POLIMORFISME GEN MX PADA AYAM LOKAL DI SULAWESI TENGGARA Oleh: Muhammad Amrullah Pagala1) ABSTRACT The objective this reseacrh was knowed the polymorfism Mx gene of Tolaki Chicken and Kampung Chicken. As a threatment in this research was carried out experiment by using 12 Tolaki chicken, consist of 6 Tolaki Chicken and 6 Kampung Chicken from Konawe Selatan Regency. The research was conducted from September to Nopember 2012. The Method of this research was using DNA Extraction according to Sambrook, et al (1989). The polymorfism test of Mx Gene was conducted based on PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction- Restriction Fraghment Long Polymorfism) according to Ko et al (2002); Maeda (2005) and Sulandari et al (2007). The spesifik primer Mx gene according to Seyama et al (2006) was Foward NE-F2 (5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTAGG AA3’) and Reverse NE-R2/R (5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCGTGTA3). Result showed that all Tolaki Chicken and village Chicken sample had Mx gene with 299 bp. While the test results show the chicken Mx gene polymorphism has a degree Tolaki Mx gene polymorphism is very high with the A allele frequency of (0.83) is higher than Kampung chickens (0,67). Overall a total of 12 samples of native chickens Southeast diSulawesi have A allele frequency or f (A) is very high with an allele frequency of 0.75 A and G allele frequency of 0.25. Keywords : local chicken, polymorfism, Mx gene and PCR-RFLP.
PENDAHULUAN Ayam lokal di Indonesia memiliki potensi yang sangat besar untuk pengembangan dan peningkatan mutu genetiknya. Potensi genetik ini tercermin dari tingginya keragaman sifat-sifat yang dimiliki, baik sifat-sifat tampilan fisik maupun produktivitasnya (Mansjoer, 2003). Tingginya keragaman sifat ayam lokal merupakan bahan baku genetik yang dapat dimanfaatkan guna membentuk galur ayam unggul, melalui seleksi yang ketat dan terarah terutama terhadap sifat-sifat yang bernilai ekonomis tinggi seperti produksi daging dan telur, kemampuan adaptasi serta daya tahan terhadap penyakit. Di daerah tropis tingginya prevalensi penyakit dan terbatasnya upaya meningkatkan mutu genetik merupakan faktor utama yang membatasi produktivitas ayam lokal (Otim, 2005). Beberapa riset sebelumnya yang melihat hubungan asosiasi penyakit dan karakterisasi gen pada ayam lokal telah dilakukan oleh Dalgaard, et al (2003) dan Maeda (2005). Hasil ini mempertegas kemampuan ternak dalam 1
merespon serangan penyakit ternyata dikendalikan oleh sejumlah gen. Ayam Tolaki merupakan salah satu dari 31 jenis ayam lokal yang memiliki karakteristik penampilan yang khas (Nataamidjaja dan Dwiyanto, 1994). Ayam Tolaki adalah ayam lokal asli Sulawesi Tenggara. Sebagaimana yang dinyatakan Sarwono (2005), bahwa ayam yang berbadan atletis ini diperkirakan berasal dari Sulawesi Tenggara. Habitat ayam ini terdapat di wilayah yang berdekatan dengan hutan, diduga kuat ayam Tolaki merupakan hasil perkawinan dari ayam Kampung dan ayam hutan. Oleh karena itu ayam Tolaki memiliki sifat-sifat yang mirip dengan ayam hutan seperti pola warna bulu dan sifat liar (agresifitasnya) yang mirip dengan ayam hutan merah (Gallus-gallus), termasuk beberapa sifat ketahanannya terhadap beberapa penyakit viral. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa aliran gen Mx pada ayam lokal yang mengendalikan sifat daya tahan penyakit viral pada ayam diperoleh dari atau bersumber dari ayam hutan. Keberadaan gen Mx pada ayam lokal telah dibuktikan oleh hasil penelitian Pagala
)Staf Pengajar Jurusan Peternakan Volume Fakultas Peternakan Universitas Oleo, Kendari AGRIPLUS, 23 Nomor : 02 MeiHalu 2013, ISSN 0854-0128
118
119
