SEJTVÁZ SEJTOSZTÓDÁS SEJTCIKLUS Citogenetikai alapfogalmak 1
CITOSZKELETON
A MIKROFILAMENTUMOK
B MIKROTUBULUSOK
C INTERMEDIER FILAMENTUMOK
2
SEBGYÓGYULÁS
3
AXON NÖVEKEDÉS
4
A LEGGYORSABB SEJT: HAL KERATOCITA
5
BAKTÉRIUMOT ÜLDÖZŐ FEHÉRVÉRSEJT
6
SEJTOSZTÓDÁS
7
INTERMEDIER FILAMENTUMOK 8
INTERMEDIER FILAMENTUMOK Típusok: I., II. keratin, hámsejtek, haj, köröm, dezmoszóma III. vimentin: sejtdifferenciálódás elején, dezmin:izomsejtek IV. neurofilamentum, axonokat erősíti V. lamin, a sejtmaghártya belső oldalán levő hálózatot alkotnak Betegségek: epidermolysis bullosa simplex, (keratin) amyotrophic lateral sclerosis (neurofilamentum)
A tetramerlemezek feltekercselődnek
A tetramerek lemezekbe rendeződnek
9
AKTIN FILAMENTUMOK (MIKROFILAMENTUMOK) 10
AKTIN FILAMENTUMOK Globuláris aktin monomerek polimerizációjával kialakult 8 nm átmérőjű filamentumok
- vég
Polimer: F-aktin
+ vég Monomer: G-aktin
Funkciók: Sejtmembrán alatti aktinháló védi a sejtet a mechanikai behatásoktól Transzmembrán fehérjéket köt össze citoplazmikus fehérjékkel Citokinézis során a két leánysejt szétválasztása Sejtek helyváltoztatása Izomösszehúzódás
11
AKTIN KÖTŐ FEHÉRJÉK Sapkázás: CapZ
Monomer szekvesztrálás: timozin
Kötegelés: fascin, fimbrin
Aktin monomer
Aktin polimer
Keresztkötés: filamin
Fragmentálás:gelszolin Membrán kötés: spektrin, disztrofin
Depolimerizáció: kofilin
12
SEJTVÁNDORLÁS
Aktin citoszkeleton polarizált fibroblasztban. Aktin hálózat a lamellipodiumban (Lam.), kötegek a filopodiumban (Fil); kontraktilis stressz-kötegek (stress fibres, S.F.) 13 Fokális komplexek (Fx) és fokális adhéziók (F.A.) játszanak szerepet a sejt extracelluláris térhez tapadásában.
LAMMELLIPÓDIUM-A SEJT LÁBA
Aktin alegység áramlás vándorló sejt lammellipódiumában (fodrozó él) 14
FEHÉRJE INTERAKCIÓK A LAMELLIPODIUMBAN
Arp2/3 Aktin monomer
Aktin keresztkötő fehérjék Aktin depolimerizáló fehérje Az aktin polimerizációt extracelluláris jelre beindító fehérjekomplex
15
SEJTVÁNDORLÁS
A sejtek vándorlásuk során először a sejt elejét előretolják, majd a sejt hátsó részét behúzzák. A sejt elejének kitüremkedését az aktin filamentumok polimerizációja okozza a sejthártya közvetlen közelében, míg a sejt hátsó részének behúzását a stressz kötegek összehúzódása (miozinok segítségével) okozza. A lamellipódium szélessége állandó az alegység áramlás miatt, aktin monomerek épülnek be a sejthártya felőli részen (előrenyomva a sejthártyát), míg aktin 16 monomerek válnak le a sejttest felőli részen.
SEJTVÁNDORLÁS ÉS SEJTADHÉZIÓ A fokális komplexek/adhéziók legfontosabb alkotói az integrinek. a és b integrinek (transzmembrán fehérjék) dimerjei felelősek a sejt és az extracelluláris mátrix közti dinamikus kapcsolat kialakításáért. Az integrinek adapter fehérjéken keresztül (vinkulin, talin) kapcsolódnak az aktin sejtvázhoz. 17
SEJTVÁNDORLÁS, SEJTADHÉZIÓ ÉS MT-K
A mikrotubulusok szerepe a sejtvándorlás során: fokális komplexek/adhéziók feloldása.
