Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
Polisakarida mannan PRODUK SAMPING PEMBUATAN KONSENTRAT PROTEIN DARI BUNGKIL INTI SAWIT SEBAGAI PENGENDALI Eschericia coli (IN VITRO) (Mannan Polysaccharides in Byproducts of Protein Concentrate from Palm Kernels as Eschericia coli Control) SYAHRUDDIN1, YATNO2, N. RAMLI3 dan K.G. WIRYAWAN3 1
Fakultas Pertanian Universitas Negeri Gorontalo 2 Fakultas Peternakan Universitas Jambi 3 Fakultas Peternakan Institut Pertanan Bogor
ABSTRACT The objective of the research was to evaluate efficacy of mannan containing polysaccharide against several strains of Eschericia coli, namely; (ATCC 25922, EHEC 0157, E. coli from chicken gut and K 9 from cattle gut). PM was obtain from by product of protein extraction from PKM. The parameters measured were agglutination test, inhibition test in liquid media and resistance bacteria against E. coli strains. Aglutination test was done by mixing bacteria and PM (1 : 1) in object glass and observed under microscope. Inhibition test was done by culturing bacteria in liquid media containing 0, 3 000 and 6 000 ppm of PM interm of total sugar, while resistance test of bacteria was done in agar medium using cakram paper containing PM and then clear zone was of observed. The result showed that there were positif result in aglutinantion test in all strains of E. coli bacteria, while clearing zone was not observed. How ever total number of all strains of E. coli decreased as the concentration of PM in the media increased. It is concluded that PM from PKM is capable of agglutinantinized of all E. coli strains and decreasing total number of bacteria without bacteriocidal effect. Key Words: Mannan Polysaccharide, palm kernel meal, Eschericia coli ABSTRAK Bungkil inti sawit (BIS) merupakan hasil ikutan dari pengolahan minyak inti sawit yang ketersediaannya di Indonesia cukup tinggi. Penggunaan BIS dalam pakan unggas memiliki keterbatasan karena kandungan βmannan yang tinggi pada BIS yang tergolong polisakarida bukan pati (NSP: Non Starch Polysaccharides). Namun disisi lain polisakarida mannan BIS berpotensi sebagai imbuhan pakan seperti prebiotik yang akan meningkatkan kesehatan ternak. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji kemampuan polisakarida mannan dari bungkil inti sawit sebagai pengendali Eschericia coli (in vitro). Ekstraksi bungkil inti sawit dilakukan dengan cara kombinasi fisik dan kimia untuk mendapatkan konsentrat protein sebagai produk utama dan produk samping berupa polisakarida mannan/PM BIS. Efek dari polisakarida mengandung mannan dari BIS sebagai pengendali E. coli dilakukan dengan uji aglutinasi, uji hambat pada media cair dan uji resistensi bakteri. Pengujian tersebut dilakukan dengan menggunakan 4 strain bakteri E. coli (ATCC 25922, EHEC 0157, E. coli dari usus ayam dan K 9 dari usus sapi) dan PM BIS. Uji aglutinasi secara kualitatif dilakukan dengan cara mencampurkan suspensi bakteri dan PM (1 : 1) pada objek glass. Uji hambat pada media cair dilakukan dengan cara menumbuhkan bakteri dalam media nutrient Broth (104, 105 dan 106 CFU/ml) ditambah PM konsentrasi 0, 3 000, 6 000 ppm berdasarkan kandungan total gulanya. Uji resistensi bakteri pada medium agar dengan menggunakan kertas cakram mengandung PM (0, 3 000, 6 000 ppm) dengan indikator pembentukan zona bening. Hasil penelitian menunjukkan bahwa uji aglutinasi memperlihatkan hasil yang positif secara mikroskopis yang ditandai dengan terjadinya efek penggumpalan (clumping) bakteri. Penggunaan PM BIS pada tingkat 3 000 ppm menunjukkan penurunan jumlah koloni bakteri yang lebih banyak dibanding pada tingkat 6 000 ppm. Uji zona bening (clearing zone) menunjukkan hasil yang negatif. Dapat disimpulkan bahwa pengujian in vitro PM BIS dapat mengaglutinasi semua strain E. coli yang digunakan, menurunkan jumlah koloni pada konsentrasi 3 000 ppm dan tidak bersifat bakterisidal. Kata Kunci: Polisakarida Mannan, Bungkil Inti Sawit, Eschericia coli
617
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
