Polimerlánc “egyensúlyi” alakja Az a makroállapot, amely a legtöbb mikroállapottal valósítható meg (legvalószínűbb állapot)
Féregszerű polimermodell (Wormlike chain) WLC (wormlike chain):
θ(s) s
⎛ s⎞
ha s elég nagy, cosθ ( s) s függvényében lecseng: cosθ ( s) = exp⎜− ⎟ ⎝ lp ⎠ lp=perzisztencia hossz ha s<
>lp, akkor cosθ ( s) ~0, azaz θ(s) 0˚ és 360˚ közötti értékeket ugyanolyan valószínűséggel vehet fel. A perzisztencia hossz értelme: az a hossz, amelyen belül a lánc megtartja irányát (emlékszik rá). A perzisztencia hosszon túl a lánc elfelejti irányítottságát. EI = hajlítómerevség (E = Young modulus - anyagfüggő, I = keresztmetszet másodrendű nyomatéka - alakfüggő); kBT = termikus energia
DNS molekulák fluoreszcencia mikroszkóp alatt
Értelme: minél merevebb egy lánc, annál nagyobb távolságon (lp) lesznek csak észlelhetők a termikusan gerjesztett fluktuációk.
A globális alak és rugalmasság között összefüggés van l = perzisztencia hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz
Entropikus rugalmasság vizualizálása Csomókötés egyetlen DNS láncra
Merev lánc l>>L
Mikrotubulus mikrogyöngy mozgatható lézercsipeszben Fáziskontraszt kép
Szemiflexibilis lánc l~L
Flexibilis lánc l<
Fluoreszcencia kép
Aktin filamentum
DNS molekula
mikrogyöngy stacionárius lézercsipeszben Kinosita Group
A humán genom fizikai mérete
A DIFFÚZIÓ SPECIÁLIS ESETE: REPTÁCIÓ • Reptáció: polimér hálóban történő “kígyószerű”diffúzió. (Reptilia: hüllők)
A tanteremnyi modell-sejtre adaptálva: Analógia Idealizált sejt: 20 μm oldalfalú kocka 20 m Tanterem: oldalfalú kocka DNS vastagsága
2 nm
2 mm
DNA teljes hossza
2m
2000 km
Perzisztenciahossz (LP)
50 nm
5 cm
320 μm
320 m
130 μm
130 m
Átlagos vég-vég hossz
Girációs sugár (RG)
L ⋅N τr = μ ⋅ k ⋅T 2
• Tehát: az egyensúlyi alakú DNS nem férne el a sejtben. • Teljesen kompakt DNS (elméletileg legkisebb) térfogata (2 mm alapterületű, 2000 km hosszú henger térfogata): 8 m3 (2 m élhosszúságú kocka) • A DNS-t a sejtben csomagolni szükséges
Egyedi nukleoszóma partikulum: hiszton fehérjekomplex (oktamer) + ~1.6-ször köré tekeredett DNS
Polimerizáció
τr = Reptációs idő, egy kontúrhossznyi távolság megtételéhez szükséges idő; L = kontúrhossz; N= elemi szegmensek száma; μ = lánc mozgékonyság; kT = termikus energia
(a ⋅ N )
2
Dr =
τr
Polimerizációs egyensúlyok 1. valódi equilibrium
Alegységek összeállásának folyamata
A polimerizáció fázisai: 1. Lag fázis: nukleáció 2. Növekedés fázisa 3. Equilibrium (egyensúly) fázisa Polimer mennyiség
2. dinamikus instabilitás: folyamatos, lassú növekedést követő katasztrofikus depolimerizáció
Equilibrium
Növekedés Lag
Idő
Dr = Reptációs diffúziós állandó; N= elemi szegmensek száma; a = elemi szegmens hossz (~perzisztenciahossz); τr = reptációs idő. N.B.: számláló az átlagos négyzetes elmozdulással analóg.
3. Treadmilling: taposómalom
In vivo treadmilling
Dinamikus instabilitás Mikrotubulusok
Gary Borisy
Aktin
Microtubulusok
GFP-aktin Speckle microscope Clare Waterman-Storer
Gary Borisy
Motilitás aktin polimerizációval
Motilitás aktin polimerizációval
Intracelluláris patogének mozgása
In vitro körülmények
Listeria monocytogenes
F-aktin jelölés phalloidinnel
Shigella flexneri Listeria Xenopus extraktumban
ActA-val aszimmetrikusan bevont mikrogyöngy Xenopus extraktumban
ActA-val szimmetrikusan bevont mikrogyöngy Xenopus extraktumban
ActA: A protein expressed by the bacterium Listeria monocytogenes that is responsible for the "rocketing" motility of the bacterium throughout the eukaryotic host cell. In addition to other host proteins, ActA binds actin directly.
