26
4. POLIMORFISME GEN Pituitary Positive Transcription Factor -1 (Pit-1) PADA AYAM LOKAL DI INDONESIA ABSTRAK Pituitary Positive Transcription Factor-1 (Pit-1) merupakan salah satu gen yang berkaitan erat dengan pertumbuhan dan produktifitas ayam. Gen ini merupakan “faktor regulator positif” pada transkripsi khusus untuk ekspresi gen penyandi hormon pertumbuhan (GH), prolaktin (PRL) dan Thyroid Stimulating Hormon β (TSH-β). Ayam lokal yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 64 ekor masing-masing rumpun terdiri dari 16 ekor. Polimorfisme gen Pit-1 dianalisis berdasarkan single nucleotida polymorphism (SNP) pada ekson 6 dan intron 2. Keragaman nukleotida gen Pit-1 pada ekson 6 ditunjukkan oleh rendahnya polimorfisme nukleotida, yaitu 178 nukleotida bersifat kekal dan hanya satu nukleotida saja yang bervariasi. Rekonstruksi pohon filogenetik menunjukkan bahwa ayam sentul (SN606 and SN632) terpisah dari kelompok rumpun ayam lainnya. Pensejajaran gen Pit-1 pada intron 2 menunjukkan bahwa 374 nukleotida bersifat kekal, sedangkan 13 nukleotida lainnya beragam. Rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan gen ini juga menunjukkan tidak adanya hubungan yang nyata antara keragaman nukleotida gen Pit-1 pada intron 2 dengan bobot tubuh dan genotip. Kata-kata kunci : polimorfisme, gen Pit-1, genotip, ayam lokal.
ABSTRACT Pituitary Positive Transcription Factor-1 (Pit-1) is one of the gene controlling chicken growth and productivity. This gene is a “positive regulatory factor” on special transcription for gen expression encoding growth hormone (GH), prolactin (PRL), and Thyroid Stimulating Hormon β (TSH-β). Native chickens used in this research was 64 individuals, each race compose with 16 individuals. Pit-1 gene polymorphism was analyzed based on Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in exon 6 and intron 2. Pit-1 gene in exon 6 resulted very low in nucleotide polymorphism. There was only one nucleotide differed out of 179 nucleotides, the other 178 nucleotides was conserved. Reconstruction of phylogenetic tree strengtened the result that only sentul chickens (SN606 and SN632) located in a separate cluster of other races. Pit-1 gene in intron 2 alignment denoted that, therein, 374 nucleotides were conserve, while 13 nucleotides varied. Reconstruction of phylogenetic tree based on this gene showed that there was no clear relationship between nucleotide variation in intron 2 of Pit1 gene and body weight as well as the genotype. Key words : polymorphism, Pit-1 gene, genotype, native chicken.
27
PENDAHULUAN Latar Belakang Penanda genetik merupakan suatu teknik yang digunakan dalam genetika moderen sebagai alat bantu mengidentifikasi genotip suatu individu atau sampel yang diambil dari hewan tersebut. Gen Pituitary Specific Positive Transcription Factor-1 (Pit-1, POU1F1 atau GHF1) adalah salah satu penanda genetik. Gen Pit1 merupakan salah satu gen yang berkaitan erat dengan pertumbuhan dan produktifitas ayam, karena gen Pit-1 mengendalikan ekspresi gen penyandi hormon pertumbuhan dan hormon prolaktin (Miyai et al. 2005). Gen ini merupakan “faktor regulator positif” pada transkripsi khusus untuk ekspresi gen penyandi hormon pertumbuhan (GH), prolaktin (PRL) dan Thyroid Stimulating Hormon β (TSH-β) (Bodner et al. 1988; Miyai et al. 2005). Aktivasi awal gen Pit-1 dikontrol oleh gen PROP-1 (Phophet of Pit-1). Protein Pit-1 terutama mengekspresikan laktotrophs, somatotrophs dan thyrotrophs dan mensekresikan PRL, GH dan TSH-β (Simmons 1990). Bioaktifitas yang lain dari gen Pit-1 adalah sebagai ‟aktifator regulasi‟ anterior pituitary (Li et al. 1990 dan de la Hoya 1998). Selain itu gen Pit-1 merupakan „regulator ekspresi mRNA‟ dari beberapa tipe sel pituitary (Somson et al. 1996). Dengan demikian dari contoh tersebut apabila mampu