PENDAHULUAN Bungkil inti sawit merupakan hasil ikutan dari industri pengolahan minyak inti sawit yang ketersediaanya di Indonesia cukup tinggi, BIS dapat digunakan untuk mendapatkan mannan. TAFSIN (2007) melaporkan bahwa ekstraksi BIS menghasilkan kandungan mannosa mencapai 74% dari total gula terekstrak, komponen gula dominan yang terdeteksi berupa galaktomannan dengan rasio antara galaktosa dan mannosa mencapai 1 : 3. Sekarang ini banyak dikembangkan bahan alam yang mengandung komponen mannosa untuk mengendalikan bakteri patogen yang merugikan ternak. Kolonisasi bakteri Salmonella, E. coli dan Vibrio cholera dalam saluran pencernaan diperantarai oleh reseptor yang dikenal dengan nama fimbriae tipe I dan penempelannya spesifik terhadap mannosa (MULLER et al., 1991; ALTHOUSE, 2003; DE BUCK et al., 2005). Dengan demikian penambahan komponen mannosa dalam pakan akan mencegah terjadinya penempelan pada saluran pencernaan, sehingga proses kolonisasi bakteri tidak terjadi. SPRING et al. (2000) menemukan bahwa mannanoligosakarida (MOS) dapat mengaglutinasikan 5 dari tujuh starin E. coli dan 7 dari 10 strain Salmonella thypimurium dan Salmonella enteridis. Informasi penggunaan BIS sebagai sumber mannose masih sangat terbatas. Melihat potensi tersebut menarik untuk diteliti penggunaan polisakarida mengandung mannan produk samping pembuatan konsentrat protein dari bungkil inti sawit sebagai pengendali E. coli (in vitro). Pada penelitian ini polisakarida mannan yang digunakan telah dipisahkan dari komponen protein pada pH isolelektrik. MATERI DAN METODE Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain; bungkil inti sawit (BIS), kultur bakteri E. coli 4 strain, media nutrien agar dan nutrien broth, pecahan kaca, asam asetat 0.05 N, NaOH 1 N, HCl 0.1 N dan kertas cakram. Alat yang digunakan antara lain; mortal grinder, autoklaf, mesin cuci, ruang pemekatan, talang plastik, sentrifuge, tabung dialisis, rotary evaporator dan spektrofotometer.
618
Proses ekstraksi bungkil inti sawit Proses ekstraksi BIS dilakukan berdasarkan metode RAMLI (2005) dan TAFSIN (2007). Pemisahan padatan (ampas) dan filtrat menggunakan mesin cuci (spin 3 x 8 menit). Filtrat yang diperoleh diendapkan dengan HCl 0.1 N sampai tercapai titik isoelektrik, sehingga padatan (protein) mengendap dan diperoleh cairan yang akan digunakan pada penelitian ini. Cairan selanjutnya dipekatkan pada ruang pemekatan (100 x 50 x 50 cm; 41°C; 96 jam) sampai kental kemudian disentrifugasi (himac CR 21G; pada 12 000 G; 15 menit). Supernatan yang diperoleh dinetralkan dari pengaruh bahan kimia dengan cara dialisis menggunakan tabung dialisis (dialysis tube 33 x 21 mm). Selanjutnya dievaporasi menggunakan rotary evaporator sebelum disentrifugasi. Supernatan yang diperoleh merupakan “Polisakarida Mannan/PM” yang akan digunakan sebagai pengendali E. coli in vitro. Pengujian in vitro Uji aglutinasi Uji aglutinasi dilakukan guna melihat kemampuan PM untuk mengikat bakteri. Pengujian ini dilakukan secara kualitatif menggunakan modifikasi metode SPRING et al. (2000). Standarisasi konsentrasi bakteri dilakukan dengan cara menumbuhkan kultur bakteri selama 24 jam menggunakan media nutrien Broth. Sel bakteri dipanen dengan cara sentrifugasi dan disuspensikan ke dalam Phosphate Buffer Saline (PBS) (0.05M) pada pH 7,2 dan diukur pada kerapatan optik (OD 660 nm = 1,60). Hal yang sama dilakukan terhadap PM dengan melarutkan pada PBS (OD 660 nm = 1.60). Uji aglutinasi dilakukan dengan cara mencampurkan suspensi bakteri dan PM (1 : 1) pada objek glass dan dibiarkan selama 5 menit, selanjutnya diamati aglutinasi dengan menggunakan mikroskop. Uji hambat pada media cair Pengujian dilakukan terhadap bakteri 4 strain E. coli dalam media Nutrient Broth yang ditambah PM dengan konsentrasi 0; 3 000; dan
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
6 000 ppm berdasarkan kandungan total gulanya. Jumlah koloni awal yang dimasukkan yaitu 104, 105 dan 106 CFU/ml, selanjutnya kultur tersebut diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C dan pengamatan dilakukan terhadap jumlah koloni yang terbentuk (CFU). Perhitungan koloni dilakukan dengan melakukan pengenceran secara seri menggunakan NaCl fisiologis dan dilanjutkan kultur pada cawan petri dengan menggunakan media Nutrien agar. Jumlah koloni dihitung setelah dilakukan inkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C. Uji resistensi Pengujian aktivitas PM terhadap 4 strain bakteri E. coli dilakukan dengan cara kultur bakteri pada cawan petri menggunakan media Nutrien Agar. Metode yang digunakan untuk uji resistensi yaitu menggunakan kertas cakram yang sudah diberi PM. Konsentrasi PM yang diuji yaitu 0; 3 000; dan 6 000 ppm berdasarkan
kandungan total gula, dan dimasukkan sebanyak 50 ul ke dalam kertas cakram. Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 24 – 48 jam dan diamati ada atau tidaknya pembentukan zona bening (clearing zone) pada kultur media tersebut. HASIL DAN PEMBAHASAN Uji aglutinasi Hasil uji aglutinasi pada 4 strain bakteri E. coli (ATCC 25922, EHEC 0157, E. coli dari usus ayam dan K 9 dari usus sapi) menunjukkan bahwa polisakarida mengandung mannan secara visual belum memperlihatkan adanya penggumpalan, namun secara mikroskopis terlihat adanya perbedaan antara perlakuan kontrol dengan perlakuan polisakarida mannan. Gambaran foto mikroskopis uji aglutinasi dapat dilihat pada Gambar 1.