18
PATOGÉNEK ÉS AKTIN FILAMETUMOK
Intracelluláris parazita baktériumok: Listeria, Shigella, Salmonella
19
IZOMDISZTRÓFIÁK Izomszövet specifikus ECM-membráncitoszkeleton kapcsolat. A kapcsolatot létrehozó molekulákat (disztrofin, szarkoglikán, disztroglikán és laminin) kódoló gének mutációi izomdisztrófiákat okoznak. Leggyakoribb a Duchenne-féle, X-hez kötött izomdisztrófia.
20
AKTIN MOTOROK:MIOZINOK
ATP-függő erő-generáló enzimek
21
MIOZINOK Relaxált izom miozin fej
vastag filamentum
az aktin filamentumok plusz vége felé mennek vékony filamentum
Összehúzódott izom
22
MIOZINOK
23
belsőfül szőrsejt
MIOZINOK
sztereocílium bélbolyhok
endocitózis
vezikulum transzport fagocitózis
exocitózis axon növekedés sejtnyúlványok 24
MIKROTUBULUSOK
25
MT SZERKEZET
- vég MT DINAMIKUS INSTABILITÁS POLIMERIZÁCIÓ
DEPOLIMERIZÁCIÓ
MIKROTUBULUS (MT)
+ vég
MT asszociált fehérjék is (MAP-1, MAP-2, Tau) befolyásolják a dinamikus instabilitást, (stabilizálnak).
citosztatikumok: kolchicin, taxol, vinblastin-stabilizál, nagyobb koncentrációban depolimerizál Susan L. Kline-Smith and Claire E. Walczak: Mitotic Spindle Assembly and Chromosome Segregation: Refocusing on Microtubule 26 Vol. Dynamics. Molecular Cell, 15, 317–327, 2004,
”MOZGÓLÉPCSŐZÉS”
MT
MT alegység áramlás
Susan L. Kline-Smith and Claire E. Walczak: Mitotic Spindle Assembly and Chromosome Segregation: Refocusing on Microtubule Dynamics. Molecular Cell, Vol. 15, 317–327, 2004,
27
MOLEKULÁRIS MOTOROK: MIOZINOK, DINEINEK & KINEZINEK
28
MOLEKULÁRIS MOTOROK
MIOZIN aktin Plusz vég felé
KINEZIN MT Plusz vég felé
DINEIN MT Mínusz vég29felé nehéz, könnyű és intermedier láncok
MT MOTOROK: DINEINEK & KINEZINEK
AXONÁLIS TRANSZPORT 30
MT MOTOROK: KINEZINEK
A KINEZINEK CSOPORTOSÍTÁSA A MOTOR DOMÉN ELHELYEZKEDÉSÉNEK MEGFELELŐEN (N:N terminus, I:belső régió, C: C-terminus):
Kin N (plusz-vég irányú kinezinek), Kin I (MT depolimerázok) Kinezin családfa
Kin C (minusz-vég irányú kinezinek) családok Monomer, dimer, tetramer formák
31
MT MOTOROK: KINEZINEK
A KINEZINEK FUNKCIÓI: vezikulumok szállítása sejtorganellumok szállítása pigmentszemcsék szállítása ER és Golgi pozícionálása Kinezin családfa
MT depolimerizáció (sejtosztódás anafázis)
osztódási orsó kialakítása
32
MT MOTOROK: DINEINEK A CITOPLAZMATIKUS DINEINEK FUNKCIÓI: vezikulumok szállítása
sejtorganellumok szállítása
DINEIN komplex
pigmentszemcsék szállítása ER és Golgi pozícionálása kromoszóma transzport (kinetokór, sejtosztódás) osztódási orsó kialakítása
DINAKTIN komplex 33
CILIUM ÉS FLAGELLUM flagelláris dinein 9 MT
2 MT sejthártya
alapi test
flagelláris dinein
KARTAGENER SZINDRÓMA
34
35
CENTROSZÓMA (CS)
A CS-át Fleming & Van Beneden fedezte fel 1875-6-ban, de Boveri tanulmányozta először részletesen néhány év mulva. Boveri eredeti preparátuma, Parascaris equorum embrió (Heidenhain vas- haematoxylin festés). A centriólumok fekete körök a két póluson.