mengidentifikasi karakter genetik spesifik dari gen Pit-1 dikaitkan dengan penampilan fenotipik tertentu maka akan menjadi alat yang tajam dalam proses seleksi. Sampai saat ini, cDNA Pit-1 telah diidentifikasi pada beberapa spesies hewan dan terdiri dari 6 ekson pada mamalia, 7 ekson pada burung dan ikan. Pada mamalia selain perbedaan jumlah ekson, terdapat pula perbedaan dalam panjang prekursornya (Tatsumi 1992; Yamada et al. 1993). cDNA Pit-1 pada ayam pertama kali diisolasi dan disekuensing oleh Tanaka et al. (1999) dengan menggunakan isoform, yaitu Pit-1 α*(335 asam amino), Pit-1 β*(363 Asam amino) dan Pit-1 ω*(327 asam amino) (Van As et al. 2000). Berdasarkan hasil tersebut struktur gen Pit-1 α pada ayam telah diidentifikasi berlokasi di kromosom 1 (GGA1) terdiri dari 7 ekson dan 6 intron dengan total ukuran gen sebesar ± 14 kb terdiri dari 336 asam amino (Yamada et al. 1993) dan struktur gen dapat digambarkan seperti pada Gambar 7. Oleh karena itu dari uraian tersebut dapat dikatakan bahwa gen Pit-1 merupakan „kandidat gen‟ yang mempunyai prospek untuk digunakan sebagai penanda genetik dalam program seleksi ayam lokal dan perkembangan kajian gen Pit-1 ini menarik untuk dikembangkan terutama pada ayam lokal di Indonesia. Pada penelitian ini gen Pit-1 digunakan sebagai “marker genetik” dalam melihat keragaman serta kemampuan produksi dari beberapa rumpun ayam di Indonesia. Menurut Nie et al. (2008) gen Pit-1 yang berprospek sebagai marker genetik adalah pada intron 2, sedangkan menurut Jiang et al. (2004) pada ekson 6. Pada kedua fragmen tersebut telah menunjukkan hubungan pertumbuhan ayam dengan pengukuran panjang dan diameter paruh serta kenaikan bobot badan yang signifikan.
28
Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah : 1. Menganalisis adanya polimorfisme dan mengkarakterisasi gen Pit-1 secara parsial pada daerah yang conserve untuk pertumbuhan pada beberapa ayam lokal di Indonesia. 2. Melihat kemungkinan penggunaan gen Pit-1 yang merupakan data dasar untuk digunakan sebagai marka seleksi ayam lokal di Indonesia
METODE PENELITIAN Bahan Penelitian ini menggunakan 5 rumpun ayam, yaitu: ayam sentul, ayam kedu, ayam kampung, ayam pelung dan ayam broiler. Pada setiap rumpun ayam digunakan 16 ekor dan seluruh ayam dipelihara di kandang unggas, Fakultas Peternakan IPB Dramaga, Bogor. Kandang yang digunakan dalam penelitian ini berukuran 120 x 250 cm2 dengan tinggi 2 meter sebanyak dua buah. Kandang terbuat dari kayu dan dinding diberi alas sekam padi. Pemeliharaan dilakukan mulai dari ayam umur satu hari (DOC = Day Old Chick) sampai ayam berumur 28 minggu (7 bulan) yaitu sampai ayam mencapai dewasa kelamin. Pakan dan air yang diberikan ad libitum sesuai dengan standart NRC (1994). Untuk analisis karakteristik ekson 6 dan intron 2 gen Pit-1, bahan material DNA yang digunakan berasal dari darah. Pengambilan sampel darah pada semua ayam yang akan diteliti dilakukan pada waktu ayam berumur 8 minggu. Sampel darah diambil secara langsung dengan menggunakan spuit dari bagian vena pangkal sayap (vena brachialis). Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung yang berisi alkohol absolut untuk mengawetkan sampel. Struktur gen Pit-1 Intron 1 5‟ Promotor
E1
Intron 3
E2
E2a
a Intron 2
E3
Intron 5 E4 Intron 4
E5
Ekson 6 E6
Termi 3‟ nator
Intron 6
Gambar 7. Struktur gen Pit-1. (Yamada et al. 1993) Keterangan : E = Ekson. Ekstraksi dan Purifikasi DNA Ekstraksi DNA dari darah dilakukan menggunakan modifikasi metode Duryadi (1993). Hasil ekstraksi dimigrasikan pada gel agarose 1.2% dalam larutan 1xTBE (Tris base-Boric acid–EDTA) dengan menggunakan piranti Submarine Elektrophoresis (Hoefer, USA). DNA total dalam gel yang sebelumnya diwarnai dengan Ethidium bromide (0.5 µg/ml) divisualisasikan dalam piranti Gel Doc dengan bantuan UV transiluminator.
