Ciklinek, ciklinfüggő proteinkinázok Réz Gábor A sejtciklus motorjai és sebességváltói
Az élőlények növekedése, szaporodása, a szövetek állandó megújulása, sőt a vírusok sokasodása sem lehetséges a sejt örökítő anyagának megkettőzése és osztódása nélkül. A sejtosztódás, tehát az egyedek, következésképpen a földi élet fennmaradásának, terjedésének, és végső fokon evolúciójának is alapfeltétele. Az osztódó sejtpopulációban az anyasejt megkettőződését egy előkészítő szakasz követi, s csak ezután indul meg leánysejtjeik osztódása. Ez a periodikusan ismétlődő folyamat a sejtciklus. A sejtciklus regulációja a szervezet növekedés-szabályozásának sejtszintű alapja. A ciklusszabályozás hibái vagy a sejt pusztulását okozzák, vagy korlátlan növekedéshez, végső fokon rosszindulatú daganatos elfajuláshoz vezetnek. A 2001. évi Orvosi Nobel-díj kitüntetettjei a sejtciklus sejten belüli szabályozó molekuláinak, a ciklineknek és a ciklinfüggő kinázoknak, valamint működési mechanizmusuk felfedezéséért részesültek a legnagyobb tudományos elismerésben. A kinázok mennyisége a sejtciklus során állandó, aktivitásuk azonban a ciklinek által szabályozott módon változik. A Nobel-díj Bizottság által is alkalmazott népszerű hasonlat szerint a ciklinek és a tőlük függő kinázok együtt hajtják a sejtciklust fázisról fázisra. A ciklin-dependens kinázmolekulákat tekinthetjük a hajtóműnek, a ciklineket pedig a sebességváltónak, mely meghatározza, hogy a motor alapjáraton működjék-e, vagy inkább előre hajtsa a sejtet a ciklusban.
Az egy- vagy többsejtű élő szervezetek növekedése, fejlődése és szaporodása egyaránt a sejtek sokasodásán: növekedésén és osztódásán alapul. A magasabb rendű többsejtű szervezetekre jellemző az is, hogy sejtjeik folyamatosan cserélődnek; pusztulnak, és a tartaléksejtek osztódásából származó újakkal pótlódnak. A növényekben és a gerinces állatokban a tartaléksejtek sajátos struktúrákat alkotva csoportosulnak, úgynevezett osztódó (merisztematikus, kambiális, germinatív) szöveteket alkotnak, amelyek feladata egy-egy specifikus szövet növekedésének biztosítása, vagy pusztuló sejtjeinek pótlása. A tartaléksejtek osztódásának és növekedésének szabályozása kulcsfontosságú tényezője a szövetek, szervek normális növekedésének és differenciálódásának. Ebből a szempontból kényes, soktényezős
2 egyensúly uralkodik a normális növekedésű szövetben. Egy jó- vagy rosszindulatú daganat kifejlődéséhez elegendő, ha egyetlen testi sejtben történnek a sejtosztódást és –növekedést szabályozó specifikus génekben mutációk. Érthető tehát, hogy a molekuláris sejtbiológiai és a biomedicinális kutatások igen jelentős része miért foglalkozik a sejtosztódás és -növekedés megismerésével. A valódi sejtmagvas sejtek (eukarióták) osztódása sejtmagosztódásból mitózisból (M) és az azt követő kettéosztódásból áll. A gyakorlatban azonban a teljes sejtosztódást is szokás mitózisnak nevezni. Az osztódó sejtpopulációban a sejtek életciklusa születési folyamatukkal, vagyis az úgynevezett anyasejt mitózisával kezdődik. Ennek a mitotikus fázisnak a terméke a két leánysejt, amelyek osztódászkkor örökítő anyagukat szintén (kromoszómáik DNS és fehérjemolekuláit) megkettőzik. A két M-fázis között tehát időnek kell eltelnie: ez az interfázis. Osztódó sejtpopulációkban tehát a sejtek életciklusai, vagyis