dan Aku (2012) yang menemukan adanya gen Mx pada ayam Tolaki dengan panjang ukuran pita 299 bp. Karakterisasi genetik sifat ekonomis pada ayam lokal melalui analisis DNA termasuk identifikasi molekuler sifat ketahanan terhadap penyakit viral masih sangat sedikit dilakukan. Oleh karena itu penting melakukan penelitian analisis molekuler ayam lokal untuk menghasilkan karakterisasi genetik sifat ketahanan penyakit viral yang dimilikinya. Berdasarkan Pemikiran tersebut, maka telah dilakukan suatu penelitian molekuler yang dapat menggambarkan derajat polimorfisme sifat resistensi penyakit viral pada Ayam Tolaki. METODE PENELITIAN Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan bulan September sampai Nopember 2012 Lokasi pengambilan sampel dilaksanakan di Kabupaten Konawe Selatan Propinsi Sulawesi Tenggara. Analisis sampel di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Molekuler Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas peternakan IPB Bogor. Materi Penelitian Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ayam Tolaki dan ayam kampung yang diambil dari beberapa daerah di Kabupaten Konawe Selatan Sulawesi Tenggara sebanyak 12 ekor. Selanjutnya analisis di Laboratorium. Bahan yang digunakan adalah bahan kimia untuk pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, gel elektroforesis, dan Silver Staining antara lain : EDTA, Trs, HCL pekat, potassium asetat, air bebas ion, NaCl, NaOH, SDA, natrium asetat, asam asetat, fenol, etanol absolute, kloroform, isoamil alkohol, dan proteinase K, agarose, bromfenolblue, etidium Bromida, marker DNA leader 100 pb, Tris-Borat-EDTA, Mgcl2, dNTP, Taq polymerase dan random primer. Alat yang digunakan mesin PCR, elektroforesis, autoclave, vacuum tainer, pipet mikro, pipet tip,disposable glove,
sentrifuse, vortex,gelas piala, magnetic stirrer, tabung eppendorf, alat thremocycler, lampu UV, kamera paraloid. Isolasi DNA Total Isolasi DNA Total dilakukan dengan menggunakan metode pemurnian fenol dan presipitasi dengan etanol menurut (Sambrook, et al, 1989). Adapun prosedur pelaksanaannya adalah sebagai berikut : 1. Darah ayam sebanyak 250 µl yang sebelumnya telah ditambahkan EDTA 10% dipindahkan kedalam tabung ependorf 1,5 ml. 2. Ditambahkan digestion buffer (SDS 1% v/v, 10 mM EDTA, pH 8, 20 mM NaCl, 50 mM, Tris HCL pH 9) sebanyak 500 µl dan dikocok. 3. Inkubasi pada suhu 550C selama semalam atau 16 jam. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA pada praktikum ini menggunakan protokol ekstraksi DNA metode phenol (Sambrook, et al, 1989). Sebagai berikut : 1. 250 µl sampel darah dalam EtOH dipindahkan ke tabung 1,5 ml 2. Ditambahkan 1000 µl DW/TE dan lisis buffer 500 µl dikocok pada votex dan didiamkan selama 5 menit. 3. Sentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit 4. Supernatannya dibuang dan endapannya (pelet) disuspensikan dengan larutan 40 L SDS 10% dan 10 L Protk 5 mg/ml, dan 1 x STE sampai 400 µl. 5. Dikocok pelan dalam inkubator pada suhu 55°C selama 2 jam. 6. Supernatan sisa diekstraksi dengan penambahan 1 x volume 400 µl phenol400 µl (chloroform-Isoamil alkohol,24:1) dan 40 µl 5M Nacl. Dikocok pelan pada suhu ruang selama 1 jam. 7. Sentrifuge pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Bagian bening (DNA) dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru. 8. Ditambahkan 800 µl Etanol absolut dan 40 µl 5 M Nacl. 9. Selanjutnya tabung difreezing selama (lebih dari) 30 menit/over night.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
120
10. Larutan kemudian disentrifuse pada 12.000 xg selama 5 menit untuk mempresipitasi Asam Nukleat. 11. Supernatan dibuang dan pelet dibilas dengan 800 L Etanol 70% (etanol kemudian dibuang). 12. Diamkan dalam keadaan terbuka dalam desikator atau ruang terbuka sampai alkoholnya hilang. 13. Ditambahkan 100 µl.TE 80% atau Elution Buffer dan DNA kemudian disimpan dalam freezer sampai akan digunakan. Identifikasi dan Uji Polimorfisme gen Mx Secara umum metode genotiping yang akan dilakukan untuk mengidentifikasi genotip jenis gen adalah PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). Metode PCR-RFLP mengikuti metode penggunaan penanda molekuler gen menurut metode analisis Gen Mx+ PCR-RFLP oleh Ko et al (2002); (Maeda, 2005) dan Sulandari et al, 2007). Primer spesifik untuk mengamplifikasi gen Mx berdasarkan Seyama et al (2006) adalah primer Foward M A1 A2 A3 A4 A5 A6
