modellek fő korlátját a Cre-egértörzsek promoterének specificitása jelenti. Általában nehéz olyan promotert találni, amely egy bizonyos szövetféleségben kellő erősséggel működik, ám a szervezet többi részében teljesen kikapcsolt állapotban van. Mitöbb, hiába szövetspecifkus valamely Cre-transzgénes egértörzs kifejlett egyedeiben a rekombináz expressziója, ha az egyedfejlődés korai szakaszában a promoter más szövetekben is bekapcsol: ilyen esetben az embrionálisan Cre-t expresszáló sejtek valamennyi utódsejtjében hiányzik a loxP helyek közötti DNS szakasz. Ha a promoter akár csak minimálisan is bekapcsolódik az ivarsejtekben, előalakjaikban vagy a zigótában, akkor a deléció és annak fenotípusos következménye az egyed minden sejtjében megtalálható lesz (48). A probléma megoldását az indukálható transzgénes rendszerek jelentik, ahol csak az induktor molekula jelenléte esetén aktiválódik a gén működése. A legfontosabb rendszereket mutatjuk be az alábbiakban, de az ideális stratégia még felfedezésre vár. 1.5.4.1.1 Liganddal indukálható Cre rekombinázok E rekombináns Cre proteinek csak akkor képesek a loxP helyek rekombinációját katalizálni, ha a megfelelő induktor hozzájuk kapcsolódik és konformácio-változást idéz elő. Az induktor általában szteroid hormon: ösztrogénnel indukálható Cre, tamoxifennel (ösztrogén analóg) indukálható Cre (49, 50). E rendszerek fő problémája, hogy gyakran megfigyelhető Cre aktivitás és nemkívánatos rekombináció induktor hiányában is. A másik probléma, hogy a szövetspecifikus és indukálható rendszereket egyedileg kell előállítani, a ligand-inducibilis Cre és a szövetspecifikus promoter összekapcsolásával; a stratégia képtelen kihasználni a nagyszámu már létező és jól jellemzett Cre egértörzset (51). 1.5.4.1.2 Tetraciklinekkel indukálható transzgénes rendszerek
23
A tetraciklin-inducibilis rendszereket eredetileg Herman Bujard laboratióriuma fejlesztette ki (52, 53). A rendszer egyik alapvető eleme a tetraciklin-reszponzív cisz-ható elem, mely egy minimális promoterből és a tetraciklin operátor oligomerjéből áll. Ezt közvetlenül a modulálni kivánt transzgéntől 5‘ helyzetbe helyezik el. A másik komponens a tetraciklin transzaktivátor, amely rekombináns DNS-kötő fehérje, a tetraciklin represszorból és a herpes simplex virus VP16 aktivációs peptidjének hibridjéből áll. Az eredetileg kifejlesztett tetraciklin transzaktivátor (tTA) esetében a tetraciklin vagy analógja (doxyciklin) kikapcsolja a génexpressziót (tet-off). A rendszer továbbfejlesztése a reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA), ahol a drog hozzaadása indukálja a génexpressziót (tet-on rendszer). A rendszerek működését mutatja be a 6. ábra. A génexpresszió be- illetve kikapcsolása tetraciklinnel történhet in vitro sejttenyészetben vagy in vivo élő állatban. Előbbi esetben a médiumhoz, utóbbi esetben az állat ivovízéhez adjuk a tetraciklint. Embrionális génaktiváció céljából a vemhes nőstényt kezeljük tetraciklinnel. Kinetikai okok miatt ez utóbbi esetben csak a tet-on rendszer használható. A tetraciklin-inducibilis rendszerek széles körű használatát két nehézség korlatozza. Az egyik, hogy a génműködés gátlása sokszor nem teljes, kikapcsolt állapotban is van némi génexpresszió, amely fenotípusos eltérésekhez is vezethet. Az utóbbi évtizedben ezért a rendszereket továbbfejlesztették, új transzaktivátorokat fejlesztettek ki és bevezették a tetraciklin-dependens silencer (tTS) alkalmazását (54, 55). A másik probléma, hogy – ellentétben a nagy számú és jól jellemzett Cre egértörzsekkel, hasonló tTA és rtTA törzsek egyelőre nem állnak rendelkezésre. 1.5.4.1.3 Egyéb inducibilis rendszerek A fentebb részletezett és általánosan elterjedt stratégiák mellett egyéb inducibilis rendszerek kifejlesztése is folyamatban van. Beszámoltak erythromycin-reszponziv transzaktivátor létrehozásáról (56), a laktóz operon alkalmazásáról emlős szervezetben (57), sőt gázzal indukálható transzgénekről is (58). A tetraciklin-reszponziv elem
24
6. ábra: Tetraciklin-inducibilis rendszerek A tetraciklin reszponzív promoter (TRE) egy minimális promoterből (TATA box) és a tetraciklin operátor (tetO) heptamerjéből áll. A tetraciklin transzaktivátor (tTA) és a reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA) mutáns tetraciklin represszorok, melyeket a herpes simplex vírus VP-16 proteinjének aktivációs doménjéhez kapcsoltak. A. Tetraciklin transzaktivátor (tTA, tet-off) rendszer. Tetraciklin hiányában a tetraciklin transzaktivátor (tTA) kötődik a tetraciklin reszponzív elemhez, és aktiválja a transzgén kifejeződését. Tetraciklin jelenléte esetén az a transzaktivátorhoz kötődik, és úgy változtatja meg annak konformációját, hogy az nem képes többé kötődni a promoterhez; a gén működése kikapcsolódik. B. Reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA, tet-on) rendszer. Az rtTA fehérje önmagában képtelen kötődni a TRE-hez, doxiciklin jelenlétében azonban hozzákapcsolódik és aktiválja a gén működését.
A
B tTA (Tet-off)
rtTA (Tet-on)
Gossen et al, 1992
Gossen et al, 1995
rtTA tTA (tetO)x7 + TATA
Transzkripció
(tetO)x7 + TATA
Nincs transzkripció
tTA rtTA (tetO)x7 + TATA
tTA
Nincs transzkripció
= tetR + VP16-AD
(tetO)x7 + TATA
rtTA
25
= tetR*+ VP16-AD
Transzkripció
szabályozta Cre rekombináz (TRE-Cre illetve tetO-Cre) indukálható Cre expressziót tesz lehetővé (59). A probléma ez esetben a szövetspecificitás hiánya. 1.5.4.2 Genomiális integrációra építő stratégiák A Cre és Flp rekombinázok nem működnek elég hatékonyan azon genetikai változások katalízise során, amelyek genomiális integrációval járnak. Ennek oka, hogy az ellenkező irányú reakció (deléció) termodinamikailag és kinetikailag egyaránt favorizált. E stratégiákra két fő célból van szükség: 1. Géncsapda-inszerciók másodlagos módosítása. Az eredeti inszerció általában null mutációt eredményez (l. 1.4.2 szakasz). Kívánatos volna azonban – a knock-in modellekhez hasonlóan – multifunkciós allélsorozatok előállítása (pontmutációk, vizualizálható markerek stb.). Ez jelenleg a homológ rekombinációval lehetséges a gén klónozása és target vektor építése után. Az inszerciókba történő helyspecifikus integráció segítségével azonban azok egyszerűen módosíthatók lennének ES sejtekben. 2. Jól jellemzett dokkoló helyek transzgének számára. A korábban említetteknek megfelelően az egér genomjába random módon beépülő transzgének az endogén génkörnyezet kiszámíthatatlan szabályozó hatása alá kerülnek (l. 1.2.2 szakasz). Ha a transzgéneket helyspecifikus integrációval korábban már jó jellemzett dokkoló helyekre építenénk be, kiküszöbölnénk a pozició hatás okozta eltéréseket. Célzott genomiális integráció létrehozására általában az alábbi két stratégia valamelyikét alkalmazzák. A kérdéskör azonban nem megnyugtatóan megoldott. 1.5.4.2.1 A „pop-in” integráció A „pop-in” integráció lényegében a deléciós helyspecikus rekombináció fordítottja. A reakció egyensúlya erősen eltolt az előbbi irányába, ezért nem szelektív körülmények között az inszerciót követően azonnal bekövetkezik a beépült szakasz kivágódása a genomból. Pop-in integráció kivitelezése ezért két módon lehetséges: 26
1. Erős pozitív szelekció alkalmazásával, például ha a helyspecifikus integráció helyreállít egy pozitív szelekciós markert (7A. ábra). Általában a kódoló szekvencia van a dokkoló helyen és a promoter a beépülő plazmidon, de a fordított helyzet is lehetséges. A szelekciós marker inszerciót követő eltávolításához egy második helyspecifikus rekombináz felhasználására van szükség (42, 43, 60). 2. Mutáns felismerési helyek felhasználásával. A két felismerési hely tartalmaz egy-egy, de egymástól különböző mutációt (pl. lox66 és lox71). A közöttük lezajló helyspecifikus rekombináció eredményeként két mutációt tartalmazó (lox66/71) és vad típusú (loxP) felismerési helyek jönnek létre, melyek egymással nem reagálnak, így nem történik meg az integrálódott szakasz azonnal deléciója. Pozitív szelekció alkalmazása azonban általában e stratégiához is szükséges (61). 1.5.4.2.2 A rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) A RMCE lényege a rekombináz felismerési helyek által közrefogott DNS szakasz cseréje egy másik, ugyancsak felismerési helyek által közrefogott DNS szakaszra (7B ábra). A reakcióhoz nélkülözhetetlen, hogy a dokkoló hely felismerési helyei páronként kompatibilisek legyenek a beépülő plazmid megfelelő felismerési helyeivel, egymással azonban ne reagáljanak (akkor ugyanis a dokkoló hely deléciója következne be). RMCE megvalósítható mutáns lox vagy FRT helyek alkalmazásával, illetve a loxP és FRT rendszerek kombinálásával (62, 63, 64, 29). Szelekció minden esetben szükséges, ez lehet pozitív, negatív, vagy a kettő kombinációja. Negatív szelekció esetén a végtermékben nem marad vissza szelekciós marker. (65, 66, 67).
27
7. ábra: Genomikus integráció ES-sejtekben A. Pop-in integráció Az inszerciós vektor helyspecifikus integrációja promotert kapcsol egy pozitív szelekciós markert (neo) kódoló gén elé. Drogszelekció esetén a reakció egyensúlya eltolódik az egyébként kedvezőtlen irányba, a genomikus integráció felé. A háromszögek helyspecifikus rekombináz felismerési helyeit (loxP vagy FRT) jelölik.
Genom DNS neo
pA
Inszerci—svektor
Gˇn
Pr
Gˇn
Pr
28
neo
pA
B. Rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) A + és – jelek pozitív illetve negatív szelekciós markereket jelölnek. A kazettacsere során a vektor szaggatott vonallal jelölt részei nem épülnek be a genomba. A stratégia eredményességének feltétele, hogy a vad típusú (loxP, FRT) és a mutáns (lox511, FRTm) felismerési helyek ne reagáljanak egymással, mert az a dokkoló hely deléciójához vezetne. Genom DNS
Inszerci—svektor
Cre / Flp
loxP / FRT lox511 / FRTm
1.6 A φC31 integráz rendszer 1.6.1. A φC31 integráz jellemzői A Cre és a Flp rekombináz egyaránt a helyspecifikus rekombinázok λ-integráz csoportjába tartozik. E csoport tagjaira jellemző a DNS átmeneti kovalens kötődése az enzim egy tirozin gyökéhez, és a Holliday típusú intermedier létezése. A rekombinázok másik nagy csoportja az invertáz/reszolváz család. Reakciómechanizmusuk pontosan nem ismert, a DNS az enzim egyik szerinjéhez kötődik. A csoport nagy molekulasúlyú alcsaládjához tartozik a Streptomyces nemzetség φC31 bakteriofágjának integráza, mely 29
606 aminosavból épül fel (molekulatömeg 67 kDa). Az enzimet a fág a gazdaszervezet genomjába történő integrációhoz és az onnan való kiszabaduláshoz használja (68, 69). 1.6.2 A φC31 integráz felismerési helyei A φC31 integráz két felismerési hellyel rendelkezik: attB és attP hely. Előbbi a Streptomyces genomjában, utóbbi a fág DNS-ében található meg. Rekombináció kizárólag egy attB és egy attP hely között történik. Két attB vagy két attP nem reagál egymással. A rekombináció eredményeként keletkező attL és attR helyek szintén nem reagálnak egymással heterológ szervezetekben; e reakció lezajlásához valószínűleg egy eddig nem azonosított kofaktor szükséges, mely a természetes gazdában megtalálható (70). Az attB és attP hely egyaránt két karból áll (B és B’ valamint P és P’), amelyek egy TTG tripletet fognak közre, ami a rekombináció pontos helyét képezi. A karok nem mutatnak jelentős palindrómiát. A rekombináció során keletkező attL hely B és P’ karokból, az attR hely P és B’ karokból áll (70). A felismerési helyek pontos hossza nem ismeretes, de bizonyított, hogy extragenomiális (plazmid) DNS-molekulák között rekombináció lehetséges jelentősen redukált hosszúságú (kb. 50 bp) szekvenciák segítségével is. Genomiális integrációra jelen munkát megelőzően csak >200 bp hosszúságú felismerési helyeket használtak. A dolgozatban használt felismerési helyeket a 8. ábra mutatja be (l. a „Módszerek“ fejezetben). 1.6.3 A φC31 integráz működése heterológ környezetben A φC31 integráz működőképessége igazolt prokarióta (E. coli) és eukarióta sejtekben (Schizosaccharomyces pombe, 293 emberi sejtvonal (embrionális vese sejtek), NIH 3T3 egér sejtvonal) (71, 72, 73). Valamennyi kísérlet során az integráz tranziens expresszióját idézték elő. A ko-transzfectált vektorban az integráz expresszióját erős CMV promoter irányította. A humán és egér sejtvonalak esetén az integráz segítségével genomiális integrációt értek el. Kimutatták, hogy az integráció nem random módon, hanem preferált genomiális helyekre történt, melyek szekvenciája hasonlóságot mutat az 30
enzim eredeti felismerési helyeivel. E „pszeudo-helyek” felhasználásával megkísérelhető célzott genomiális integráció. A közelmúltban számoltak be a φC31 integráz mesterséges „evolúciójáról”, melynek során az egyik pszeudo-hellyel erősebben reagáló enzimvariánst hoztak létre (74). Az integráz hatékonysága emlős sejtekben növelhető nukleáris lokalizációs szignál fúziójával is (75). E stratégiákkal transzgének erős és tartós expressziója érhető el emberi és egér sejtekben (76, 77). A módszer felhasználható génterápiára, és alternatívája lehet a vírus-mediálta géntranszfernek, amelynek biztonságával kapcsolatban újabban komoly aggályok merültek fel (78, 79). A „pszeudo felismerési helyek” létezésének következménye lehet azonban nemkívánatos genetikai átrendeződések létrejötte, ahogyan azt a Cre rekombináz esetében igazolták is (80).
31
2. Célkitűzések Az alábbiakban részletezett munka célja a transzgénes egér technológia fentebb részletezett két nehézségének áthidalása volt. I. A genomiális integráció hatékonyságának javítása céljából megkíséreltük bevezetni a φC31 integráz használatát az embrionális őssejt technológiában. Kombinált alkalmazása a már széles körben használt helyspecifikus rekombinázokkal (Cre, Flp) tovább bővítheti az egérgenom célzott megváltoztatására irányuló lehetőségeket. Jellemzőinél fogva a φC31 integráz rendszer különösen alkalmas lehet a célzott genomiális integrációt igénylő stratégiák során. Vizsgálatainkkal az alábbi kérdésekre kerestünk választ: 1. Működőképes-e a φC31 integráz egér ES sejtekben ? 2. Lehetséges-e genomiális integráció csökkentett hosszúságú (kb. 50 bp felismerési helyek alkalmazásával 3. Szükséges-e szelekció alkalmazása a helyspecifikus integráció eléréséhez 4. Befolyásolja-e a φC31 integráz expressziója az ES sejtek életképességét és fejlődési potenciálját ? II. A nemkívánatos rekombináz-expresszió kiküszöbülése céljából megkiséreltük összekapcsolni a Cre egértörzsek szövetspecificitását a tetraciklin transzaktivátor indukálhatóságával. Célunk egy olyan technológia kifejlesztése volt, mely térben és időben szabályozható génexpressziót tesz lehetővé. Célkitűzéseink a következők voltak: 1. Knock-in egér létrehozása, mely a reverz tetraciklin transzaktivátort az ubiquitaer (minden szövetben és az egyedfejlődés minden szakaszában aktív) Rosa26 lókuszrol fejezi ki. 2. Az rtTA gén csak Cre mediálta DNS átrendeződés után kapcsolódik be, így biztosítva a szövetspecificitást. 3. A rendszer szabályozhatóságának tesztelése ES sejtekben in vitro és transzgénes egérben in vivo. 3. Módszerek 32
3.1. Transzgénes vektorok létrehozása 3.1.1 φC31 integráz kísérlet 3.1.1.1 Felismerési helyek Az attB és attP felismerési helyek 52 illetve 51 bp hosszúságú központi részeinek megfelelő oligonukleotidok szintézisét kereskedelmi szolgáltató végezte (Sigma Genosys). A szintetizált egyláncú oligonukleotidok végein restrikciós endonukleázok felismerési helyeinek szekvenciái találhatók. A komplementer oligonukleotidok egyesülése kettősszálú DNS szakaszokat eredményez, melyek végein különböző restrikciós enzimek hasítási termékeivel kompatibilis „tapadós végek” találhatók: XhoI és HindIII az attBHX és attPXH esetében, valamint BamHI és XbaI az attBXbB és attPBXb esetében (8. ábra). A pBSattB plazmid előállításához a pBluescript II KS(-) plazmidot XhoI-gyel és HindIII-mal emésztettük és ligáltuk attBHX oligonukleotiddal. pBSattB-t BamHI-gyel és XbaI-gyel emésztettük, és ligáltuk attBXbB-vel; így keletkezett a pBSattBattB plazmid, ami azonos orientációban tartalmaz két attB helyet. A két felismerési hely között és azok két oldalán különféle restrikciós enzimek hasítási helyei található, ami a további szakaszok beépítését megkönnyíti. A fentiekhez hasonlóan, a pBSattP plazmid előállításakor a pBluescript II KS(-) plazmidot XhoI-gyel és HindIII-mal nyitottuk meg, és az attPXH oligoval ligáltuk. pBSattP-t BamHI-gyel és XbaI-gyel emésztettük, majd attPBXb-vel ligáltuk, így jött létre a pBSattPattP plazmid. 3.1.1.2 Dokkoló vektorok A φC31 integráz kódoló szekvenciáját tartalmazó PFY06 plazmidot Dawid Ow bocsátotta rendelkezésünkre (72). E vektorban az integráz kódoló szekvenciájának 5’ 8. ábra: A φC31 integráz felismerési helyei
33
Az attBHX oligonukleotid a vad típusú attB felismerési hely központi részének 52 nukleotidját tartalmazza. Az attPBXb oligonukleotid az attP felismerési hely 51 központi nukleotidjának felel meg. A felismerési helyeket restrikciós endonukleázok kohezív végei határolják, a szövegben részletezett módon (dőlt betűvel jelölve). A rekombináció a vastaggal jelölt helyen történik. attB felismerési hely: attBHX oligonukleotid B kar
B’ kar
AGCTTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCAC ACGCCCACGGTCCCGCACGGGAACCCGAGGGGCCCGCGCATGAGGTGGAGTGAGCT
attBXbB oligonukleotid B kar
B’ kar
CTAGAGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACG TCGCCCACGGTCCCGCACGGGAACCCGAGGGGCCCGCGCATGAGGTGCCTAG
attP felismerési hely: attPBXb oligonukleotid P kar
P’ kar
GATCCGTGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGGCGTAGGGT GCACGGGGTTGACCCCATTGGAAACTCAAGAGAGTCAACCCCCGCATCCCAGATC
attPXH oligonukleotid P kar
P’ kar
TCGAGTGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGGCGTAGGGTCA CACGGGGTTGACCCCATTGGAAACTCAAGAGAGTCAACCCCCGCATCCCAGTTCGA
34
végéhez egy szintetikus oligonukleotid van hozzákapcsolva, amely Kozak konszenzus szekvenciát és start kodont tartalmaz (81). A kódoló szekvencia 5’ vége ezzel a következőképpen módosul: gccaccATGACACAAGGGGTTGGTGACCGGGGTG (az új ATG start kodont és az eredeti GTG start kodont aláhúzással jelöltük). E változás miatt az enzim N-terminális részéhez nyolc új aminosav adódik (MTQGVVTG), és az eredeti GTG start kodon által kódolt metionint valin helyettesíti. E változtatások az enzim eukarióta környezetben való hatékony működéséhez szükségesek. A dokkoló helyeket tartalmazó vektorok előállításához a φC31 integráz kódoló szekvenciáját NheI és BamHI enzimekkel kivágtuk a PFY06 plazmidból, és beépítettük a pBluescript II KS(-) vektor XbaI és BamHI helyei közé; így jött létre a pBSφC31 vektor. A pCAAGSFlpeIRESpuro vektorból (Francis Stewart ajándéka, l. 82. hivatkozás) kivágtunk egy EcoRI-BamHI fragmentumot, amely tartalmazza az encephalomyocarditis virus belső riboszomális belépési helyét (IRES, l. 83. referencia), a puromycin aciltranszferáz kódoló szekvenciáját (puro, l. 84. referencia), és a szarvasmarha növekedési
hormonjának
poliadenilációs
szignálját
(bpA).
