A sejtciklus és szabályozása 2016. április 21.
Lippai Mónika
Az osztódó sejt élete sorá egkülö öztethető az M-fázis (mitózis és citokinézis) és az interfázis szakasza
Már korai fénymikroszkópos vizsgálatok során is felismerték, hogy a sejt élete során elkülö íthető fázisok va ak. http://en.wikipedia.org/wiki/Mitosis
A sejt élete során a kromoszómák állapota periodikusan változik: a kromoszóma-ciklus
zöld: mikrotubulus kék: kromoszóma piros: kinetochor
interfázis
profázis
prometafázis
metafázis
anafázis
telofázis
http://www.wi.mit.edu/news/paradigm/spring_2008/splitsville.html
Míg a sejt RNS- és fehérjetartal a fol a atosa ő az interfázis során, DNS-tartalmának duplázódása az interfázison elül eg köz ülső időszakhoz, az “-fázishoz köthető
A sejtciklus során a sejt DNS-tartalma (C) változik
G1
S
G2
M citokinézis
DNS replikáció mitózis
2C
4C
2C
C: a haploid sejt (például az ivarsejt) DNS-tartalma http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle
Sejttérfogat
Citoplazma-ciklus: a sejtciklus során a sejtméret is ciklikusan változik
Csökkentett tápanyag-ellátottság
Az osztódást a sejt térfogata is befolyásolja. Ha a sejt elért egy bizonyos, az adott sejttípusra jelle ző éretet, osztódhat. Ehhez egfelelő tápanyagellátás és növekedési faktorok jele léte kell. A egfelelő éret azo a sak szükséges, de nem elégséges feltétel: ha valami nincs rendben a sejtben (pl. sérült a genom), normális körülmények között nem osztódhat a sejt.
A sejt méretét befolyásoló faktorok Haploid
wee (kináz) „A fehérje
Cdk1 (kináz) „B fehérje
osztódás
növekedés: „A fehérje „B fehérje mennyisége csökken (kihígul)
osztódás
Tetraploid
Tetraploid szalamandrák utóagyában a sejtek jóval nagyobbak, mint a haploidokban
Hasadóélesztők wee mutánsai kisebbek, mert túl hamar osztódnak
A sejtciklus-szakaszok időtarta á ak
G2
eghatározása
G2
S
Az S fázis a levő sejtek DN“-ének megjelölése 3H-timidinnel
A sejtciklus-szakaszok időtarta á ak
G2
eghatározása
G2
G2 + M
G2 + M + S stb.
Az eukarióta sejt ciklusának tipikus fázisai és átlagos hosszuk sejttenyészetben M-FÁZIS
INTERFÁZIS
M-FÁZIS
1 óra
INTERFÁZIS
M-FÁZIS
M-fázis: mitózis + citokinézis
4 óra 11 óra
24 óra
8 óra http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle
A centroszóma-ciklus
A centroszóma-ciklus Interfázis
G1
centriólum szeparálódás
G1
a centriólum replikáció kezdete
S S
G G22
Profázis
mikrotubulusok
centroszóma egy centriólum párral Sejtmag
Profázis mindkét centroszóma mikrotubulusok képződésének kiindulópontja
Metafázis
Kialakul az orsórendszer
asztrális mikrotubulusok
poláris mikrotubulusok
centroszóma szeparáció
Anafázis
A centroszómák távolodnak, a sejt megnyúlik (közben a kromatidák is szeparálódnak)
(Az ábrán a kromoszómák nincsenek feltüntetve)
Telofázis
Milyen mechanizmusok, mely gének teszik lehetővé a övekedési/osztódási fol a atok összehangolását?