Erőkifejtés citoszkeletális filamentum polimerizációjával
A polimerizációs erő megmérhető
Brown-féle kilincskerék mechanizmus m kbe kki F
δ Diffúzió
K(F) = erő jelenlétében fennálló disszociációs állandó - az a monomer koncentráció, amelynél a nettó filamentum növekedés 0. Kc = kritikus koncentráció (0 erőnél); F = erő; δ = diszkrét növekedés egyetlen monomer beépülésekor. kBT = termikus energia. N.B.: F lehet + vagy -. A folyamat lehet reakcióvezérelt (a kbe-hez képest túl gyors diffúzió) vagy diffúzióvezérelt (a kbe-hez képest lassú diffúzió).
MT-depolimerizáció-vezérelt erőkifejtés
MCAK: MT-depolimerizáló kinezin MCAK: “Kinezin-13” A MT + végéhez kötődik Diffúziós mechanizmussal keresi meg a + véget ATP-t hidrolizál MT depolimerizációt szabályoz (“katasztrófa-faktor”)
MT-indukált MT depolimerizáció
Vezikulum transzport MT depolimerizációval Kromoszóma (kinetochore) mozgatás MT depolimerizációval
Diffúziós keresés a MT mentén (GFP-MCAK)
Tematika
Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék, egyensúlytól távoli folyamatok
• Motorfehérjék működése. A munkaciklus • Egyensúlytól távoli folyamatok. Erővezérelt fehérjegombolyodás.
• Bemutatások: in vitro motilitási próba. Az Kellermayer Miklós
MOTORFEHÉRJÉK 1. Specifikus citoszkeletális filamentumhoz kapcsolódnak (DE…) 2. Elmozdulást és erőt generálnak 3. Kémiai energiát használnak fel 4. Kémiai energiát közvetlenül alakítják mechanikai munkává (nincs közbülső hővagy elektromos energia)
atomerőmikroszkóp. Titin kitekerés AFM-mel.
A motorfehérjék típusai 1. Aktin alapú Miozinok: Konvencionális (miozin II) és nem-konvencionális Miozin szupercsalád (I-XXIV osztályok). Plusz vég irányába mozognak. 2. Mikrotubulus alapú a. Dineinek: Ciliáris (flagelláris) és citoplazmáris dineinek. A mikrotubulus mentén a minusz vég irányába mozognak. b. Kinezinek: Kinezin szupercsalád: konvencionális és nem-konvencionális. A mikrotubulus mentén a plusz vég irányába mozognak. c. Dinaminok: MT-függő GTPáz aktivitás Biológiai szerep: vakuoláris fehérjeválogatás (pinchase enzimek)? 3. DNS alapú mechanoenzimek DNS és RNS polimerázok, vírus kapszid csomagoló motor, kondenzinek A DNS fonal mentén haladnak és fejtenek ki erőt 4. Rotációs motorok F1F0-ATP szintetáz Bakteriális flagelláris motor 5. Mechanoenzim komplexek Riboszóma
A miozin szupercsalád
In vitro aktomiozin motilitás
≥50% homológia a tagok között processzív
Myosin
ent
lam
in fi
Act
HMM 1 mM ATP 30 mM MgCl2
Microscope coverslip
"konvencionális" 2-fejű
Immobile fraction
Mobile fraction (1.3 μm/s)
Minusz vég irányába mozog
A miozin II
A miozin fej (Subfragment-1) könnyűláncok
2 db alfa-hélixből “coiled-coil”
nyaki v. pánt régió
Regulatórikus könnyű lánc (RLC) ATP-kötő zseb csupasz zóna
“miozin fejek”
“miozin fejek”
Nyak (erőkar)
Aktin-kötő hely
Esszenciális könnyű lánc (ELC) miozin farok
Konverter domén
A motor domén mutációi hipertrofiás kardiomiopátiához vezetnek.
Processzív motorok. Plusz vég irányába mozognak. Vesicular transport
Dineinek Típusok: axonemális és citoplazmáris. Sok alegységes fehérjék (Mr~500 kDa) A minusz vég irányába mozognak. Koordinált működésük meghajlítja a ciliumot.
minusz vég irányába mozog
Switch domén: hasonlóság a miozinhoz és G-fehérjékhez.
Dinaminok
DNS Motorok
Vakuoláris fehérjeválogatás GTPázok
Processzív motorok
T7 DNS Polimeráz
“pinchase” funkció RNS Polimeráz , Wang et al. 1998.
