Příprava dutých křemičitých mikročástic a jejich charakterizace

Návod pro vypracování úlohy

Příprava dutých křemičitých mikročástic a jejich charakterizace Laboratoř přípravy nano a mikromateriálů Ing. Marek Šoltys, Ing. Denisa Lizoňová

Úvod V přírodě se vyskytují organismy (např. rozsivky), které jsou chráněny před okolím pomocí schránek z oxidu křemičitého (SiO2). Stejně jako křemenné sklo, které je rovněž z oxidu křemičitého, jsou tyto schránky dosti odolné jak mechanicky, tak vůči mnoha chemikáliím - kyselinám i louhům - a proto o nich mikro- a nanotechnologové uvažují jako o reakčních nádobách (Obr. 1A). Ještě zajímavější vlastností částic z oxidu křemičitého je jejich přirozená porozita (Obr. 1B). Póry jsou velmi malé, v průměru mívají od jednoho do pěti nanometrů (ale mohou být i mnohem menší či naopak větší). Výsledná částice má pak jako celek velký specifický povrch. V kombinaci s tím, že oxid křemičitý na svůj povrch dobře váže chemické látky (volné silanolové skupiny na povrchu jsou schopny vytvářet vodíkové můstky), pak nepřekvapí jeho časté využití jako sorpčního materiálu. S částicemi z oxidu křemičitého se tak dnes nejčastěji můžeme setkat v absorpčních kolonách určených pro separaci látek z roztoků eluční chromatografií (každá látka se na povrch váže různou intenzitou a slaběji vázané látky pak projdou kolonou rychleji, Obr. 2). Tohoto efektu však můžeme využít i pro tvorbu mikroskopických chemických zásobníků. Do částic necháme v koncentrovaném roztoku látku nasorbovat, poté ji můžeme nechat vyschnout a když nastane potřeba, látka se po rozdispergování částic v čistém rozpouštědle desorbuje ven. Tento efekt je v současné době zkoumán například pro doručování léčiv. Oxid křemičitý je i snadné dále chemicky modifikovat. Mnohé výzkumné skupiny proto pracují právě s oxidem křemičitým a vytvářejí komplexní funkční systémy v mikro- či nano-měřítku (Obr. 1C) a snaží se připravit částice se schopností cíleně se dostat na místo určení a vyloučit svůj obsah až po dosažení cíle buď změnou vnějších podmínek, nebo na základě řízeného impulzu zvenčí [1-3]. Schopnost částic sorbovat látky a znovu je desorbovat si vyzkoušíme v této práci.

Obr. 1: Snímky křemičitých mikro- a nanočástic z elektronového mikroskopu. A) TEM snímek dutých křemičitých nanočástic připravených z polystyrenových šablon [1], B) TEM snímek křemičitých nanočástic se zřetelnou porozitou [2]. C) SEM snímek křemičitých nanočástic poskládaných do větších celků [3].

1

Obr. 2: Schematické znázornění průběhu separace látek pomocí eluční chromatografie v absorpční koloně.

K práci budeme používat duté porézní křemičité mikročástice, které si nejprve emulzní metodou připravíme [4]. Oxid křemičitý bude v tomto případě vznikat hydrolýzou a kondenzací z tetraethoxysilanu (TEOS) na fázovém rozhraní kapek octylaminu ve vodě. Emulzní metody dnes patří mezi hlavní metody příprav dutých křemičitých částic, ať již mikro-částic nebo nano-částic. U nanočástic však již syntézy nebývají tak jednoduché a pro dosažení nanometrových emulzí kapek, které slouží jako tekutá šablona výsledné částice, je potřeba použít surfaktant. Naštěstí pro nás, příprava mikročástic je poměrně nenáročná a obejdeme se bez surfaktantů.

H2O, HNO3

Obr. 3: Schema přípravy porézních silikových mikročástic.