A sejtciklus szabályozása
E lőssejtek vizsgálatához: szi kro izált sejttenyészet készítése szükséges Sejt mitózisban
Sejt interfázisban
Tápoldat
„Mitotikus lerázás” Sejtek mitózisban
Gyakori módszer ma: - a mikrotubulusok dinamikájának gátlása (metafázis-blokk) - tápanyag-megvonás (G1-fázis blokk)
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata I: “ejtfúziós kísérletek e lőssejtekkel S
G1
G1→azonnal S-be megy S fázisban van valami, ami a G1-fázisú sejtet „ ei dítja
S
G2
A G2 marad, bevárja az S-t, majd együtt → M-be
G1
G2
A G2 marad, bevárja G1-et, és együtt → M-be
A G2-es sejt nem replikálja újra A G2-es sejt nem replikálja a DNS-ét. Ugyanakkor nem is újra a DNS-ét. Ugyanakkor lép a maga idejében M-fázisba nem is lép M-fázisba – – valami akadályozza ebben valami akadályozza ebben re-replikációs blokk és G2 /M kontroll pont
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata I: “ejtfúziós kísérletek e lőssejtekkel M
G1
M
S
M
G2
A G1, az S és a G2 sejtek is M-be mennek. MPF = Mitosis Promoting Factor van jelen a citoplazmában
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: két élesztőgo afaj élet iklusa Idő ké t a diploid sejtjek is szaporodnak
Diploid sejtek
Meiózis (általában rögtön a spórák kihajtása után)
Meiózis és spóraképzés Konjugáció (általában rögtön a spórák kihajtása után)
Konjugáció A spórák kihajtanak
A spórák kihajtanak Idő ké t a haploid sejtjek is szaporodnak
Saccharomyces cerevisiae
Haploid sejtek
Schizosaccharomyces pombe
Eg sejtű, de eukarióta szervezetek. Haploid formában is szaporodnak – a recesszív mutációk által okozott fenotípus is megjelenik
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: hő érséklet-érzéke élesztő utá sok
A sejtciklust befolyásoló faktorokat kódoló géneket mutációk indukálásával el lehet rontani, és haploid ge o al re delkező sejtek e hatásuk azo al látszik. Azonban az ilyen mutáció, ha letalitást okoz, nem tartható fenn. Kondicionális mutánsok izolálásával elérhető, hog a fenotípus csak restriktív körülmények között jelenjen meg. Ha ekkor a sejtciklus valamely fázisában „ egakad a sejt, e e ol a gé ro lott el, a el ek ter éke szükséges lenne a ciklus folytatásához. Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: sejt iklust sza ál ozó gé ek utá iójá ak izolálása élesztő e G2/M kontroll pont
cdc (cell-division-cycle) mutáns
Mi az ép cdc+ funkciója?
G1/S kontroll pont
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: módszer cell-division-cycle (cdc) mutánsok izolálására Kondicionális letális mutáns
Élesztősejtek mutagenezise Mesterlemez permisszív hő érséklete
Kondicionális letális mutáns-g űjte é
Replika restriktív hő érséklete
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: gének izolálása hő érséklet-érzékeny cdc mutánsok alapján Plazmidok az élesztőge o különféle szakaszaival Mutáns cdc allél
Az ép cdc+ gén
TRANSZFEKCIÓ haploid sejt
parciális diploid sejt
A mutáns sejtek restriktív körülmények között nem osztódnak
Restriktív körülmények között csak a plazmidban az ép cdc+ gént hordozó sejtek osztódnak
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: gének izolálása hő érséklet-érzékeny cdc mutánsok alapján Plazmidok ép élesztő DN“ szakaszokkal
Restriktív körülmények között csak azok a sejtek osztódnak, amelyekben a plazmid éppen a egfelelő, ép cdc+ gént hordozza
Egyfajta cdc mutáns sejtek tenyészete Élesztősejtek restriktív hő érséklete
Ezeket a sejteket felszaporítják, előlük plazmidot izolálnak.
A plazmidokból izolálják az ép cdc+ gént
A sejtciklus szabályozásának vizsgálata III: Xenopus petesejt vizsgálata (nagyok, szinkronizáltak) Petesejt Sejtmag Progeszteron
ÉRÉS
Pete
AKTIVÁLÓDÁS
Embrió
Diploid sejtmag Meiózis I
Megtermékenyülés
A petesejt a Az első Sarki Sarki test 2. meiotikus test meiotikus osztódás M osztódás fázisában vesztegel M fázisa Citoplazma injekció Citoplazma injekció Magorsó M fázisú sejt ől interfázisos sejt ől képződik Sejtmag
A petesejt az 1. meiotikus osztódás G2 fázisában vesztegel
Osztódások
Zigóta interfázisban
Petesejt G2 fázisos petesejt
A petesejt M fázisba jut
A petesejt G2 fázisban marad
M-fázisú petesejtben: Maturation Promoting Factor = Mitosis Promoting Factor, MPF!!
Te geri sü ől izolálták az első olyan fehérjét, amely szintje követi a sejtciklust
ciklinek
1. osztódás
2. osztódás
Fehérjék osztódó sejtek ől gélelektroforézissel szeparálva
idő
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9962
Nobel-díj 2001: „for their discoveries of key regulators of the cell cycle".