Marie Delattre and Pierre Gönczy: The arithmetic of centrosome biogenesis. Journal of Cell Science 117, 1619-1629 2004
36
CENTROSZÓMA
CS
Centroszóma: anya centriólum
Centriólum+PCM
g-tubulin MTOC
PCM leány centriólum
MT összekötő fehérjék
Marie Delattre and Pierre Gönczy: The arithmetic of centrosome biogenesis. Journal of Cell Science 117, 1619-1629 2004
37
Elmar Schiebel: g-tubulin complexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation. Current Opinion in Cell Biology 2000, 12:113–118
CENTRIÓLUM
Wallace F. Marshall: Centrioles take center stage. Current Biology 2001, 11:R487–R496
38
A CS-ÁK VISELKEDÉSE AZ IVARSEJTEK KIALAKULÁSA ÉS A FERTILIZÁCIÓ SORÁN
HÍM MEIÓZIS MT, DNS, CS
SPERMATOGENEZIS 39
A CS-ÁK VISELKEDÉSE AZ IVARSEJTEK KIALAKULÁSA ÉS A FERTILIZÁCIÓ SORÁN
OOGENEZIS
A centriólumok már az oogenezis kezdetén inaktiválódnak, elvesznek , a női meiotikus osztódások gyakran acentriolárisak.
A PCM g-tubulin gyűrűkomplexei szétszóródnak a petében. 40
MT, DNS, CS
A CS-ÁK VISELKEDÉSE AZ IVARSEJTEK KIALAKULÁSA ÉS A FERTILIZÁCIÓ SORÁN
FERTILIZÁCIÓ spermium aszter, anyai & apai pronukleuszok
AZ ELSŐ EMBRIONÁLIS CS KIALAKULÁSA: CENTRIÓLUM SPERMIUMBÓL
PCM PETESEJTBŐL
41
MT, DNS, CS
SEJTOSZTÓDÁS: MITÓZIS & MEIÓZIS
42
KROMOSZÓMÁK-CITOGENETIKAI ALAPFOGALMAK Kromoszóma: kondenzált DNS a hozzá kapcsolódó fehérjékkel (a sejtciklus M fázisa)
humán kariogram
Kromatin: nem kondenzált DNS a hozzá kapcsolódó fehérjékkel (a sejtciklus interfázisa)
homológ kromoszómák
kromoszóma szerkezet „A” allél
„a” allél
gének
centromer leány kromatida
telomer duplikálódott kromoszóma
1.
1.
2.
2.
43
AZ OSZTÓDÁSI ORSÓ kinetokór
PICTURE!!!
centroszóma
kinetokór MT interpoláris MT
asztrális MT
kromoszóma 44 Sharat Gadde and Rebecca Heald: Mechanisms and Molecules of the Mitotic Spindle. Current Biology, Vol. 14, R797–R805, 2004
KINETOKÓR C E N T R O M E R
DINAKTIN komplex
DINEIN komplex
kinetokór és adapter fehérjék
Kinetokór: A kromoszómák centromerikus régiójához kapcsolódó fehérje komplex, 45 a (kinetokór) MT elfogása és a kromoszómák transzportja a funkciója.