29
PCR (Polymerase Chain Reaction) Analisa PCR, yaitu suatu tehnik perbanyakan molekul DNA target dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Kondisi PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA target dilakukan sebagai berikut: pra-PCR berupa denaturasi pada suhu 940C selama 5 menit, dilanjutkan dengan siklus PCR selama 35x yang terdiri dari tahapan berulang denaturasi pada suhu 940C selama 45 detik, kemudian penempelan primer (annealing) pada suhu 560C (untuk primer MR5) dan 520C (untuk primer MR1) berlangsung selama 45 detik. Selanjutnya suhu dinaikkan menjadi 720C selama 90 detik yang disebut proses elongasi. Proses amplifikasi diakhiri dengan perpanjangan pada suhu 720C selama 10 menit. Primer spesifik yang digunakan adalah MR5 (untuk ekson 6 dengan kode akses AJ236855; Nie et al. 2008) dan MR1 (untuk intron 2 dengan kode akses AY396150; Van As et al. 2000) dari Gallus gallus (Tabel 12). Posisi penempelan dari kedua pasang primer tersebut dapat dilihat pada Gambar 8 dan Gambar 9 dengan produk PCR masing-masing sebesar 179 bp dan 387 bp (Tabel 12).
Tabel 12. Primer spesifik (MR1 dan MR5) ekson 6 dan intron 2 gen Pit-1. Marker
Kode Akses sekuen Gen Bank
Region
Primers Produk (forward/reverse) PCR (5' → 3') (bp) ggcactttggagaacaaagc/ctc AJ236855** MR5* Exon 6 gtggtgctccttgataa 179 MR1* AY396150*** Intron 2 (gtcaaggcaaatattctgtacc/t gcatgttaatttggctctg) 387 Sumber :* Nie et al. (2008); **Van As et al. (2000) ; *** Nie et al. (2003)
179 nt R
F
1
214 Ekson 6 Gambar 8. Posisi penempelan primer MR5 pada ekson 6 gen Pit-1 387 nt F
1
R
430
759 Intron 2
Gambar 9. Posisi penempelan primer MR1 pada intron 2 gen Pit-1.
1108
30
Setelah dimigrasikan pada piranti elektrophoresis, produk PCR dalam gel agarose 1.2 % yang sebelumnya diwarnai dengan Ethidium bromide (0.5 µg/ml) divisualisasikan dalam piranti Gel Doc dengan bantuan UV transiluminator. Sekuensing dan Pensejajaran Runutan DNA Produk PCR yang didapat kemudian dilakukan sekuensing lengkap dua arah baik forward dan reverse di Laboratorium First Based-Singapura melalui PT Genetika Science Indonesia, Jakarta. Hasil editing dari sekuen masing-masing rumpun ayam tersebut kemudian disejajarkan. Pensejajaran menggunakan Clustal W yang terdapat pada software MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007). Sebagai standar urutan sekuen dipakai data dari Gen Bank asal ayam dari china (Nie et al. 2003) yaitu ekson 6 gen Pit-1 dengan kode akses AJ238655 dan sekuen intron 2 gen Pit-1 dengan kode akses AY 396150. Analisis Genetik Hasil sekuen gen Pit-1 diolah dengan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007). Dari hasil pensejajaran, dibuat matriks persamaan maupun perbedaan nukleotida dan jarak genetik yang dipakai adalah model Kimura 2 - parameter. Berdasarkan jarak genetiknya, dibuat pohon filogeni dengan metode NeighborJoining, boostrapped 1000x (Tamura et al. 2007).