Klenow-polimerázzal
kitöltöttük a fragmentum tapadós végeit, majd beépítettük a pBSφC31 plazmid szintén tompított végű BamHI helyére. Az így keletkezett plazmidból (pBSφC31IP) NotI-EcoRV kettős emésztéssel kivágtuk a φC31-IRES-puro-bpA szekvenciákat tartalmazó szakaszt, a végeit kitöltöttük, és beillesztettük a pBSattBattB és pBSattPattP vektorok szintén tompított EcoRI helyére. Az így keletkező plazmidokban (pBB-φC31IP és pPP-φC31IP) a fenti szakasz a két attB vagy attP hely között helyezkedik el. A pPGKpuro vektorból kivágtunk egy EcoRI – XhoI szakaszt, amely tartalmazza az egér foszfoglicerát-kináz-1 génjének promoterét és 5’ helyzetű nem transzlálódó szekvenciáját (a továbbiakban „PGK”), és a tompított végű fragmentumot beépítettük a pBB-φC31IP és a pPP-φC31IP vektorok szintén tompított NotI helyére. Így keletkezett a pPGK-BB-φC31IP és a pPGKPP-φC31IP plazmid, amelyekben PGK az att helyek által közrefogott régión kívül helyezkedik el (9A. ábra). Elektroporáció előtt a plazmidokat ScaI enzimmel linearizáltuk.
35
3.1.1.3 Inszerciós plazmidok A pNeobpA vektorból EcoRI–XhoI kettős emésztéssel kivágtuk azt a szakaszt, ami tartalmazza a neomycin foszfotranszferáz gén kódoló szekvenciáját (neo) és a szarvasmarha növekedési hormonjának poliadenilációs szignálját (bpA). A tompa végek kialakítása után a fragmentumot beépítettük a pBSattBattB és pBSattPattP vektorok szintén tompított EcoRI helyére a megfelelő orientációban. E plazmidokat (pBBneo és pPPneo) cirkuláris formában vagy ScaI-gyel történő linearizálás után használtuk juttattuk be az ES sejtekbe (9B. ábra). Az eGFP gén az Aequoria victoria zöld fluoreszcens fehérjéjének (green fluorescent protein – GFP) felerősített fluoreszcenciájú mutáns változatát kódolja (85, 86). A pBBeGFP plazmid előállításához egy, a gén kódoló szekvenciáját valamint egy poliadenilációs jelet tartalmazó EcoRI–PstI fragmentumot illesztettünk be a pBSattBattB vektor azonos restrikciós helyei közé a megfelelő orientációban. A „Venus”-nak nevezett fehérjét a GFP genetikai módosításával állították elő. A GFP-től eltérően nem zöld, hanem sárga színben fluoreszkál, és eltér attól intenzitása illetve fél-életideje is (87). A pBBVenus nevű plazmid előállításához a Venus kódoló szekvenciáját és az SV40 vírus poliadenilációs jelét (SV40pA) BamHI–NotI emésztéssel izoláltuk, és a kohezív végek kitöltése után beillesztettük a pBSattBattB plazmid EcoRV helyére a megfelelő orientációban. A βgeo fúziós egyaránt kódolja az E. coli β-galaktozidáz enzimjét és a neomycin foszfotranszferáz enzimet, ezért egyidejűleg használható drogszelekcióra és hisztokémiai markerként (88). A pBBβgeo plazmid előállításához a pSAβgeo vektorból HindIII– SalI kettős emésztéssel kivágtunk egy 4,2 kb hosszúságú fragmentumot, amely tartalmazza a βgeo gént és bpA-t, majd a kohezív végek kitöltése után azt megfelelő orientációban beillesztettük a pBSattBattB vektor EcoRV helyére.
36
9. ábra: A munka során használt néhány plazmid.
A: pPGK-PP-φC31IP.
B: pBBneo. ScaI
ScaI Ap
Amp
ORI KpnI XhoI HindIII
ORI XbaI
PGK attPP'
7290 bp
IRESpurobpA
attPP'
BamHI
4052 bp
attBB'
PhiC31
attBB'
KpnI
bpA
neo
XhoI
XbaI
HindIII
NcoI
BamHI
KpnI
NcoI
C: pROSA26-rtTA
ROSA26 5' SA loxP PGKneoPGKpA XhoI 12508
EcoRV 2874
3xSV40pA
PGK DTA bpA
loxP rtTA
IRES EGFP ROSA26 3'
bGHpA
pROSA26PA_BigT_rtTA_IRESeGFP 15386 bp
37
3.1.2. Reverz tetraciklin transzaktivátor kísérlet 3.1.2.1. Target vektor készítése A pSPC-rtTA plazmidból (Jeff Whittsett ajándéka, l. 89. hivatkozást) EcoRI emésztéssel hasítottuk ki a reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA) kódoló szekvenciáját és az 5’ végén található nukleáris lokalizációs szignált (nls). A fragment végeit Klenow polimerázzal tompítottuk, és ligációval beépítettük a pCALL2-IRES-eGFP plazmid (Corinne Lobe ajándéka) szintén tompított XhoI helyére. Az így keletkezett plazmidot (pCALL2-rtTA-IRES-eGFP) először BglII enzimmel emésztettük, a véget Klenow polimerázzal tompítottuk, majd NotI emésztés következett, és az így kivágott rtTA-IRESeGFP fragmentet izoláltuk. A BigT vektort (Frank Costantini ajándéka, l. a 90. hivatkozást) először SalI enzimmel megnyitottuk, a végeket tompítottuk, majd NotI-nal emésztettük. Az így kapott vektorba illesztettük be ligációval az rtTA-IRES-eGFP fragmentet. Igy jött létre a pBigT-rtTA-IRES-eGFP plazmid. Ennek egész inszertjét kihasítottuk AscI–PacI kettős emésztéssel, és beillesztettük a hasonlóan megnyitott pROSA26-PA vektorba (90). E lépés eredményeként jött létre a pROSA26-rtTA-nak nevezett target vektor (9C). Az ES sejtekbe történő bejuttatást megelőzően a plazmidot XhoI enzimmel linearizáltuk. 3.2 Sejtkultúra protokoll Valamennyi kísérlet során az R1 egér ES sejtvonalat használtuk (91). Az egér ES sejtek fenntartásának és manipulációjának általános tudnivalóival kapcsolatban l. a 92. számú irodalmi hivatkozást. Az alábbiakban a munkánk során használt eljárások részleteit tekintjük át.
38
3.2.1 ES sejtek tenyésztése, passzálása, tárolása 3.2.1.1 ES sejtek tenyésztése A sejtek tenyésztésére 0,1 % zselatinnal borított műanyag tenyésztőedényeket használtunk, kivéve a sejtek felolvasztása utáni első passzázst, ami tápláló sejtekkel borított lemezeken történt. Tápláló sejtekként mitomycin C-vel osztódásban gátolt egér embrionális fibroblasztokat használtunk. A fibroblasztok neomycin rezisztensek, mivel a neo gént expresszáló transzgénes egérből származnak. Az ES sejtek tenyésztéséhez a Dulbecco szerint módosított Eagle-médiumot használtuk (DMEM, magas glukóz koncentrációjú (4,5 g/l), 2,2 g/l Na-bikarbonáttal pufferolt). A DMEM-et a következő adalékokkal egészítettük ki: 15 % foetalis bovin szérum (ES-cell minőségű, HyClone), 0,1 mM nem esszenciális aminosav elegy (Gibco #11140), 1 mM Na-piruvát, 0,1 mM βmerkapto-etanol, 2mM L-glutamin, 50 U/l penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 1000 U/ml leukaemia inhibitor faktor (LIF). A sejteken a médiumot naponta cseréltük. A tenyésztést 37°C hőmérsékleten, 5% CO2 tartalmú és párásított atmoszférában végeztük. 3.2.1.2 ES sejtek passzálása A fejlődési potenciál fenntartása érdekében az ES sejteket 70-80% konfluencia elérésénél 1:6 arányban passzáltuk. Ilyen körülmények között az R1 sejtek 2-3 naponta igényelnek passzázst. A passzázshoz a sejteket Ca2+- és Mg2+-mentes foszfát-pufferelt sóoldattal (a továbbiakban: PBS) mossuk, majd unicellularis szuszpenziót hozunk létre 0,05% tripszin / 0,5 mM EDTA segítségével. A tripszin inaktiválása után a sejteket lecentrifugáljuk (1000 rpm, 5 perc), majd a tenyésztőoldatban reszuszpendáljuk, és új zselatinizált tenyésztőlemezekre visszük. 3.2.1.3 ES sejtek tárolása Az R1 ES sejtek fejlődési potenciáljuk megőrzése mellett eltarthatók a folyékony nitrogén hőmérsékletén határozatlan ideig, -70°C-on kb. 3 hónapig. A fagyasztáshoz a fenti összetételű ES sejt médiumot használjuk azzal a két különbséggel, hogy az FBS 39
koncentrációja 22%, és krioprotektív anyagként 10% dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmaz. A folyékony nitrogénben történő tároláshoz krioküvettákat használunk, egy küvettába kb. 5 x 106 sejt kerül. A fent leírt módon tripszinizálással sejtszuszpenziót készítünk, a sejteket centrifugálással ülepítjük, majd 0°C hőmérsékletű fagyasztó médiumban reszuszpendáljuk, 24 órán keresztül –70°C-on tároljuk, végül a folyékony nitrogént tartalmazó tartályba helyezzük. A krioküvetta tartalmának olvasztása 60 mm átmérőjű, tápláló sejteket tartalmazó lemezre történik. A küvetta tartalmát 37°C-on gyorsan felolvasztjuk, a sejtszuszpenziót ES sejt médiummal higítjuk. A sejteket centrifugálással ülepítjük, majd tápoldatban reszuszpendáljuk, és a tenyésztőlemezre visszük. Másnap a médiumcsere során távolítjuk el az elhalt sejteket. A megfelelő sejtsűrűség elérése után a sejteket zselatinizált lemezekre passzáljuk. A fagyasztás és olvasztás együttesen egy passzázsnak számít. Átmenetileg (legfeljebb 2-3 hónapig) lehetőség van az ES sejtek tárolására – 70°C-on. Általában a drogszelekció során izolált sejtvonalakat (rendszerint több százat) tároljuk ilyen módon, mialatt azok genetikai elemzését elvégezzük. A megfelelő genetikai változást hordozó sejtvonalakat felolvasztjuk, expandáljuk, és krioküvettában folyékony nitrogén hőmérsékletén tároljuk. A fagyasztás során a 96 rekeszes tenyésztőlemez tartalmát rekeszenként 50 μl tripszinnel szuszpendáljuk, majd ES sejt médiummal 100 μl végtérfogatra hig⊆tjuk. A rekeszekhez ezután 100 μl kétszeres FBS és DMSO koncentrációjú 0°C-os fagyasztómédiumot adunk (így azok végkoncentrációja a fent leírtakkal lesz azonos). A szuszpenziókra 50 μl steril ásványi olajat rétegezhetünk, ha hosszabb tárolást tervezünk. A rekeszeket műanyag foliával légmentesen lezárjuk, majd a lemezt gyorsan –70°-ra helyezzük. A 96-os lemez rekeszeinek kiolvasztása 4- vagy 24 rekeszes táplálósejt-tartalmú lemezekre történik. A lemezeket inkubátorban gyorsan kiolvasztjuk, majd a kívánt rekeszekből a sejtszuszpenziót a 24-es lemez rekeszeibe visszük át. Másnap médiumcsere, megfelelő sejtsűrűség elérése után pedig passzázs történik nagyobb átmérőjű zselatinizált lemezekre. A sejtvonalak expanziója után azokból folyékony nitrogénben tárolunk több küvettával.
40
3.2.2 ES sejtek genetikai módosítása 3.2.2.1 DNS bejuttatása ES sejtekbe Kísérleteink során az ES sejtekbe elektroporációval juttattunk be kívülről DNS molekulákat. Ehhez küvettánként 0,8 ml, 107 sejtet tartalmazó, 0°C hőmérsékletű sejtszuszpenziót használtunk. A sejteket 70-80% konfluenciájú zselatinizált lemezekről nyertük, melyeken az elektroporáció előtt 2-3 órával médiumot cseréltünk. A lemezeket tripszinizáltuk,
centrifugálással
ülepítettük,
majd
megfelelő
térfogatú
jéghideg
elektroporációs pufferben (Specialty Media #ES-003-D) reszuszpendáltuk úgy, hogy a szuszpenzió ne tartalmazzon sejt-aggregátumokat. A sejtekbe juttatandó DNS-t szükség esetén restrikciós hasítással linearizáltuk, minden
esetben
reszuszpendáltuk.
etanollal
precipitáltuk
és
Ezután
spektrofotometriával
mostuk, és
majd agaróz
ultratiszta
vízben
gélelektroforézissel
megvizsgáltuk mennyiségét, tisztaságát és integritását; a DNS koncentrációját 0,5-1,0 μg/μl értékre állítottuk be. A DNS mennyisége a φC31 integrázt expresszáló dokkoló helyek létrehozásakor (pPGK-BB-φC31IP és a PGK-PP-φC31IP) küvettánként 10 μg, az inszerciós plazmidok bejuttatásakor (pBBneo és pPPneo) küvettánként 20 μg volt. A nemszelektív körülmények között történő integráció vizsgálatakor 30 μg inszerciós plazmid (pBBeGFP vagy pBBVenus) és 5 μg pCALL2 elegyét elektroporáltuk az ES sejtekbe. Az utóbbit Corinne Lobe bocsátotta rendelkezésünkre; benne a neo gén expresszióját CMV promoter irányítja, mely aktív a differenciálatlan ES sejtekben. A linearizált pROSA26-rtTA target vektorból 20 μg-ot használtunk az elektroporációhoz. A sejtszuszpenzió és a DNS oldat elegyítése után a küvettákat 5 percig jég között tartottuk, majd Gene Pulser™ (BioRad) segítségével elektroporáltuk (paraméterek: 250 V, 500 μF). Az időállandó minden esetben <11 volt. Ezután a küvettákat 20 percre jég közé helyeztük, majd tartalmukat ES sejt médiummal higítottuk, és küvettánként 2 darab 100 mm átmérőjű zselatinizált lemezre vittük. Végül a lemezeket az inkubátorba helyeztük. 3.2.2.2 ES sejtek drogszelekciója és a kolóniák expanziója 41
A bejuttatott transzgéneket stabilan expresszáló sejtek klónjait pozitív drogszelekcióval izoláltuk. A szelekciót 24 órával az elektroporáció után kezdtük, amikor a sejtek konfluenciája a lemezeken kb. 30-40% volt. A dokkoló helyeket tartalmazó sejtvonalak szelekciójához puromycint használtunk 1,1-1,2 μg/ml dózisban 8 napon keresztül. Az inszerciós vektorok esetében G418 (Geneticin™) szelekciót végeztünk 170 μg/ml dózisban 11 napon át. A szelektív médiumot naponta cseréltük. A szelekciós periódus alatt megfelelő méretű drogrezisztens kolóniák képződtek. Ezek számát rögzítettük, majd a kolóniákat sztereomikroszkóp alatt izoláltuk, tripszinnel sejtekre bontottuk, és egyedileg zselatinizált 96-os lemez rekeszeibe vittük át. A drogszelekciót folytatva a sejteket tovább szaporítottuk, és a lemezek replikáit hoztuk létre, melyek egy részét –70°C-on tároltuk, másik részét DNS-izolálásra használtuk. 3.2.3 Genomiális DNS izolálása ES sejtekből A 96-os tenyésztőlemez egyes rekeszeiből az alábbi módszerrel hozzávetőlegesen 10 μg nagy molekulasúlyú genomiális DNS izolálható (93). A sejteket PBS-sel mostuk, majd rekeszenként 50 μl lízis pufferben inkubáltuk 16 órán át 55°C hőmérsékleten nedves atmoszférában (a puffer összetétele: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl; 0.5% sarcosyl; 1 mg/ml Proteinase K). Ezután 100 μl hideg NaCl / etanol elegyet adunk hozzá, és várunk, amíg a DNS az edény alján kicsapódik. E csapadékot háromszor mossuk szobahőmérsékletű 70% etanollal, levegőn szárítjuk, majd reszuszpendáljuk a TE pufferben vagy a megfelelő restrikciós endonukleázot is tartalmazó reakciópufferben.
42
3.2.4 ES sejtek előkészítése az embrió aggregációra A molekuláris módszerekkel megfelelően jellemzett és a kívánt genetikai változást hordozó ES sejt vonalak sejtjeit 8 sejtes diploid embriókkal aggregáltuk, hogy transzgénes egereket hozzunk létre. Ehhez a megfelelő sejtvonalat folyékony nitrogénből felolvasztottuk (l. fent). Az aggregáció előtt egy nappal tripszinnel monocelluláris szuszpenziót hoztunk létre; a táplálósejtektől rövid ülepítéssel megszabadultunk, és a sejteket zselatinizált lemezre vittük. Az aggregáció napján rövid tripszines emésztéssel a sejtcsoportokat a zselatintól elválasztottuk, és a 8-15 sejtből álló csoportokat használtuk az aggregáció során. 3.2.5 ES sejtek transzfekciója lipofekcióval Az rtTA expresszió in vitro vizsgálatához a pCAGGS-Cre-PGK-puro vektort (Corrinne Lobe ajándéka) lipofekcióval (Lipofectamine 2000, Invitrogen) jutattuk be a knock-in sejtvonalakba. A kisérlethez szubkonfluens 35 mm átmérőjű tenyésztő lemezeket és 2 μg cirkuláris plazmidot használtunk. A transzfekció során OPTI-MEM mediumot használtunk. Puromycin szelekciót alkalmaztunk (1.2 μg/ml) és a rezisztens koloniákat izoláltuk és expandáltuk. A tetraciklin indukálhatóság vizsgálata során a pBI-3 plazmidot (Herman Bujard ajándéka) jutattuk be a Cre-deléción átesett sejtekbe lipofekcióval a fenti protokoll szerint.