az M- és az interfázisok, tehát az ún. sejtciklusok követik egymást. Testi sejteknél a DNS-szintézis fázisa, az S-fázis nem kezdődhet meg közvetlenül az M-fázis után, mert a sejtnek előbb növekednie kell. A mitózis végétől a DNS-szintézisig szükséges időszakaszt G1-fázisnak nevezik. A mitózisból kilépett „új” sejt csak akkor lép be a G1-szakaszba, ha ezt a sejten kívüli szabályozó molekulák által közvetített jel (mitogén szignál), állati és emberi sejteknél az illető sejttípusra nézve specifikus növekedési faktor jelenléte kiváltja. Növekedési faktor hiányában a sejt nyugalmi, ún. G0-fázisba kerül: kilép a ciklusból. A növekedési faktorok a plazmamembrán (a sejtet határoló lipoprotein hártya) specifikus fehérjemolekuláin, a receptoraikon kötődnek meg. A receptorok viszik át a mitogén jelet a sejt belsejébe, ahol azután a jelközvetítő molekulák a sejtmagba továbbítják azt. A mitogén jel a sejtmagban a G1-fázisra jellemző géneket aktivál: megkezdődik a sejtciklus molekuláris folyamatait az S-fázis felé előreléptető és egyben a citoplazma növekedését serkentő fehérjék hírvívő-RNS molekuláinak, majd e fehérjék szintézise. Az ily módon kifejeződő fehérjék között rendszerint jelen van valamely újabb növekedési faktor receptora is, mely rövidesen megjelenik a sejtfelszínen, és ha a sejt környezetéből hozzájut specifikus növekedési faktoraihoz, akkor az előbbiekhez hasonló módon továbblépteti a sejtet a G1fázisba. A sejt végül is egy ponton elkötelezetté válik a DNS-szintézis megkezdésére: visszavonhatatlanul elkezdődik az S-fázist végrehajtó molekulák (pl. a DNS-polimeráz) szintézise. Ezt az elkötelezettségi pontot restrikciós pontnak (R-pont) nevezzük, tekintve, hogy ezt megelőzően a növekedési faktor(ok) megvonása a G1-fázis leállását és a sejt G0fázisba húzódását eredményezi. E folyamat után a növekedési faktor restrikció már hatástalan: a sejt a restrikciós pont átlépése után egy idő múlva mindenképpen S-fázisba lép.
3 Az S-fázis vége és az M-fázis kezdete között is beiktatódik egy előkészítő szakasz, a G2-fázis, melyre leginkább a sejtosztódást végrehajtó apparátus szintézise a jellemző. Ily módon tehát a teljes sejtciklus az M-->G1-->S-->G2-fázisok egymásutánjából épül fel (1. ábra). A G rövidítés az S- és M-fázis közötti megszakítások angolnyelvű kifejezéséből (’gap’) ered. Az elmondottakból nyilvánvaló, hogy a sejtciklus szabályozása külső mitogén tényezők függvénye, amelyek azonban egy sejten belüli, megszabott sorrendű lépésekből álló programot működtetnek a ciklizáló sejtekben. A növekedési faktorok sitmulálják a sejt felkészülését az S-fázisra. A restrikciós pont után a folyamatok már automatikusan követik egymást, és csak akkor állnak le, ha a folyamatokba hiba csúszik, vagy a sejtet külső eredetű sérülés (DNS-szintézis gátlás stb.) éri. A ciklus hibátlanságának, feltételei hiánytalanságának vizsgálata az ún. ellenőrzési pontokon (’check points’) történik. Maga az R-pont is közéjük tartozik: nem más, mint a G1-fázis végrehajtásának, tehát az S-fázis feltételeinek ellenőrzése és megkezdésének engedélyezése. Ellenőrzési pont felügyeli a DNS-szintézis (replikáció) hűségét, hibáit, és azt, hogy megtörtént-e a hibák javítása, valamint később azt is, hogy szabályosan épült-e fel a mitózis apparátusa, indulhat-e a magosztódás. A sejtciklus folyamatainak