RNS Polimeráz
Vírus portális motor
DNS mechanoenzimek
Különleges DNS motor
Kondenzinek SMC fehérjecsalád SMC = "structural maintenance of chromosomes"
φ29 bacteriofág portális motor
MukBEF nanomechanika és kondenzációs model
ROTÁCIÓS MOTOROK I: F1F0-ATP SZINTETÁZ
20 nM ATP 200 nM ATP
Diszkrét 120˚ rotációs lépések
Kinosita
ROTÁCIÓS MOTOROK II:
Mechanoenzim komplex
Bakteriális flagellum motor
Riboszóma
Wen et al. Nature 2008
2.7 nm-es lépések (egy triplett) 0.078 s transzlokációs idő Transzlokációval csatolt helikáz aktivitás
Fordulatszám: > 20000 rpm Fogyasztás: 10-16 W Hatásfok: > 80% Energiaforrás: protonok
Titin: rugalmas molekuláris “gyöngyfüzér” Izomköteg Izomrost Miofibrillum
• Egyensúlytól távoli folyamatok: erővezérelt fehérjekitekeredés és gombolyodás
Szarkomer
Összehúzódás
Z
Vékony filamentum
M
Vastag filamentum
Z
Titin
I-szakaszbeli szegmens
tandem Ig-régió
Ig-domén (7-szálú ß-hordó)
PEVKdomén
tandem Ig-régió
Titinmolekula nanomechanikája lézercsipesszel
Erővezérelt fehérje-kitekeredés k0off Titin I55-62 rekombináns fragmentum kitekerése
Erővezérelt szerkezetváltozások:
Erőválasz
55
80
Erő (pN)
Natív állapot
~28 nm
2
C
50
C
40 1.75
1.8
Reakció koordináta
xß
Domén kitekeredés
45
60
Kitekert állapot
3
D
60
Tranzíciós állapot
Fxß
Nemlineáris rugalmasságra szuperponált domén kitekeredés A-B
100
G
ΔL
1
1.85
Funf =
D
40
kBT ⎛ rxβ ⎞ ln 0 kBT ⎟⎠ xβ ⎜⎝ kunf
B Nemlineáris rugalmasság
20
E
E
Kitekerési erő
A
200 pN
Nemlineáris rugalmasság
F
0 0
0.5
1 1.5 Megnyúlás (µm)
2
2.5
F
50 nm
A domének egymás után, a mechanikai stabilitásuk növekvő sorrendjében tekerednek ki.
ΔL = 29,8 ± 3,5 nm
A mechanikai stabilitás biológiai logikája Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje
Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása
Nagy kitereredési erő
Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása
Alacsony kitereredési erő
20 Gyakoriság 15
3
10 5
2
ΔL
1
0 0
100 200 300 Kitekeredési erő (pN)
200 pN
Mechanikai stabilitás alapja:
Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak
50 nm
ΔL = 29,8 ± 3,5 nm
400
Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán
Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel
“High-force clamp”
Referencia jel (erő) T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy
Mért jel (+/-) (erő)
Csapdázott gyöngy
Erő (pN)
120
Mozgatott gyöngy
80
Kv
ázi
40
erő
rám
pa
0 3000
Σ
“Low-force clamp” Kiteredési görbe
2500
sulfo-SANPAH keresztkötővel bevont latex gyöngy
Megnyúlás (nm)
titin Feedback vezérlés
mozgatható mikropipetta
Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás)
2000
1500
1000
Visszatekeredési görbe 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Idő (103 s)
6
x10
~20-perces adatsor
Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban
Titin kitekeredés konstans erőnél Lépcsőméret eloszlás 30
Freqency
3800
15
Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak “fej”
“farok”
10
Monoexponenciális Singleexponential fit görbeillesztés
3000
0
15
40
50
~28 nm lépcsők 20
25
Idő (s)
3
30 x10
2600 10
30
Erőfüggő sebességi állandók
1484
15
5
20
Step size (nm)
1590
2800
10
20
60
Megnyúlás (µm)
3200
0
1696
1
3
25 x10
Idő (s)
A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben.
Topografikus magasság (nm)
Autokorreláció függvény
0
-1
3400
1.6 1.2 0.8 0.4 0 4 0 -4
5
1802
Megnyúlás (nm)
3600
Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény
20
0 4000
Megnyúlás (nm)
Erő (pN)
100
Rate constant (s )
Erő (pN)
28.02 ± 14.06 SD 25
200
400
600
800
Axiális távolság (nm)
Kitekeredési ugrások
0.1
Idő (s) 94 97 100
130
Feedback force (pN)
Kellermayer et al. BBA Bioenergetics 2003
5-10 doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki.
Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél
Titin gombolyodás konstans erőnél 100 0
Nagy lépcső
50 pN
Megnyúlás (µm)
Kitekert állapot
2000 Sima
Kitekeredés
T12 9D10 (PEVK)
20 pN
5 pN
Z
Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével)
Erő (pN)
500
30
40
50
60
70
80
“Teljesen” feltekert állapot 90
3
x10
Idő (s)
Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. Megnyúlás (μm)
Megnyúlás (nm)
Erő (pN)
A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is Erővezérelt ki- és visszatekeredés 100 0
1500
1000
500
0 60
80
100
120
Idő (s)
140
160
180
3
x10
Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát
Fluktuációk 4 pN
Domén unfolding
Fluktuációk ~700 nm
Idő (s)
Végső kontrakció (ritkán tapasztalható)
Trombitás et al. J. Struct. Biol. 1998.
Titin T12 és 9D10 ellenanyagokkal megragadva
Elsimult átmenet
Idő (s)
Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus)
1000
10 pN
Nagy lépcső (>100 nm)
1500
Erő (pN)
Megnyúlás (μm)
30 pN
Megnyúlás (nm)
40 pN
Megnyúlás (μm)
60 pN
Erő (pN)
Erő (pN)
70 pN
Erő (pN)
Domén kitekered és
80 pN
Az erőt ~3 pN alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek.
Részleges refolding
Megnyúlás (μm)
Molekuláris fáradás
Idő (s)