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Ekson 6 Gen Pit-1. Hasil amplifikasi PCR pada masing-masing ayam lokal, yaitu ayam kedu, ayam kampung, ayam sentul serta ayam broiler dengan menggunakan primer MR5 untuk ekson 6 gen Pit-1 disajikan pada Gambar 10. Gambar tersebut menunjukkan bahwa fragmen ekson 6 gen Pit-1 menghasilkan pita yang konsisten sebesar 179 bp. Pensejajaran Runutan Nukleotida dan Analisis Filogeni. Hasil sekuensing gen Pit-1 ekson 6 terdiri dari 2 sekuen pada masingmasing ayam, yaitu pada ayam broiler, ayam pelung, ayam kampung, ayam kedu dan ayam sentul, didapat pensejajarannya sepanjang 179 nt. . Berdasarkan hasil pensejajaran tersebut menunjukkan bahwa sebanyak 178 nt bersifat kekal (conserve) sedangkan nukleotida yang berbedanya (variable) hanya sebanyak 1 nt. Hal ini menunjukkan bahwa polimorfisme nukleotida pada sekuen ekson 6 gen Pit-1 antar rumpun ayam berbeda sangat rendah. Namun demikian setelah dilakukan pensejajaran dengan taxon lain sebagai outgrupnya yaitu angsa ((Anser anser) dari 179 nt sebanyak 173 nukleotida bersifat kekal (conserve) dan sebanyak 6 nt mengalami perbedaan (bersifat variabel).
31
500bp 179bp
Gambar 10. Hasil PCR gen Pit-1 pada ayam lokal Keterangan : 1 = Marker 100 bp 2-3 = 4-5 = 6-7 = 8-9 = 10-11=
SN606 – SN623 (ayam sentul) KD53 - KD87 (ayam kedu) BRO59-BRO712 (ayam broiler) P7 - P22 (ayam pelung) KM5-KM6 (ayam kampung)
Jarak genetik rumpun ayam sentul, kedu, kampung, pelung dan broiler berdasarkan jarak genetik model Kimura-2 parameter dari basa-basa nukleotidanya, disajikan pada Tabel 13.
Tabel 13. Jarak genetik Kimura 2 parameter ekson 6 gen Pit-1 pada lima rumpun ayam penelitian sepanjang 179 nt dan rumpun angsa (ANS) ANS SN606 SN632 KD53 KD87 BRO59 BRO712 P7 P22 KM5 KM6 ________________________________________________________________________ ANS SN606 0.053 SN632 0.053 0.000 KD53 0.059 0.006 0.006 KD87 0.059 0.006 0.006 0.000 BRO59 0.059 0.006 0.006 0.000 0.000 BRO712 0.059 0.006 0.006 0.000 0.000 0.000 P7 0.059 0.006 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000 P22 0.059 0.006 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 KM5 0.059 0.006 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 KM6 0.059 0.006 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Tabel 13 diolah dengan program MEGA 4 sehingga dihasilkan diagram pohon filogeni seperti pada Gambar 11. Gambar tersebut menunjukkan bahwa ada
32
dua kelompok besar (cluster) dari rumpun yang diteliti dan kelompok outgrup (angsa) (cluster A) terpisah secara jelas. Diantara rumpun ayam yang diteliti, rumpun ayam sentul (SN606 dan SN632) memisah dalam kelompok tersendiri (cluster B), sedangkan sisanya mengelompok dalam kelompok lain. Hasil analisis jarak genetik gen Pit-1 ekson 6 antara ayam kedu, kampung, pelung dan broiler adalah 0.00, sedangkan antara ayam sentul dengan keempat jenis ayam (ayam kedu, kampung, pelung dan broiler) adalah 0.06. Sehingga hasil pohon fenogram menunjukkan bahwa ayam sentul merupakan kelompok tersendiri. Hal ini menunjukkan bahwa pada ayam lokal antara ayam sentul dengan ayam kedu dan kampung mempunyai hubungan kekerabatan yang jauh. Sedangkan hasil penelitian Sartika et al. (2004) dengan metode morfometrik bahwa antara ayam kampung dan ayam sentul mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat. Demikian pula antara ayam broiler dengan ayam pelung dan kedu, memiliki jarak genetik yang dekat karena dalam satu cluster. Sedangkan hasil penelitian Zhang et al. (2010) menunjukkan bahwa antara ayam lokal cina dengan ayam broiler memiliki jarak genetik yang jauh, demikian pula hasil penelitian Azmi et al. (2000) antara ayam lokal malaysia dengan ayam broiler. Hal tersebut berarti ekson 6 gen Pit-1 ayam china berbeda dengan sekuen ekson 6 gen Pit-1 ayam broiler. Sedangkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekson 6 gen Pit1 ayam broiler tidak berbeda dengan sekuen ekson 6 gen Pit-1 ayam kedu, pelung dan kampung.