Leland H. Hartwell
pékélesztő
Tim Hunt
tengeri sün
Paul Nurse
hasadóélesztő
Az MPF ciklikus aktivitást mutat, ami összhangban van a ciklin B koncentrációjának növekedésével
Relatív koncentráció →
MITÓZIS
INTERFÁZIS
MITÓZIS
INTERFÁZIS
MITÓZIS
MPF
ciklin B
Idő →
A sejtfúziós, genetikai és biokémiai vizsgálatok közös eredményre vezettek: az MPF egyik komponense a ciklin B d evű, minden sejtciklus végén lebomló, majd újra szintetizálódó fehérje, másik komponense egy ciklin dependens kináz (CDK1, = d , a el aktivitása függ a ikli B jele lététől.
A CDK ciklinnel komplexet képezve aktiválódik, és foszforilálja specifikus célfehérjéit
http://sgugenetics.pbworks.com/w/page/24725253/Group14-CDK
Többféle ciklin va , eltérő expressziós mintázattal. Minden sejtciklus során újra szintetizálódnak, majd lebomlanak
http://en.wikipedia.org/wiki/Cyclin
Élesztők e eg etle CDK található, a el a sejt iklus eg es stádiumaiban más- ás ikli hez köt → eltérő ese é eket indít el MITÓZIS MPF ciklin B MPF : CDK+ciklin B SPA : CDK+ciklin D
CDK
(Az ábrán csak az SPA -nak és az MPF - ek egfelelő ko ple ek szerepelnek)
CDK (ciklin dependens kináz)
SPA REPLIKÁCIÓ
ciklin D
Gerincesekben négyféle CDK található, amelyek a sejtciklus külö öző stádiu ai a képez ek aktív ko ple et
“PA
MPF http://www.bioscience.org/2005/v10/af/1551/fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=yes
A sejt iklus elle őrzési po tjai Az összes DNS replikálódott?
Minden kromoszóma ikrotubulushoz kötődött ?
Megfelelőek a körül é yek?
Metafázis-anafázis átmenet
G2/M kontrollpont
BELÉPÉS A MITÓZISBA
ANAFÁZIS MEGKEZDÉSE; CITOKINÉZIS
BELÉPÉS A SEJTCIKLUSBA, S-FÁZIS KEZDETE Start/restrikciós pont Megfelelőek a körül é yek?
Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
A G1 fázisban nincs CDK-aktivitás, a sejt addig nyugalomban marad, amíg mitogén jelet nem kap az osztódásra
génszabályozó fehérje aktiválódása
génexpresszió
génszabályozó fehérje
BELÉPÉS A SEJTCIKLUSBA, S-FÁZIS KEZDETE
Start/restrikciós pont
CDK4ciklinD
génexpresszió
Megfelelőek a körül é yek? Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
A CDK4-ciklinD komplex aktiválódása a sejtosztódást gátló Rb (retinoblasztóma) fehérje gátlódását eredményezi aktív Rb fehérje
aktív CDK4/ ciklinD aktív E2F fehérje
inaktív E2F fehérje
aktív CDK2/ ciklinE S-fázis gének átíródása
ciklinE ciklinA
aktív CDK2/ ciklinA
DNS SZINTÉZIS
inaktív Rb fehérje
Az Rb inaktiválódása olyan CDK-ciklin komplexek kialakulásához vezet, amelyek beindítják az S fázist, a DNS replikációját. A pozitív visszacsatolások gyors és éles G1-S-fázis átmenethez vezetnek.
Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
A re-replikációs blokk: a DNS-szintézis egy cikluson belül e kezdődhet újra replikációs kezdőpo t
jogosító faktor komplex
Cdk2/ ciklinA
Kezdődik a replikáció; ezen a cikluson belül nem alakulhat ki újra a jogosító faktor, mert egyes elemei lebomlanak vagy kikerülnek a sejtmagból
A G1 fázis elején kialakulhat a jogosító faktor komplexe
„jogosítófaktor”
proteolízis
exportálódik a sejtmagból
ORC origi re og itio o ple : felis eri és kötődik a DN“-en a replikációs origóhoz G1 fázisban (amikor i s CDK aktivitás . Ezutá kötődhet hozzá a jogosító faktor komplex többi eleme, köztük Mcm fehérjék: helikáz-aktivitás! http://en.wikipedia.org/wiki/Control_of_chromosome_duplication
A sejt csak akkor kezdheti el a mitózist, ha a DNS replikálódott, és teljesen ép - ez a G2/M kontrollpont legfontosabb feladata Az összes DNS replikálódott? Megfelelőek a körül é yek?