(a)
(b)
ATCC 25922
ATCC 25922 + PM
EHEC 0157
EHEC 0157 + PM
E. coli dari usus ayam
E. coli dari usus ayam + PM
K 9 dari usus sapi
K 9 dari usus sapi + PM
Gambar 1. Hasil uji aglutinasi terhadap 4 strain Eschericia coli (pembesaran 40 x) (a) kontrol (b) E. coli + Polisakarida Mannan BIS (1 : 1)
619
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
Gambar 1 menunjukkan adanya perbedaan antara perlakuan kontrol dengan perlakuan yang diberi PM. Perbedaan yang tampak yaitu adanya penumpukan bakteri (tanda panah) pada partikel yang mengandung PM (lebih gelap), menunjukkan PM dari BIS mampu menggumpalkan 4 strain E. coli (ATCC 25922, EHEC 0157, E. coli dari Usus Ayam dan K 9 dari usus sapi). Hal tersebut mengindikasikan bahwa adanya aktivitas berupa penempelan antara komponen mannosa dari PM dengan reseptor bakteri. Fimbriae tipe I merupakan reseptor yang penempelannya sensitif terhadap mannosa (MULLER et al. 1991; ALTHOUSE, 2003; DE BUCK et al. 2005). Spring et al. (2000) melaporkan bahwa mannanoligosakarida (MOS) dapat mengaglutinasikan 5 dari tujuh starin E. coli dan 7 dari 10 strain S. thypimurium dan S. enteridis. Penelitian ini sejalan dengan TAFSIN (2007) bahwa penggunaan polisakarida mengandung mannan dari BIS menunjukkan hasil positif secara mikroskopis, yaitu dapat mengaglutinasikan S. thypimurium. Walaupun hasil uji aglutinasi secara visual tidak sejelas seperti yang dilakukan oleh SPRING et al. (2000) dan PEREZ-SOTELO et al. (2005) yang menggunakan sel S. cerevisiae sebagai bahan
uji. Perbedaan tersebut diduga karena pada penelitian ini menggunakan ekstrak berupa cairan (bukan sel) sehingga efek aglutinasinya secara visual belum tampak, tetapi pengamatan secara mikroskopik serupa yang dilaporkan PEREZ-SOTELO et al. (2005). Uji hambat pada media cair Hasil uji hambat pada media cair menggunakan media nutrient broth yang ditambah polisakarida mannan (0; 3000 dan 6000 ppm) disajikan pada Gambar 2. Gambar 2 menunjukkan adanya penurunan jumlah koloni bakteri pada penambahan 3 000 ppm PM BIS dalam media cair. Penurunan jumlah koloni pada strain E. coli berturut-turut; ATCC 25922 (3,7 x 105 menjadi 1,0 x 104 CFU/ml), EHEC 0157 (3,7 x 105 menjadi 4,0 x 104 CFU/ml), K9 dari usus sapi (3,7 x 105 menjadi 4,0 x 104 CFU/ml) dan E. coli dari Usus ayam (3,7 x 105 menjadi 8,0 x 104 CFU/ml). Sedangkan pada penambahan 6000 ppm PM BIS terjadi penurunan jumlah koloni bakteri E. coli tidak signifikan berturut-turut; ATCC 25922 (3,7 x 105 menjadi 1,6 x 105 CFU/ml), EHEC 0157 (3,7 x 105 menjadi 1,6 x
Gambar 2. Profil daya hambat PM BIS pada 4 strain E. coli terhadap koloni bakteri yang terbentuk (log CFU/ml)
620
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
105 CFU/ml), K9 dari usus sapi (3,7 x 105 menjadi 1,7 x 105 CFU/ml) dan E. coli dari Usus ayam tidak terjadi penurunan jumlah koloni. Pengamatan terhadap penembahan PM BIS dalam media cair menunjukkan bahwa bakteri E. coli masih dapat berkembang biak yang menunjukkan PM BIS tidak bersifat bakteriostatik. Penurunan jumlah koloni bakteri diduga diakibatkan terjadinya efek penggumpalan (clumping) bakteri, sehingga ketika dikultur pada media agar jumlah koloni yang terhitung menjadi lebih sedikit. Efek penggumpalan tersebut terlihat secara mikroskopik pada pengamatan uji aglutinasi. Penurunan jumlah