sorbakapcsoltságát szabályozó gének, és termékeik megismerése a folyamat lényegének felismerése óta a kutatások egyik fő célja volt. Ebben a munkában a kutatások fő irányát meghatározó felfedezést Yoshio Masui (Univesity pf Toronto, Canada) tette meg 1971-ben, amikor elsőként igazolta, hogy a béka (Rana pipiens) petesejtjének érésében, amely a számfelező osztódás (meiózis) egy szakaszán belül történik, részt vesz egy fehérjeszintézis-függő promóciós faktor (MPF: ’maturation promoting factor’), melyről kiderítették, hogy minden bizonnyal két komponense van, és ezek egyike nagy valószínűséggel protein kináz aktivitással jellemezhető. A protein kinázokról tudnivaló, hogy nem mások, mint foszforilázok, amelyek a fehérjék megfelelő helyen lévő aminosavépítőköveinek hidroxil csoportjai és a foszforsav között hoznak létre észtercsoportokat. Az így létrejött foszfoproteinek aktivitása megváltozik: egyes defoszfoproteinek aktiválódhatnak, mások viszont inaktiválódhatnak a protein kinázok hatására. A foszfoproteinek specifikus protein foszfatázok működése révén veszíthetik el foszfát-csoportjaikat. A sejten belüli fehérjék foszforilációja és defoszforilációja a fehérjeműködés és ezáltal a sejtműködések ún. epigenetikai szabályozásának egyik legfontosabb, leggyakoribb módja. A fehérjeszintézis-függő promóciós faktor (MPF) mitózisbeli szerepét kezdettől fogva gyanították, de csak 1978 és 1983 között sikerült ezt kétséget kizáróan bizonyítani, mint ahogyan azt is, hogy aktivitásához két komponensre van szükség. A 2001. évi Orvosi Nobeldíjat az MPF két komponensének és génjeiknek azonosításáért, hatásmódjuk tisztázásáért
4 ítélték oda három egyenlő arányban megosztva egy amerikai és két brit kutatónak. A két fehérjealegységből álló fehérjeszintézis-függő promóciós faktor katalitikus (enzimatikus) komponense egy specifikus protein kináz molekula, mely csak akkor nyeri el aktivitását, amikor aktivátorával, a ciklin nevű regulátormolekulával heterodimert alkothat. Ennek alapján ciklin-dependens kináznak (CDK) nevezik. Leland Hartwel (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, USA, 1939) a díjat a sejtciklust ellenőrző gének felfedezésért kapta. Idevágó első közleményeit már 197071-ben megjelenttette. Kísérleti objektuma az egysejtű sörélesztő (Saccharomyces cerevisiae) volt, melyből több mint száz sejtosztódási ciklus (cell division cycle, CDC) mutánst izolált és vizsgált. A bizottság indoklása külön kiemelte a „start” gén (CDC28), kimutatását, melynek hiányakor (negatív mutációjánál) a sejtek nem képesek átlépni az élesztőkben a startnak, gerincesekben pedig a restrikciós pontnak nevezett ellenőrzési pontot. A start gén terméke végül is az élesztők ciklin dependens kinázának bizonyult. Ezen túl, Hartwel tanulmányozta az élesztősejtek ciklusának sugárérzékenységét is. Eredményei alapján világossá vált, hogy a sejtciklus leáll, ha a DNS-molekulák sérülnek. Ennek célja az, hogy időt biztosítson a hibajavításra, a reparációra. Ezt nevezte el az S-fázis ellenőrzési pontjának. Később ezt a fogalmat kitejesztette további molekuláris történésekre, melyek a sejtciklus fázisainak sorrendjét hivatottak biztosítani. Hartwel vezette be tehát az ’ellenőrzési pont’ fogalmát, ami értékes hozzájárulás volt a sejtciklus megértéséhez. Paul Nurse (Imperial Cancer