A doxiciklint 5 órával a transzfekció után adtuk a táptalajhoz 100 ng/ml
koncentrációban. Egy nappal később a sejteket 1:5 arányban passzáltuk, és további 1-2 napig tenyésztettük doxiciklin jelenlétében, majd X-gal festést végeztünk. 3.3 Southern blotting A Southern hibridizációt lényegében a 94. hivatkozásban leírtaknak megfelelően végeztük. Az ES sejtekből kb. 10 μg genomiális DNS-t izoláltunk a fentebb részletezett protokoll szerint. A DNS-t a megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítottuk, a fragmentumokat 0,7%-os agaróz gélen elválasztottuk, és nitrocellulóz membránra (HyBond N , Amersham) vittük át. A szondákat 43
32
P izotópot tartalmazó dCTP-vel
jelöltük a ReadyPrime II Kit felhasználásával. A hibridizációt 65°C-on végeztük 25 ng radioaktív szonda felhasználásával. A nemspecifikusan kötődő izotóp lemosását követően a hibridizáció eredményét foszforeszkáló ernyőn vizualizáltuk. A genomiális dokkoló helyek jellemzéséhez és a helyspecifikus integráció vizsgálatához KpnI emésztést alkalmaztunk. A φC31 szonda a φC31 integráz kódoló szekvenciájának 970 bp hosszúságú HindIII fragmentumát tartalmazta. A puro és a neo szondák a megfelelő gének teljes kódoló szekvenciájából álltak. Az 533 bp hosszúságú Pgk-1 szonda előállításához a PGK-PP-φC31IP plazmidot SacII és XbaI enzimekkel hasítottuk, és a megfelelő fragmentumot izoláltuk. A ROSA26-rtTA gén targeting detektálásához a genomiális DNS-t EcoRV enzimmel emésztettük. A hibridizáció során a 5’ homológ kartól 5’ irányba elhelyezkedő külső szondát valamint neo szondát használtunk. 3.4 Polimeráz láncreakció (PCR) A PCR reakcióhoz 100 ng genomiális DNS-t használtunk templátként. A 25 μl-es reakcióelegy összetétele a következő volt mindkét primerből 10 pmol, mind a négy dNTP-ból 0.2 mM, 10 mM TRIS pH 8.8, 50 mM KCl, 0.08% Nonidet P40, 1mM MgCl2 és 0.1 U Taq polymerase (Fermentas). A PCR termékeket 1,5-2,0 %-os agaróz gélen elemeztük. Szükség esetén az amplifikációs termékeket a gélből izoláltuk a Qiaquick Gel Extraction Kit™ (Qiagen) segítségével, és szekvenciájukat ABI Prism 3700™ szekvenciadetektáló rendszer segítségével határoztuk meg az amplifikációhoz is alkalmazott primerek felhasználásával. A genomiális dokkoló helyek és a helyspecifikus integráció kimutatásához a következő oligonukleotidokat használtuk primerként: PGK-BG és NEO-BG1 illetve INT1-BG. A primerek szekvenciáját l. a I. táblázatban. A PCR program 4 perc denaturációval kezdődött 94°C-on, amit a következő ciklus 35-szöri ismétlése követett: 1 perc 94°C-on, 45 másodperc 60°C-on és 1 perc 72°C-on; végül egy 5 perces elongációs lépés következett 72°C-on. A ROSA26-rtTA knock-in allél kimutatásához a ROSA5 és az RTTA3 primereket használtuk, a reakció 215 bp hosszúságú terméket eredményez. A vad típusú ROSA26 allélt a ROSA5 és a ROSA3 primerek alkamazásával detektáltuk, mely reakció 44
322 bp hosszúságú szakaszt amplifikál. A PCR program a következő volt: 1 perc denaturáció 94°C-on, majd a következő ciklus 35-szöri ismétlése: 1 perc 94°C-on, 45 másodperc 62°C-on (knock-in allél) illetve 64°C-on (vad típusú allél) és 1 perc 72°C-on; végül egy 5 perces elongációs lépés következett 72°C-on. I. táblázat: PCR és szekvenáló primerek PGK-BG NEO-BG1 INT1-BG ROSA5 RTTA3 ROSA3
CTTTCGACCTGCATCCATCT CGTGCAATCCATCTTGTTCA CGACTGACGGTCGTAAGCAC GAGTTCTCTGCTGCCTCCTG AAGACCGCGAAGAGTTTGTC CGAGGCGGATACAAGCAATA
3.5 Embriológiai módszerek 3.5.1 ES sejt – diploid morula aggregáció Transzgénes egerek létrehozásához a genetikailag módosított és jellemzett ES sejteket szuperovuláló CD1 nőstény egerekből származó 8 sejtes morulákkal aggregáltuk. Az aggregációt és az embrió-transzfert Sandra Tondat és Sarang Kulkarni transzgénes technikusok végezték. A módszer részletes leírását l. a 95. számú hivatkozás alatt, vagy a http://www.mshri.on.ca/nagy weboldalon.. Az aggregációhoz az ES sejteket a 3.2.4-ben leírtak szerint készítettük elő. Az aggregációt követően a kiméra morulákat 37°C-on 5% CO2 atmoszférában egy éjszakán át in vitro növesztettük, majd a blasztula stádiumú kimérákat álterhes (2.5 dpc) egerek méhébe transzplantáltuk. A megszületett utódoknál a kimérizmus fokát a szőrzet színe alapján ítéltük meg. Germinális transzmisszióra az erős (> 90%), ezek hiányában a mérsékelt (> 50%) hímnemű kimérákat használtuk. A keresztezéshez albinó ICR nőstényeket használtunk. 3.5.2 Pronukleáris mikroinjekció
45
Az inszerciós plazmidok bejuttatása a zigótába pronukleáris mikroinjekcióval történt. A procedúrát Marina Gertsenstein végezte, részletes leírását l. 92. Hivatkozásban és a http://www.mshri.on.ca/nagy webdoldalon. Az eljáráshoz a pBBβgeo, pBBVenus és pBBneo
plazmidokat
használtuk,
cirkuláris
formában,
1.0
illetve
2.5
ng/μl
koncentrációban. A PFY06 integráz expressziós vektor 0,5 illetve 1 ng/μl koncentrációban injektáltuk a zigótákba. Az alkalmazás előtt a DNS-t a GeneClean II™ Kit-tel (Qbiogene) tisztítottuk, majd TE pufferben reszuszpendáltuk (10 mM Tris (pH 7.4), 0,1 mM EDTA, ultratiszta vízből készítve), és 0,2 μM pórusú szűrőn passzáltuk. A DNS koncentrációját és integritását spektrofotometriával és agaróz gélektroforézissel határoztuk meg. 3.5.3 Egérembriók X-gal festése Az X-gal elnevezésű szubsztrátot (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid) az E. coli β-galaktozidáz enzime elhasítja, a reakció eredményeképpen kék színű festékanyag keletkezik. A hisztokémai reakcióval vizsgálható az enzim jelenléte és így a lacZ gén expressziója az ES sejtekben illetve az embrió különböző szöveteiben. Az eljárás során az embriókat boncolást követően 1 órán keresztül fixáltuk 4% paraformaldehidben 4°C-on fénytől elzártan, majd háromszor mostuk 15 percig a mosó pufferben (50 μM EGTA, 0,0001% Deoxycholate, 0,00004% NP40, 0,004 mM MgCl2, PBS-ben elkészítve). Ezután következett a festés 4°C-on egy éjszakán keresztül sötét közegben X-gal festékkel (összetétele: 50 μM K3Fe(CN)6, 50 μM K4Fe(CN)6, 50 μM EGTA, 0.0001% Deoxycholate, 0.00004% NP40, 4 μM MgC12, 1mg/ml X-gal (törzsoldata dimetil-formamidban), PBS-ben elkészítve.
46
3.5.4. Fluoreszcens detektálás Az Aequoria victoria zöld fluoreszcens fehérjéjének genetikailag módosított változata (eGFP, 86. referencia). ultraibolya illetve kék fénnyel történő megvilágítás hatására zöld fényben fluoreszkál. Az egérembriók és ES sejtek fluoreszcenciájának vizsgálatához a sztereomikroszkóp objektivére erősíthető kék fényforrást használtunk 002™, BLS Ltd.).
47
4. Eredmények 4.1 φC31 integráz kísérlet 4.1.1 Dokkoló helyet tartalmazó ES sejtvonalak létrehozása és molekuláris jellemzése Munkánk első lépéseként olyan transzgénes ES sejtvonalakat hoztunk létre, amelyek egyrészt stabilan expresszálják a φC31 integrázt, másrészt genomjukban hordozzák az enzim (attB vagy attP) felismerési helyeit. A pPGK-BB-φC31IP és a pPGK-PP-φC31IP plazmidokban a φC31 integráz és a puromycin aciltranszferáz gének expresszióját az egér Pgk-1 promotere irányítja, amely differenciálatlan ES sejtekben bekapcsolt állapotban van (9A. ábra). A transzkripció során a génekről bicisztronos mRNS molekula szintetizálódik. A φC31 és a puro gének kódoló szekvenciája között belső riboszomális belépési hely (internal ribosome entry site – IRES) szekvencia található, amely biztosítja az utána következő gén (puro) hatékony transzlációját. A kódoló szekvenciákat két attB illetve attP felismerési hely fogja közre. A fenti plazmidokat linearizált formában juttattuk be R1 egér ES sejtekbe elektroporáció segítségével, majd puromycin szelekciót alkalmaztunk. A drog rezisztens kolóniák izolálása és expanziója után azokat kiterjedt genetikai elemzésnek vetettük alá Southern hibridizáció segítségével. A sejtek genomiális DNS-ét KpnI enzimmel emésztve és φC31 szondával hibridizálva meghatározható, hány példányban épült be a plazmid az adott sejtvonal genomjába. A plazmidban nem található KpnI hely a szondától 5’ irányban, ezért a hibridizáció során vizualizálódó fragment hosszúsága jellemző a transzgén genomiális helyére (l. 9A. és 10. ábrák). A fragment hossza legalább 4,0 kb, hacsak a transzgén vége nem rövidült meg a genomba épülés során. A genom több pontján transzgén-kópiát tartalmazó sejtvonalak esetén több különböző hosszúságú fragmentum ábrázolódik. Előfordul, hogy a bejuttatott transzgén több példánya integrálódik a genom adott helyére tandem kópiák formájában, ekkor 5,8 kb hosszúságú fragment ábrázolódik. Pgk-1 szondát alkalmazva ugyancsak a fenti hasítási termékek vizualizálódnak; ez egyben jelzi a promoter és az 5’ rekombináz felismerési hely 48
10. ábra: Genomikus dokkoló helyek Southern elemzése A dokkoló helyet tartalmazó ES sejtvonalakból származó DNS-t KpnI enzimmel hasítottuk el, és a jelzett szondákkal hibridizáltuk.
φC31 szonda
Pgk-1 szonda
10 kb 8 kb 6 kb 5 kb 4 kb 3 kb
19B 19C 110A 110H 212A
19B 19C 110A 110H 212A
integritását is (10. ábra). A 3’ felismerési hely integritása puro szonda alkalmazásával lehetséges, mely intakt kópia esetén integrációs helytől függetlenül 1,5 kb hosszúságú hasítási terméket vizualizál. A fenti vizsgálatok segítségével 25, a dokkoló helyként szolgáló transzgént egyetlen intakt példányban tartalmazó sejtvonalat választottunk ki, ezek közül 9 tartalmaz attB helyeket, 16 pedig attP helyeket. További vizsgálataink során e sejtvonalakat használtuk. 4.1.2 A φC31 integráz működőképes egér ES sejtekben 4.1.2.1 Helyspecifikus integráció a φC31 integrázt expresszáló ES sejtekben
Kísérletünk második lépéseként a pBBneo és pPPneo inszerciós plazmidokat transzfektáltuk a fenti sejtvonalak sejtjeibe valamint vad típusú (genetikailag nem megváltoztatott) R1 ES sejtekbe. Az elektroporáció során sztandard körülményeket 49
használtunk (l. 3.1.2.2.1 szakasz). Az inszerciós plazmidokat cirkuláris vagy linearizált formában elektroporáltuk, és az attB vagy attP helyeket tartalmazó sejtvonalak illetve plazmidok összes lehetséges kombinációját kipróbáltuk, mindig több, eltérő genomiális lokalizációjú dokkoló helyet tartalmazó sejtvonalat használva. G418 szelekciót alkalmaztunk, majd meghatároztuk a keletkező drog rezisztens kolóniák számát. Az eredményeket a II. táblázat foglalja össze.
II. táblázat: A G418 rezisztens kolóniák száma a dokkoló helyek és az inszerciós plazmidok lehetséges kombinációi esetén
A számok elektroporációnként értendők, sztandard körülményeket használva (l. a metodikák fejezetben). Szürke árnyékolás jelzi azokat az eseteket, amikor a dokkoló hely és az inszerciós plazmid eltérő felismerési helyet hordoz.
Sejtvonal R1 19B 19C 110A 110H 212A
Dokkoló hely típusa Nincs B B P P P
Inszerciós plazmid B P cirkuláris lineáris 10 36 43 43 50 12 >200 >300 >200 67 140 11
B lineáris 2 24 8 33 27 21
P cirkuláris 7 6 7 9 3 7
A pBBneo és pPPneo plazmidokban található neo gén nem rendelkezik saját promoterrel. G418 rezisztens sejtek ezért csak úgy keletkezhetnek, ha a plazmid egy aktív endogén promoter közvetlen szomszédságába (valamely gén 5’ nem transzlálódó régiójába) épül be. Ez az úgynevezett "promoter csapda" esemény igen ritka, ennek megfelelően vad típusú R1 sejtekben csak igen kisszámú drogra rezisztens kolónia képződik. G418 rezisztens kolóniák képződhetnek úgy is, ha helyspecifikus integráció révén a neo kódoló szekvencia a dokkoló hely Pgk-1 promoterének szomszédságába kerül (11.
50
11. ábra: φC31 integráz mediálta inszerció és kazettacsere
Az ábra a dokkoló hely, a két lehetséges pop-in intermedier és a komplett kazettacsere szerkezetét mutatja be. Az áttekinthetőség kedvéért az ábra nem méretarányos. Az x fragmentum hosszúsága az adott dokkoló helyre jellemző. A Southern analízis során használt szondák helyét szürke vonalakkal, a PCR primereket szürke nyilakkal jelöltük. Restrikciós hasítóhelyek: K: KpnI, Xb: XbaI. A többi rövidítés magyarázatát l. külön táblázatban.
Dokkoló hely K
K 1,5 kb K
x
φC31-IRES-puro-pA
PGK
2,4 kb
Xb
I. típusú integráció
K
x + 1,7 kb
PGK
2,4 kb
K
neo-pA
K
1,5 kb
φC31-IRES-puro-pA
4,1 kb
Xb
II. típusú integráció K
K
x
φC31-IRES-puro-pA
PGK
K
x –1,2 kb PGK
attP
Xb
1,2 kb
neo-pA
2,4 kb
Xb
RMCE
K
4,2 kb
K neo-pA 1,2 kb
attB attL attR
51
K
K
ábra). A II. táblázatból kitűnik, hogy jelentősen magasabb számú rezisztens kolónia képződését észleltük, amikor attP helyeket tartalmazó sejtvonalakba attB-t tartalmazó plazmidot juttattunk be cirkuláris formában. Az egyéb kombinációk (vagyis amikor a dokkoló hely és az inszerciós plazmid azonos típusú att helyet tartalmazott, illetve amikor a dokkoló helyen volt attB) jóval kevesebb kolóniát eredményeztek. Egy kivétel volt ez alól, amikor az attP tartalmú 110A sejtvonalba elektroporáltunk linearizált attP tartalmú plazmidot. A G418 rezisztens sejtvonalak genetikai analízise (l. lentebb) 36 esetből egyben sem igazolt helyspecifikus genomiális integrációt, más sejtvonalakban pedig a magasabb kolóniaszám nem volt reprodukálható, ezért a továbbiakban e jelenséggel nem foglalkoztunk. Kiemelendő, hogy a φC31 integrázt expresszáló sejtekben elvileg lehetőség van a bejuttatott vektor helyspecifikus integrációjára a genomban megtalálható pszeudo felismerési helyek (l. 1.6.3) valamelyikén. G418 rezisztens sejtvonal azonban ilyenkor is csak úgy képződik, ha az inszerciós hely közvetlen szomszédságában aktív promoter található. Ennek valószínűsége igen csekély, ezzel magyarázható, hogy az integrázt expresszáló sejtvonalakban észlelt „háttér” értéke igen alacsony, a vad típusú R1 sejtekével összevethető. 4.1.2.2 A rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) mechanizmusának elemzése 4.1.2.2.1 A helyspecifikus integráció lehetőségei
Ahhoz, hogy a dokkoló hely kazettája az inszerciós vektor szekvenciájára cserélődjön ki, a kazettát közrefogó mindkét att helynek rekombinálódnia kell a bejuttatott DNS megfelelő felismerési helyeivel. A két rekombinációs reakció elvileg történhet egymás után, két lépésben, és történhet egyidejűleg (12A. ábra). Ha a reakció két lépésben történik, akkor először egy „pop-in” intermedier képződik; ez a keletkező attL és attR helyeken kívül tartalmazza a másik attB és attP helyet is. Ezek rekombinációja a köztük levő DNS szakasz delécióját eredményezi, ami komplett kazettacserét eredményez. A két pár felismerési hely egyidejű reakciója egy lépésben vezet ugyanezen termék képződéséhez. Neo (G418) rezisztens sejtvonalak tehát négy módon jöhetnek létre: 52
1. Promoter csapda esemény random genomiális helyen vagy egy pszeudo felismerési helyen: 2. A dokkoló hely és az inszerciós vektor 5’ helyzetű felismerési helyeinek rekombinációjával (I. típusú integráció). A keletkező pop-in intermediernél a neo gén expresszióját a dokkoló hely Pgk-1 promotere irányítja, mivel az kívül esik a kicserélődött régión. Az integrációval egyidejűleg a φC31 és puro transzgének további expressziója megszűnik. Az átmenetileg még jelenlevő enzim fehérje azonban a sejtek egy részében vagy összességében katalizálhatja a második rekombinációs reakció lezajlását, és így a teljes kazettacserét; e folyamatra azonban nem irányul szelekció. 3. Először a 3’ helyzetű felismerési helyek rekombinálódnak (II. típusú integráció). E reakció nem eredményez G418 rezisztens intermediert, viszont továbbra is expresszálja a φC31 integrázt. Pozitív szelekció hat tehát a második rekombinációs reakció lezajlására, amely a fentivel azonos terméket eredményez. 4. Az 5’ és 3’ helyzetű felismerési helyek egyidejű reakciója ugyancsak komplett kazettacseréhez vezet. Előfordulhat az is, hogy a dokkoló hely 5’ helyzetű felismerési helye az inszerciós plazmid 3’ helyzetű helyével reagál vagy fordítva. E reakciók azonban semmilyen módon nem vezetnek a neo gént expresszáló és ezért G418 rezisztens sejtvonalak létrejöttéhez. Elképzelhető az is, hogy a két reakciómechanizmus (a két illetve egy lépéses) egyaránt megvalósul. 4.1.2.2.2 Az integrációs termékek elemzése
A helyspecifikus integráció tényének bizonyítására és a fenti lehetőségek vizsgálatára a G418 rezisztens sejtvonalak genetikai vizsgálatát végeztük Southern hibridizációval. Az inszerciós plazmid nem tartalmaz promotert, ezért a Pgk-1 promoter szekvenciája ú.n. „külső szondaként” használható, vagyis jelzi a kérdéses genomiális dokkoló hely megváltozását, a random módon integrálódó plazmidok azonban nem jelölődnek. E módszerrel a helyspecifikus és random integrációs események elkülöníthetőek (l. 12B. ábra). 53
12. ábra: A helyspecifikus integráció lehetséges módjai
A. A lehetséges rekombinációs mechnizmusok Az ábra magyarázatát l. a szövegben.
PGK
φC31-IRES-puro-pA + neo-pA
I. típusú integráció
PGK
neo-pA
II. típusú integráció
PGK
φC31-IRES-puro-pA
PGK
neo-pA
Komplett kazettacsere
54
φC31-IRES-puro-pA
neo-pA
B. A rekombinációs termékek elkülönítése Southern hibridizációval A 212A ES sejtvonal attP felismerési helyet tartalmazó dokkoló hellyel rendelkezik. AttB tartalmú inszerciós vektor elektroporációja után keletkezett neo rezisztens sejtvonalakat vizsgáltunk, KpnI emésztést és Pgk-1 szondát alkalmazva. I. típusú pop-in intermedier jelenléte igazolható a 2, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 14 és 15 számmal jelzett sejtvonalak esetében. Komplett kazettacsere észlelhető 1, 7, 10 és 12 esetében. A 16. Számú sejtvonalban mozaik mintázat figyelhető meg: I típusú intermedier és RMCE egyaránt kimutatható. 5. Esetében a változatlan dokkoló hely jelenléte mutatható ki; e sejtvonalban feltehetően promoter csapda esemény történt. C. A beépült kópiák számának vizsgálata Az ábra B részében bemutatott sejtvonalak vizsgálata neo probe alkalmazásával. Helyspecifikus integráció esetén a szonda ugyanazon fragmentumhoz kötődik, mint Pgk1, emellett azonban az esetleges random integránsok is megjelenne, változó hosszúságú fragment formájában. Ilyen csupán az 5. számú sejtvonal esetén látható (feltételezett promoter csapda esemény); e sejt genomjába két példányban épült be az inszerciós vektor random lokalizációban.