profázis
prometafázis
metafázis
anafázis A
anafázis B
telofázis
Az osztódási orsó összeszerel ődés klasszikus ”kutass és fogd el” (”search and capture”) mechanizmusa
Jonathan M. Scholey, Ingrid Brust-Mascher & Alex 46 Mogilner: Cell division NATURE VOL 422, 2003
HOGYAN VÁLNAK SZÉT A KROMATIDÁK A SEJTOSZTÓDÁS SORÁN? metafázis kromoszóma
becsévélés
kinetokór
centroszóma kinetokór MT
anafázis
47 Rebecca W. Heald: Burning the spindle at both ends NATURE VOL 427 2004
MIKROTUBULUS MOTOROK & A KROMOSZÓMÁK SZEGREGÁCIÓJA kinetokór
MT depolimerizáló kinezin
MT depolimerizáló kinezin
dinaktin
dinein
MT alegység áramlás
centroszóma
48 Rogers et. al.: Two mitotic kinesins cooperate to drive sister chromatid separation during anaphase NATURE | VOL 427 | 22 J 2004
MIKROTUBULUS MOTOROK ÉS AZ OSZTÓDÁSI ORSÓ KIALAKULÁSA dinein
kinezin
49
OSZTÓDÁSI ORSÓK CENTROSZÓMÁK NÉLKÜL !!! legtöbb állati sejt
növények
nőstény meiózis
Patricia Wadsworth and Alexey Khodjakov: E pluribus unum: towards a universal mechanism for spindle assembly. TRENDS in Cell Biology Vol.14 No.8 2004
50
HOGYAN ALAKULNAK KI CS NÉLKÜL AZ OSZTÓDÁSI ORSÓK? NUKLEÁCIÓ
ORGANIZÁCIÓ
PÓLUS KÉPZÉS
Oliver J. Gruss and Isabelle Vernos: The mechanism of spindle assembly: functions of Ran and its target TPX2. The Journal of Cell 51 Biology, Volume 166, Number 7, 2004 949–955
MIKROTUBULUS MOTOROK ÉS AZ OSZTÓDÁSI ORSÓ KIALAKULÁSA
tetramer kinezin
kromoszómához kötött kinezin
dinein komplex
centroszómával
centroszóma nélkül
Andreas Merdes and Don W. Cleveland: Pathways of Spindle Pole Formation: Different Mechanisms; Conserved Components 52 The Journal of Cell Biology 138, Number 5, September 8, 1997, 953–956
A KROMOSZÓMÁK SZÉTVÁLÁSA A MEIÓZIS SORÁN r r y Y Y Heterozygous Yy, rR diploid cell (YyRr) to undergo meiosis R R y
y
Y
R
r
y
Y
r
R
Meiózis I
y
y
Y
Y
y
y
Y Y
r
r
R R
vagy R
R
r r
Meiózis II y
y R
Y r
R 2 Ry
:
y
Y r
2 rY
r
y
Y
r 2 ry
R :
Y R
2 RY
53
MEIÓZIS SPERMATOGENEZIS
OOGENEZIS
ősivarsejt spermatogónium/ oogónium
Mitózis Mitózis
elsődleges spermatocita/oocita Meiózis I
A NŐI MEIÓZIS ASSZIMMETRI KUS: 1 PETESEJT + 3 SARKI TEST I. PROFÁZIS ÉS II. METAFÁZIS ARREST
másodlagos spermatocita/oocita Meiózis II spermatida/ootida
spermium/ovum 54
MEIÓTIKUS NONDISZJUNKCIÓ
55
CITOKINÉZIS A telofázisban 2 sejtmag van közös citoplazmában. A citokinézis az utódsejtek citoplazmájának kettéválása.
hasadási sík kiválasztás
kontraktilis gyűrű kialakulás és összehúzódás
középtest képzés
sejt szétválás
Az aktomiozin-kontraktilis gyűrű nélkülözhetetlen a sejtosztódás végén a két 56 leánysejt szétválásához. Michael Glotzer :ANIMAL CELL CYTOKINESIS Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. 17:351–86
CITOKINÉZIS
Tubulin-GFP
Aktin-GFP
57
A SEJTCIKLUS SZABÁLYOZÁSA 58
59
A SEJTCIKLUS SZAKASZAI G2 fázis
mitózis
M fázis citokinézis
Interfázis
S fázis
DNS replikáció
G1 fázis 60
KROMOSZÓMÁK és a SEJTCIKLUS
61
A SEJTCIKLUS ALAPVETŐ FOLYAMATAIT EGY SZABÁLYOZÓ EGYSÉG INDÍTJA EL Mitótikus orsó összeszerelése
Sejtosztódás befejezése
mitótikus gépezet indítása
kr. szegregációs gépezet indítása
M kezdete
M vége
szabályozó
S kezdete DNS replikációs gépezet indítása
DNS DNS replikációja replikáció
62
AZ ELLENŐRZÉSI PONTOKNÁL A SEJTCIKLUS VISSZATARTHATÓ Befejeződött-e a DNS replikáció? Történt-e DNS károsodás?
G2 ELLENŐRZÉSI PONT
Kialakult-e a mitótikus orsó? Kapcsolódtak-e a kromoszómák az orsófonalakhoz?