Research Fund, London, UK, 1939) Hartwelhez hasonlóan a genetikai megközelítést követte. Modellsejtje az egysejtű hasadó élesztő (Schizosaccharomyces pombe) volt. Ez az egysejtű gomba élesztő csak távoli rokona a sörélesztőnek, hiszen evolúciójuk valószínűleg több mint 1 milliárd évvel ezelőtt vált el egymástól. Nurse fedezte fel ebben az élesztőben azt a sejtosztódási ciklus mutáns gént (cdc2t), melyről az 1970-es évek közepén bizonyította be, hogy ez a gén ellenőrzi a G2-mitózis átmenetet. Majd kiderítette, hogy e géneknek és termékeiknek ennél általánosabb a szerepe: S.pombe-ban megfelel a S.cerevisiae start génjének, tehát az S-fázisba lépést is kontrollálja. 1987-ben izolálta ugyancsak ennek a génnek humán analógját. Ez a gén és analógjai, valamint termékeik kapták később a CDK1 megnevezést. Nurse kimutatta, hogy a CDK1 aktiválhatósága maga is reverzibilis foszforilációktól, tehát más, specifikus kinázok és foszfatázok aktivitásától függ. Ezen eredmények alapján humán sejtekben több mint fél tucat különböző CDK-molekulát találtak. R. Timothy(Tim) Hunt (Imperial Cancer Research Fund, London, UK, 1943) az 1980as évek elején fedezte fel az első ciklinmolekulát. A ciklinek családjába tartozó fehérjék túlnyomó többsége a sejtciklus egy meghatározott fázisában szintetizálódó, a hozzá tartozó
5 (specifikus) CDK-hoz kötődve azt aktiváló, majd a ciklus egy következő meghatározott fázisában lebontódó (degradálódó) fehérje. Hunt egy tengeri sün (Arbacia) korai embrionális osztódásainak tanulmányozása során talált rá az első ciklinre, amelynek periodikus degradációját és újraszintetizálódását is leírta. A periodikus proteindegradáció utóbb fontos sejtciklusszabályozó kontroll-mechanizmusnak bizonyult. Tim Hunt később más fajokban is rátalált a ciklinekre, és kimutatta, hogy evolúciós szempontból konzervált szerkezetűek: a gének bázissorrendje és következésképpen fehérje-termékeik aminosavsorrendje is csak kevéssé különbözik ha egymástól milliárd évnyi evolúciós távolságban lévő fajokat hasonlítunk is össze. A konzervált gének és termékeik funkciói nélkülözhetetlenek a fajok és ezzel az élet fenntartása szempontjából. Ezidáig mintegy tíz különböző ciklint azonosítottak humán sejtekben. Az első ciklin és CDK felfedezése óta megismertük a ciklus fázisainak sorbarendezési módját is (2. ábra). Emlős és humán sejtekben négy különböző ciklin-CDK komplex működik sorbakapcsolva. Mint említettük: az osztódással frissen keletkezett „új” sejt csakis a neki megfelelő sejtenkívüli növekedési faktor hatására léphet be a ciklusba, vagyis a G1-fázisba. A növekedési faktor által közvetített jelre a sejt új gének kifejezésével, azaz új minőségű fehérjemolekulák szintézisével reagál. Az újonnan kifejeződő fehérjék között jelennek meg a sejtben a restrikciós ponton ellenőrző ciklin D molekulák. Ezek CDK partnereikkel, a G1fázis előrehaladtával, fokozatos foszforiláció útján szabályozzák a ciklus továbblépéséhez szükséges szabályozómolekulák, végső fokon pedig specifikus transzkripciós faktorok aktivitását. A restrikciós ponton engedélyt kapott, aktiválódott átírási faktorok beindítják az S-fázisba lépéshez szükséges gének kifejeződését. Az új fehérjék között megjelenik az Sfázist ellenőrző ciklin E, miközben a ciklin D molekulák lebomlanak. Az S-fázis végén ezzel teljesen azonos módon indítja be a Ciklin E-CDK komplex a G2-fázisban működő Ciklin A kifejeződését, és végül a ciklin A és CDK partnere Ciklin B szintézisét. Ezutóbbi felelős CDK partnerével együtt a mitózist beindító és fenntartó MPF aktivitásért. Az ismertetett sorbakapcsolt ciklinfüggő folyamatok tehát képesek arra, ha egyszer a G1fázisú sejt átlépte a restrikciós pontot, akkor a folyamatok már a külső szabályozástól függetlenül,