DNS károsodás
G2/M kontrollpont
p53
BELÉPÉS A MITÓZISBA
p21 DNS reparáció
Apoptózis Sejtciklus feltartóztatás
Genom-integritás
egőrzése
DNS-károsodás esetén a p53 nemcsak a G2/M, hanem a G1/S határon is megállíthatja a sejtciklust, ott a CDK4-ciklin D komplex aktiválódását gátolva. Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
A p53 DNS-károsodás hatására stabilizálódik, és CDK-gátló fehérje p képződését serke ti DNS
DNS-sérülés [ ATM/ATR , majd Chk1/Chk2 kináz aktiválódik ]
Mdm2
p53
proteolízis (ubiquitinálódik, proteaszómákhoz irányítódik)
p53 foszforilálódik
stabil, aktív p53: aktiválja a p21 gén átírását p21 gén
TRANSZKRIPCIÓ TRANSZLÁCIÓ
p21 mRNS p21 (CDK gátló fehérje)
aktív CDK2ciklin E/A
inaktív CDK2ciklin E/A Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
Belépés a mitózisba: a CDK1-ciklinB komplex aktiválódása
Relatív koncentráció →
M-FÁZIS
INTERFÁZIS
M-FÁZIS
INTERFÁZIS
M-FÁZIS
aktív CDK1ciklinB komplex
ciklinB
Idő →
Bár a ciklinB e isége fokozatosa ő, a CDK pedig fol a atosa jele van a sejtben, komplexük aktivitása mégis hirtelen emelkedik meg. Miért?
Belépés a mitózisba: a CDK1-ciklinB komplex aktiválódása CDK-gátló foszfátcsoport (gátló kináz) CDK-aktiváló foszfatáz
CDK-aktiváló foszfátcsoport (aktiváló kináz, CAK)
A CDK1- ikli B ko ple g ors és ag e iségű aktiválódása aktiváló és gátló enzimek (kinázok, foszfatázok eg ütt űködésével törté ik. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9962
Belépés a mitózisba: a CDK1-ciklinB komplex aktiválódása inaktív foszfatáz
ciklinB
gátló foszfátcsoport CDK-aktiváló kináz
aktiváló foszfátcsoport CDK1
inaktív CDK-gátló kináz CDK1-ciklinB
inaktív CDK1-ciklinB
aktív CDK1ciklinB
A CDK1- ikli B ko ple g ors és ag e iség e törté ő aktiválódása aktiváló és gátló e zi ek eg ütt űködésével és pozitív vissza satolás révén történik. (A cdc25 foszfatázt kezdet e valószí űleg a CDK -ciklinA aktiválja). Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
A CDK1-ciklinB komplex váltja ki a mitózis valamennyi kezdeti lépését kromatin tömörülése (hiszton H1, condensin komplex foszforilálása) profázis
felbomlik a maghártya (laminok és a póruskomplex fehérjéinek foszforilálása)
mikrotubulus-hálózat átszerveződése
agorsó
(mikrotubulus-asszociált fehérjék (MAP-ok), motorfehérjék, centroszóma-fehérjék foszforilálása) prometafázis
a kinetochor a mikrotubulusokkal kapcsolódik (MAP-ok és kinetochor-fehérjék foszforilálása)
metafázis
http://www.wi.mit.edu/news/paradigm/spring_2008/splitsville.html
A mitózis csak akkor lép az anafázis szakaszba, ha valamennyi kromoszómában a kinetochorok az ellentétes pólusok irá á a ekötődtek Minden kromoszóma ikrotubulushoz kötődött ?