NE-F2 (5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTA GGAA 3’) dan primer Reverse NE-R2/R (5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCG TGTA 3’). Untuk menentukan genotipe Mx++, Mx+-, dan Mx—digunakan metode PCR-RFLP yaitu hasil PCR dari fragmen gen Mx dipotong oleh enzim retriksi yang dapat memotong situs 631 yaitu enzim retriksi Hpy81 (Sironi et al, 2008). Produk PCR yang sudah dipotong dengan enzim restriksi kemudian dipisahkan dengan metode elektroforesis gel poliakrilamida 5% (PAGE5%) yang kemudian di visualisasikan dengan metode pewarnaan sensitif perak. Prosedur pewarnaan perak nitrat berdasarkan Sulandari dan Zein, (2003). HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi PCR pada Ayam Tolaki dan Ayam Kampung Hasil ekstraksi DNA ayam Tolaki dan ayam Kampung yang dilanjutkan dengan proses perbanyakan (amplifikasi DNA) dengan PCR (Polymerisasi Chain Reaction) ditampilkan pada Gambar di bawah ini.
M B1 B2 B3 B4 B5 B6
299 bp
Gambar 1. Hasil Amplifikasi PCR DNA Ayam Tolaki dan Ayam Kampung Keterangan : M = Marker 1 kb A = Sampel Ayam Tolaki B = Sampel Ayam Kampung Berdasarkan gambar 1, terlihat bahwa semua sampel ayam lokal baik sampel ayam Tolaki maupun ayam Kampung memiliki atau mengandung gen Mx dengan ukuran pita DNA sebesar 299 bp. Gen Mx adalah gen yang bertanggungjawab terhadap
kemampuan ayam dalam mempertahankan diri (Resisten) terhadap serangan virus flu burung (avian influenza) dan New castle Disease (ND) yang disebabkan oleh virus vesicular stomatitis virus (VSV) (Maeda, 2005). Hasil penelitian serupa sebelumnya
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
121
juga telah dilakukan oleh Sironi, et al (2008) yang menemukan adanya gen Mx pada ayam jenis white leghorn dan New Hampshire sebesar 300 bp. Keberadaan gen Mx pada ayam Tolaki dan ayam kampung semakin menguatkan dugaan awal bahwa sebagian besar ayam lokal memiliki daya tahan terhadap serangan penyakit ayam yang disebabkan oleh virus VSV ini. M AG AA AG AA AA AA
Polimorfisme Ayam Tolaki dan Ayam Kampung Hasil uji polimorfisme ayam Tolaki dan ayam Kampung dengan teknik PCRRFLP dapat dilihat pada gambar 2 dibawah ini.
AG AA AA AA AG GG
A (ayam Tolaki) B (ayam Kampung) Gambar 2. Polymorfisme Gen Mx pada ayam Tolaki dan ayam kampung Berdasarkan gambar 2 tersebut diperoleh informasi bahwa semua sampel DNA ayam Tolaki dari 2 Kecamatan yang berbeda memiliki keragaman alel (polymorfisme) yang cukup tinggi, terdiri dari alel AA, AG dan GG. Uji deteksi polymorfisme bertujuan untuk melihat frekuensi alel dari gen Mx. Gen Mx sendiri memiliki 3 kategori berbeda yang digolongkan kedalam gen Mx++(mengandung jenis alel yang resisten terhadap virus flu burung), gen Mx+(mengandung jenis alel yang bisa resistent dan rentan terhadap virus flu burung) dan gen Mx—(mengandung alel yang rentan terhadap serangan virus flu burung). Hasil dari visualisasi PCR-RFLP di atas diperoleh panjang gen Mx sebesar 299 bp. Dimana Genotipe AA digambarkan dengan pita DNA sepanjang 299 bp (tidak terpotong oleh enzim Hpy8I). Genotipe AG digambarkan dengan pita DNA sepanjang 299, 200 dan 99 bp (terpotong sebagian oleh
enzim Hpy8I). Sedangkan Genotipe GG digambarkan dengan pita DNA sepanjang 200 dan 99 bp (terpotong sempurna oleh Berdasarkan deteksi enzim Hpy8I). polymorfisme gen Mx menggunakan enzim retriksi Hpy 81 pada gambar di atas diperoleh informasi dari 6 sampel ayam Tolaki, terdapat 4 sampel dengan tipe alel AA (67% gen Mx++) dan terdapat 2 sampel dengan tipe alel AG (33% gen Mx+-), tidak terdapat alel GG (0% gen Mx--). Sementara pada 6 sampel ayam Kampung terdapat 3 sampel dengan tipe alel AA (50 % gen Mx+), 2 sampel dengan tipe alel AG (33% gen Mx--) dan terdapat 1 alel GG (17 % gen Mx++). Hasil ini bermakna bahwa kedua ayam lokal tersebut memiliki daya tahan terhadap penyakit viral cukup tinggi, dimana ayam Tolaki relatif sedikit lebih tinggi daya tahannya dibandingkan ayam Kampung. Adapun nilai frekuensi alel gen Mx ayam Tolaki disajikan pada tabel 3 berikut ini.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