Jedním z nutných kroků přípravy částic je jejich vysušení a kalcinace (vypékání za vysoké teploty). Tento krok pro jeho velkou časovou náročnost přeskočíme a k další práci obdržíte již dříve připravené částice. Jak již bylo zmíněno dříve, křemičité částice jsou skvělým absorbentem. Budeme tedy dále měřit absorpční schopnosti připravených křemičitých částic a zároveň budeme měřit desorpci (kinetiku vylučování) z částic již obsahujích nasorbovanou účinnou látku. Jako modelovou účinnou látku budeme používat ibuprofen, známé antiflogistikum. Koncentraci ibuprofenu budeme měřit pomocí UV-VIS spektrofotometru. Jelikož spektrofotometr měří po spuštění měření již automaticky, lehce si připravené částice ocharakterizujeme. Prohlédneme si je nejprve na optickém mikroskopu a následně změříme velikostní distribuci pomocí statického rozptylu světla. Tyto výsledky následně porovnáte s výsledky z navazující úlohy optické mikroskopie. Principy fungování UV-VIS spektrofotometrie i měření statického rozptylu světla byste již měli znát z předmětu analytická chemie. Pokud si je potřebujete připomenout, můžete využít například wikipedii: https://en.wikipedia.org/wiki/Ultraviolet%E2%80%93visible_spectroscopy https://en.wikipedia.org/wiki/Static_light_scattering

2

Cíle práce 1. Příprava křemičitých mikročástic 2. Změření absorpčního spektra ibuprofenu a zvolení vhodné vlnové délky, při které bude probíhat měření 3. Změření absorpce ibuprofenu do částic 4. Změření kinetiky vylučování ibuprofenu z částic 5. Změření distribuce velikosti částic pomocí statického rozptylu světla

Potřebné chemikálie     

Tetraethoxy silan (TEOS) Octylamin Kyselina dusičná (konc.) Deionizovaná voda Ibuprofen (206,29 g/mol)

Potřebné přístroje  

UV-VIS spektrofotometr Specord 205 BU Přístroj pro analýzu velikosti částic statickým rozptylem světla Horiba Partica LA-950 V2

Potřebné laboratorní vybavení         

PTFE kádinka – 200 ml Sada skleněných kádinek Odměrný válec 100 nebo 250 ml Pipeta 100-1000 µl Magnetické míchadlo – 1 cm a 3 cm Centrifugační vialky - velké Navažovací lžička Kyveta do UV-VIS spektrofotometru (typ QS) Kyveta pro měření statického rozptylu světla

3

Postup práce – příprava částic  

Celou reakci provádíme v digestoři, octylamin totiž nepříjemné zapáchá a je zdraví škodlivý a toxický pro vodní ekosystémy. Používáme osobní ochranné pomůcky – plášť, brýle a rukavice.

Do 200 ml PTFE kádinky nalijeme 10 ml octylaminu a za stálého míchání (800 rpm) přidáme 10 ml TEOSu a necháme míchat 3 minuty. Následně rychle přidáme 100 ml vody okyselené 0,2 ml kyseliny dusičné a stále míchaný roztok necháme 3 minuty reagovat. Vzniklé částice odstředíme v centrifugačních vialkách (6000 rpm, 5 min – během odstřeďování uklízíme a již si připravujeme měření na spektrofotometru). Po odstředění supernatant slijeme zpět do kádinky, v níž probíhala reakce, a částice přímo ve vialkách promyjeme acetonem a dáme znovu odstředit. Aceton opět slijeme do kádinky a částice vyjmeme z vialek rozdispergováním v ethanolu na porcelánovou krystalizační misku a dáme sušit. Obsah reakční kádinky vylijeme do nádoby na vodný toxický odpad.

Postup práce – měření absorpce a desorpce ibuprofenu Pro sorpční a desorpční experimenty obdržíte od asistenta již dříve připravené a vyžíhané částice. Jedny čisté a druhé s nasorbovaným ibuprofenem. Dále obdržíte zásobní roztok ibuprofenu v ethanolu (1M) a ve vodě (0,05 mg/ml).