B
C 8 kb 5 kb 3 kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Az eredményeket a III. táblázat mutatja be. Összefoglalva, attP tartalmú dokkoló hely és attB tartalmú inszerciós plazmid alkalmazásakor a G418 rezisztens sejtvonalak 55
87%-ában (n = 207) helyspecifikus genomiális integráció volt észlelhető. Az arány hasonló volt mind a négy vizsgált, különböző lokalizációjú dokkoló helyet tartalmazó sejtvonal esetén. Érdekes módon a linearizáció nem befolyásolta a helyspecifikus integráció arányát, noha jelentősen csökkentette a G418 rezisztens kolóniák számát. A dokkoló helyek és inszerciós plazmidok egyéb kombinációi egy esetben sem eredményeztek helyspecifikus integrációt.
III. táblázat: A helyspecifikus integráció aránya különböző dokkoló helyek és plazmidok esetén.
A táblázat a helyspecifikus integrációt tartalmazó és a vizsgált sejtvonalak számát mutatja. Az elemzés Southern hibridizációval történt. Szürke árnyékolás jelzi azokat az eseteket, amikor a dokkoló hely és az inszerciós plazmid eltérő felismerési helyet hordoz. n/a = nem áll rendelkezésre
Sejtvonal 19B 19C 110A 110H 212A 110G
Dokkoló hely típusa B B P P P P
Inszerciós plazmid B P cirkuláris lineáris 0 / 17 0/8 0 / 10 0 / 36 40 / 54 0 / 36 9 / 11 0/7 105 / 108 n/a 10 / 12 n/a
B lineáris 0 / 11 0/8 9 / 12 8 / 10 n/a n/a
P cirkuláris 0/6 0/6 0/8 0/3 n/a N/a
A Southern analízis alkalmas a pop-in köztitermék és a komplett kazettacsere elkülönítésére is. Előbbi esetben a KpnI fragmentum hosszúsága a dokkoló helyre jellemzőnél 1,7 kb-sal hosszabb, utóbbi esetben 1,2 kb-sal rövidebb lesz (11. és 12B. ábrák). A pop-in intermedier észlelése igazolja kétlépéses reakciómechanizmus I. típusának létezését. A kizárólag komplett kazettacserét mutató sejtvonalak háromféle módon jöhettek létre: 1. Az I. típusú integrációt minden sejtben követi a kivágódási reakció. 2. II. típusú integrációval. Itt a pop-in intermedier tartósan nem létezhet, mivel a G418 rezisztencia csak az exciziót követően alakul ki. 56
3. Egylépéses mechanizmussal (intermedier képződése nélkül) Egyes sejtvonalak mozaikok: sejtjeik egy része pop-in intermediert, másik része komplett kazettacserét tartalmaz. E vonalak létrejöhettek az I. típusú integrációt követő részleges excizióval, ugyanis ez esetben utóbbira nem irányul szelekció, és az integráz expressziójának megszűnése miatt csak átmenetileg lehetséges. Létrejöhettek azonban e sejtvonalak az egylépéses és a kétlépéses reakcióút egyidejű létezése esetén is. A 12B ábrán egy esetben a dokkoló helyre jellemző fragmentum látható változatlan formában. E sejtvonalnál valószínűleg promoter csapda esemény történt. Hasonló sávot eredményezne a II. típusú integrációs intermedier is, ez azonban nem G418 rezisztens, így megjelenése az alkalmazott szelektív tenyésztési körülmények esetén nem várható. A különböző reakciótermékek aránya a vizsgált négy sejtvonal esetén hasonlóan alakult: az esetek 52%-ában a pop-in intermedier (I. típusú integráció), 32%-ban komplett kazettacsere, 6,5%-ban pedig mozaik mintázat volt megfigyelhető (n = 200). Random promoter csapda esemény csak az esetek 9,5%-ában fordult elő. Elméletileg lehetséges, hogy a helyspecifikus integráció (és a G418 rezisztencia megszerzése) után az átmenetileg még létező integráz aktivitás további plazmidokat integrál random vagy pszeudo felismerési helyekre, ilyen módon kontaminálva a genomot. E lehetőség vizsgálatára a elvégeztük a hibridizációt neo szondával is, mely „belső szonda”-ként valamennyi integrálódó vektort kimutatja (12C. ábra). Minden esetben a Pgk-1 szondával is észlelt sávot kaptuk csupán, további kópiák genomiális integrációját kimutatni nem lehetett. 4.1.2.3 A rekombinációs helyek molekuláris vizsgálata
A helyspecifikus genomiális integráció tényének további bizonyítására és a crossing over pontos helyének tisztázása céljából a rekombináció során keletkező attL helyet és közvetlen környezetét PCR segítségével amplifikáltuk. A PCR-hez használt
57
13. ábra: A helyspecifikus rekombináció PCR és szekvencia analízise
A. PCR vizsgálat. A reakcióhoz a PGK-BG és a NEO-BG1 primereket használtuk. Csak helyspecifikus integráció esetén képződik PCR termék, mely tartalmazza a rekombináció során keletkező attL helyet. B. Szekvencia elemzés. A felismerési hely nukleotidjait dőlt betűvel jelöltük, a rekombináció helyét (CAA triplet) vastag betűvel emeltük ki. A neo gén kódoló szekvenciája alá van húzva.
A neo-pA
PGK
attL 204 bp
B ... GAC CCT ACG CCC CCA ACT GAG AGA ACT CAA GGG CAC GCC CTG GCA CCC GCA AGC TTG ATA TCG AAT TAA TTC CTG CAG CCA ATA TGG GAT CGG CCA TTG AAC AAG ATG GAT TGC ACG
...
neo kódoló szekvencia
oligonukleotid primerek egyike (PGK-BG) a dokkoló hellyel, a másik (NEO-BG1) az inszerciós vektor a neo génjének kódoló szekvenciájával mutatott komplementer szerkezetet (13. ábra). A 204 bp hosszúságú PCR termék így csak helyspecifikus integráció esetén képződik. Azon sejtvonalak, melyek esetében a Southern hibridizáció helyspecifikus integrációt igazolt, kivétel nélkül PCR pozitívnak bizonyultak, azonban egy alkalommal sem lehetett PCR termék képződését kimutatni a hibridizációval negatívnak ítélt 58
sejtvonalak esetében. A PCR termék szekvencia-analízise a 12 vizsgált eset mindegyikében a vártnak megfelelő eredményt adott: a Pgk-1 promoter 3’ helyzetű részei valamint a neo gén 5’ része között megtalálható volt a rekombináció során keletkezett attL felismerési hely (13. ábra). A rekombináció minden esetben a TTG triplet területén történt, ahogyan arról mások is beszámoltak (69, 73). 4.1.3 A φC31 integráz expressziója nem befolyásolja az ES sejtek fejlődési potenciálját
A φC31 integráz jövőbeli használhatósága szempontjából igen fontos kérdés, nem befolyásolja-e kedvezőtlenül az integráz expressziója az ES sejtek pluripotenciáját. E kérdés megválaszolására 8 sejtes embriókkal aggregáltuk azon négy ES sejtvonal sejtjeit (110A, 110H, 110G, 212A), amelyek esetében in vitro kimutatható volt helyspecifikus integráció. A kiméra embriókat álterhes egerek méhébe ültettük be. Három sejtvonal (110H, 110G és 212A) esetében születtek szőrzetük színe alapján kimérának imponáló újszülött egerek. Közöttük germinális kimérák is megtalálható voltak, amelyek felhasználásával mindhárom vonal esetében germinális transzmisszió volt elérhető. A transzgén jelenlétét az utódokban PCR vizsgálattal igazoltuk a PGK-BG és INT1-BG primerek felhasználásával (14. ábra). A transzgént hordozó egyedek aránya a mendeli aránynak megfelelő (kb. 50%) volt, és azok életképesek, egészségesek, vad típusú alomtársaiktól megkülönböztethetetlenek és fertilisek voltak. A transzgénes egyedek egymás közötti keresztezéskor az utódok 70%-a (n = 20) hordozta a transzgént, és azok valamennyien egészségesek voltak. 4.1.4 A φC31 integráz használata szelekciót igényel 4.1.4.1 Genomiális integráció vizsgálata a zigótában
Annak vizsgálatára, hogy képes-e a φC31 integráz nem szelektív körülmények között helyspecifikus genomiális integrációt előidézni, a dokkoló helyet tartalmazó
59
14. ábra: A dokkoló hely kimutatása a transzgénes egerek genom DNS-ében
Az ábra Int-110H hímek és ICR nőstények keresztézéséből származó utódok PCR vizsgálatát mutatja a PGK-BG és INT1-BG primerek alkalmazásával. A transzgénes egyedek aránya kb. 50%.
200 bp
zigótákba (110H, 110G) juttatunk be különböző inszerciós plazmidokat (pBBβgeo, pBBVenus, pBBneo) pronukleáris mikroinjekcióval. A transzgén az esetek egy részében petesejt, más részében spermium eredetű volt. A kísérletek egy részében ko-injektáltuk a PFY06 plazmidot is, melyben a φC31 integráz expresszióját CMV promoter irányítja. A zigótákat álterhes egerek méhébe ültettük be, majd a 9.5 dpc (dies post coitum) embriókat X-gal festéssel (pBBβgeo esetén) illetve fluoreszcens vizualizációval (pBBVenus) vizsgáltuk. A pBBneo esetében 9.5 dpc embriókból primer fibroblast kultúrákat izoláltunk, és ezek G418 rezisztenciáját vizsgáltuk; a genomiális integrációt ez esetben PCR-rel is megkíséreltük kimutatni. Összesen 119 embriót vizsgáltunk meg a különböző kísérletek során. Egyetlen alkalommal sem észleltünk helyspecifikus integrációt, még mozaik formában sem. A φC31 integráz hatékonysága tehát nem elegendő ahhoz, hogy a zigótában nem szelektív
körülmények között transzgének helyspecifikus integrációját előidézze. 4.1.4.2 Genomiális integráció ES sejtekben nem szelektív körülmények között
60
A nem szelektív körülmények közötti helyspecifikus integráció vizsgálatára olyan sejtvonalakat választottunk, amelyekben az integráz működését szelektív körülmények között előzetesen már igazoltuk (212A és 110G). A sejtekbe egyszerre juttattunk be elektroporációval egy attB tartalmú inszerciós vektort (pBBVenus vagy pBBeGFP) és egy szelekciós markert (neo) tartalmazó vektort (pCALL2). A két plazmid közül az inszerciós vektor volt feleslegben (30 μg vs. 6 μg, ami 10:1 moláris aránynak felel meg). 7 napig tartó G418 szelekciót követően a drogra rezisztens sejtvonalakat megvizsgáltuk Southern hibridizációval, történt-e bennük helyspecifikus integráció. 275 sejtvonalat elemezve a dokkoló hely megváltozását érzékelő külső szondával (Pgk-1), egy alkalommal sem sikerült helyspecifikus integrációs eseményt kimutatnunk. Két plazmid egyidejű elektroporációja esetén az egyik plazmidot felvevő sejtek jelentős részébe a másik plazmid is bejut egyidejűleg. Korábbi vizsgálataink alapján, amennyiben a két vektor moláris aránya 10:1 a nem szelektált plazmid javára, a stabilan drog rezisztens sejtvonalak mintegy 10-20 %-a tartalmazza genomjába beépülve a másik vektort is. Ezért kísérleteink alapján elmondhatjuk, hogy nem szelektív körülmények között a φC31 integráz által előidézett helyspecifikus integráció gyakorisága jelentősen elmarad a random módon történő genomba épülés gyakoriságától.
61
4.2. Reverz tetraciklin transzaktivátor kísérlet 4.2.1. Rosa26-rtTA knock-in ES sejtvonal létrehozása
Homológ rekombináció segitségável olyan ES sejtvonalat és knock-in egértörzset kívántunk létrehozni, amely Cre-rekombináció után minden sejtben és szövetben expresszálja az rtTA és eGFP géneket. Akceptorként az állandóan expresszálódó Rosa26 gént választottuk ki (96, 97). A készített target vektor a 9D ábra mutatja be. Az 5’ és 3’ genomiális „homológ karok” izogénikusak az embrionális őssejt (129 egértörzs) DNS-ével. Az azonosság teszi lehetővé a homológ rekombinációt. A rekombináció eredményeképpen egy mesterséges exon epül be a Rosa26 gén 1. intronjába (az első és második exon közé). Ezen exon tartalmazza az rtTA és az eGFP gének kódoló szekvenciáját; a közöttük található belső riboszomális belépési hely (IRES) teszi lehetővé a második cisztron (eGFP) egyidejű transzlációját. A loxP helyekkel közrefogott pozitív szelekciós kazetta (Pgk-neo-pA) egyrészt lehetővé teszi a sikeresen transzfektált sejtek szelektív expanzióját, másrészt meggátolja az rtTA és az eGFP gének expresszióját; ezek csak a szelekciós kazetta Cre rekombináz mediálta deléciója után íródnak át a Rosa26 promoter felhasználásával. A homológ karokon kívül elhelyezkedő negatív szelekciós kazetta a vektor random integrációja ellen nyújt viszonylagos védelmet. A knock-in allél létrehozásának stratégiáját a 15A. ábra mutatja be. A target vektor transzfekcióját és a drog rezisztens klónok szelekcióját a metodikai részben leírtaknak megfelelően végeztük. 140 G418 rezisztens ES sejt szubklón molekuláris elemzését végeztük el Southern hibridizációval. A homológ rekombináció detektálásához a 5’ homológ kartól 5’ irányban elhelyezkedő genomiális szondát használtunk. Az eredményes homológ rekombináció egy EcoRV RFLP-t (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmust) hoz létre: a knock-in allél 3.8 kb hosszúságú fragmentet ad, a módosítatlan Rosa26 allél 11 kb hosszúságút (15B ábra). A 140 sejtvonalból 12 bizonyult homológ rekombinánsnak, vagyis a „gén targeting” esemény frekvenciája kb. 8% volt.
62
15. ábra: Knock-in allél létrehozása a Rosa26 lókuszon
A. A gén targeting stratégiája. A számozott négyszögek exonokat jelölnek, a homológ DNS szakaszokat megvastagitott vonal jelzi. A vektor integrációja a jelzett XbaI helyre történik. A vad típusú és a rekombináns allél megkülönböztetésére használt EcoRV RFLP-t nyilak jelzik. Az 5’ külső szondát vastag vonal szimbolizálja. A háromszögek loxP helyeket jelölnek.