automatikusan,
az
egyes
ciklinek
kifejeződésének
és
a
specifikus
foszforilációknak az időszükségletétől függően meghatározzák a sejtciklus történéseinek sorrendjét és időbeli szakaszolását. A ciklus előreléptetése azonban nem mindig zavartalan. Az automatizmus gátló hatásokon keresztül szabályozódik. Ha például az S-fázis ellenőrző pontjának központi tényezője, a P53 elnevezésű fehérje valamilyen mutáció jeleként szakadást, szabad végeket érzékel a DNS-molekulán, akkor jelet ad a replikáció leállítására. Hatására CDK-inhibítorok
6 génjei aktiválódnak, és megjelennek például olyan gátló molekulák, melyek a CDK2 molekulákhoz kötődve szabályozzák azok kinázaktivitását. Az ílymódon relatíve túlnyomóvá vált protein foszfatázok csökkentik a kináz által serkentett fehérjemolekulák aktivitását. Ezért a ciklin-CDK-függő folyamatok is szabályozódnak. Konkrét példánkban az S-fázis a DNSreparáció idejére leáll. A 2001. évi Orvosi Nobel-díj kitüntetettjeinek munkássága valóban alapvető volt a sejtciklus molekuláris szintű szabályozásának megismerésében. Ennek természetesen nagy elméleti jelentősége van, hiszen közelebb visz bennünket a természetben nagyon gyakori körfolyamatok egyikének megértéséhez. A kutatásokat, a sikerességükhöz szükséges társadalmi beruházások szükségessége miatt azonban az ismeretek gyakorlati haszna hajtja a céljuk felé. A sejtciklussal kapcsolatos alapkutatási felfedezésekből a biomedikális kutatások majd’ minden ága hasznot fog húzni. Ismeretessé vált, hogy például a ciklin–D1 génjének (bcl1) létezik olyan mutációja, mely a molekulát konstitutívvá (szabályozatlanná) teszi, és ílymódon az egy rosszindulatú megbetegedés, a B-sejtes limfóma egyik közvetlen génikus okává, vagyis onkogénné vált. Továbbá a daganatsejtek igen gyakori és jellemző tulajdonsága például, hogy bennük a P53-gén inaktív, a P53-fehérje nem, vagy inaktív mutánsával fejeződik csak ki. Ezzel kiesik például a DNS szabad végeinek, töréseinek érzékelése és a ciklin-függő
kinázok
aktivitásának
következményes
szabályozása.
A
rosszindulatú
daganatsejtekben a DNS-mutációk, kromoszóma-rendellenességek halmozódnak, mint azt mondani szokták: e sejtek genetikai instabilitása inherens. Eközben a CDK aktivitások relatív, vagy abszolút túlsúlya alakul ki, ami pedig szabályozatlanul túlpörgeti a sejtciklust. Különösképpen jellemző ez például emlőrákokra és agydaganatokra. A fehérjebiokémia és a molekulaszerkezet-modellezés fejlettsége ma már azt is lehetővé teszi, hogy enzimek, köztük a
ciklin-dependens
kinázok
gátlómolekuláit,
mint
reménybeli
gyógyszereket
az
enzimműködés szerkezeti alapjainak ismeretében megtervezzék és szintetizálják. Jelenleg a CDK-inhibítorok fejlesztése már a klinikai kipróbálás fázisában van, ami remélhetőleg szélesebb körű alkalmazásukhoz vezet majd a daganatellenes kemoterápiában. Természet Világa, 133. évf. 3. sz. 2002. március p. 106-109.