Metafázis-anafázis átmenet
ANAFÁZIS MEGKEZDÉSE; CITOKINÉZIS
INSTABIL
INSTABIL
INSTABIL
STABIL
Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
Az anafázis kezdetekor aktiválódik az Anaphase Promoting Complex (APC), amely ubikvitin ligázként proteaszomális bontásra ítéli célfehérjéit aktiváló alegység (cdc20)
poliubikvitin lánc
inaktív APC ciklinB
aktív APC ciklinB lebomlik CDK1
ubikvitin
Az aktiváló alegység csak akkor kapcsolódik az APC-hez, ha valamennyi kinetochorhoz mikrotubulus kapcsolódott, és a sejt a leánykromatidák között széthúzó erőt érzékel ekkor egszű ik az aktiváló aleg ség gátlása . Az aktív APC komplex a proteaszómához irányítja a ciklinB-t – egszű ik az MPF-aktivitás. Ugyanakkor serkenti a kromatidákat összetartó fehérjék bontását – elkezdődhet az a afázis! Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
Az APC hatására lebomlanak a kromatidákat összetartó cohesin fehérjék, íg a ikrotu uláris húzófo alak e té kezdődhet a szétválás – az anafázis [securin] aktiváló alegység
[inaktív separase]
a securin lebomlik inaktív APC CDK1ciklinB [cohesin
complex]
aktív APC aktív separase
„felaprított cohesinek
Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008
Összefoglalva: a sejtciklust ciklinek, kinázok, foszfatázok és ubikvitin ligázok „összjátéka irá ítja A sejt iklus eg es résztvevői: - a következő stádiu ot irányító komplexet aktiválják. Ciklinjének szintézisét serkentik, és hozzájárulnak a komplex CDK-jának aktiválásához (pl. gátlófehérje inaktiválásával). Ez nem igaz az APC-re, mert ez leállít minden ciklin-aktivitást – a sejt G1-ben marad mindaddig, míg osztódásra jelet nem kap, és új ciklin nem szintetizálódik - sokszor saját aktivitásukat is serkentik (pozitív visszacsatolás) - az előző stádiu komplexét inaktiválják, ubikvitin ligázok bontják az „előző ciklint, gátlófehérjék aktiválódnak (ez egyfajta negatív visszacsatolás is!)
Hányszor osztódhat egy sejt? A sejtciklus beindításához (a G1-“ át e ethez szükséges té ezők: - növekedési, osztódási faktorok - hordozófelületre ki tudjanak tapadni (de a sejt-sejt kapcsolatok kialakulása gátol!) - eg szövete elül a szövetféleség érete is li itáló té ező pl. áj
Egy sejtféleség osztódási potenciálja - azaz, hogy hány cikluson tud keresztülmenni - fajra jelle ző, ge etikailag sza ál ozott érték. - A ciklizálóképesség elvesztése: celluláris öregedés. A jelenség oka: a kromoszómák fokozatos rövidülése a replikáció során.
Miért rövidül a telomer?
A repliká ió ter észeté ől adódóan mindig RNS-pri errel kezdődik a másolás. Az új DNS- olekula frisse szi tetizálódott 5’ legvégé az RN“-primer lebomlik, de a helyébe nem szintetizálódik DNS. http://www.hartnell.edu/tutorials/biology/dnareplication.html
Miért rövidül a telomer?
fehérjekötőhely
A
telomer B Replikáció 1
A B1
A primer degradálódik és
A1 B
Replikáció 2
A1 B2
A primer degradálódik
A2 B1
A kötőhely elveszett
Primer (RNS)
Van megoldás a sejtöregedéssel szemben?
Igen, vannak halhatatlan sejtjeink! A telomer rövidülése ellen hat a telomeráz enzim, amely normális esetben a szomatikus sejtek többségében nem vagy alig expresszálódik. Az őssejtek e (vagy más néven törzssejtekben) viszont aktív! (Dyskeratosis congenita: az egyik kópia telomeráz-gén mutációja miatt kevésbé hatékony a telomerek hosszának biztosítása. Egy idő után abbamarad az őssejtek osztódása, a következmény so tvelőhiá , ájzsugorodás, őrkárosodás.)
sejtosztódás
a telomer hossza
A legtöbb sejt osztódási képessége nem végtelen (a sejtvonal korlátozott szá ú ele ől áll
telomeráz aktiváció
sejtöregedés (celluláris szeneszcencia)
telomeráz
Miért halhatatlanok az őssejtek? http://www.ucl.ac.uk/cancer/rescancerbiol/chrommaintenance
A telomeráz
űködése
Kapcsolódik a telomeráz
A telomeráz az RNS te plát alapjá a ’ irányban meghosszabbítja a DNS fonalat
A megrövidült 5’ vég A telomeráz DNS-t szintetizál
A telomeráz
A telomeráz saját templát RNS-e
A DNS polimeráz az új 5’ véget RNS pri ertől indulva kiegészíti AACCCCAAC
DNS polimeráz
A templátként szolgáló „régi DN“-szál ’ végé ek lehetővé válik, hog az új 5’ vég is hossza leg e
eghossza
késő le o ló RNS-primer
ításával