METAFÁZIS ELLENŐRZÉSI PONT
M kezdete
M vége
S kezdete
G1 ELLENŐRZÉSI PONT Kedvezők-e a környezeti feltételek? Sejt proliferációs szignálokat kapott-e a sejt?
63
KILÉPÉS A SEJTCIKLUSBÓL-G0
Interfázis
G0 64
M FÁZIS PROMÓTÁLÓ FAKTOR (MPF): CIKLIN DEPENDENS KINÁZ (CDK)+CIKLIN
Cdk 1 CIKLIN B
NAGYSZÁMÚ CÉLFEHÉRJÉT AKTIVÁL/INAKTIVÁL FOSZFORILÁCIÓVAL, A SEJT MŰKÖDÉSE MEGVÁLTOZIK.
A KINÁZOK ANTAGONISTÁI A FOSZFATÁZOK.
65
M FÁZIS PROMÓTÁLÓ FAKTOR (MPF): CIKLIN DEPENDENS KINÁZ (CDK)+CIKLIN Relatív koncentráció
MPF aktivitás
mitótikus ciklin
idő
MPF CSAK MAGAS CIKLIN KONCENTRÁCIÓNÁL AKTÍV
66
MAGASABBRENDŰ EUKARIÓTÁK CDK/CIKLIN KOMPLEXEI Cdk-s Cdk4
Cdk2
ciklinek
M
D
G1
Cdk1
E
A
S
B(A)
G2
M G1
Start
Sejt ciklus fázisok
67
CDK SZABÁLYOZÁSI MECHANIZMUSOK CIKLIN
CDK INHIBÍTOR
AKTIVÁLÓ FOSZFORILÁCIÓ
GÁTLÓ FOSZFORILÁCIÓ
68
CDK SZABÁLYOZÁSI MECHANIZMUSOK FOSZFORILÁCIÓ-DEFOSZFORILÁCIÓ inaktív foszfatáz
cdk aktiváló kináz
M-ciklin
Pozitív visszacsatolás
gátló foszfát
aktíváló foszfát Cdk1
Inaktív M-Cdk
cdk gátló kináz
Inaktív M-Cdk
aktív M-Cdk
69
CDK SZABÁLYOZÁSI MECHANIZMUSOK CIKLIN DEPENDENS KINÁZ INHIBITOROK (CDKI) ciklin
Cdk
aktív ciklin-Cdk komplex
p27
inaktív ciklin-Cdk-p27 komplex
INHIBÍTOR FEHÉRJE (P27/CDKI) KÖTŐDÉSE INAKTIVÁLJA A CIKLIN-CDK KOMPLEXET
70
CDK SZABÁLYOZÁSI MECHANIZMUSOK UBIQUITIN-FÜGGŐ PROTEIN DEGRADÁCIÓ SCF-függő proteolízis aktív SCF poliubiquitin lánc
CDKI degradáció Cdk inhibítor fehérje (CDKI)
proteaszóma Ubiquitiláló enzimek
APC-függő proteolízis Aktiváló alegység (Cdc20)
poliubiquitin lánc
inaktív APC
aktív APC
M-ciklin degradáció
Ubiquitiláló enzimek
71
A PROTOONKOGÉNEK A SEJTCIKLUS PROGRESSZIÓT ELŐSEGÍTŐ NORMÁLIS GÉNEK. DOMINÁNS MUTÁCIÓK HATÁSÁRA ONKOGÉNNÉ VÁLNAK. CDK ÉS CIKLINEK DOMINÁNS MUTÁCIÓI (HIPERMORF) RÁKKÉPZŐDÉSHEZ VEZETNEK. 72
SEJTCIKLUS ELLENŐRZŐ PONTOK METAFÁZIS ELLENŐRZŐ PONT Kromoszóma-osztódási
orsó kapcsolat
G2/M ELLENŐRZŐ PONT Sejtméret DNS
károsodás G1/S ELLENŐRZŐ PONT
Sejtméret
Tápanyagok Növekedési
faktorok DNS károsodás
G0 73
G1/S ELLENŐRZŐ PONT DNS károsodás DNS
Protein kináz aktiváció Stabil, Aktív p53 p53 foszforiláció
p53 kötődik a p21 gén promóteréhez
p53 degradáció
transzkripció P21 mRNS transzláció
P21 (CKI)
AKTÍV
INAKTÍV
74
G1/S ELLENŐRZŐ PONT
75
G1/S ELLENŐRZŐ PONT
E2F célgének expressziója
Az Rb protein az E2F transzkripciós faktor megkötésével gátolja a G1/S átmenetet (lsd. Részletes G1/S ábrát). Az E2F szükséges pl. a c-myc & 76 c-fos proto-onkogének transzkripciójához.