KM5 KM6 BRO712 BRO59 P22 P7 KD87 KD53 SN606 SN632 ANS
Gambar 11. Konstruksi pohon filogeni ekson 6 gen Pit-1 ayam penelitian sepanjang 179 nt dan gen Pit-1 angsa (ANS) sebagai pembanding.
33
Polimorfisme Intron 2 Gen Pit-1 Amplifikasi Intron 2 Gen Pit-1 Amplifikasi PCR intron 2 gen Pit-1 pada masing-masing ayam lokal, yaitu ayam kedu, ayam kampung, ayam sentul serta ayam broiler dengan menggunakan primer spesifik (MR1) disajikan pada Gambar 12. Gambar tersebut menunjukkan bahwa fragmen amplikon menghasilkan pita yang konsisten sebesar 387 bp. Pensejajaran Runutan Nukleotida dan Karakterisasi Intron 2 Gen Pit-1. Hasil sekuensing gen Pit-1 intron 2 terdiri dari 4 sekuen pada ayam broiler dan ayam pelung, 3 sekuen pada ayam kampung dan kedu serta 2 sekuen pada ayam sentul, didapat pensejajarannya sepanjang 387 nt (Lampiran 4).
387 bp
Gambar 12. Hasil PCR intron-2 gen Pit-1 pada ayam lokal. Keterangan : 100bp = Marker 100 bp ; 1-2 = SN606 – SN623 (ayam sentul) 3-4 = KD53 - KD87 (ayam kedu) 5-6 = BRO59-BRO712 (ayam broiler) 7-8 = P7 - P22 (ayam pelung) ; 9-10= KM5-KM6 (ayam kampung).
Hasil pensejajaran intron 2 gen Pit-1 menunjukkan bahwa 374 nt bersifat kekal (concerve) sedangkan nukleotida yang berbedanya (variable) sebanyak 13 nt.
Analisis Filogeni Hasil diagram pohon filogeni seperti pada Gambar 13. Gambar tersebut menunjukkan bahwa ada dua kelompok besar (cluster) dari rumpun yang diteliti yaitu runutan nukleotida ayam broiler, kedu, sentul, kampung dan pelung, sedangkan dalam kelompok lain terdapat pula ayam broiler dan ayam kedu. Hal ini dapat dijelaskan bahwa konstruksi pohon filogeni menunjukkan tidak ada hubungan yang jelas antara variasi nukleotida intron 2 Pit-1 dengan karakter bobot tubuh maupun genotip.
34
P7 P21 P2 KM16 KM6 KM5 SN610 SN601 KD90 KD49 BRO803 BRO723 BRO632 P22 BR0712 KD83
Gambar 13. Konstruksi pohon filogeni Intron-2 gen Pit-1 sepanjang 387 nt
SIMPULAN Polimorfisme marka genetik ekson 6 dan intron 2 gen Pit-1 antar ayam lokal dan ayam broiler relatif rendah. Rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan marka ekson 6 dan intron 2 gen Pit-1 ini tidak menunjukkan adanya hubungan yang nyata antara keragaman nukleotida gen Pit-1 pada intron 2 dengan bobot tubuh maupun genotip tertentu. SARAN Eksplorasi polimorfisme gen Pit-1 dapat diperluas dengan sekuen target yang lebih besar yaitu daerah coding (Cds) maupun daerah non coding (intron) lain. Hal ini diharapkan dapat diperoleh situs-situs polimorphisme yang spesifik bagi ayam lokal Indonesia.