Sorpční experimenty – část 1 Pro sorpci budeme používat čisté křemičité částice, které rozdispergujeme v zásobním ethanolovém roztoku ibuprofenu a budeme pozorovat, jak v roztoku klesá jeho absorbance (tudíž i koncentrace). V erlenmayerově baňce se zábrusem (nebo jiné) rozdispergujeme 100 mg částic v 5 ml 1M roztoku ibuprofenu v ethanolu a necháme míchat na magnetické míchačce. Před koncem práce částice necháme usadit (případně odebereme a zcentrifugujeme v eppendorf vialce) a z hladiny odebereme vzorek roztoku a změříme koncentraci ibuprofenu (cca 1000x naředíme) v UV-VIS spektrofotometru – viz část 2. Dbáme na to, aby vzorka neobsahovala žádne částice!

Měření absorpčního spektra ibuprofenu  Kyvetky chytáme pouze za matné stěny a v rukavicích  S kyvetami opatrně, jsou velmi drahé! Od asistenta obdržíte:  Vodný a ethanolový zásobní roztok ibuprofenu  Dvě sklěněné kyvety s optickou dráhou 1 cm  Automatickou pipetu s rozsahem 100-1000 µl  Sadu kádinek Absorpční UV-VIS spektrum ibuprofenu ve vodě i v ethanolu změříme v UV a viditelné oblasti (200 700 nm). Nejprve zapneme spektrofotometr, poté spustíme program WinAspect a v záložce Measurement vybereme Initialize device. Program nabídne, zda chceme zapnout i UV výbojku, klineme na Yes. Poté, co se přístroj úspěšně inicializuje, klikneme vpravo na tlačítko Parameters. Jednotlivé karty nastavíme podle následujících obrázků (Obr. 4 A, B, C). Nakonec klikneme na tlačítko OK a ve výzvě, zda chceme parametry uložit, klikneme na Yes. Nyní je spektrometr připraven k měření.

4

Obr. 4: Nastavení spektrofotometru pro měření celého absorpčního spektra ibuprofenu.

Spektra změříme s roztoky ibuprofenu v ethanolu o koncentracích 0,5 mg/ml a 0,25 mg/ml a ve vodě o koncentracích 0,05 mg/ml a 0,025 mg/ml (naředíme si ze zásobních roztoků, v případe ethanolového roztoku ředění nejdříve vypočteme a skonzultujeme s asistentem). Do skleněných čtvercových kyvet (obdržíme od asistenta) napipetujeme 2 ml vzorku a na matnou stranu kyvetky si je označíme. Kyvety umístíme do osmipozicového držáku spektrofotometru na pozice 2 a 3 (nejdříve vzorky v ethanolu, pak měření opakujeme s vodními roztoky). První pozice zůstane prázdná pro referenci, kterou je v tomto případě vzduch. Zavřeme víko spektrofotometru a v softwaru WinAspect klikneme na tlačítko Start measurement. Než se spektra doměří, můžete si zatím připravovat vzorky pro měření kinetiky vylučování z následujícího bodu. Po naměření spekter se zobrazí dvě okna s jednotlivými spektry. Pro referenční pozici se žádné výsledkové okno neotevře. Obě spektra si uložíme so složky na ploše (Nano-mikro) nejprve příkazem Save as a poté vyexportujeme do ASCII tabulky pro Excel přes File – Export – ASCII. Vždy se ukládá pouze aktivní okno a musíte tedy uložit obě okna zvlášť. Exportujeme hodnoty absorbance (třetí záložka Values a následně zvolíme Absorbance). Spektra operativně zhodnotíme a vybereme vlnovou délku (pakliže se budou spektra lišit, vybereme vlnovou délku pro vodu i ethanol zvlášť), při které budeme měřit koncentraci ibuprofenu v dalších měřeních. Toto rozhodnutí konzultujeme s asistentem a své rozhodnutí i diskuzi odůvodníme a popíšeme do protokolu. Pro vybrané vlnové délky sestrojíme kalibrační křivky, pomocí kterých budeme kvantifikovat množství ibuprofenu v neznámých vzorcích. Kyvetky vylijeme a několikrát propláchneme destilovanou vodou, ethanolem a nakonec acetonem.

5

Desorpční experimenty – kinetika vylučování Od asistenta obdržíte:  Mikročástice s nasorbovaným ibuprofenem  Kádinka s míchadlem  Vzorkovací eppendorf vialky  Stříkačky a 5 µm stříkačkové membránové filtry V této části budeme měřit, jak se z částic uvolňuje nasorbovaný ibuprofen. Částice navážíme do kádinky (přibližne 50 mg, přesnou hodnotu si zapíšeme) a zvlášť přichystáme 100 ml vody a 8 vzorkovacích eppendorf vialek. Kádinku s částicemi a míchadlem umístíme na magnetickou míchačku, přichystáme si stopky a v momentě, kdy přilijeme vodu a spustíme míchání, začneme měřit čas. V časech vypsaných níže pak vždy odebereme stříkačkou s nasazeným filtrem cca 1,2 ml míchaného objemu, odstraníme filtr a vzorek vytlačíme do eppendorfky, kterou si ihned označíme daným časem. Vzorky v eppendorfce by mělo být nejméně 1ml. Časy: 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 30 min, 60 min Zamyslete se nad tím, proč se vzorky musí filtrovat, jak by měření vypadalo, kdyby se vzorky nefiltrovaly a jak takovéto odebírání vzorku ovlivní měření. Diskutujte s asistentem. Nyní si musíme přenastavit spektrometr, aby již neměřil celé spektrum, ale pouze absorbanci při jedné, vámi vybrané vlnové délce (zadáte místo XXX v obrázku). Pokud již máte uložené výsledky z měření spekter, klikněte znovu na tlačítko Parameters a přenastavte následující dvě záložky podle obrázků (Obr. 5 A, B). Vyberte měřící mód Wavelengths a po kliknutí na Edit v kartě Mode místo XXX zadejte vámi zvolenou vlnovou délku a klikněte znovu na Edit. Nezapomeňte nastavit počet pozic na 8 a odškrtnout „1st position as reference“. Jakmile máte vše nastaveno, klikněte na OK a u výzvy na uložení znovu kliněte na Yes. Nyní do spektrofotometru nevkládejte žádnou kyvetu, víko nechte zavřené a nejprve klikněte na tlačítko Reference. Spektrometr změří referenci na vzduch. Nyní vložte na pozice 1-8 kyvetky se vzorky z eppendorf vialek (1 ml vzorky + 1 ml demineralizované vody-promíchat!!, tzn. v kyvetě budou 2 ml roztoku), zavřete víko spektrofotometru a v softwaru klikněte na tlačítko Start measurement. Vzorky se nyní postupně všechny změří a po dokončení měření vám vyskočí zvlášť okno pro každou pozici. Výsledky nemusíte ukládat, stačí si hodnoty pro každou pozici opsat. Pokud se v některé pozici blíží naměřená hodnota absorbanci 3, je nutné vzorek naředit a změřit znovu. Pokud se tak stane, konzultujte další postup s asistentem. Jak byste postupovali, pokud byste chtěli naměřené hodnoty absorbance přepočítat na koncentraci? Co byste k tomu potřebovali?

Sorpční experimenty část 2: měření Měření provedeme stejným způsobem, jako jsme prováděli předchozí měření, jen použijete místo osmi kyvetek jednu. Spektrometr přenastavovat nemusíte, zbylých 7 pozic se jen změří naprázdno.

6

Obr. 5: Nastavení spektrofotometru pro jednorázové změření jedné kyvety se vzorkem a reference.

Postup práce – měření velikosti částic  Tuto část práce provádějte výhradně s asistentem  S kyvetou pro měření statického rozptylu světla pracujeme velmi opatrně Od asistenta obdržíte:  Kyvetu pro měření SLS  Magnetické míchadlo Asistent vám připraví přístroj HORIBA k měření – pravděpodobně se bude muset přenastavit vnitřní uspořádání pro měření v kyvetě. Spustíme software LA-950. Zkontrolujeme kyvetu, zda je dostatečně čistá a naplníme ji čistou destilovanou vodou. Klikneme v softwaru na třetí tlačítko zleva pro měření (Obr. 6 A). V nově otevřené kartě měření klikneme na tlačítko Alignment (Obr. 6 B), aby si přístroj zkalibroval zaměření laserů, a poté vložíme kyvetu s vodou. Klikneme na tlačítko Blank, aby si přístroj vytvořil referenci na kyvetu, a poté zapneme míchání a do kyvety velmi opatrně (abychom NIC NEROZSYPALI po přístroji) přisypáváme vzorek částic a sledujeme v softwaru sloupce znázorňující intenzitu signálu z jednotlivých laserů. Přisypáváme vzorek tak dlouho, dokud se lasery neustálí v zeleně označené zóně (po každém přisypání zavřete dveře přístroje a počkejte několik vteřin, než se obsah kyvety zhomogenizuje, Obr. 6 C). Pokud jsme s koncentrací vzorku spokojení, zavřeme dvířka přístroje a klikneme na tlačítko Measurement. Přístroj se zeptá, zda chceme změnit parametry měření, klineme na Yes. Kartu měření vyplníme podle třetího obrázku a vypíšeme si své jméno vzorku, ostatní pole můžeme ponechat prázdná. Klikneme na Start a necháme přístroj měřit. Po ukončení měření se přístroj zeptá, zda chceme přepsat existující data, klineme opět na Yes a naměřená data si z tabulky zkopírujeme do souboru excel.

7

Obr. 6: Nastavení přístroje Horiba pro změření distribuce velikosti částic v kyvetě.

8

Příprava protokolu Do protokolu (který bude mít experimentální a výsledkovou část a závěr) uvedeme:            

Úvodní odstavec – krátce popište význam úlohy a co jste si z ní odnesli za poznatky Postup přípravy částic Postup přípravy sorpčního experimentu, kalibrační křivka v ethanolu, spektrum jedného kalibračního roztoku s vyznačenou vlnovou délkou zvolenou pro kvantifikaci Postup měření spekter, výsledná koncentrace roztoku po sorpci, výpočet množství ibuprofenu v částicích na konci experimentu Postup desorpčního experimentu, kalibrační křivka ve vodě, spektrum kal. roztoku ve vodě s vyznačenou vlnovou délkou zvolenou pro kvantifikaci Postup měření spekter, data kinetiky vylučování z částic v jednom grafu (na ose y dopočítané koncentrace podle kalibrační křivky ve vodě) Postup měření velikosti částic Výsledná spektra v jednom graf Graf distribuce velikosti částic ze statického rozptylu světla (Horiba) Obrázek částic z optického mikroskopu (z odpolední úlohy) Graf obsahující srovnání výsledků ze statického rozptylu světla a z obrazové analýzy z odpolední úlohy Závěr se zhodnocením všech výsledků a shrnutím poznatků

Při psaní protokolu se v žádném případě neodkazujte na tento návod. Protokol by měl dávat kompletně smysl sám o sobě, tudíž by v něm měly být kompletní informace ohledně použitého postupu, včetně např. použitých vzorků a jejich koncentrací. Při psaní protokolu dodržujte pravidla stylistiky – dokument by měl mít ucelenou grafickou a strukturovanou podobu.

Reference [1] Z. Deng, Z. Zhen, X. Hu, S. Wu, Z. Xu a P. Chu, „Hollow chitosanesilica nanospheres as pH-sensitive targeted delivery carriers in breast cancer therapy,“ Biomaterials, č. 32, pp. 4976-4986, 2011. [2] X. Mei, D. Chen, ,. N. Li, Q. Xu, J. Ge, H. Li a J. Lu, „Hollow mesoporous silica nanoparticles conjugated with pH-sensitive amphiphilic diblock polymer for controlled drug release,“ Microp. Mesop. Mater., č. 152, pp. 16-24, 2011. [3] T. Taniguchi, S. Obi, Y. Kamata, T. Kashiwakura, M. Kasuya, T. Ogawa, M. Kohri a T. Nakahira, „Preparation of organic/inorganic hybrid and hollow particles by catalytic deposition of silica onto core/shell heterocoagulates modified with poly[2-(N,N-dimethylamino)ethyl methacrylate],“ Journ. Coll. Interf. Sci., č. 368, pp. 107-114, 2012. [4] P. Kovačík, M. Singh a F. Štěpánek, „Remote control of diffusion from magnetic hollow silica microspheres,“ Chem. Eng. J., sv. 232, pp. 591-598, 2013.

9