ATM (ataxia telangiectasia mutated) telangiektázia neurodegeneráció immunrendszer problémák
hajlam a rákképződésre
sugárérzékenység sterilitás
Az ataxia telangiektázia tünetei. Az ATM protein a DNS károsodás detektálásában játszik szerepet. (lsd. Részletes G1/S ábrát)
77
SEJTCIKLUS ELLENŐRZŐ PONTOK METAFÁZIS ELLENŐRZŐ PONT Kromoszóma-osztódási
orsó kapcsolat
G2/M ELLENŐRZŐ PONT Sejtméret DNS
károsodás G1/S ELLENŐRZŐ PONT
Sejtméret Tápanyagok Növekedési
faktorok DNS károsodás
G0 78
G2/M ELLENŐRZŐ PONT DNS replikáció befejeződött
DNS replikáció nem teljes/károsodott DNS
ellenőrző pont fehérjék
ellenőrző pont fehérjék
mitózis
mitózis
Várakozás G2-ben 79
G2/M ELLENŐRZŐ PONT
cdk1
80
SEJTCIKLUS ELLENŐRZŐ PONTOK METAFÁZIS ELLENŐRZŐ PONT Kromoszóma-osztódási
orsó kapcsolat
G2/M ELLENŐRZŐ PONT Sejtméret DNS
károsodás G1/S ELLENŐRZŐ PONT
Sejtméret Tápanyagok Növekedési
faktorok DNS károsodás
G0 81
META/ANAFÁZIS ÁTMENET Leány kromatidák
kohezin
szeparin
metafázis
anafázis
szeparin
degradált szekurin
szekurin
Anafázis Promótáló Komplex (APC)
MPF
degradált mitótikus ciklin
82
META/ANAFÁZIS ÁTMENETMETAFÁZIS ELLENŐRZŐ PONT abnormális osztódási orsó
MI TÖRTÉNNE A METAFÁZIS ELLENŐRZŐ
anafázis
PONT NÉLKÜL?
citokinézis A RÁKOS SEJTEK GYAKORLATILAG MIND ANEUPLOIDOK
ANEUPLOID SEJTEK Hiányzó kromoszóma
Extra kromoszóma
83
META/ANAFÁZIS ÁTMENETMETAFÁZIS ELLENŐRZŐ PONT
metafázis
anafázis
Anafázis nem következik be addig, amíg minden kinetokórhoz nem kapcsolódott mikrotubulus
84
META/ANAFÁZIS ÁTMENETMETAFÁZIS ELLENŐRZŐ PONT Ellenőrző pont inaktív
A kinetokór kapcsolódik két oldalról MT-al
Anafázis elkezdődik Ellenőrző pont aktív
HTLV-1 vírus Tax fehérjéje megköti és inaktiválja a MAD proteint: T sejtes leukémia A kinetokór nem kapcsolódik két oldalról MT-al
Anafázis gátolva
85
A metafázis ellenőrző pont az APC-t inaktiválja
A SEJTCIKLUS ELLENŐRZŐ PONTOKBAN RÉSZTVEVŐ FEHÉRJÉKET KÓDOLÓ GÉNEK A TUMOR SZUPRESSZOR GÉNEK. A TUMOR SZUPRESSZOR GÉNEK A SEJTCIKLUS PROGRESSZIÓT GÁTOLJÁK. A TUMOR SZUPRESSZOR GÉNEK RECESSZÍV, FUNKCIÓVESZTÉSES MUTÁCIÓI RÁKKÉPZŐDÉSHEZ VEZETNEK. a tumor szupresszorok epigenetikailag is inaktíválódnak metilációval.
86