122
Tabel 3. Frekuensi Alel Gen Mx Ayam Tolaki Jumlah Ayam (ekor) Genotipe Mx++ Mx+Ayam Tolaki ( 6) 4 2 Ayam Kampung (6) 3 2 Total = 12 7 4 Berdasarkan Tabel 3, diperoleh informasi sampel ayam Tolaki mempunyai frekuensi alel A pada gen Mx lebih tinggi yakni 0,83 dibandingkan frekuensi alel G yakni hanya 0,17. Sementara pada ayam Kampung frekuensi alel A pada gen Mx yakni 0,67 dan frekuensi alel G 0,33. Hasil ini menunjukkan frekuensi Alel A pada ayam Tolaki relatif sedikit lebih tinggi daripada ayam Kampung. Namun secara keseluruhan dari kedua sampel ayam lokal tersebut diperoleh frekuensi alel A yang cukup tinggi yakni 0,75 dan frekuensi alel G yang rendah yakni 0,25. Hasil ini sejalan dengan hasil analisis A/G SNP gen Mx dari populasi ayam lokal Indonesia yang telah dilakukan oleh Sulandari, dkk (2007) diperoleh frekuensi alel A yang resisten terhadap AI berkisar 0,35 – 0,89. Hal ini menunjukkan ketahanan ayam lokal Indonesia terhadap serangan virus AI cukup tinggi. Sartika, dkk (2011) juga melakukan identifikasi gen penciri resistensi genetik terhadap flu burung pada 110 ayam sentul diperoleh hasil alel gen Mx+ 55% dan alel gen Mx- 45 %. Selanjutnya seleksi terhadap ayam lokal di Indonesia dari 200 induk ayam dan 40 ayam jantan diperoleh frekuensi alel resisten Mx++ 65% pada induk dan 60% pada ayam jantan, sementara frekuensi alel yang rentan virus Mx- yakni 35% pada induk dan 40% pada jantan. Daya tahan terhadap penyakit viral ini ditemukan pada exon 13 nukleotida nomor 1892, yakni adanya mutasi basa transisi (single mutation), dimana mutasi pada pasangan basa GC menjadi AT, sehingga menyebabkan perubahan asam amino serin (AGT) menjadi asparagin (AAT). Terdapatnya asam amino asparagin (A) pada nukleotida nomor 1892 exon 13 menjadi indikator ayam tersebut tahan terhadap infeksi virus, yang dikelompokkan sebagai gen Mx+, dan sebaliknya bila yang terjadi adalah mutasi basa menjadi asam
Mx-0 1 1
Frekuensi Alel F(A/ Mx+) F(G/ Mx-) 0,83 0,17 0,67 0,33 0,75 0,25
amino serin (G), maka ayam rentan terhadap serangan virus, dikelompokkan sebagai gen Mx-.(Watanabe 2003; Ko et al., 2004). Gen Mx ini dapat digunakan sebagai marker guna mendeteksi daya tahan ayam terhadap penyakit viral seperti Avian Influenza dan Newcastle Disease, hal ini dikarenakan gen Mx merupakan native antiviral yang spesifik pada ayam, sehingga gen Mx ini dapat digunakan sebagai penciri dalam seleksi molekuler (Sartika, 2011). KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut : 1. Ayam lokal di Sulawesi Tenggara yakni ayam Tolaki dan ayam Kampung terbukti memiliki Gen Mx yang bertanggungjawab terhadap serangan virus Flu Burung (Avian Influenza) ataupun serangan virus tetelo (Newcastle Disease), dengan ukuran sebesar 299 bp. 2. Ayam Tolaki dan ayam Kampung memiliki gen Mx dengan derajad polimorfisme yang sangat tinggi yang terdiri dari alel AA, AG dan GG. Ayam Tolaki memiliki frekuensi alel A sedikit lebih tinggi (0,83) dari ayam kampung (0,67). 3. Secara keseluruhan dari total 12 sampel ayam lokal diSulawesi Tenggara memiliki frekuensi alel A atau f(A) sangat tinggi dengan frekuensi alel A sebesar 0,75 dan frekuensi alel G sebesar 0,25. DAFTAR PUSTAKA Dalgaard TS, Hojsgaard S, Skodt K, Madsen JHR. 2003. Differences in chickens MHC class I alpha gene expression between Marek’s disease-resistant and susceptible
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
123
MHC haplotypes. Scand. Immunology.57(2);135-43.