Genom
11.0 kb
EcoRV
EcoRV
1
2
3
XbaI
Target vektor SA
rtTA-ires-eGFP-pA
Pgk-neo-3xpA
Pgk-DT-A-pA
Knock-in 3.8 kb
EcoRV
1
EcoRV
SA
Pgk-neo-3xpA
2
rtTA-ires-eGFP-pA
Cre delˇ ci— 1
SA
2
rtTA-ires-eGFP-pA
63
B. Sikeres „gén targeting” detektálása Southern blotting segítségével. Az 5’ külső szonda egyaránt jelöli a knock-in allélt (3.8 kb fragment) és a másik vad tipusú Rosa26 allélt (11 kb fragment). A neo transzgén szondája csak a knock-in allélhez hibridizálódik
B
11.0 kb
3.8 kb
5Õpr— ba
neo pr—ba
Előfordul, hogy a homológ rekombináció után a genomba további vektor DNS-ek épülnek be random módon, és ez nem kívánt mutációkhoz vezethet. Ennek kizárására a sejtvonalakat neo szonda hibridizációjaval vizsgáltuk meg. A 3.8 kb fragmenten kívül a szonda nem jelölt meg más DNS szakaszt a 12 sejtvonal egyikében sem, vagyis random beépülés nem történt (15B ábra). 4.2.2. A tetraciklinnel indukálhatóság vizsgálata ES sejtekben
Következő lépésként in vitro kívántuk vizsgálni a loxP felismerési helyek működőképességét, valamint a termelődő rtTA protein inducibilitását. Egy Crerekombinázt expresszáló vektor ES sejtekbe juttatásával hajtottuk végre a loxP helyek
64
16. ábra: A doxiciklinnel indukálhatóság tesztelése in vitro
A. Puromycin rezisztens kolóniák a pCAGGS-Cre-PGK-puro plazmid transzfekcióját követően. B. A kolóniak zöld fluoreszcenciát mutatnak. C és D. X-gal festés a pBI-3 vektor transzfekciója után. C. Doxiciklin hiányában X-gal pozitívitás nem észlelhető. D. doxiciklin indukció esetén a sejtek egy része X-gal pozitivvá válik. Részletes magyarázatot l. a szövegben. A
B
C
D
rekombinációját, s így a szelekciós kazetta (Pgk-neo-pA) delécióját. E plazmid tartalmazza a puromycin aciltranszferáz génjét is, ami lehetővé tette, hogy a stabilan transzfektált szubklónokat izoláljuk. A Cre deléciót követően a Rosa26 promoterről képződő mRNS tartalmazza az rtTA és eGFP kódoló szekvenciáját is. Várakozásainknak megfelelően a képződő puromycin rezisztens szubklónok zöld fluoreszcenciát mutattak (16A és 16B ábrák). A Cre plazmid bejuttatását megelőzően a sejtek nem voltak fluoreszcensek. 65
Két fluoreszcens szubklónt (1C12 és 1H6) izoláltunk, és a sejtekbe lipofekcióval bejuttattuk a pBI-3 plazmidot, amelyben a béta-galaktozidáz génje előtt tetraciklin reszponzív promoter helyezkedik el. Ezt követően megvizsgáltuk a doxiciklin hatását a béta-galaktozidáz expressziójára. A doxiciklinnel nem kezelt lemezeken X-gal festéssel pozitivitást nem észleltünk, vagyis induktor hiányában a rtTA nem képes a transzkripciót aktiválni (16C ábra). Doxiciklin hozzáadása (100 ng/ml) esetén X-gal pozitivitást észleltünk (16D ábra). Megjegyzendő, hogy ez esetben is csak a sejtek egy része volt Xgal pozitív, aminek egyik lehetséges magyarázata, hogy ez esetben nem alkamaztunk szelekciót, és valószínűleg csak a sejtek egy része vette fel a pBI-3 plazmidot. 4.2.3. Rosa26-rtTA knock-in egér létrehozása
Két független ES sejt klónnal (1C4 és 1C12) ES sejt – embrió aggregációt és embriótranszfert végeztünk. Mindkét sejtvonal „targetált” volt, a knock-in allélt hordozta. Mindkét esetben változó fokú kiméritást mutató utódok születtek (l. 1B ábra). A kimérák egy része mindkét sejtvonal esetében germinális kimérizmust mutatott, és a knock-in allélt utódaira közvetítette. A heterozigóta knock-in egerek életkesek voltak, kóros fenotípust nem mutattak, élettartamuk azonos volt a megfelelő beltenyésztett egértörzs (129) vad típusú egyedeiével. Az 1C12 törzs heterozigóta egyedeit egymással kereszteztük, és ez a knockin allél mendeli öröklődését eredményezte, vagyis az utódok 25%-a homozigóta Rosa26rtTA / Rosa26-rtTA volt. Ezek az egerek sem mutattak kóros fenotípust, nem transzgénes álomtársaiktól megkülönböztethetetlenek voltak, és termékenynek bizonyultak. A kesőbbiekben a Rosa26-rtTA egértörzset homozigóták keresztezésével tartottuk fenn, ami szükségtelenné teszi az utódok genotipizálását.
66
4.2.4. A Cre-kondicionális Rosa26-rtTA egértörzs vizsgálata in vivo 4.2.4.1 A Rosa26-rtTA egértörzs használatának elvi semája
Amennyiben célunk valamely transzgén overexpressziójának tér- és időbeli szabályozása, ehhez háromszoros transzgénes egyedeket kell keresztezéssel létrehozni. A keresztezési sémát a 17. ábra mutatja be. Első lépésként a tetraciklin reszponzív transzgént tartalmazó törzset keresztezzük a szövetspecificitást biztosító Cre egértörzzsel. Az utódok 25%-a mindkét transzgént hordozni fogja. Mivel a Cre rekombináz esetleges expressziója nem befolyásolja a tetraciklin reszponzív transzgént, ezeknél az állatoknál fenotípusos eltérést nem várunk. Következő lépésként a kettős transzgénes egyedeket keresztezzük a Rosa26-rtTA egyedekkel. A mendeli öröklésmenetnek megfelelően az utódok 25%-a fogja hordozni mindhárom transzgént. További 25% kettős transzgénes lesz Cre és a Rosa26-rtTA transzgénekre. E két csoportban a Cre rekombináz szövetspecificitását az illető szövetek zöld fluoreszcenciája jelzi. Az egerek további 25%-a Rosa26-rtTA és a TRE transzgén allélokra lesz kettős transzgénes, 25%-uk pedig csupán a Rosa26-rtTA allélt fogja hordozni. A háromszoros transzgénes állatokban doxiciklin hozzadásával (1mg/ml az állatok ivóvízében) a tetraciklin reszponzív transzgén overexpressziója érhető el. A doxiciklin indukció történhet in utero (ilyenkor a vemhes nőstényt kezeljük doxiciklinnel), és történhet kifejlett egyedben is. Rendszerünk teszteléséhez a VEGF-A gént választottuk, mivel e gén rendkívül dózisérzékeny, működésének kiesése akár heterozigóta formában is embrionális letalitást okoz (98, 99), továbbá konstitutív overexpressziója is letalitást eredményez (100). A „tetO-VEGF-A-164” egértörzsben a VEGF-A 164 kDa molekulasúlyú izoformáját kódoló cDNS expresszióját tetraciklin reszponzív promoter szabályozza. Három Cre egértörzset használtunk kísérleteink során: A pCAGGS-Cre törzs esetében a Cre rekombináz erős expresszió figyelhető meg a fejlődő embrió és a kifejlett állat minden szervében – szövetében (41). A nestin-Cre egértörzsben a Cre a központi idegrendszerben expresszálódik (101). A podocin-Cre törzs esetében Cre expresszió csak a vese glomerulusok podocytáiban figyelhető meg (Karen Sison és mtsai. – publikáció előtt). Az 67
első két Cre egértörzs esetében a doxiciklin indukciót in utero (1.5 dpc) illetve 3-4 hónapos kifejlett állatban végeztük. A podocin-Cre törzs esetében csak postnatalis génindukció történt. A kísérleteket az IV. táblázat mutatja be. A mindhárom transzgént hordozó egyedek doxiciklin hiányában valamennyi esetben életképesek voltak, kóros fenotípust nem mutattak, és csak genotipizálással voltak megkülönböztethetők a csak egy vagy kettő transzgént hordozó alomtársaiktól. Utóbbiak szolgáltak kontrollként vizsgálataink során. Doxiciklin indukció hatására kóros fenotípusok jelentek meg (l. lentebb és az IV. táblázatban). A pCAGGS-Cre és nestin-Cre törzsekkel kapcsolatos vizsgálatokat Dr Jody Haigh (Samuel Lunenfeld Kutatóintézet), a podocin-Cre kísérleteket Dr Karen Sison (Samuel Lunenfeld Kutatóintézet) végezte.
17. ábra: Rosa26-rtTA knock-in egértörzs keresztezési sémája
A homozigóta Rosa26-rtTA hímeket keresztezzük a Cre transzgént és a tetO-VEGF-A164 transzgént egyaránt hordozó nöstényekkel. Az embriók vizsgálatához a doxiciklint a vemhes nőstények ivóvízébe adagoljuk, a posztnatalis vizsgálatok során a kifejlett utódokat kezeljük.
Rosa26-rtTA
Tet(O)-VEGF-A
Rosa26-rtTA
Promoter-Cre
Doxyciklin
(100 ng/ml)
25% mindhárom transzgénre pozitiv utód
pCAGGS-Cre Nestin-Cre Podocin-Cre
68
IV. táblázat: A doxiciklin indukciós kisérletek összefoglalása Genotípus ROSA26-rtTA, pCAGGS-Cre, tetOVEGF-A-164 Rosa26-rtTA vagy Rosa26-rtTA és pCAGGS-Cre vagy Rosa26-rtTA és tetO-VEGF-A-164 ROSA26-rtTA, pCAGGS-Cre, tetOVEGF-A-164 Rosa26-rtTA vagy Rosa26-rtTA és pCAGGS-Cre vagy Rosa26-rtTA és tetO-VEGF-A-164 ROSA26-rtTA, Nestin-Cre, tetO-VEGF164 Rosa26-rtTA vagy Rosa26-rtTA és Nestin-Cre vagy Rosa26-rtTA és tetOVEGF-A-164 ROSA26-rtTA, Nestin-Cre, tetO-VEGFA-164 Rosa26-rtTA vagy Rosa26-rtTA és Nestin-Cre vagy Rosa26-rtTA és tetOVEGF-A-164 ROSA26-rtTA, Podocin-Cre, tetOVEGF-A-164 Rosa26-rtTA vagy Rosa26-rtTA és Podocin-Cre vagy Rosa26-rtTA és tetOVEGF-A-164
Kor E9.5
n 10
Fenotípus Embrionális letalitás. Valamennyi szövet fluoreszcens 20 embrió: normális 2 embrió: embrionális letalitás fluoreszcencia minden szövetben Letális / moribund 5 napon belül
E9.5
22
3-4 hónap 3-4 hónap
8 10
9 állat: normális 1 állat: moribund 5 napon belül
E9.5
5
Embrionális letalitás
E9.5
4
Normális embriók
3-4 hónap 3-4 hónap
6
Normális
6
Normális
4 hónap 4 hónap
6
Nephrosis szindróma
5
Normális
4.2.4.2 A VEGF-A embrionális konstitutív overexpressziója embrionális letalitást okoz
Ha másfél nappal (E1.5) a megtermékenyítés után doxiciklint adagoltunk a vemhes nőstények ivóvízébe, háromszorosan transzgénes egerek nem születtek meg. 9.5 naposan (E9.5) a háromszorosan transzgénes embriók jellegzetes fenotípust mutattak. A embrionális fejlődésükben megrekedt embriókban a szikhólyag vérhálózata alulfejlett volt (18. ábra A-D). A vérszigetek a normálisnal lényegesen nagyobbak voltak, és magvas vörösvértest előalakokkal voltak kitöltve. Az egyszeresen illetve kétszeresen transzgénes utódok kóros fenotípust nem mutattak. Kivételt képezett kettő, kétszeresen transzgénes, Rosa26-rtTA, tet-O-VEGF embrió; ezekben a fenti kóros fenotípus volt megfigyelhető. Noha ezek az állatok a Cre transzgént nem tartalmazták, a Cre rekombináció mégis megtörtént, feltehetőleg a fejlődő petesejtben felhalmozódó Cre
69
18. ábra: A VEGF-A-164 overexpressziója az embrionális életben
A-D: Konstitutív Cre expressziót mutató háromszoros transzgénes (pCAGGS-Cre, Rosa26-rtTA, tetO-VEGF-A164) embriók. A: A kórosan fejlődő embrióban a szikzacskó érhálózata alulfejlett. B: Az embrió konstitutív zöld fluoreszcenciát mutat. C és D: Doxiciklin hiányában az embrió fejlődése normális és ugyancsak konstitutív zöld fluoreszcencia észlelhető. A
B
QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.
C
D
G-I: Nestin-Cre, Rosa26-rtTA és tetO-VEGF-A164 háromszoros transzgénes embriók. G: Zöld fluoreszcencia – a nestin promoter akitivitásának megfelelően – a fejlődő központi idegrendszerben észlelhető. H: Doxiciklin hiányában az embrionális fejlődés normális. I: Doxiciklin adása esetén központi idegrendszeri vérzések észlelhetők.
QuickTime™ and a TIFF (LZW) decompressor are needed to see this picture.
70
19. ábra: A VEGF-A-164 overexpressziója kifejlett egyedben
A-D: Peliosis hepatis-szerű patológiai elváltozások májban a VEGF-A-164 overexpressziója esetén. A és B: A pCAGGS-Cre, Rosa26-rtTA, tetO-VEGF-A-164 háromszorosan transzgénes embriókban doxiciklin hiányában a máj szöveti képe normális. C és D: Doxiciklin indukció esetén a sinusoidok tágulata és a sinusendothel sejtek leválása figyelhető meg. E-H: A VEGF-A-164 overexpresziója a thymus atrophiáját okozza. E-F: Doxiciklin hiányában a thymus mérete és szöveti szerkezete normális. G-H: Doxiciklin indukció esetén a thymus lebenyeinek mérete jeletősen kisebb; a kéregállomány sejtszegény, a velőállománytól nehezen különíthető el. A
B
QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.
C
D
E
F
QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.
G
H
71
fehérje miatt, ahogy arról már mások is beszámoltak (48). Ezt támasztja alá az is, hogy ez két embrió zöld fluoreszcenciát mutatott. 4.2.4.3 Peliosis hepatis és thymus atrophia a VEGF-A postnatalis overexpressziója esetén
3-4 hónapos korú háromszoros transzgénes állatokat kezeltünk doxiciklinnel. Az 5 napos kezelés végére az állatok vagy elpusztultak vagy euthanáziát kellett alkalmazni súlyosan moribund állapotuk miatt. A kontroll egy- vagy kétszeres transzgénes egyedekben betegség hosszabb doxiciklin adagolás után sem alakult ki. Ez alól kivételt képezett egy állat, melyben azonban az általános zöld fluoreszcencia anyai eredetű Cre aktívitásra utalt (l. fent). A moribund háromszoros transzgénes állatokat megvizsgálva, rajtuk generalizált oedema volt megfigyelhető. Az autopszia során feltűnő elváltozás volt a máj megnagyobbodása és vérbősége valamint a thymus atrophiája. Megfigyelhető volt ezen kívül a belső szervek generalizált vérbősége is. A szövettani feldolgozás során a májban és a thymusban találtunk jellegzetes patológiai eltéréseket. A májban megfigyelhető szövettani eltérések a peliosis hepatis nevű elváltozásra emlékeztettek, melyet Bartonella henselae fertőzéssel kapcsolatban, androgén kezelés mellékhatásaként és ritkán paraneoplasztikus szindróma formájában figyeltek meg (102). A máj sinusoidjai a normálisnál tágabbak voltak. Jellemző volt a sinus endothel sejtek leválása is (19. Ábra A-D). A thymus lebenyei a normálisnál jelentősen kisebbek voltak. A kéregállomány sejtszegény volt, a basophil thymocyták száma jelentősen csökkent (19 ábra E-H). 4.2.4.4 A VEGF-A központi idegrendszeri overexpressziója az embrionális életben idegrendszeri vérzések kialakulásához vezet
A VEGF-A központi idegrendszeri overexpressziójához a Nestin-Cre egértörzset használtuk. A nestin intermedier filament, mely korai idegrenszeri marker, a fejlődő központi idegrendszer sejtjeiben (idegsejt és glia) expresszálódik (18G ábra és 22. referencia). Amennyiben a vemhes nőstények ivóvízébe 1.5 dpc kezdettel doxiciklint 72
adagoltunk, és az utódokat E12.5 időpontban megvizsgáltuk, a háromszoros transzgénes egyedekben agyi és gerincvelői vérzéseket tapasztaltunk (18. ábra H és I). Az egyéb genotípusú utódokban ezek az elváltozások nem voltak megfigyelhetők. Doxiciklin indukció hiányában a háromszoros transzgénes utódok is életképesek voltak és kóros fenotípust nem mutattak. A kifejlett állatoknak doxiciklint adagolva azokban betegség nem lépett fel. 4.2.4.5 A VEGF-A overexpressziója a vese podocytáiban nephrosis szindrómát okoz
A Podocin-Cre egértörzsben a Cre rekombináz expressziója a vese podocytáira korlátozódik. Háromszoros transzgénes egyedeket 7 napig doxiciklinnel kezelve azokban nemszelektív proteinuria lépett fel, melynek mértéke meghaladta a 5 g/litert. A proteinuria a glomerulus filtráció zavarát, a szelektív permeabilitás elvesztését jelzi. Ezen egerek részletes patológiai vizsgálata jelenleg folyamatban van (Karen Sison és munkatársai, Samuel Lunenfeld Kutatóintézet).
73
5. Megbeszélés 5.1. φC31 integráz projekt 5.1.1 A φC31 integráz működése és annak korlátai ES sejtekben
A dolgozatban részletezett kísérletsorozat fő eredménye annak igazolása, hogy a φC31 integráz működőképes egér embrionális őssejtekben. Ez megteremti annak elvi
lehetőségét, hogy e helyspecifikus integráz rendszert felhasználjuk az egér genom célzott módosítására. Ha alkalmazását kombináljuk a már eddig is kiterjedten használt technológiákkal, az tovább növelheti lehetőségeinket az egér genom precíz manipulációja terén. Ez lényeges, mert lehetővé teszi gének alaposabb in vivo funkcionális jellemzését és pontosabb emberi betegségek pontosabb modellezését. Az φC31 integráz tényleges felhasználhatóságát természetesen csak a rendszer jövőbeli alkalmazásain keresztül fogjuk megismerni. Az alábbiakban néhány olyan szempontot ismertetünk, amely az enzim alkalmazhatóságát vélhetően befolyásolni fogja. 5.1.1.1 A helyspecifikus rekombináció lehetséges iránya
A φC31 integráz két felismerési hellyel rendelkezik: attB és attP. A közöttük fellépő rekombináció eredményeként attL és attR helyek keletkeznek (l. 1.6.2). Munkánk során azt vizsgáltuk, képes-e a φC31 integráz helyspecifikus integrációt előidézni ES sejtekben. A felismerési helyek valamennyi lehetséges kombinációját kipróbáltuk (l. II. és III. táblázat), de helyspecifikus integrációt csak úgy lehetett elérni, ha a dokkoló hely attP, az inszerciós plazmid attB helyet tartalmazott. Az egyéb lehetséges kombinációk nem vezettek eredményre: két azonos felismerési hely soha nem reagált egymással, és akkor sem észleltünk helyspecifikus integrációt, ha a dokkoló hely attB helyet, az inszerciós plazmid attP helyet tartalmazott. A φC31 integráz működőképességét már igazolták E. coli, Schizosaccharomyces pombe, valamint emlős sejtvonalak esetén (71, 72, 73). Utóbbiak vizsgálatával
74
Thyagarajan és munkatársai a mienkkel részben hasonló eredményekre jutottak. A két vizsgálat különbségei az alábbiakban foglalhatók össze: 1. Vizsgálataink során egér embrionális őssejteket használtunk, szemben a Thyagarajan és munkatársai által alkalmaztak transzformált egér sejtvonallal (NIH3T3) és humán embrionális vese sejtvonallal (293). Az ES sejtek vizsgálata kiemelt jelentőségű, mivel segítségükkel genetikailag célzottan módosított egértörzsek hozhatók létre. Sikerült azt is megmutatnunk, hogy a φC31 integráz expressziója ES sejtekben nem befolyásolja kedvezőtlenül azok
képességét transzgénes élőlények létrehozására. 2. Thyagarajan és munkatársai elsősorban az emberi és egér genomban jelen lévő pszeudo felismerési helyeket használták helyspecifikus integrációhoz, a jelen munka során viszont első lépésként dokkoló helyeket helyeztünk el a genomba, és az integráció e helyekre történt. A pszeudo felismerési helyek használata előnyös lehet génterápiás próbálkozások esetében, mivel ekkor dokkoló helyek előzetes elhelyezésére nincs mód. A φC31 integráz mesterséges evolúciójával az enzim működése valamely pszeudo felismerési helyen hatékonyabbá tehető (74). E változtatással az enzim in vitro és in vivo génterápiára felhasználható (76, 77, 78, 79). Az ES sejt technológia alkalmazásakor azonban célszerű a mesterséges dokkoló helyek használata, mivel ez kiszámítható genetikai környezetet biztosít a bejuttatott transzgének számára. Ugyancsak szükséges használatuk knock-out allélek és géncsapda inszerciók másodlagos módosítása során. A jelen munka igazolja a technológia elvi működőképességét. 3. Valamennyi korábbi vizsgálattal ellentétben az integráz expressziója kísérleteinkben nem expressziós vektorról, hanem a genomba integrálódott transzgénről történt. Bizonyítottuk, hogy e stratégia több különböző genomiális lokalizáció esetén megfelelő enzimaktivitást biztosít. Az integráz működése következtében fellépő genetikai változás az enzim expressziójának megszűnését eredményezi, ezzel csökken annak lehetősége, hogy az integráz további, nem kívánt genetikai változásokat idézzen elő a sejtben. 4. A korábbi munkával ellentétben, mi genomiális integrációra nem > 200 bp hosszúságú att felismerési helyeket, hanem csupán 52 bp illetve 51 bp 75
hosszúságú
attB
illetve
attP
helyeket
használtunk.
A
technológia
alkalmazásakor rövid felismerési helyek használata célszerű, mivel kisebb az esélye, hogy e DNS szakaszok befolyásolják a vizsgált genetikai elemek működését. Az általunk használt att helyek hossza összemérhető a loxP és FRT helyek hosszúságával (34 bp). A felismerési helyek start kodont (ATG) a lehetséges 6 (mindkét irányban 3) leolvasási lehetőség („reading frame”) egyikében sem tartalmaznak, stop kodont az attB hely a 6-ból 5 esetben, az attP hely csak egy esetben tartalmaz. 5. Thyagarajan és munkatársai (73) kb. tízszer kevésbé hatékony genomiális integrációt észleltek, amennyiben a dokkoló hely attB-t, az inszerciós plazmid attP-t tartalmazott. Mi egyáltalán nem tudtunk ebben az irányban specifikus integrációt kimutatni. Ezen aszimmetria oka ismeretlen. A fiziológiás szituációban az attB található a baktérium kromoszómáján és az attP a fág genomjában. Elképzelhető, hogy a reakció során keletkező szinapszis aszimmetriája felelős a jelenségért. Az is lehetséges, hogy a DNS kromatinba szerveződése eltérően érinti a kétféle reakciót. Különbözően befolyásolhatja a kétféle reakciót a felismerési helyek hosszának csökkentése is. Ez lehet az oka, hogy a két munka során kapott eredmények némileg eltérnek. Az a tény, hogy jelen fázisban a reakció csupán egyik kombinációban működőképes, a rendszer alkalmazhatóságát nem befolyásolja. 5.1.1.2 A genomiális integráció mechanizmusáról
A kísérleteinkben alkalmazott rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) történhet egy vagy két lépésben. Előbbi esetben a két crossing over egyidejűleg történik, az utóbbiban egymást követően (l. 4.1.2.2.2). A reakció végterméke mindkét esetben ugyanaz. A „pop-in” rekombinációs intermedier létezése bizonyítja a két lépéses mechanizmus létezését. Nem zárható azonban ki, hogy ezzel egyidejűleg az egy lépéses reakcióút is létezik. A mozaik sejtvonalak megfelelhetnek a pop-in intermedier inkomplett reszolúciójának, de jelenthetik a két reakcióút egymás melletti létezését is. E kérdésre tehát vizsgálataink alapján nem tudunk egyértelmű választ adni. 76
Helyspecifikus integrációt el lehetett érni linearizált inszerciós plazmidok alkalmazásával is, noha ez a keletkező drog rezisztens kolóniák számát jelentősen lecsökkentette. Az integráció eredményeként pop-in intermediert tartalmazó sejtvonalak is létrejöttek. Legvalószínűbb tehát, hogy a linearizált plazmid végei újra egyesültek, a genomba épülést megelőzően. 5.1.1.3 A φC31 integráz mediálta genomiális integráció hatékonysága
Helyspecifikus
genomiális
integráció
előidézése
a
rendelkezésre
álló
technológiákkal problematikus. Ennek egyik oka, hogy a Cre vagy Flp rendszerek használata esetén a genomba épülés két egymáshoz közeli cisz-helyzetű felismerési helyet eredményez. Ezek között nagy hatékonysággal történik rekombináció, ami a beépült szakaszok delécióját eredményezi (41). Mutáns felismerési helyek használatával a rekombinációs reakció az integráció irányába eltolható. Szelekciós stratégia alkalmazására azonban ebben az esetben is szükség van mivel az integrációs reakció nemcsak termodinamikailag, hanem kinetikailag is kedvezőtlen: olyan bimolekuláris reakció, ahol az egyik szubsztrát (a dokkoló hely) csupán egyetlen példányban áll rendelkezésre. Szelekció alkalmazása kedvezőtlen, mivel a szelekciós kazettát utólag, második lépésben el kell távolítani, s ez egy második helyspecifikus rekombináz alkalmazását igényli, elvonva azt más alkalmazásoktól. Alternatív lehetőség a dokkoló helyre beépített negatív szelekciós marker, ehhez azonban szükséges, hogy a határoló felismerési helyek szelektív nyomás alatt is inkompatibilisek legyenek (67). In vivo alkalmazások során szelekcióra természetesen nincs lehetőség. Kísérleteink során az egyik legerősebb pozitív szelekciós stratégiát, a promoter csapdázást használtuk. Az inszerciós vektorban a neo gén nem rendelkezett saját promoterrel, helyspecifikus integráció esetén viszont a Pgk-1 promoter szomszédságába került. Random genomiális integráció esetén a neo gén nem expresszálódik, hacsak nem kerül egy endogén promoter közvetlen szomszédságába. Ennek esélye igen alacsony (103). Ennek tudható be, hogy a G418 rezisztens sejtvonalak 87%-ában helyspecifikus integráció volt megfigyelhető. Megkíséreltük transzgének helyspecifikus integrációját a zigótában nem szelektív körülmények között. E stratégia lehetővé tenné a klasszikus transzgenezis során észlelt 77
pozició hatás kiküszöbölését. Helyspecifikus integrációt elérnünk nem sikerült, sem a genomból expresszálódó integráz aktivitással, sem expressziós vektor ko-injekciója esetén. Ez az eredmény nem meglepő, hiszen mások igen alacsony hatékonyságú genomiális integrációról számoltak be Cre rekombináz alkalmazása esetén (104). In vitro körülmények között is vizsgáltuk az integráz nem szelektív alkalmazási lehetőségeit. Ez esetben az alacsony hatékonyság egyik fő oka, hogy csupán a sejtek igen kis hányada veszi fel a külső DNS-t az elektroporáció során. Ezért a szelekciós markert nem tartalmazó inszerciós vektorral egyidejűleg bejuttattunk az ES sejtekbe egy másik plazmidot is, amely hordozott egy pozitív szelekciós markert. A két vektor koelektroporációja esetén az egyiket felvevő sejtekben nagyobb valószínűséggel lesz megtalálható a másik is. A ko-elektroporált plazmid szelekciós markerére rezisztens nagyszámú sejtvonal egyikében sem tudtunk azonban helyspecifikus integrációt kimutatni. A φC31 integráz tehát nem képes helyspecifikus genomiális integrációt előidézni nem szelektív körülmények között, legalábbis a munkánk során alkalmazott körülmények (promoterek, genomiális helyek stb.) esetén. Ennek hiányában is tovább bővíti azonban lehetőségeinket az egér genom célzott manipulálására. 5.1.1.4 A φC31 integráz lehetséges káros hatásai az ES sejtekre
A mikroorganizmusokból származó helyspecifikus rekombinázok, mint DNS mobilizáló elemek, idegenek az emlős genom számára. Aktivitásuk következményei ezért kiszámíthatalanok. Általánosságban igaz, hogy idegen DNS beépülése a genomba mutagén hatású lehet vagy megzavarhatja endogén gének expresszióját. A helyspecifikus rekombinázok emellett nem kívánt genetikai átrendeződéseket is okozhatnak a sejtekben. Az átrendeződések történhetnek az enzim által felismert, a természetes felismerési helyhez részben hasonló „pszeudo felismerési helyek” között. A felismerési helyet tartalmazó transzgén több példányának beépülése esetén azok is reagálhatnak egymással. Az eredmény DNS-szakaszok elvesztése vagy transzlokációja lehet. Ilyen káros hatásokról a Cre rekombináz esetében már beszámoltak (80). Kísérleti rendszerünkben az ES sejtek φC31 integrázt a genomjukba beépült transzgénről expresszálják. Az expressziót az egér Pgk-1 génjének promotere irányítja, 78
mely differenciálatlan ES sejtekben bekapcsolt állapotban van. Az inszerciós plazmid helyspecifikus beépülése az integráz expressziójának megszűnéséhez vezet, így csökkentve a lehetőségét nem kívánt genetikai változások kialakulásának. Eredményeink igazolták, hogy a helyspecifikus integrációt követően a reziduális integráz aktivitás nem vezet további transzgén kópiák random beépüléséhez. Három különböző ES sejtvonallal sikerült germinális transzmissziót és egészséges transzgénes egerek születését elérnünk. Ezek mindegyike expresszálta az integrázt, hiszen lehetséges volt bennük attB felismerési helyeket tartalmazó transzgének helyspecifikus beépülése. Nem vizsgáltuk az integráz expresszióját az integráz gén hordozó egyedek különböző szerveiben és szöveteiben, ez további vizsgálatok tárgya kell, hogy legyen. A jelen munka alapján tehát a φC31 integrázt in vitro rekombinációt igénylő stratégiákhoz ajánlhatjuk ES sejtekben. 5.1.2 A φC31 integráz rendszer lehetséges alkalmazásai az ES sejt technológiában 5.1.2.1 Géncsapda inszerciók másodlagos módosítása
A nagyléptékű „gene trap” projektek során a vizsgált gének részletesebb funkcionális elemzéséhez szükséges az inszerciók másodlagos módosítása ES sejtekben (l. 1.4.2). A folyamat helyspecifikus genomiális integrációt igényel, ezért a rendelkezésre álló technológiákkal problematikus. Jellemzőinél fogva a φC31 integráz különösen alkalmas lehet erre a feladatra. A 20. ábrán egy olyan stratégiát vázolunk fel, amelyben a φC31 integrázt alkalmazva a legkülönbözőbb funkciójú allélek sorozatát lehet egyszerűen
előállítani.
79
20. ábra: Géncsapda inszerciók másodlagos módosítása a φC31 integráz alkalmazásával
Az ábra felső részén az alkalmazandó géncsapda vektor látható. A G418 rezisztens és Xgal pozitív sejtvonalakból transzgénes egér hozható létre, és ennek fenotípusa vizsgálható. Az embrió aggregációt megelőzően a génexpressziót potenciálisan befolyásoló szekvenciákat célszerű eltávolítani, ez a Cre rekombináz és negatív szelekció segítségével történik in vitro (l. az ábra jobb oldali része). RMCE és negatív szelekció segítségével lehetőség van a géncsapda inszerciók másodlagos módosítására, és különféle knock-in allélek létrehozására. A: A mutagén inszerció eltávolítása, elengedhetetlen annak bizonyításához, hogy a fenotípust maga a géncsapda inszerció és nem más nemkívánatos genetikai változás okozta. B: Reverz kondicionális null allél, a Cre rekombináz hatására a normál génfunkció helyreáll. C: Fluoreszcens knock-in allél, a gén expresszáló sejtek in vivo vizsgálhatók valamint FACS segítségével izolálhatók. D: Cre knock-in allél, a génre jellemző szövetspecifikus Cre-expressziót biztosít. E: Kondicionális null allél. A kódoló szekvencia géncsapda inszerciótól 3’ irányba eső (Cds∗) részét loxP helyek fogják közre. A Cre-excízió null allélt eredményez. F: Pontmutációt tartalmazó allél, melyből Cre-excízióval szövetspecifikusan null allél állítható elő. G: Szövetspecifikus és indukálható allél. A befogott gén promotere irányítja az a reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA) expresszóját. Doxyciklin kezeléssel a GÉN szövetspecifikus expressziója in vivo indukálható. A GÉN tetszőleges kódoló szekvencia lehet, akár maga a géncsapda inszerció során befogott gén is. (A rövidítések magyarázatát l. a dolgozat végén.)
SA-βgeo-pA
PGK-φC31-IRES-tk-pA
RMCE
Ganciklovir
Cre
A
SA-βgeo-pA
B SA-pA C SA-IRES-eGFP-pA D SA-Cre-pA E SA
Cds*
pA
attP
F SA
Cdsmut
attB
pA
loxP
G SA-IRES-rtTA-3xpA
tet(o)-G N-pA
80
Törölt: 14
5.1.2.2 Transzgének kiszámítható expressziója jól jellemzett genomiális dokkoló helyeken
A génszabályozó elemek vizsgálatához nélkülözhetetlen az in vivo analízis, amelynek során általában az adott szabályozó elem és egy vizualizálható marker (pl. lacZ vagy eGFP) kombinációját juttatjuk be a genomba. A különböző szabályozó modulok összehasonlító vizsgálatához szükséges, hogy a genomiális pozíció gén expressziót befolyásoló hatását kikapcsoljuk. Ideális esetben a különböző elemek működését ugyanazon a jól jellemzett genomiális helyen vizsgáljuk, kiküszöbölve így a pozició hatást. A 21. ábra genomiális dokkoló helyek kialakítását mutatja be a φC31 integráz felhasználásával. 5.1.3 A φC31 integráz egyéb alkalmazási területei
Az ES sejtek genetikai manipulációja mellett a φC31 integráz másik fő lehetséges alkalmazását a génterápia jelenti. A géntranszfer céljára leggyakrabban használt virális vektorokkal kapcsolatban biztonságossági problémák merülnek fel, a plazmid alapú vektorok viszont sokszor képtelenek megfelelő erősségű és stabil génexpresszió biztosítására. A φC31 integráz a non-virális génterápia új lehetőségét kínálja. Olivares és mtsai (77) kifejlett egér szöveteiben értek el stabil transzgén-expressziót a φC31 integráz és az egér genom endogén pszeudo-attP helyeinek felhasználásával. A nagynyomású injekcióval az egér szervezetébe juttatott transzgén a IX. véralvadási faktort kódolta, és képes volt tartósan megfelelő faktor szintet biztosítani a májszövetben. Ortiz-Urda és mtsai (76) epidermolysis bullosa dystrophica betegségben szenvedő betegekből származó primer keratinocytákat használt. A φC31 integráz alkalmazásával in vitro a sejtek genomjába, pszeudo-attP helyekre építette be a betegségért felelős gén (COL7A1) normális példányát. A genetikailag korrigált sejtek (a mutáns sejtekkel ellentétben) képesek voltak immundeficiens egerekbe transzplantálva bőrregenerációban normálisan részt venni. Charlberg és mtsai patkány retinájában értek el genomiális integrációt és stabil génexpressziót (78). A módszer emberi in vivo génterápiára is alkalmazható lehet,
81
amennyiben megfelelő eljárás áll rendelkezésre a vektor bejuttatására az emberi szervezetbe (79).
21. ábra: Genomikus dokkoló helyek kialakítása és jellemzése a φC31 integráz alkalmazásával
A módszer lehetővé teszi, hogy különböző transzgéneket egyazon genomikus helyen expresszáljunk és vizsgáljunk. A. A helyspecifikus integráció stratégiája: Első lépés a genomikus dokkoló hely létrehozása, mely során puromycin szelekciót alkalmazhatunk. Az inszerciós vektor beépítése a vektorba kettős (pozitív és negatív) szelekcióval történik. A pozitív szelekció biztosítja a helyspecifikus integrációt. A negatív szelekció segítségvel a pop-in intermedierek aránya lecsökkenthető, mivel a reakció a komplett kazettacsere irányába tolódik el; emellett vég a random integránsok ellen is. A szelekciós marker eltávolítása a Cre rekombináz segítségével történik. Dokkol— hely PGK
φC31-IRES-puro-pA
PGK-tk-pA
Inszerci—svektor neo-pA
RMCE
G418 + Ganciklovir PGK
attP attB
X
neo-pA
X
Cre X
loxP
82
B. A genomikus dokkoló hely jellemzése és használata: A genomikus dokkoló helyet alkalmazás előtt meg kell vizsgálni, hogyan befolyásolják az endogén génszabályozó elemek a bejuttatott gének expresszióját in vivo. Permisszív genomikus helyeken a CMV promoter (A) erős génexpresszióhoz és lacZ pozitívitáshoz vezet a szervezet legtöbb szövetében. A hsp68 minimális promoter (B) csak egy enhancer közelsége esetén elégséges a transzkripcióhoz, neutrális genomikus helyeken lacZ negatívitást észlelünk. Az így jellemzett dokkoló helyek felhasználható génszabályozó modulok összehasonlító vizsgálatára (C és D)
A
CMV
lacZ
hsp68
lacZ
B
C
mod. A
lacZ
mod. B
lacZ
D
mod. A
mod. B transzkripci—
83
5.2. Reverz tetraciklin transzaktivátor projekt
Az emberi szervezetben a gének működése térben és időben szabályozott. Ha genetikai modellek (pl. transzgénes vagy knock-out egerek) segítségével kívánjuk megérteni az emberi gének működését, a modelleket úgy kell létrehozni, hogy a génműködés azokban is térben és időben szabályozható legyen. A regulatív génműködés biztosítására egérben több rendszert fejlesztettek ki, az ideális stratégia felfedezése azonban még várat magára (105). Munkánk során arra tettünk kísérletet, hogy kombináljuk
egymással
a
Cre
rekombináz
alapú
transzgénes
rendszerek
szövetspecificitását a doxiciklinnel alapú rendszerek indukálhatóságával. 5.2.1 Az indukálható génexpressziós rendszerek sajátságai
Ideális esetben az in vivo szabályozható génműködést biztosító stratégia az alábbi tulajdonságokkal rendelkezne: 1. A stratégia alkalmazásához szükséges genom manipuláció (transzgének integrációja, knock-out vagy knock-in allélek létrehozása) más endogén genetikai elemek működését nem befolyásolja és kóros fenotípust nem okoz. 2. Az induktor anyag oralisan adagolható, az állat valamennyi szervébe jól penetrál, normálisan a szervezetben nincsen jelen, ugyanakkor nem toxikus vagy teratogén, és önmaga nem befolyásolja a szervezet génjeinek működését. 3. Induktor hiányában génexpresszió egyáltalán nem figyelhető meg, az induktor jelenléte esetén a génműködés gyorsan bekapcsol. 4. Induktor jelenléte esetén is csak a kívánt szervekben illetve szövetekben kapcsolódik be a szabályozni kívánt gén, máshol (pl. zigótában, korai stádiumú embriókban, fejlődő ivarsejtekben) minimális génműködés sem figyelhető meg. 5.2.2 A Rosa26-rtTA stratégia alkamazhatóságának elemzése
Az alábbiakban az általunk alkalmazott stratégiát a fenti szempontoknak megfelelően elemezzük. 5.2.2.1 A genom manipuláció és az induktor hatása
84
A minden sejtben aktív Rosa26 génről két különböző mRNS molekula képződik alternatív splicing-gal. Ezekkel átfedést mutat egy antisense transzkript, amelynek promotere ismeretlen. Az mRNS molekulákban „open reading frame“ nem található, azokról fehérje nem képződik (96). Jelenleg nincsen tudomásunk olyan életfunkcióról, amelyben a Rosa26 gén jelentős szerepet játszik. A gén inaktiválása semmilyen fenotipikus változást nem okoz egérben (97). Egyedüli ismert szerepe, hogy a gén inaktiválása befolyásolja az Apc tumor szuppresszor gén működését (106). A Rosa26-rtTA knock-in egértörzsben a transzgéneket a gén 1. intronjába (az első és a második exon közé) építettük be, ez a sense irányú transzkripció diszrupciójához, vagyis gén knock-out-hoz vezet. A knock-in egerek vad típusú alomtársaiktól megkülönböztethetetlenek voltak, kóros fenotípust nem mutattak. Mitöbb, a törzs fenntartható volt homozigóta egyedek keresztezése révén, szükségtelenné téve így az utódok genotipizálását. A tetraciklin antibiotikum mikroorgaznizmusokból származik, a doxiciklin szemiszintetikus analóg. Tetraciklin-szerű endogén vegyületek emlősökben nem találhatók. Az embrionális tetraciklin expozíció emberben fogfejlődési zavarokat és a csontok elszíneződését okozhatja, egyéb teratogén hatása nagy dózisban sincsen (107). A tetraciklinnel indukálható transzgénes egértörzsek létrehozásakor kiterjedten vizsgálták a különböző tetraciklin dózisok hatását az egerekre. Az általunk alkalmazott koncentráció (1 mg/ml az állatok ivóvízében) nem befolyásolja az állatok életműködéseit (54). 5.2.2.2 Alacsony háttéraktívitás és gyorsan indukálható génexpresszió
A tetraciklinnel indukálható transzgének fő problémája sok esetben, hogy a tetraciklin-reszponzív minimális promoterről induktor hiányában is képződik valamennyi mRNS. Különösen akkor nagy ennek az esélye, ha az rtTA expresszióját erős promoter irányítja. A nagy koncentrációban jelen levő rtTA protein induktor hiányában is kötődhet a TRE-hez, aminek eredménye nemkívánatos transzgén expresszió. A Rosa26 promoter az egér valamennyi szövetében bekapcsolt állapotban van, a termelődő mRNS mennyisége azonban nem excessziv. Ez alapján feltételeztük, hogy a háttéraktivitás alacsony lesz. Az in vitro vizsgálataink során észlelt zöld fluoreszcencia 85
intenzitása jóval kisebb, mint az erős promotereket tartalmazó eGFP sejtvonalaké, pl. a pCAGGS-eGFP sejtvonalé (Bélteki, nem publikált adat). A tetO-lacZ kazettát tartalmazó plazmid transzfekciója után csak abban az esetben észleltünk X-gal pozitivitást, ha a tápmédiumhoz doxiciklint adtunk. A hipotézis in vivo tesztelésére egy olyan gént választottunk, melynek „dózisérzékenyesége“ bizonyított. A VEGF-A hiánya egérben már heterozigóta formában is letális, és a gén túltermelődése is kóros fenotípushoz és embrionális letalitáshoz vezet. Megfigyeléseink szerint a háromszorosan transzgénes (pCAGGS-Cre, Rosa26-rtTA, tetO-VEGF-A) doxiciklin hiányában nem mutattak kóros fenotípust, vagyis az alacsony háttéraktívitás in vivo is igazolt. A gyors indukálhatóság előfeltétel akkor, ha embriológiai vizsgálatokat akarunk folytani, az egér rövid vemhessége (20 nap) miatt. Másfél nappal a megtermékenyítés után kezdve a doxiciklin adagolást, az embrionális élet 9-10. napján már kiterjedt patológai eltéréseket tapasztaltunk. Kifejlett állatnak adagolva a tetraciklint, 5 nap után valamennyi egyed elpusztult vagy súlyosan beteg volt. Ezek az adatok a rendszer gyors indukálhatóságát támasztják alá. 5.2.2.3 A szövetspecificitás biztosítása
A szigorúan szövetspecifikus génexpresszió elengedhetetlen kívánalom a kondicionális rendszerek esetén. A nemkívánatos génexpresszió zavaró fenotípusok megjelenéséhez vezet, ami megnehezítheti az eredmények értékelését. Az embrionális élet során a kóros fenotípus letalitást okozhat, és ez esetben a későbbi életszakaszok nem tanulmányozhatók. A Cre rekombináz esetében gyakori probléma a promoter aktiválódása az embrionális fejlődés kezdeti szakaszában illetve az anyai eredetű Cre enzimaktívitás a zigótában. Mivel a Cre genetikai változást (pl. deléció) idéz elő, az és a következményes génaktiváció (vagy inaktiváció) valamennyi utódsejtben megtalálható. Kísérleteink során első lépésként promoter-Cre, tetO-VEGF-A-164 kettős transzgénes egyedeket hoztunk létre. Ezekben az állatokban nem találhatók loxP helyek, vagyis nemkívánatos Cre hatástól nem kell tartani. Ezt követően a kettős transzgénes nőstényeket kereszteztük homozigóta Rosa26-rtTA hímekkel. Néhány esetben észleltünk nemkívánatos Cre aktívitást olyan egyedekben, amelyek a Cre transzgént nem is 86
tartalmazták (l. IV. táblázat). Ezekben az esetben feltehetőleg anyai eredetű Cre fehérje jelenléte okozta a deléciót a megtermékenyített petesejtben. Ezek az embriók egyértelműen azonosíthatók univerzális zöld fluoreszcenciájuk révén és ezért kísérleteinket nem zavarják. 5.2.3 A VEGF-A overexpressziójának következményei egérben
A VEGF-A dózis emelkedésének következményeit többen tanulmányozták. Miquerol
és
munkatársai
hypermorph VEGF-A
allélt hoztak
létre
knock-in
technológiával; a mutáns egyedeknél szívfejlődési rendellenességeket és embrionális letalitást észleltek (100). A VEGF-A szövetspecifikus overexpressziója a fejlődő tüdő alveolusaiban újszülöttkori tüdővérzésekhez és alveolaris elváltozásokhoz vezetett (108), a proximális légutakra korlátozódó overexpresszió pedig bronchus fejlődési zavarokat okoz (109). Ohm és munkatársai VEGF-A szisztémás adagolásával a thymus atrophiáját idézték elő egerekben (110). Mi hasonló szövettani eltéréseket észleltünk VEGF-A posztnatalis overexpressziója esetén. Wong és munkatársai VEGF-A-t szekretáló tumorsejteket ültettek be egerek bőre alá és jellegzetes paraneoplasztikus szindróma kialakulásáról számoltak be (102). Hasonló, a peliosis hepatis-ra emlékeztető szövettani eltéréseket észleltünk mi is a VEGF-A géndózis növekedése esetén. Mi lehet az oka, hogy különböző kutatók különböző elváltozásokat észleltek a VEGF-A géndózisának növekedése esetén? A vizsgálatok különböznek a VEGF-A overexpressziójának módja (transzgén, knock-in, szekretáló tumorsejt, szisztémásan adagolt VEGF-A fehérje), az overexpresszió helye (generalizált, tüdő) és az alkalmazás ideje (embrionális illetve posztnatális) tekintetetében. Ezek a különbségek erősen eltérő szinteket eredményezhetnek a különböző szervekben-szövetekben, és különböző fenotípusokhoz vezetnek. Befolyásolhatja az észlelt fenotípust a vizsgáló érdeklődése is, mert az annak megfelelő szervek elváltozásait nagyobb mélységben és szakértelemmel vizsgálhatta. A VEGF-A embrionális életben történő overexpressziója esetén a szikzacskói vérképzés zavarát észleltük. Miquerol és munkatársai szívfejlődési rendellenességekről számolt be emelt VEGF géndózis esetén (100). E látszólagos ellentmondás feloldása valószínűleg a tényleges géndózis különbségében keresendő. Másik különbség a két 87
munka között, hogy Miquerol kísérletei során valamennyi VEGF-A izoforma dózisa megnövekedett,
míg
esetünkben
csak
a
164
kDa
molekulasúlyú
változat
overexpressziójára került sor. A VEGF-A posztnatalis overexpressziója esetében a thymusban és a májban azonosítottunk specifikus patológiai eltéréseket, amelyekről mások is beszámoltak (102). Fontos azonban kiemelni, hogy a VEGF-A szisztémás overexpressziója egyéb kóros elváltozásokhoz is vezethet, amelyeket mi nem észleltünk. Ennek egyik oka, hogy mikroszkópos vizsgálatokat azokra a szövetekre korlátoztuk, amelyek a boncolás során makroszkópos eltérést mutattak, nem történt meg valemennyi szerv szisztematikus vizsgálata. A másik problémát a tetO-VEGF-A-164 ismeretlen genomiális környezete képezi. E transzgén random módon épült be az egér genomjába, genetikai környezete nem ismert. Elképzelhető, hogy a transzgén közelében lévő endogén génszabályozó elemek az génexpresszió fokát jelentősen és szövetspecifikusan befolyásolják. 5.2.4 A stratégia korlátai és továbbfejlesztési lehetőségei
A tetraciklin inducibilis transzgének alkalmazását általában két tényező korlátozza: 1. Bázisaktivitás induktor hiányában is. Ez különösen akkor képez problémát, ha az rtTA transzgént erős promoter előzi meg. A Rosa26 promoterről kifejeződő rtTA esetén nem észleltünk jelentős transzgén aktivitást doxiciklin hiányában. 2. A tetraciklin reszponzív transzgén genomiális környezete befolyásolhatja annak expresszióját (l. előző szakasz). E tényező kiiktatása úgy lehetséges, ha a transzgént a genom ismert helyére építjük be célzottan. Ez történhet helyspecifikus rekombinációval, például a φC31 integráz alkalmazásával, és történhet knock-in technológiával, ahogyan a Rosa26-rtTA allélt is létrehoztuk. A Rosa26 allél közel neutrális genetikai környezetet biztosít, és megfelelő helynek tűnik a tetraciklin-reszponzív transzgének számára.
88
6. Következtetések 6.1 φC31 integráz projekt
A kísérletsorozatban egy helyspecifikus rekombináz, a φC31 integráz alkalmazási lehetőségeit vizsgáltuk egér embrionális őssejtekben. Eredményeinket a következők foglalhatjuk össze: 1. A φC31 integráz működőképes ES sejtekben, és hatékonyan végzi transzgének helyspecifikus integrációját a genom meghatározott helyére pozitív szelekció alkalmazása esetén. 2. A φC31 integráz expressziója ES sejtekben nem befolyásolja azok életképességét és fejlődési potenciálját. 3. A φC31 nem képes megfelelő hatékonyságú helyspecifikus integráció katalízisére nem szelektív körülmények között.
89
6.2 Reverz tetraciklin transzaktivátor projekt
Gén targetinggel létrehoztunk egy knock-in allélt az egér Rosa26 lókuszán, amely Cre rekombináció után az rtTA és az eGFP transzgéneket expresszálja. Transzgénes rendszerünket jellemeztük in vitro és in vivo. Eredményeinket a következőképpen foglalhatjuk össze: 1. A Rosa26-rtTA allél jelenléte kóros fenotípust még homozigóta formában sem okoz. 2. Doxiciklin hiányában a tetraciklin reszponzív (tetO, TRE) transzgének
expressziója
elhanyagolható, in vitro (ES sejtek) és in vivo (transzgénes
egerek) egyaránt. 3. Doxiciklin
indukció
esetén
a
tetraciklin
reszponzív
transzgének
bekapcsolódnak. A VEGF-A regulatív overexpressziója az embrionális életben és posztnatálisan jellegzetes patológiai eltérések megjelenéséhez vezet. 4. A Rosa26-rtTA allél jól alkalmazható lehet génfunkciós vizsgálatokra,
amennyiben valamely gén dózisváltozásának következményeit térben és időben szabályozott módon kívánjuk tanulmányozni.
90
7. Köszönetnyilvánítás
Köszönetemet szeretném kifejezni Dr Nagy Andrásnak (Samuel Lunenfeld Kutatóintézet, Toronto, Kanada) szakmai irányításáért és hogy lehetővé tette számomra laborjában a dolgozat alapjául szolgáló munka elvégzését. Köszönettel tartozom a Nagy labor valamennyi munkatársának, de különösképpen Dr Jody Haigh-nek és Dr Louis Lefebvre-nek a munka során adott ötletekért. A Rosa26rtTA egerek fenotípusát Dr Jody Haigh jellemezte. Dr Karen Sison végezte a podocytaspecifikus VEGF-A overexpresszióval kapcsolatos vizsgálatokat. Feleségem, Dr Kabács Nikolett, felbecsülhetetlen támogatást és technikai segítséget nyújtott. Köszönet illeti a Samuel Lunenfeld Kutatóintézet transzgénes laboratóriumának munkatársait, különösképpen Sandra Tondat és Sarang Kulkarni technikusokat az embrió aggregációk elvégzéséért, és Marina Gertsensteint a pronukleáris injekciók elvégzéséért. David Ow bocsátotta rendelkezésünkre a φC31 integráz kódoló szekvenciáját tartalmazó plazmidot. Az IRESpurobpA szekvenciát a pCAAGSFlpeIRESpuro vektorból nyertük ki, ami Francis Stewart ajándéka volt. A pBigT és a pROSA26-PA plazmidokért Dr Frank Costantininek tartozunk köszönettel. A pSPC-rtTA plazmidot és a tetO-VEGF-A-164 egértörzset Dr Jeffrey Whittsett labortatóriuma bocsátotta rendelkezésünkre. A pBI-3 vektor Dr Hermann Bujard ajándéka volt. Végül,
de
nem
utolsósorban
szeretnék
köszönetet
mondani
Ph.D.
témavezetőmnek, Falus András Professzor Úrnak, aki munkámat és a dolgozat megírását mindvégig támogatta és segítette.
91
8. Irodalomjegyzék
1. Lander, E.S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001). 2. Venter, J.C. et al. The sequence of the human genome. Science. 291, 1304-1351 (2001). 3. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931-45 (2004). 4. Adams, M.D. et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000). 5. The C. elegans Sequencing Consortium: Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998). 6. Mouse Genome Sequencing Consortium: Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002). 7. Cole, S.T. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature. 393, 537-544 (1998). 8. Nadeau, J.H. et al. Sequence interpretation. Functional annotation of mouse genome sequences. Science. 291, 1251-1255 (2001). 9. Hardouin, S. & Nagy, A. Mouse models for human disease. Clin. Genet. 57, 237–244 (2000). 10. Evans, M.J. & Kaufman, M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981). 11. Martin, G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, 7634-7638 (1981). 12. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M.H. & Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984). 13. Hadjantonakis, A.K, Gertsenstein, M., Ikawab, M., Okabe, M. & Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mech. Dev. 76 79–90 (1998). 14. Hadjantonakis, A.K., Dickinson, M.E., Fraser, S.E. & Papaioannou, V.E. Technicolour transgenics: imaging tools for functional genomics in the mouse. Nat. Rev. Genet. 4, 13-25 (2003). 92
15. Capecchi, M.R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989). 16. Müller, U. Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vector design to phenotype analysis. Mech. Dev. 82, 2-21 (1999). 17. Pham,.C.T.N, MacIvor, D. M, Hug, B.A, Heusel, B.W. & Ley, T.J. Long-range disruption of gene expression by a selectable marker cassette Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 13090-13095 (1996). 18. Miquerol, L., Gertsenstein, M., Harpal, K., Rossant, J. & Nagy, A. Multiple Developmental Roles of VEGF Suggested by a LacZ-Tagged Allele. Dev. Biol. 212, 307–322 (1999). 19. Hrabe de Angelis, M.H. et al. Genome-wide, large-scale production of mutant mice by ENU mutagenesis. Nat. Genet. 25, 444-447 (2000). 20. Nolan, P.M. et al. A systematic, genome-wide, phenotype-driven mutagenesis programme for gene function studies in the mouse. Nat. Genet. 25, 440-443 (2000). 21. Kile, B.T. et al. Functional genetic analysis of mouse chromosome 11. Nature. 425, 81-6 (2003). 22. Munroe, R.J. et al. Mouse mutants from chemically mutagenized embryonic stem cells. Nat. Genet. 24, 318-321 (2000). 23. Gossler, A., Joyner, A.L., Rossant, J. & Skarnes, W.C. Mouse embryonic stem cells and reporter constructs to detect developmentally regulated genes. Science. 244, 463-465 (1989). 24. Skarnes, W.C., Auerbach, B.A. & Joyner A. A gene trap approach in mouse embryonic stem cells: the lacZ reported is activated by splicing, reflects endogenous gene expression, and is mutagenic in mice. Genes Dev. 6, 903-918 (1992). 25. Skarnes, W.C. et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat. Genet. 36, 543-4 (2004). 26. Hansen, J. et al. A large-scale, gene-driven mutagenesis approach for the functional analysis of the mouse genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9918-22 (2003) 27. Zambrowicz, B.P. et al. Wnk1 kinase deficiency lowers blood pressure in mice: a gene-trap screen to identify potential targets for therapeutic intervention. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 14109-14 (2003). 28. Schnutgen, F. et al. Genomewide production of multipurpose alleles for the functional analysis of the mouse genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 7221-6 (2005). 93
29. Cobellis, G. et al. Tagging genes with cassette-exchange sites. Nucleic Acids Res. 33, e44 (2005). 30. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E. & Mello, C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998). 31. Kamath, R.S. et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003). 32. Paddison, P.J. et al. A resource for large-scale RNA-interference-based screens in mammals. Nature. 428, 427-431 (2004). 33. Berns, K et al. A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of the p53 pathway. Nature. 428, 431-437 (2004). 34. Kunath T., Gish, G., Lickert, H., Jones, H., Pawson, T. & Rossant, J. Transgenic RNA interference in ES cell–derived embryos recapitulates a genetic null phenotype. Nat. Biotech. 21, 559-561 (2003). 35. Lickert, H., Cox, B., Wehrle, C., Taketo, M.M., Kemler, R. & Rossant J. Dissecting Wnt/beta-catenin signaling during gastrulation using RNA interference in mouse embryos. Development. 132, 2599-2609 (2005). 36. Lewandowski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat. Rev. Genet. 2, 743-755 (2001). 37. Orban, P.C., Chui, D. & Marth, J.D. Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6861-6865 (1992). 38. Lakso M. et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-6236 (1992). 39. Dymeczki, S.M. Flp recombinase promotes site-specific recombination in embryonic stem cells and transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6191-6196 (1998). 40. Rodriguez, C.I. et al. High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre- loxP. Nat. Genet. 25, 139-140. (2000). 41. Nagy, A. Cre Recombinase: The Universal Reagent for Genome Tailoring. Genesis 26, 99-109 (2000). 42. Hardouin, N. & Nagy, A. Gene-Trap-Based Target Site for Cre-Mediated Transgenic Insertion. Genesis 26, 245-252 (2000). 43. Wutz, A., Rasmussen, T.P. & Jaenisch R. Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains of Xist RNA. Nat. Genet. 30, 167-174 (2002). 94
44. Gertsenstein, M., Lobe, C. & Nagy, A. ES cell mediated conditional transgenesis. In Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols. (ed. Turksen, K.) Methods in Molecular Biology 185, 285-307 (2002). 45. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M. & Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science 269, 1427-1429 (1995). 46. Zhang, Y., Riesterer, C., Ayrall, A.M., Sablitzky, F., Littlewood, T.D. & Reth M. Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 24, 543-548 (1996). 47. Lobe, C.G., Koop, K.E., Kreppner, W., Lomeli, H., Gertsenstein, M. & Nagy, A. Z/AP, a Double Reporter for Cre-Mediated Recombination. Dev. Biol. 208, 281–292 (1999). 48 Lallemand, Y., Luria, V., Haffner-Krausz, R. & Lonai, P. Maternally expressed PGKCre transgene as a tool for early and uniform activation of the Cre site-specific recombinase. Transgenic Res., 7, 105–112. (1998) 49 Zhang, Y., Riesterer, C., Ayrall, A.M., Sablitzky, F., Littlewood, T.D. & Reth, M.: Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 24, 543-548 (1996). 50 Feil, R., Brocard, J., Mascrez, B., LeMeur, M., Metzger, D. & Chambon, P.: Ligandactivated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 1088710890 (1996). 51: Nagy A. & Mar, L. Creation and use of a Cre recombinase transgenic database. Methods Mol. Biol. 158, 95-106 (2001). 52. Gossen, M. & Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 5547-5551 (1992). 53. Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. & Bujard, H.: Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995). 54. Zhu, Z., Zheng, T., Lee, C.G., Homer, R.J. & Elias, J.A.: Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling. Semin Cell Dev Biol. 13, 121-8 (2002). 55. Urlinger, S. et al.: Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transactivators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97: 7963-7968 56. Weber, W. et al. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice Nature Biotech. 20, 901-907 (2002) 95
57. Cronin, A., Gluba, W. & Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes Dev. 15, 1506-1517 (2001) 58. Weber, W et al. Gas-inducible transgene expression in mammalian cells and mice Nature Biotech. 22, 1440-1444 (2004). 59. Schonig, K., Schwenk, F., Rajewsky, K. & Bujard, H.: Stringent doxycycline dependent control of CRE recombinase in vivo. Nucleic Acids Res. 30, e134, 2002. 60. Koch, K.S. et al. Site-specific integration of targeted DNA into animal cell genomes. Gene 249, 135-144 (2000). 61. Lee, G. & Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cremediated recombination. Gene 216, 55-65 (1998). 62. Bouhassira, E.E., Westerman, K. & Leboulch, P. Transcriptional behavior of LCR enhancer elements integrated at the same chromosomal locus by recombinase-mediated cassette exchange. Blood. 90, 3332-3344 (1997). 63. Araki, K., Araki, M. & Yamamura, K. Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 25, 868-872 (1997). 64. Schlake, T. & Bode, J. Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry. 43, 1274612751 (1994). 65. Lauth, M., Spreafico, F., Detleffsen, K.& Meyer, M. Stable and efficient cassette exchange under non-selectable conditions by combined use of two site-specific recombinases. Nucleic Acids Res. 30, e115-e121 (2002). 66. Seibler, J., Schubeler, D., Fiering, S., Groudine, M. & Bode, J. DNA cassette exchange in ES cells mediated by Flp recombinase: an efficient strategy for repeated modification of tagged loci by marker- free constructs. Biochemistry 37, 6229-6234. (1998). 67. Kolb, A.F. Selection-marker-free modification of the murine beta-casein gene using a lox2272 site. Anal Biochem 290, 260-271. (2001). 68. Smith, M.C.M, Burns, R.N., Wilson, S.E & Gregory, M.A The complete genome sequence of the Streptomyces temperate phage φC31: evolutionary relationships to other viruses. Nucleic Acids Res. 27, 2145-2155 (1999). 69. Thorpe, H.M. & Smith M.C.M. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505-5510 (1998).
96
70. Thorpe, H.M., Wilson S.E. & Smith, M.C.M. Control of directionality in the sitespecific recombination system of the Streptomyces phage φC31. Mol. Microbiol. 38, 23241 (2000). 71. Groth, A.C., Olivares, E.C., Thyagarajan, B. & Calos, M.P. A phage integrase directs efficient site-specific integration is human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 59956000 (2000). 72. Thomason, L.C., Calendar, R. & Ow, D.W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage phiC31 sitespecific recombination system. Mol. Genet. Genomics. 265, 1031-1038 (2001). 73. Thyagarajan, B., Olivares, E.C., Hollis, R.P, Ginsburg, D.S & Calos, M.P. Sitespecific genomic integration in mammalian Cells by phage phiC31 integrase. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934 (2001). 74. Sclimenti, C.R., Thyagarajan, B. & Calos, M.P. Directed evolution of a recombinase for improved genomic integration at a native human sequence. Nucleic Acids Res. 29, 5044-5051 (2001). 75. Andreas, S., Swenk, F., Küter-Luks, B., Faust, N. & Kühn, R. Enhanced efficiency through nuclear localization signal fusion on phage φC31-integrase: activity comparison with Cre and FLPe recombinase in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 30, 2299-2306. (2002). 76. Ortiz-Urda, S., Thyagarajan, B., Keene, D.R., Lin, Q., Fang, M., Calos, M.P. & Khavari, P.A. Stable nonviral genetic correction of inherited human skin disease. Nat. Med. 8: 1166-1170 (2002). 77. Olivares, E.C., Hollis R.P., Chalberg, T.W., Meuse, L., Kay, M.A & Calos, M.P. Sitespecific genomic integration produces therapeutic Factor IX levels in mice. Nat. Biotech. 20,1124-1128 (2002). 78. Chalberg, T.W., Genise, H.L., Vollrath, D. & Calos, M.P. PhiC31 integrase confers genomic integration and long-term transgene expression in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 2140-2146 (2005). 79. Ginsburg, D.S. & Calos, M.P. Site-specific integration with phiC31 integrase for prolonged expression of therapeutic genes. Adv. Genet. 54, 179-187 (2005) 80. Schmidt, E.E., Taylor, D.S., Prigge, J.R., Barnett, S. & Capecchi, M.R. Illegitimate Cre-dependent chromosome rearrangements in transgenic mouse spermatids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13702-13707 (2000). 81. Kozak, M. Interpreting cDNA sequences: some insights from studies on translation. Mammalian Genome 7, 563-574 (1996).
97
82. Buchholz, F., Angrand, P.O. & Stewart, A.F. Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat. Biotech. 16, 657-620 (1998). 83. Jang, S. K., Davies M.V., Kaufman, R.J. & Wimmer, E. Initiation of protein synthesis by internal entry of ribosomes into the 5’ nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA in vivo. J. Virol. 63,1651-60 (1989). 84. Tucker, K.L. et al. Germ-line passage is required for establishment of methylation and expression patterns of imprinted but not of nonimprinted genes. Genes Dev. 10, 1008-1020 (1996). 85. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W. & Prasher, D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802–805 (1994). 86. Cormack, B.P., Valdivia, R.H. & Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene 173, 33–38 (1996). 87. Nagai, T., Ibata, K., Park, E.S., Kubota, M., Mikoshiba, K. & Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotech. 20, 87-90 (2002). 88. Friedrich, G. & Soriano, P. Promoter traps in embryonic stem cells: a genetic screen to identify and mutate developmental genes in mice. Genes Dev. 5, 1513–1523 (1991). 89. Tichelaar, J.W., Lu, W. & Whitsett, J.A. Conditional expression of fibroblast growth factor-7 in the developing and mature lung. J. Biol. Chem. 275, 11858-11864 (2000). 90. Srinivas, S et al: Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the Rosa26 locus. BMC Developmental Biology, 1, 4 (2001) 91. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W. & Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8424-8428 (1993). 92. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K. & Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003). 93 Ramirez-Solis, R., Rivera-Perez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal. Biochem. 201, 331335 (1992). 94. Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molecular cloning. A laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 95. Nagy, A. & Rossant, J. Production and analysis of ES cell aggregation chimaeras. In Gene targeting: a practical approach. (ed. Joyner, A.L.), 177-206. Oxford University Press, New York NY, 2000). 98
96. Zambrowicz, B.P., Imamoto, A., Fiering, S., Herzenberg, L.A., Kerr, W.G. & Soriano, P. Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expression of beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 3789-3794 (1997). 97. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet., 21, 70–71 (1999). 98. Carmeliet, P. et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature. 380, 435–439 (1996). 99. Ferrara, N. et al. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature. 380, 439–442 (1996). 100. Miquerol, L., Langille, B.L. & Nagy, A. Embryonic development is disrupted by modest increases in vascular endothelial growth factor gene expression. Development. 127, 3941–3946 (2000). 101. Tronche, F. et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nat. Genet. 23, 99–103 (1999). 102. Wong, A. K. et al. Excessive tumor-elaborated VEGF and its neutralization define a lethal paraneoplastic syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7481–7486. (2001) 103. Reddy, S., DeGregori, J.V., von Melchner, H. & Ruley, H.E. Retrovirus promotertrap vector to induce lacZ gene fusions in mammalian cells. J Virol 65, 1507-1515. (1991). 104. Lauth, M., Moerl, K., Barski, J.J. & Meyer, M. Characterization of Cre-mediated cassette exchange after plasmid microinjection in fertilized mouse oocytes. Genesis. 27, 153-158 (2000). 105. Mills, A.A. Changing colors in mice: an inducible system that delivers. Genes and Dev. 15, 1461-1467 (2001) 106. Kohlhepp, R.L., Hegge, L.F. & Moser, A.R. The ROSA26 LacZ-neo(R) insertion confers resistance to mammary tumors in Apc(Min/+) mice. Mamm Genome. 12, 606611 (2001). 107. Heinonen, O.P., Slone, D. & Shapiro, S. (eds.) Birth Defects and Drugs in Pregnancy. Littleton Publishing Sciences Group, 1977 108. Le Cras, T.D., Spitzmiller, R.E., Albertine, K.H., Greenberg, J.M., Whitsett, J.A., & Akeson, A.L. VEGF causes pulmonary hemorrhage, hemosiderosis and air space enlargement in neonatal mice Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287, L134 –L142 (2004). 99
109. Akeson A.L., Cameron, J.E., Le Cras, T.D, Whittsett, J.A. & Greenberg J.M. Vascular Endothelial Growth Factor-A Induces Prenatal Neovascularization and Alters Bronchial Development in Mice. Pediatr. Res. 57, 82–88 (2005). 110. Ohm, J.E. et al. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumorinduced immune suppression. Blood, 101, 4878–4886 (2003).
100
9. Saját közlemények jegyzéke A dolgozat témájához kapcsolódó közlemények:
Belteki G., Gertstenstein M, Ow D., Nagy A.: Site-specific cassette exchange and germline transmission with mouse ES cells expressing PhiC31 integrase. Nature IF: 17,721 (2003) Biotechnology, 21(3), 321– 324, 2003 Belteki G, Haigh J, Kabacs N, Haigh K, Sison K, Costantini F, Whitsett J, Quaggin S, Nagy A: Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research 33(5), e51, 2005 IF: 7,260 (2004) Egyéb közlemények: Nemzetközi folyóiratok:
Korets-Smith E., Lindemann L., Tucker K.L., Jiang C., Kabacs N., Belteki G., Haigh J., Gertsenstein M., Nagy A.: Cre recombinase specificity defined by the tau locus. Genesis, 40(3), 131-138, 2004, IF: 2,93 (2003) Magyar folyóiratok:
Bélteki G, Pataki M., Csanády K.: Kollodium baby phenotypusában megjelenő lamellaris ichthyosis újszülöttkori esete. Gyermekgyógyászat. 49, 352-357, 1998. Bélteki G., és mtsai.: A benignus familiaris újszülöttkori görcsök (BFNC) genetikája Pediáter, 1999. (VIII. Évfolyam) 1. Szám Tankönyv fejezetek:
Bélteki G: Orvosi genetika témakör. In: Rövidítések az orvosi gyakorlatban. Melania Kiadó, Budapest, 1996., 1999. Kálmánchey és Bélteki: Chromosoma rendellenességek és dysmorphiás syndromák. In: Kálmánchey (szerk.): Gyermekneurologia. Medicina, Budapest, 2000. Bélteki: Veleszületett rendellenességek. In: Fekete (szerk.): Gyermekgyógyászati tabularium. Melania, Budapest, 2001
101
10. Összefoglaló
Az emberi gének működéséről sokat tudhatunk meg az egér homológ génjeinek tanulmányozása révén. Az egér embrionális sejtek (ES sejtek) genetikai manipulációja lehetővé teszi, hogy a gén dózisát megváltoztassuk, és annak következményeit in vivo tanulmányozzuk. A gén inaktiválása (knock-out) és overexpressziója egyaránt kóros fenotípusokhoz vezethet, és ezek jellege tudósíthat a gén szerepéről normális körülmények között. A génműködés pontos megértéséhez azonban rendszerint számos különböző allél létrehozása valamint térben és időben szabályozható génexpresszió szükséges. Munkám során olyan új módszereket kerestem, melyek a génműködés in vivo tanulmányozását egyszerűbbé tehetik. Tanulmányoztam a
φC31
integráz
alkalmazhatóságát
egér
embrionális
őssejtekben. E helyspecifikus rekombinázt korábban nem használták az egér genom manipulációjára. Bizonyítottam, hogy az integráz működőképes egér ES sejtekben, és aktívitásához nem szükséges kofaktor jelenléte. Transzgének helyspecifikus genomiális integrációja lehetséges megfelelő szelekciós stratégia alkalmazásával. Végezetül, a φC31 integráz expressziója nem befolyásolja az ES sejtek életképességét és fejlődési potenciálját. Ezek alapján a φC31 integráz a transzgénes egér technológia hasznos eszközévé válhat. Munkám másik része egy olyan stratégia kidolgozására irányult, mely lehetővé teszi transzgének szövetspecifikus és indukálható overexpresszióját ES sejtekben és transzgénes egérben. Kombináltam a Cre rekombináz szövetspecificitását a tetraciklin reszponzív rendszerek indikálhatóságával. Létrehoztam egy transzgénes egértörzset, amelyben Cre közvetítette rekombináció után a reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA) és az zöld fluoreszcens fehérje (eGFP) gének fejeződnek ki. A génexpresszió a minden sejtben aktív Rosa26 promoterről történik. A mutáns allél jelenléte az egerekben kóros fenotípust nem okoz. A stratégia alkalmazhatóságát háromszorosan transzgénes állatokban teszteltük, amelyek a vaszkuláris endotheliális növekedési faktort (VEGF-A) különböző szerveikben overexpresszálják génindukció esetén. Indukció nélkül a háromszorosan transzgénes állatok normálisak voltak, indukció hatására jellegzetes szöveti fenotípusok jelentek meg. Stratégiánk tehát jól szabályozható génexpressziót tesz lehetővé. 102
11. Summary Novel methods in trangenic mouse technology
Understanding human gene function can be facilitated by studying orthologous mouse genes. Genetic manipulation of mouse embryonic stem (ES) cells enables us to change gene dosage and study the consequences in vivo. Both inactivation (knock-out) and overexpression of a gene can lead to aberrant phenotypes and the nature of these can provide clues about the gene’s function under normal circumstances. However, understanding gene function in great detail will require the generation of numerous alleles as well as spatially and temporally regulatable overexpression. In my work I searched for novel methods which can simplify in vivo gene studies. I studied the utility of the φC31 integrase in mouse embryonic stem cells. This site-specific recombinase had not been used for manipulation of the mouse genome previously. I showed that the integrase is operational in mouse ES cells without any additional cofactor. Site-specific genomic integration of transgenes is possible when a suitable selection strategy is applied. Finally, expression of the φC31 integrase does not affect the viability and developmental potential of ES cells. These properties could turn the φC31 integrase into a useful tool in transgenic mouse technology. My other aim was to develop a strategy for tissue-specific and inducible overexpression in ES cells and transgenic mice. I combined the tissue-specificity of the Cre recombinase with the inducibility of the tetracycline-responsive systems. I generated a transgenic mouse strain that expresses the reverse tetracycline transactivator (rtTA) and the enhanced green fluorescent protein (eGFP) genes after Cre-mediated recombination. Gene expression is driven by the ubiquitous Rosa26 promoter. Presence of the mutant allele did not cause any phenotypic abnormality in mice. The utility of the strategy was tested in triple transgenic mice that overexpressed the vascular endothelial growth factor (VEGF-A) following gene induction. Without induction the triple transgenic animals were normal and the induction resulted in characteristic histologic abnormalities and lethality. In conclusion, tight control of gene expression is possible with our strategy.
103
12. Ábrák és táblázatok jegyzéke
A. Ábrák: 1. ES sejtek és alkalmazásuk A. ES sejtek izolálása, módosítása, transzgénes egér létrehozása B. ES sejtek és diploid egérembrió aggregációjából származó kiméra 2. Knock-out allél létrehozása homológ rekombinációval 3. Géncsapda mutagenezis ES sejtekben 4. A helyspecifikus rekombinázok jellemzői A. loxP és FRT felismerési helyek B. A létrehozható genetikai átrendeződések 5. Kondicionális genetikai változások létrehozása egérben A. Kondicionális knock-out B. Transzgén szövetspecifikus overexpressziója egérben 6. Tetraciklin-inducibilis rendszerek A. Tetraciklin transzaktivátor (tTA, tet-off) rendszer B. Reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA, tet-on) rendszer 7. Genomiális integráció ES sejtekben A. Pop-in integráció B. Rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) 8. A φC31 integráz felismerési helyei 9. A munka során használt néhány plazmid. A. pPGK-PP-φC31IP B. pBBneo C. pBigT-rtTA-IRES-EGFP D. pROSA26-rtTA 10. Genomiális dokkoló helyek Southern elemzése A. φC31 szonda B. Pgk-1 szonda 11. φC31 integráz mediálta inszerció és kazettacsere 12. A helyspecifikus integráció lehetséges módjai A. A lehetséges rekombinációs mechanizmusok B. A rekombinációs termékek elkülönítése Southern hibridizációval C. A beépült kópiák számának vizsgálata 13. A helyspecifikus rekombináció PCR és szekvencia analízise 14. A dokkoló hely kimutatása a transzgénes egerek genom DNS-ében 15. Knock-in allél létrehozása a Rosa26 lókuszon 16. A doxiciklinnel indukálhatóság tesztelése in vitro 17. Rosa26-rtTA knock-in egértörzs keresztezési sémája 18. A VEGF-A-164 overexpressziója az embrionális életben 19. A VEGF-A-164 overexpressziója kifejlett egyedben 20. Géncsapda inszerciók másodlagos módosítása a φC31 integráz alkalmazásával 21. Genomiális dokkoló helyek kialakítása és jellemzése a φC31 integráz alkalmazásával
104
B. Táblázatok: I. II. III. IV.
PCR és szekvenáló primerek A G418 rezisztens kolóniák száma a dokkoló helyek és az inszerciós plazmidok lehetséges kombinációi esetén A helyspecifikus integráció aránya különböző dokkoló helyek és plazmidok esetén A doxiciklin indukciós kisérletek összefoglalása
105
13. A dolgozatban használt rövidítések β-geo Bp bpA CMV DMEM DMSO DNS dpc DT-A E9.0 EDTA eGFP
ENU ES sejt FBS GFP IRES Kb kDa lacZ LIF mRNS neo pA PBS PCR Pgk-1 puro RFLP RMCE RNAi RNS rtTA SA TRE tTA tk X-gal
LacZ és neo fúziós gén bázispár Szarvasmarha növekedési hormon poliadenilációs jel Citomegalovirus Dulbecco-modifikálta Eagle-médium Dimetil-szulfoxid dezoxiribonukleinsav Postcoitalis nap (dies post soitum) Diphteria toxin A alegysége Az embrionális fejlődés 9. napja Etiléndiamin-tetraacetát Felerősített zöld fluoreszcens fehérje (enhanced green fluroescent protein) Etilnitrozurea Embrionális őssejt (embryonic stem cell) Foetalis marhaszérum (fetal bovine serum) Zöld fluoreszcens fehérje (green fluorescent protein) Belső riboszomális belépési hely (internal ribosome entry site) kilobázis kilodalton β-galaktozidáz Leukémia inhibitor faktor messenger RNS Neomycin foszfotranszferáz Poliadenilációs jel Foszfátpufferelt sóoldat (phosphate-buffered saline) Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) Foszfoglicerát kináz-1 Puromycin aciltranszferáz Restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus Rekombináz-mediált kazetta csere (recombinase-mediated cassette exchange) RNS interferencia ribonukleinsav Reverz tetraciklin transzaktivátor Splice akceptor Tetraciklin reszponzív elem Tetraciklin transzaktivátor Timidin kináz 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid
106