1.ábra. A sejtciklus sémája. A mitotikus osztódásból (M-fázis) kilépő utódsejt csak akkor maradhat a ciklusban, ha környezetéből osztódást serkentő anyag (mitogén) hat rá. Ellenkező esetben kilép a ciklusból és G0-fázisba kerül. Mitogén hatásra belép az első előkészítési vagy növekedési szakaszba (G1-fázis), melynek során sorozatos génkifejeződések (RNS- és fehérjeszintézisek) segítségével éri el megfelelő méretét és felkészültségét a DNS-szintézis (S-fázis) megkezdésére. A restrikciós (R) vagy START pont előtt (korai G1) a sejt a mitogén megvonására G0-fázisba lépésssel reagál: kilép a ciklusból. Az R-pont átlépése után (késői G1) már mitogénfüggetlen a ciklus: a sejt elkötelezetté vált az S-fázis beindítására. Ha a DNS-szintézis maradéktalanul és hibátlanul befejeződött, akkor a sejt továbbléphet a G2-fázisba, a mitózis előkészítő szakaszába. Ahhoz, hogy a sejt M-fázisba lépjen, szükséges, hogy a mitotikus apparátus anyagai maradéktalanul rendelkezésre álljanak.
2. ábra. . A ciklinek ciklusa. A mitózisból kilépett sejt a mitogén hatására megkezdi, többek között a G1ciklinek (ciklin D változatok) szintézisét. Ezen ciklinek szintézisének fenntartásához az R pontig mitogén hatás szükséges. Az újonnan megjelenő ciklin D molekulák kötődnek hosszú (több ciklusra is kiterjedő) életidejű és állandó koncentrációjú ciklin-dependens kináz (CDK4 vagy CDK6) partnerükhöz és ezáltal aktiválják őket. A szóbanforgó CDK molekulák legfontosabb szubsztrátuma az ú.n. retinoblasztóma gén 105 kilodalton molekulatömegű fehérjeterméke (P105). Ez megkötve, inaktív állapotban tart olyan speciális transzkripciós faktorokat (az E2F1 géncsalád termékeit), melyek, többek között, az S-fázis megindításához szükséges fehérjék génjeit aktiválják. A P105 fehérjén számos foszforilálható hely van, melyek a ciklus elején még üresek, majd a G1-szakasz előrehaladtával az állandóan sokasodó ciklin D-CDK komplexek fokozatosan foszforilálják őket. A P105 molekulák az R pontnál kerülnek maximálisan foszforilált állapotba. Ennek hatására elengedik az eddig fogva tartott transzkripciós faktorokat, amelyek aktiválják a késői G1-fázisban szintetizálódó és az S-fázisban működő fehérjék génjeit. Ezek közé tartozik a ciklus következő továbblépését biztosító ciklin E is. A restrikciós pont után megjelennek a CDK enzimgátlói, a ciclin D-CDK dimerek disszociálnak, és a ciklin degradálódik. Megindult azonban már a ciklin E szintézise. Partnere a CDK2. Dimerjük az előzőekkel teljesen azonos módon szabályozza egy retinoblasztóma családba tartozó újabb fehérje, a P107 működését, amely az S-fázis vége előtt az E2F2 géncsaládba tartozó transzkripciós faktorokat köt. Utóbbiak hatására jelennek meg, többek között, a G2-fázisban működő ciklin A molekulák, miközben a ciklin E lebomlik. A ciklin A ugyancsak a CDK2-vel alkot heterodimert, és a P130 retinoblasztóma típusú fehérjén, valamint az E2F3 család átírási faktorain keresztül indítja be a legelsőként felfedezett ciklin, a ciklin B szintézisét, majd degradálódik. Az Mfázist ellenörző ciklin B partnere a CDK1. A komplexük feladata az M-fázis fenntartása: nem indukálják újabb ciklin megjelenését. A CDK1 aktivitását specifikus foszforilációk és defoszforilációk, míg a többi CDKét gátlófehérjék szabályozzák. A ciklin B az M-fázis végén bomlik le. A ciklus genetikai történései: 1sejtnövekedés; 2-kromoszómakettőződés; 3-magosztódás: a kromoszómák elosztása; 4-sejtosztódás.