Kerjasama Dinas Pertanian Konawe selatan dan STIPER Kendari.
J
Ko, J.H., H.K. Jin, A.Asano, A.Takada, A.Ninomiya, H.Kida, H.Hokiyama, M.Ohara, M.Tsuzuki, M.Nishibori, M.Mizutani and T.Watanabe. 2002. Polymorphisms and the differential antiviral activity of the Genome chciken Mx gene. Research 12 (4):595-601. Maeda, 2005. Polymorphism of Mx Gene in Asian Indigenous chicken population. Makalah dipresentasekan pada Seminar Nasional Tentang Unggas Lokal III. Universitas Diponegoro.25 Agustus 2005. Mansjoer SS. 2003. Potensi ayam buras di Indonesia. Makalah semiloka pengkajian pengembangan produksi bibit ayam Buras dan Itik, Cisarua Bogor, Tanggal 11 12 Desember 2003. Nafiu, LD, Aku, AS, Saili, T, Taufik Y dan Rusdin, M. 2009. Pelestarian dan Pengembangan Ayamn Tolaki sebagai Plasma Nutfah Asli Sulawei Tenggara. Laporan Penelitian. Lembaga Penelitian Unhalu. Kendari Nataamidjaja A.G. dan K. Diwyanto, 1994. Konservasi Ayam Buras Langka. Proceeding, Koleksi dan Karakterisasi Plasma Nutfah Pertanian, Bogor. Otim MO. 2005. Newcastle Disease in village poultry:Molecular and phylogenetic studies of the virus and disease epidemiology.[disertasi]. Copenhagen (DK) : The Royal Veterinary and Agricultural University. Pagala M.A dan Aku, 2012. Optimalisasi Potensi Genetik Ayam Tolaki dalam Upaya Pelestarian Plasma Nutfah Ayam Lokal di Sulawesi Tenggara. Laporan Penelitian.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sartika, T., Sulandari, S.,and, M.S.A Zein. Selection of Mx gene genotype as genetic marker for Avian Influenza resistance in Indonesian native chicken. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 4):S37. Sarwono, B. 2005. Ayam Aduan. Penebar Swadaya. Jakarta. Hal 16-18 Seyama, T., J.H. Ko, M.Ohe, N.Sasaoka, A Okada, H.Gomi, A.Yoneda, J.Ueda, M.Nishibori, S.Okamoto, Y.Maeda and T.Watanabe. 2006. Population Research of genetic polymorphism at amino acid position 631 in chciken Mx protein with differential antiviral activity. Biochem.Genet. 44:432443. Sironi,
L., Ramelli.P., Williams, JL.,Mariani, P., 2010. PCR-RFLP Genotyping Protocol for Chicken Mx Gene G/A Polymorphism associated with the S631N Mutation. Genetics and Molecular Research 9(2):1104-1108.
Sulandari, S.,M.S.A. Zein, D. Astuti And T.Sartika. 2007. Unblocking Indonesian Indigenous Chicken Genome to explore genetic resistance to avian influenza virus infection. Laporan Akhir, Program Insentif KNRT 2007. Watanabe, T. 2003. Genomic analysis of antiviral resistant Mx gene in the chicken. Lab. Animal Breeding and Reproduction, Hokkaido University. Sapporo, Japan. International workshop on Animal Genome Analysis, KKR 2003 Nop 6; Sapporo (JP) : Hotel Tokyo.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