koloni tersebut juga mengindikasikan bahwa bakteri E. coli tidak dapat menggunakan PM BIS sebagai salah satu sumber makanan untuk pertumbuhannya. TAFSIN (2007) melaporkan bahwa penggunaan ekstrak polisakarida mannan dari BIS (0 – 4000 ppm) menunjukkan adanya penurunan koloni bakteri S. thypimurium, seiring dengan meningkatnya kandungan polisakarida mannan dalam media cair. Uji resistensi Hasil uji resistensi terhadap bakteri E. coli 4 strain (ATCC 25922, EHEC 0157, E. coli dari Usus Ayam dan K 9 dari usus sapi) pada medium agar dengan menggunakan kertas cakram yang mengandung konsentrasi polisakarida mengandung mannan (0, 3000 dan
6000 ppm) secara visual dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3 memperlihatkan hasil yang negatif yaitu tidak adanya pembentukan zona bening (clearing zone). Uji zone bening yang negatif mendukung penelitian sebelumnya bahwa polisakarida mengandung mannan dari BIS tidak mempunyai aktivitas yang bersifat membunuh bakteri (bakterisidal). KESIMPULAN Polisakarida Mannan BIS yang diperoleh dari hasil samping pembuatan konsentrat protein dapat mengaglutinasi semua strain E. coli yang digunakan, menurunkan jumlah koloni pada konsentrasi 3000 ppm dan tidak bersifat bakterisidal. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terimah kasih kami sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Desentralisasi Penelitian Nomor: 318/SP2H/ PP/DP2M/III/2008, tanggal 5 Maret 2008 yang telah membiayai pelaksanaan penelitian hibah tim Pascasarjana melalui Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor.
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 3. Hasil uji resistensi bakteri E. coli 4 strain: (a) ATCC 25922, (b) EHEC 0157, (c) E. coli dari Usus Ayam dan (d) K 9 dari usus sapi
621
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
DAFTAR PUSTAKA ALTHOUSE, C., S. PATTERSON, P. FEDORKA-CRAY and R.E. ISSACSON. 2003. Type 1 fimbriae of Salmonella enterica serovar thyphimurium bind to enterocytes and contribute to colonisation of swine in vivo. Infect. Immun. 71(11): 6446 – 6452. DE BUCK, L., F. VAN IMMERSEL, F. HAESEBROUCK and R. DUCATELLE. 2005. Protection of laying hens against Salmonella enteridis by immunization with type 1 fimbriae. Vet. Microbial. 105(2): 93 – 101. MULLER, K.H., S.K. COLLINSON, T.J. TRUST and W.W. KAY. 1991. Type 1 fimbriae os Salmonella enteridis. J. Bacteriol. 173(15): 4765 – 4772. PEREZ-SOTELO et al. 2005. In vitro evaluation of the binding capacity of Saccharomyces cerevisiae Sc47 to adhere to the wall of Salmonella spp. Rev. Latinoam Microbiol. 47: 70 – 75.
622
RAMLI, N. 2005. Daya hambat polisakarida mengandung mannan yang diekstraksi dari bungkil inti sawit terhadap Salmonella spp. dan E. coli secara in vitro. Proseding Seminar Nasional Asosiasi Ahli Ilmu Nutrisi dan Pakan Indonesia (AINI) V. Universitas Brawijaya, Malang. SPRING, P., C. WENK, K.A. DAWSON and K.E. NEWMAN. 2000. The effects of dietary Mannanoligosaccharides on cecal parameters and the concentrations of enteric bacteria in the ceca of Salmonella-challenged broiler chicks. Poult. Sci. 79: 205 – 211. TAFSIN, M. 2007. Kajian Polisakarida Mannan dari Bungkil Inti Sawit sebagai Pengendali Salmonella thypimurium dan Immunostimulan pada Ayam. Disertasi. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor .
