Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
MODELOVÉ BIOLOGICKÉ MEMBRÁNY: JEJICH CHARAKTERIZACE A VYUŽITÍ
KATEŘINA NOVÁKOVÁa, b
o mechanismy dobře známé (přenos sodíku, draslíku, vápníku, kyslíku), avšak transport celé řady látek nebo iontů dosud dostatečně objasněn nebyl (např. nízkomolekulárních organických kyselin1, fytochelatinů2 a těžkých kovů3). Pro pochopení vlastností a funkcí biologických membrán jsou velmi vhodné modelové membrány a je potřeba, aby byly svým složením a strukturou co možná nejblíže k membránám reálným. Proto musíme disponovat spolehlivými metodami, které umožní jejich charakterizaci.
a
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Praha 8, b Ústav environmentálního a chemického inženýrství, Fakulta chemickotechnologická, Univerzita Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice
[email protected] Došlo 19.5.14, přijato 29.8.14.
2. Biologické membrány
Klíčová slova: cytoplazmatická membrána, modelová membrána, cholesterol, elektrochemická impedanční spektroskopie
Biologické membrány hrají jednu z nejdůležitějších rolí při normálním fungování živých buněk. Představují bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím (pokud mluvíme o cytoplazmatické membráně, tak mezi vnitřním a vnějším prostředím buňky, ale další membrány také vymezují řadu organel – jádro, mitochondrie, endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát). Základní funkcí buněčné membrány je ochrana buňky před jejím okolím. Buněčná membrána je selektivně propustná pro ionty a organické molekuly a ovlivňuje možnosti transportu látek mezi buňkou a jejím okolím. Historie studování struktury buněčné membrány začala již v 17. století díky vynálezu mikroskopu. Moritz Traube zjistil, že vnější vrstva musí být semipermeabilní, aby mohlo docházet k transportu iontů4. Další důležitý poznatek byl získán v roce 1888, kdy Quincke rozpoznal, že buněčná membrána je lipidové povahy, neboť zjistil, že buňky tvoří ve vodě kulovité tvary. V této době byl jediným známým materiálem, který se takto choval, pouze olej5, proto prohlásil, že buňka je obalena tenkou vrstvou přírodní kapaliny, jejímž základem je právě olej6. Na jeho poznatky navázal Overton, který formuloval základní koncept struktury a funkcí buněčné membrány – lipidovou teorii buněčné permeability a lipidní teorii narkózy7 a došel k závěru, že buněčná membrána může být formována z lecitinu a cholesterolu. Na počátku 20. století8 bylo věnováno struktuře buněčné membrány hodně pozornosti. První práce nesprávně tvrdily, že buněčná membrána je tvořena pouze z jedné molekulární vrstvy. V modelu od Davsona a Danielliho fosfolipidová dvojvrstva ležela mezi dvěma vrstvami globulární bílkoviny9. Teorie, že membrána je tvořena jednotkami složenými z lipidů a proteinů, které však nebyly integrální, byla formulována Robertsonem10. Modely biologických membrán Davsona, Danielliho a Robertsona byly termodynamicky nestabilní a hydrofobní oblasti proteinů byly vystaveny vodnému prostředí. Na druhé straně model prezentovaný Bensonem a Greenem předpokládal, že vnitřní mitochondriální membrána je tvořena z podjednotek proteinů a lipidů přítomných v kapalině (rozpouštědle)11. Díky těmto počátečním studiím, které sloužily jako klíč k rozřešení správného
Obsah 1. Úvod 2. Biologické membrány 2.1. Funkce membrán 2.1.1. Transport látek přes membránu 3. Modelové membrány 3.1. Planární fosfolipidové dvojvrstvy odvozené od černých lipidových membrán 3.1.1. Efekt cholesterolu na planární lipidovou dvojvrstvu 3.2. Stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy (Supported phospholipid bilayers; s-PLB) 3.3. Ukotvené lipidové dvojvrstvy (Tethered bilayer lipid membranes; t-BLM) 3.4. Liposomy 3.5. Protoplasty 4. Elektrochemická charakterizace modelových membrán 5. Závěr
1. Úvod Biologické membrány jsou nejdůležitějším rozhraním s elektrochemickými vlastnostmi v živých organismech. Jedná se o velmi složitou směs látek lipidového charakteru a proteinů. Biomembrány mají velké množství funkcí a jednou z nejdůležitějších je schopnost tvořit selektivní bariéru mezi extracelulárním a intracelulárním prostředím a obdobně mezi některými subcelulárními kompartmenty. Všechny látky, které do buňky vstupují (např. živiny, těžké kovy, pesticidy, organické kyseliny) nebo z ní vystupují, musí překonat tuto bariéru. Pro porozumění mechanismům přenosu přes ně je nezbytné mít k dispozici (či případně vyvinout) citlivé a spolehlivě pracující elektrody a dostatečně citlivé metody, kterými je možno přenášené látky detegovat a stanovit. V některých případech se jedná 166
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
tické síly, Van der Waalsovy síly a vodíkové můstky. Hlavní hnací silou při tvorbě dvojvrstvy jsou však hydrofobní interakce. Fosfolipidové molekuly v membráně se nacházejí v tekutém krystalickém stavu. V buněčné membráně se nacházejí oblasti obohacené cholesterolem a nazývají se lipidové rafty16. Cholesterol je amfifilní molekula, která je složena ze steroidního jádra s uhlovodíkovým řetězcem (nepolární část) a z hydroxylové skupiny (polární část) vázané v poloze 3 na steroidní jádro. Vyskytuje se v nepravidelných prostorech mezi hydrofobními konci lipidů a má stabilizující vliv na biologickou membránu. Přítomnost cholesterolu v dvojvrstvě nemění orientaci fosfolipidů, protože jeho molekuly jsou umístěny paralelně k řetězcům mastných kyselin a jejich hydroxylová skupina je směrována ke karbonylové skupině lipidů17. Fyzikální studie směsi cholesterolu s dipalmitoylfosfatidylcholinem ukazují, že cholesterol má vliv na tvorbu modelové membrány. Cholesterol je nerovnoměrně rozmístěn v celé buněčné membráně, a proto se vytváří na cholesterol bohaté oblasti a oblasti bez cholesterolu. Jednou z jeho nejdůležitějších funkcí je ovlivňování fyzikálně-chemických vlastností membrán. Při vyšších koncentracích cholesterolu vykazují lipidy vyšší uspořádanost hydrofobních řetězců a tím dochází ke snížení fluidity. Další složkou jsou integrální bílkoviny, které jsou nepravidelně a různě hluboko vnořeny do membrány. Jsou vázané hydrofobními interakcemi k molekulám lipidů a nemohou být izolovány bez rozrušení struktury lipidové membrány. Dále sem patří lipidem kotvené bílkoviny, periferní bílkoviny, které jsou asociované s membránou za pomoci iontových a Van der Waalsových interakcí. Glykosylace probíhá na extracelulárním povrchu plazmatické membrány (glykolipidy a glykoproteiny)18.
charakteru biologické membrány, byl objeven model fluidní mozaiky. Autoři tohoto modelu Singer a Nicolson12 navrhli modelovou membránu (obr. 1), která se skládá z lipidové dvojvrstvy s proteiny pronikajícími buď do poloviny dvojvrstvy či celou membránou. Zároveň vyjádřili předpoklad, že dvojvrstva je kompletně tekutá a proteiny v ní putují volně. Tento model byl první, který správně poukázal na tekutost membrány, na membránové kanály a spojil několik do té doby existujících teorií týkajících se vztahů mezi proteiny a dvojvrstvou do jediné12. Buněčná membrána je tvořena z 55 % proteiny, 25 % fosfolipidy, 13 % cholesterolem, 4 % ostatními lipidy, 3 % karbohydráty. Z těchto hodnot je patrno, že plazmatická membrána obsahuje velké množství proteinů, které přispívají k vytváření celé struktury (transmembránové proteinové komplexy – póry, kanály)13. Cytoplazmatická membrána obsahuje tři třídy amfipatických lipidů: glycerofosfolipidy, sfingolipidy a steroly. Většina lipidů, které se nachází v buněčné membráně, je ve formě fosfolipidů (především fosfatidylcholinu14, 15, dále fosfatidylethanolaminu, fosfatidylinositolu a fosfatidylserinu), které jsou schopny se sami spontánně uspořádávat do útvaru, kde dva hydrofobní řetězce jsou izolovány od okolní polární kapaliny. Tyto řetězce se obvykle skládají z uhlovodíkových řetězců dlouhých mastných kyselin, které obvykle obsahují sudý počet atomů uhlíku, nejběžněji 16 a 18. Hydrofilní hlavičky (obsahují negativně nabitou fosfátovou skupinu a mohou zahrnovat i jiné polární skupiny např. cholin, ethanolamin) jsou ve styku s intracelulárním či extracelulárním prostředím na obou stranách výsledné dvojvrstvy. Molekuly fosfolipidů nejsou v biologické membráně zastoupeny náhodně. Vnější vrstva membrány je tvořena především z fosfatidylcholinu a sfingomyelinu. Vnitřní vrstva membrány směřující do cytoplazmatického prostoru obsahuje významný podíl fosfatidylethanolaminu a fosfatidylserinu. Množství fosfatidylinositolu je v zastoupení fosfolipidů nízké, přesto tento fosfolipid má obrovský fyziologický význam. Ke vzniku lipidové dvojvrstvy samozřejmě také přispívají elektrosta-
2.1. Funkce membrán Buněčná membrána obklopuje buňku, odděluje jednotlivé kompartmenty a je aktivní součástí buňky, jejichž
Obr. 1. Cytoplazmatická membrána dle modelu fluidní mozaiky S. J. Singera a G. L. Nicolsona19
167
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
velikost a geometrii buněk) ale chybí zde iontové kanály a další velké množství látek běžně přítomných v buňkách.
integritu zajišťuje. V případě plazmatické membrány odděluje cytoplazmu buňky s intracelulárními komponenty od extracelulárního prostředí, zajišťuje mechanický kontakt s okolím a také z okolí přijímá informace. Je to velice tenká (7–10 nm) a průsvitná blanka. Dává buňce tvar, tedy ji prostorově vymezuje, hraje roli při ukotvování cytoskeletu a řídí pohyb materiálu mezi buňkou a jejím okolím. Membrána je selektivně permeabilní a může tedy regulovat, která látka do buňky vstoupí a naopak, které látky z buňky budou vypuzeny. Představuje tedy obdobu selektivního filtru, který dovolí jen určitým látkám vstoupit dovnitř či vystoupit ven. Další z funkcí membrány je udržování buněčného membránového potenciálu. Významně se podílí na udržování metabolické rovnováhy buňky a tím přispívá k její morfologické stabilitě.
3.1. Planární fosfolipidové dvojvrstvy odvozené od černých lipidových membrán Planární fosfolipidové dvojvrstvy (p-PLB) jsou používány jako nejjednodušší model biologických membrán a jsou intenzivně využívané pro charakterizaci elektrických vlastností proteinových pórů a iontových kanálů, přes které mohou molekuly procházet buněčnou membránou. Tento typ membrán je také znám pod názvem černá lipidová membrána (z angl. black lipid membrane, BLM). Termínem BLM je naznačeno, že se projevuje tmavě v odraženém světle procházejícím mikroskopem. Tloušťka membrány se pohybuje v nanometrech, což znamená, že světlo se odráží od zadní strany a střetává se s odrazem světla na přední straně21. Pro vytvoření BLM se používají především dvě metody. První z nich je metoda, kterou zavedl Mueller22 a která využívá spojení dvou monovrstev ve dvojvrstvu (obr. 2). V této metodě je využito přepážky z hydrofobního materiálu (např. teflonu), která má ve svém středu otvor. Tato přepážka je zasouvána přes hladinu, na které je rozprostřena lipidová monovrstva, která pokrývá postupně stěny přepážky a v prostoru otvoru vytváří dvojvrstvu. Nevýhodou této přípravy modelové membrány může být přítomnost různých nečistot z rozpouštědel a velké napětí lipidové dvojvrstvy na okrajích otvoru přepážky. Tato technika je často používána pro studium propustnosti membrán a vodivosti přes kanálové proteiny a peptidové póry. Velkou výhodou tohoto typu modelových membrán je skutečnost, že roztok na obou stranách měřící nádobky může být snadno zaměněn. Měření proudu a napětí procházejícího přes membránu je proveditelné díky elektrodám umístěným ve vodných roztocích na každé straně p-PLB. Pro měření vlastností p-PLB jsou používané především dvě techniky, jsou to „voltage-clamp“ metoda (kde je na-
2.1.1. Transport látek přes membránu Přenos látek přes fosfolipidovou dvojvrstvu může být buď pasivní (probíhající bez přispění buněčné energie, pohyb molekul ve směru koncentračního gradientu), nebo aktivní (při kterém buňka musí vynaložit energii pro uskutečnění transportu i proti koncentračnímu spádu), s použitím transmembránových iontových kanálů a transportérů, či endocytózou a exocytózou. Rozlišuje se pět základních transportních mechanismů: difuze (tímto mechanismem prostupují především látky rozpustné v tucích bez pomoci transportních molekul), přestup iontovými kanály (uvnitř proteinu se nachází kanál20, který je naplněný vodným roztokem, kterým mohou difundovat molekuly příslušných rozměrů a vlastností), spřažený transport (tento mechanismus je uskutečňován pomocí přenašečového systému, který je pasivní, ale zároveň je spřažen i s jiným systémem, který energii spotřebovává a může být rozdělen na symport – transport látek stejným směrem a antiport – transport opačným směrem), aktivní transport (transport molekul z oblastí s nižší koncentrací do oblastí s vyšší koncentrací, tedy proti koncentračnímu gradientu, za přispění energie obvykle z ATP, endocytóza a exocytóza (jde o energií řízené procesy, kdy molekuly jsou transportovány v uzavřených váčcích endocytotickým mechanismem (membrána se vchlípí dovnitř a přitom uzavře makromolekulu do nitra buňky) nebo exocytotickým mechanizmem (buněčný transportní vezikul přijde do styku s plazmatickou membránou, dojde k splynutí lipidových složek obou membrán a plazmatická membrána se otevře do extracelulárního prostoru).
rozpouštědlo
dvojvrstva
3. Modelové membrány Modelová lipidová dvojvrstva je struktura, která je formována in vitro a představuje dvojvrstvu přírodních buněčných membrán. V nejjednodušším modelu dvojvrstvy je zahrnut pouze jeden čistý syntetický fosfolipid. Modelové dvojvrstvy, které blíže odpovídají reálným systémům, jsou vytvořeny ze směsi několika syntetických, ale i přírodních lipidů. Modelové systémy napomáhají k lepšímu pochopení vlastností a funkcí biologických membrán (např. umělé liposomy nebo vezikuly napodobují
teflonová část
Obr. 2. Modelová dvojvrstva připravená dle Muellera na teflonovém nosiči23
168
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
pětí aplikováno na planární lipidovou dvojvrstvu) a „current-clamp“ metoda (vložení proudu na lipidovou dvojvrstvu)24. Kombinace těchto dvou metod je velmi užitečná např. pro studium elektricky indukovaných pórů v BLM. Tvar pórů je velmi nestabilní a jejich vodivost se v průběhu experimentů mění. Kombinace elektrických technik záznamu s různými typy vysokofrekvenčních elektrických polí nabízí další možnosti zkoumání strukturněfunkčních vztahů mezi lipidovou dvojvrstvou a membránovými peptidy24,25. Aplikací silného externího elektrického pole dochází k tvorbě pórů (elektroporace). Elektrické modulace fyzikálních vlastností biologických membrán mají stále větší význam pro manipulace v buňkách26. Vnější elektrické pole může způsobit strukturální změny v biologických membránách. Tato transformace může vést k přeskupení fosfolipidové dvojvrstvy a může také vést k tvorbě pórů. Membrána může získat zpátky svůj původní stav po vystavení elektrickému poli. Elektroporace je reverzibilní, pokud elektrické pole nepřekročí kritickou intenzitu a dobu trvání. Elektroporace je ireverzibilní, jestliže expozice elektrického pole je velmi dlouhá a intenzita elektrického pole je velmi vysoká (lipidová dvojvrstva se neuzavře po konci působení). Druhá metoda se nazývá podle Langmuira a Blodgettové27. Tato technika vytváří ultratenké organické filmy, kdy jsou molekuly fosfolipidů zabudovány do tenké vrstvy mající jednotnou tloušťku a specifickou vnitřní strukturu (obr. 3). Nejprve je na hladině vody utvářena monovrstva, která vzniká nanesením příslušného fosfolipidu na rozhraní fází voda/vzduch. Mezi hydrofilní částí fosfolipidů a vodou dochází k silné interakci, která zajišťuje jejich uspořádání na vodní hladině. Je zde utvářena monovrstva, která je následně stlačována pomocí pohyblivé bariéry nacházející se na straně nádobky obsahující vodný roztok elektrolytu, tím dochází k eliminaci mezer mezi molekulami fosfolipidu. Dále dochází k vytvoření samotného filmu vsunutím substrátu mezi rozhraní voda/vzduch a navázáním monovrstvy fosfolipidů na tento substrát. Tato technika umožňuje vytvořit film o přesně definované tloušťce.
3.1.1. Efekt cholesterolu na planární lipidovou dvojvrstvu Cholesterol je velmi důležitou součástí buněčné membrány, v které je rozpuštěný, ale sám o sobě dvojvrstvu netvoří29. V biomembránách je nehomogenně rozmístěný (vysoké koncentrace se nacházejí v plazmatické membráně a nízké koncentrace jsou v membránách v intracelulárních organelách). V plazmatické membráně je přítomen v množství od 20 do 50 mol.%. Cholesterol má strukturální a regulační funkci v membránách (napomáhá zachovávat správnou tekutost a tuhost plazmatické membrány). Hydroxylová skupina cholesterolu interaguje s polárními hlavičkami membránových fosfolipidů a sfingolipidů, zatímco rozměrné steroidové jádro a uhlovodíkový řetězec jsou vnořeny v membráně spolu s nepolárními mastnými řetězci dalších lipidů. Předpokládá se, že existuje asymetrie v množství cholesterolu na obou stranách dvojvrstvy30. Vliv cholesterolu na strukturu membrány byl zkoumán s použitím experimentálních31 a výpočetních32 technik. Vliv cholesterolu na rozdělení vody nebo molekulárního kyslíku v lipidových membránách je dobře vidět v membránách z nasycených lipidů v porovnání s membránami z nenasycených lipidů33. Cholesterol není rovnoměrně rozložen v biomembránách s nasycenými a nenasycenými fosfolipidy, ale hromadí se v tzv. lipidových raftech34. Cholesterol zlepšuje orientaci a snižuje tekutost struktury dvojvrstvy v hydratovaném stavu až do 50 mol.% ve vaječném lecitinu a do 25 mol.% v dipalmitoyllecitinu. Avšak přídavek 33–50 mol.% cholesterolu do dipalmitoyllecitinu zvyšuje tekutost dvojvrstvy. Také byl studován vliv cholesterolu na strukturu dvojvrstvy z fosfatidylcholinu. Cholesterol může rovněž zvyšovat nebo snižovat šířku dvojvrstvy v závislosti na fyzikálním stavu a délce řetězce fosfolipidů. Cholesterol zvyšuje tloušťku membrány a zvyšuje trans konformaci řetězců nasycených fosfatidylcholinů v tekutém krystalickém stavu35–37. 3.2. Stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy Stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy (supported phospholipid bilayers; s-PLB, obr. 4) jsou umělé lipidové dvojvrstvy běžně používané jako modelové biologické
Langmuirův film
monovrstva
Depozice dle Langmuira a Blodgettové
vzduch
monovrstva
vzduch
bariéra
bariéra kapalina
kapalina
Obr. 3. Příprava modelové membrány podle Langmuira a Blodgettové28
169
substrát
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
membrány a poprvé popsané McConnellem38,39. Jedná se o planární strukturu membrány, která je nanesena na pevném nosiči a na horní straně dvojvrstvy je vystavena roztoku (rozhraní pevná fáze/voda)40,41. Membrána je od pevného povrchu izolována ultratenkou vrstvou vody42. Slída a oxid křemičitý jsou nejběžnější materiály pro přípravu stabilizovaných lipidových dvojvrstev (s-SLB)42. I když je s-SLB spojena s pevným povrchem, zanechává si kapalné vlastnosti43. Tento typ modelových membrán je používán ke studiu základních fyzikálně-chemických vlastností lipidových dvojvrstev a je využíván jako modelový systém buněčných membrán in vitro (např. výzkum interakcí lipid-lipid nebo buňka-buňka, funkční role membránových proteinů40,44, interakcí membrán s proteinem a samozřejmě dalších biochemických procesů, jako je molekulární transport a signalizace40, dále pro vývoj biosenzorů45 a jako modelový systém pro transport léčiv46). Tyto dvojvrstvy představují velmi zajímavý systém pro objasnění buněčné adheze na umělém substrátu v důsledku strukturálních podobností s buněčnou membránou. Existuje celá řada metod určených pro analýzu povrchu, např. rezonanční excitace povrchových plazmonů (surface plasmon resonance, SPR), dále využití křemenných mikrovah doplněných o analýzu disipace energie (quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, QCM-D), elipsometrie, a různé typy mikroskopických technik jako fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM) a mikroskopie atomárních sil (AFM)47. Je známa celá řada metod pro přípravu s-PLB s rozdílnými lipidy (např. Langmuir-Blodgett/LangmuirSchaefer technika48, technika splynutí váčků , a tzv. „selfspreading“ technika, kdy molekuly lipidů jsou samoorganizovány na rozhraní pevná fáze/kapalina)49. Jednou z největších výhod těchto modelových systémů je jejich stabilita, neboť zůstávají nepoškozené, i když jsou zatíženy velkými průtokovými rychlostmi nebo vibracemi. Další výhodou je, že povrch zůstává přístupný mnoha nástrojům pro jejich charakterizaci. Pokud by byl povrch nestabilizovaný či volně plující, tak by ho tyto techni-
ky nedokázaly popsat či pouze s nižším rozlišením. Stabilizované dvojvrstvy mají schopnost vytvářet na jednom substrátu více izolovaných oblastí. Nevýhodou je možnost interakce se substrátem. Hydrofilnost substrátu je jedním z kritických faktorů, který určuje interakce mezi s-PLB a substrátem. Přímou vizualizaci trojrozměrné distribuce vodných vrstev na pevném substrátu a lipidové dvojvrstvy lze získat pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM)50. Tato informace má zásadní význam pro pochopení interakce, kterou zprostředkovává voda mezi s-PLB a substrátem51. Vlastnosti a struktura jsou ovlivněny chemickými a fyzikálními vlastnostmi pevného substrátu, i když vrstva vody mezi s-PLB a substrátem udržuje tekutost a dynamiku. Prostor mezi spodním listem dvojvrstvy a pevným nosičem je nedostatečný k tomu, aby předcházel k interakcím lipid-pevný povrch a následnému tření. Toto může způsobit pokles lipidové mobility a denaturaci inkorporovaných transmembránových proteinů44. Proto s-PLB nejsou plně v souladu s přirozenou tekutostí biologických membrán. Tento problém může být vyřešen tím, že bude lipid deponován na měkkou hydratovanou polymerní podložku, která funguje jako mazací vrstva (polymersupported membrane)43. Polymerní podložka by měla být hydrofilní, měkká, ne příliš vysoce nabitá, ne značně zesíťovaná43 a s tloušťkou menší než 100 nm (cit.44). 3.3. Ukotvené lipidové dvojvrstvy Ukotvené lipidové dvojvrstvy (tethered bilayer lipid membranes; t-BLM) jsou založeny na imobilizaci planární lipidové dvojvrstvy na pevný nosič (obr. 5), který umožňuje charakterizaci pomocí široké škály povrchově citlivých technik53. Vnitřní list lipidové dvojvrstvy je kovalentně vázán k povrchu pomocí tzv. „spacer skupiny“54,55. Tato skupina (ve většině případů se jedná o krátký oligomer a kotevní lipid, který může chemicky vázat substrát) zahrnuje malé nedokonalosti povrchu a vytváří rezervoár pro vodu a ionty pod membránou56. Tento typ membrán byl inspirován p-PLB a je využíván jako citlivá platforma pro široké spektrum biofyzikálních experimentů pro studium interakce peptid/membrána či protein/membrána, vytváření pórů, fázové přechody lipidů, vazby antigen/protilátka atd. Značnou výhodou je jejich dlouhodobá stabilita v řádu dní, týdnů nebo dokonce i měsíců. Na počátku výroby těchto platforem byla využita technika pro přípravu monovrstev podle Langmuira a Blodgettové. V současné době jsou metody pomocí samouspořádání velmi často používány pro technickou jednoduchost a vysokou reprodukovatelnost. Kotvicí jednotka (tethering unit) spojuje membránu s podkladovým pevným nosičem. Jako první kotvicí jednotky byly využity alkanthioly, které mohou být díky velké afinitě síry k vybraným kovům kovalentně vázány např. na tenké vrstvy zlata či rtuti57–59. Výsledkem je monovrstva, kde kotevní lipid je spojen se substrátem svým samouspořádáním60. Pokud je lipidový váček adsorbován do takto samouspořádané monovrstvy, začne se vytvářet hybridní dvojvrstva, kde spodní list je z alkanthiolů a horní list je z fosfolipidů61. Monovrstvy mohou být také tvořeny
dvojvrstva
hydratovaná vrstva (1 nm) substrát
Obr. 4. Stabilizovaná lipidová dvojvrstva (s-PLBs)52
170
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
teiny a cholesterol, který výrazně snižuje permeabilitu membrány. Rozdělení liposomů je často v závislosti na velikosti a počtu lipidových vrstev: malé unilamelární vezikuly (SUV průměr 25–100 nm; jedna lipidová dvojvrstva), velké unilamelární vezikuly (LUV 100–1000 nm; jedna lipidová dvojvrstva), multilamelární vezikuly (MUV jsou obvykle větší než 100 nm v průměru; 5–20 lipidových dvojvrstev), oligolamelární vezikuly (OUV – přibližně 5 lipidových dvojvrstev) a multivezikulární vezikuly (MVV – multikompartmentová struktura)68. Liposomy se připravují především odpařením roztoku fosfolipidu v organickém rozpouštědle, kdy vznikne na stěně nádobky tenký film. Následně je odstraněn zbytek rozpouštědla ve vakuu a dojde k převrstvení lipidového filmu vodou a spontánně vznikají multilamelární liposomy. Z takto připravené směsi liposomů lze získat liposomy s nižší polydisperzitou, a to díky protlačení přes různé polykarbonátové membrány. MUV se mohou také připravit přidáním vodného roztoku pufru k roztoku fosfolipidu v organickém rozpouštědle, následuje odpaření rozpouštědla a přidání vodné fáze za vzniku reverzních micel, které se postupně přeměňují („kolabují“ – za vzniku dvojvrstev) na liposomy. Z připravených velkých MUV lze opakovaným ochlazením v kapalném dusíku a ohřátím získat SUV, k jejichž přípravě se užívá injekční metoda, při níž se dávkuje injekční stříkačkou velmi pomalu alkoholický roztok lipidu do intenzivně míchané vodné fáze. Standardizace přípravy liposomů je nezbytná, aby byly zaručeny požadované a očekávané vlastnosti pro jejich konkrétní aplikaci, jako je velikost liposomů, povrchový náboj, počet vrstev, teplota fázového přechodu, složení fosfolipidů a jejich koncentrace, fyzikální a chemická stabilita, zachycený objem, stupeň zapouzdření například léku a jeho propustnost. Velice důležitým parametrem je povrchový náboj liposomů. Tento náboj ovlivňuje elektrostatické interakce mezi liposomy a okolními molekulami, částicemi a povrchem, je řízen strukturou lipidové hlavičky a složením vodného roztoku pufru, včetně hodnoty pH a iontové síly. Liposomy transportují látky pouze hydrofilní, látky nerozpustné ve vodě jsou transportovány k buňkám pomocí micel (obr. 6), jejichž struktura je tvořena pouze z jedné
přídavek lipidů a pufru ukotvené lipidy na zlatém substrátu
spontánní tvorba dvojvrstev
Obr. 5. Ukotvené lipidové dvojvrstvy66
v ethanol-lipidovém roztoku, který je potom vyměněn za roztok pufru. Tento proces vede ke spontánní tvorbě dvojvrstvy62. Další výzkum v oblasti přípravy je zaměřen na navazování makromolekulárních spacerů (polymerních řetězců44, 63, polyelektrolytových vrstev64, sacharidů nebo peptidů65) na pevný nosič. Lipidové váčky následně vytvářejí planární lipidovou dvojvrstvu na vrstvě upoutaných makromolekul. Mezi lipidovou dvojvrstvou a pevným nosičem existuje malý prostor (několik nanometrů), který umožňuje zabudování transmembránových proteinů a podporu transportu iontů přes membránu. Velmi důležité pro vlastnosti membrán jsou spacer (typ a délka – pevně ukotvené a krátké jednotky poskytují velmi vysokou hodnotu odporu membrány, ale mohou snižovat zabudovávání proteinů) a kotva (typ kotevní skupiny vhodné k připojení membrány na ušlechtilé kovy nebo další substráty). Tento typ dvojvrstvy má vynikající elektrické vlastnosti a dlouhodobou stabilitu a poskytuje skvělou platformu pro studium iontových kanálů, toxinů tvořících póry a transmembránových proteinů. Tenké kovové filmy mají výhodné vlastnosti pro elektrochemické a optické aplikace, ale dvojvrstvy na bázi thiolipidu na oxidu křemičitém či silanu jsou také velmi zajímavé v oblasti mikroelektroniky53. 3.4. Liposomy Liposomy (obr. 6) jsou uměle připravené vezikuly, které jsou složeny z lipidové dvojvrstvy a využívány pro výzkum v široké oblasti a pro terapeutické aplikace. Základní stavební složkou liposomů jsou amfifilní lipidy (velmi často fosfolipidy), které ve vodném prostředí samoutvářejí koloidní váčky, které mají v sobě uzavřený zlomek vodné fáze67. Lipidové dvojvrstvy, které tvoří liposom, jsou vytvářeny tak, aby polární hlavičky lipidů směřovaly do vnitřní dutiny a do extravezikulárního prostředí a hydrofobní řetězce směřovaly k sobě67. Membrána živých buněk je z velké části složena z fosfolipidů. Glycerofosfolipidy jsou nejčastěji používané přírodní fosfolipidy, které se využívají pro přípravu liposomů. Další přirozeně se vyskytující lipidy, které našly uplatnění, jsou sfingolipidy, glykosfingolipidy a glykoglycerofosfolipidy. Dále jsou v přípravě liposomů využívány pro-
liposom
micela
Obr. 6. Ilustrativní zobrazení liposomu a micely70
171
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
vrstvy amfifilních molekul, které utvářejí monovrstvu. Liposomy jsou využívány jako modelové membrány, dále se používají jako nosiče léčiv (od protirakovinných, přes hormony, enzymy a imunoaktivátory a další)68. Můžou být také použity jako nosiče celé řady signálních molekul, pro dodání barviv do textilu, pesticidů k rostlinám, enzymů a nutričních doplňků, využití mají i v kosmetice. Progresivním směrem využití jsou různé analytické aplikace v biosenzorech a dalších bioanalýzách díky možnosti enkapsulace69.
4. Elektrochemická charakterizace modelových membrán Pro studium tvorby fosfolipidové membrány a transportu přes tuto bariéru jsou používány různé metody: fluorescenční mikroskopie72, kombinace fluorescenční spektroskopie s ab initio výpočty73, „solvent relaxation“ technika74, či konfokální fluorescenční korelační spektroskopie75. Jako velmi vhodná elektrochemické metoda se ukázala především elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS). EIS je důležitá metoda využívající střídavého proudu ke studiu planárních lipidových dvojvrstev a k získání informací, k charakterizaci elektrických vlastností těchto membrán a ke zkoumání povrchové elektrodynamiky. Důležité fyzikální informace o vlastnostech rozhraní můžou být získány díky elektrochemickému impedančnímu spektru. Pro získání detailních informací je nezbytné použít modelování. Takzvané elektrochemické ekvivalentní obvody (EEC) jsou velmi často používány pro modelování elektrochemického impedančního spektra. V dalším kroku jsou údaje simulovány pomocí EEC a výsledky porovnávány s fyzikálními vlastnostmi povrchových systémů a procesů76. Geometrie p-PLBs umožňuje jak chemický tak elektrický přístup k oběma stranám dvojvrstvy, z toho důvodu lze snadno měřit fyzikální vlastnosti tohoto systému a využít k tomu EIS. Dále lze sledovat transport látek přes toto rozhraní a látky procházející přes membránu stanovit například pomocí voltametrických metod. Vzhledem k tomu, že množství přenášených částic přes membránu je za jednotku času velmi malé, a tudíž elektrický proud by byl obtížně registrovatelný, je třeba nechat látku přecházet přes fosfolipidovou membránu (PLM) po jistý čas (např. jednu hodinu) a následně je vyhodnocena změna koncentrací mezi kompartmenty oddělenými PLM3,76,77. Pro tento účel jsou v poslední době používány pevné elektrody78–84 např. na bázi amalgámu77,85–94, které umožňují stanovení nejrůznějších biologicky významných látek. Běžně je lipidová dvojvrstva tvořena ze dvou lipidových monovrstev na rozhraní voda/vzduch, kde dojde
3.5. Protoplasty Jednoduchá definice zní, že protoplasty (obr. 7) jsou buňky zbavené buněčné stěny. Tuto buněčnou stěnu lze odstranit buď mechanicky, nebo pomocí enzymů (např. celulasy, která štěpí celulosu v rostlinných buněčných stěnách či pektinasy, která degraduje pektinovou složku buněčných stěn). Buňky mají celulasovou stěnu bohatou na pektin a pod ní se nachází plazmatická membrána. Za normálních podmínek mezi plazmatickou membránou a buněčnou stěnou existuje velmi blízký kontakt, avšak v hypertonických roztocích (např. v roztoku cukru) se plazmatická membrána odtahuje od buněčné stěny. Pokud následně odstraníme buněčnou stěnu a další struktury, dojde k uvolnění velkého množství sférických osmoticky křehkých protoplastů, kde plazmatická membrána činí jedinou přepážku mezi cytoplazmou a vnějším okolím. Dnes jsou k dispozici spolehlivé postupy k izolaci protoplastů z celé řady rostlin jednoděložných i dvouděložných. Izolované protoplasty jsou jedinečné pro řadu experimentálních postupů, např. v mnoha studiích zaměřujících se na membránové funkce, strukturu buněk, syntézu farmaceutických výrobků a hodnocení toxicity látek. Rostlinné protoplasty poskytují jedinečný systém využívající jedné buňky v různých moderních biotechnologiích. Především díky využití v genomice, proteomice a metabolomice byl vyvolán obrovský zájem o tyto osmoticky křehké buňky zbavené buněčné stěny71.
a
b
35 m
25 m
Obr. 7. Mikroskopický snímek protoplastů izolovaných z rostlin (a) lilek brambor a (b) tabák virginský
172
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
k samouspořádání uhlovodíkových řetězců v otvoru teflonu (průměr tohoto otvoru je v řádu desítek mikrometrů), který odděluje dvě vodné fáze. Tvorba membrány je pozorována zvýšením elektrické kapacity a měřena za pomoci napěťového článku. p-PLB může být popsána z elektrického pohledu jako nedokonalý kondenzátor. Kapacita je parametr, který se ukázal jako nejlepší nástroj pro hodnocení stability a integrity p-PLB. Měřená kapacita musí být standardizována k velikosti povrchu lipidové dvojvrstvy. Obvykle se udává kapacita na jednotku plochy24. Odpor p-PLB je velmi vysoký, protože hydrofobní část je nepropustná pro nabité částice. Pokud se bude v lipidové dvojvrstvě vyskytovat několik děr o velikosti v nanometrech, odpor zřetelně poklesne24. Pomocí p-PLB a EIS může být studován mechanismus transportních procesů a vlastnosti membrán. Za použití s-SLB a při aplikaci metody EIS můžeme sledovat tvorbu a stabilitu lipidové dvojvrstvy a chování polárních hlaviček lipidové monovrstvy v závislosti na pH. Velice důležité je studium peptidů pronikajících přes membránu (cell penetrating peptides) a dalších syntetických či přírodních molekul, které se mohou inkorporovat do s-SLB. s-SLB mohou interagovat s peptidy a molekulami proteinů a mohou být využity k tvorbě vysoce selektivních senzorů sledujících transport iontů přes lipidovou membránu95. Jedinečné vlastnosti a uspořádání t-BLM umožňují najít uplatnění tohoto typu modelových membrán v senzorech například pro kvantitativní stanovení aktivity toxinů, které tvoří póry v membráně. Základním parametrem pro úspěšnou aplikaci t-BLM v biosenzorech je začlenění funkčních membránových proteinů. S využitím EIS techniky můžou být identifikovány různé vady na modelové membráně96. Liposomy jsou velmi vyhledávané modelové membrány především v biomedicínských aplikacích díky své biokompatibilitě. Dále jsou hojně využívány pro studium přenosu látek přes membrány a jako modelovém membrány pro studium vlastností biologických membrán za využití mikroskopických technik (především fluorescenční mikroskopie), elektrochemických impedančních a voltametrických metod97. Protoplasty představují jedinečný systém reprezentující jednu buňku a jsou zajímavé pro celou řadu moderních biotechnologií. Pro jejich elektrochemickou charakterizaci se používá například skenovací elektrochemická mikroskopie (scanning electrochemical microscopy; SECM) a především se využívá technika „patch clamp“ (terčíkový zámek), která umožňuje studium jednoho nebo více iontových kanálů v buňkách98. Technika terčíkového zámku byla vyvinuta E. Neherem a B. Sakmannem pro přímý důkaz přítomnosti iontových kanálů a pro analýzu jejich funkčních vlastností99. Metoda je však vhodná pouze pro buňky zbavené buněčné stěny či bazální membrány. Tato velmi jednoduchá technika vyžaduje především vhodný experimentální model, skleněné mikroelektrody o příslušném průměru a tepelně otaveném hrotu a velmi citlivé elektrické zařízení pro registraci velmi malých proudů. Elektroda, která
je naplněna vodivým roztokem, je přiváděna k povrchu buněk pod malým pozitivním tlakem (zabránění záchytu nečistot) a díky přirozené přilnavosti lipidů plazmatické membrány je vytvořen pevný spoj. Ústím pipety je vymezen malý prostor (2–4 mm) nazývaný terčík (patch). Pod tlakem je pak nasáta membrána do hrotu elektrody, čímž dojde k izolaci takto vzniklého terčíku od okolí. Metoda má různé modifikace, lze se přisát k buňce (cell-attached configuration) a tak registrovat aktivitu jednotlivých kanálů v terčíku při přirozeném membránovém potenciálu, lze registrovat membránové proudy celé buňky (whole-cell configuration) jako sumu jednotlivých proudů vznikajících aktivací jednotlivých iontových kanálů), lze snímat signál z terčíků (dvě varianty: extracelulární povrch buněčné membrány je orientován dovnitř (inside-out), nebo ven z elektrody (outside-out)) a studovat funkce jednotlivých kanálů či lze terčík v ústí pipety perforovat přidáním ionforů do roztoku v pipetě a tak vytvořit umělé kanálky v membráně (perforated-patch configuration)8, 100–102.
5. Závěr Modelové systémy biologických membrán a analytické techniky, které byly prezentované, poskytují pouze malou ukázku obrovské rozmanitosti oblasti výzkumu zaměřeného na tuto problematiku. Každý z diskutovaných systémů má individuální výhody jak v oblasti základního výzkumu, tak v oblasti možné aplikace a je nezbytné si spojit poznatky teoretické a experimentální do jednoho uceleného obrazu o studovaném systému. Je pravděpodobné, že příští generace modelových systémů bude obsahovat komplexnější složení (lipidy a proteiny) a různé další kombinace modelových systému pro objasnění základních biologických procesů. Tato práce byla finančně podporována Grantovou agenturou České republiky (projekt č. P208/12/1645). LITERATURA 1. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 2. Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 3. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 27 (2012). 4. Traube M.: Arch. Anat. Physiol. u. wiss. Med., 129 (1867). 5. Loeb J.: Science 20, 777 (1904). 6. Hertwig O., Campbell M., Campbell H. J.: The Cell: Outlines of General Anatomy and Physiology. Macmillan and Co., New York 1895. 7. Overton C. E.: Studien der Narkose (Studies of narcosis). Gustav Fischer, Jena 1901. 8. Bauer J. A., Lambert K. M., White J. A.: IEEE Trans. Biomed. Eng. 61, 1448 (2014). 173
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
30. Rog T., Pasenkiewicz-Gierula M., Vattulainen I., Karttunen M.: BBA-Biomembranes 1788, 97 (2009). 31. McMullen T. P. W., McElhaney R. N.: Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1, 83 (1996). 32. Falck E., Patra M., Karttunen M., Hyvonen M. T., Vattulainen I.: J. Chem. Phys. 121, 12676 (2004). 33. Subczynski W. K., Wisniewska A., Yin J. J., Hyde J. S., Kusumi A.: Biochemistry 33, 7670 (1994). 34. Wennberg C. L., van der Spoel D., Hub J. S.: J. Am. Chem. Soc. 134, 5351 (2012). 35. Boggs J. M., Hsia J. C.: Biochim. Biophys. Acta 290, 32 (1972). 36. Mcintosh T. J.: Biochim. Biophys. Acta 513, 43 (1978). 37. Blok M. C., Vandeenen L. L. M., Degier J.: Biochim. Biophys. Acta 464, 509 (1977). 38. Brian A. A., Mcconnell H. M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biol. Sci. 81, 6159 (1984). 39. Tamm L. K., Mcconnell H. M.: Biophys. J. 47, 105 (1985). 40. Kiessling V., Domanska M. K., Murray D., Wan C., Tamm L. K. In Wiley Encyclopedia of Chemical biology; Vol. 4, str. 411. J. Wiley, Hoboken 2008. 41. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011). 42. Castellana E. T., Cremer P. S.: Surf. Sci. Rep. 61, 429 (2006). 43. Sackmann E.: Science 271, 43 (1996). 44. Tanaka M., Sackmann E.: Nature 437, 656 (2005). 45. Worsfold O., Voelcker N. H., Nishiya T.: Langmuir 22, 7078 (2006). 46. Liu J. W., Stace-Naughton A., Jiang X. M., Brinker C. J.: J. Am. Chem. Soc. 131, 1354 (2009). 47. Afanasenkau D., Offenhausser A.: Langmuir 28, 13387 (2012). 48. Hollars C. W., Dunn R. C.: Biophys. J. 75, 342 (1998). 49. Furukawa K., Hibino H.: Chem. Lett. 41, 1259 (2012). 50. Axelrod D.: Traffic 2, 764 (2001). 51. Tero R.: Materials 5, 2658 (2012). 52. Wikipedia: Supported bilayer. http:// en.wikipedia.org/wiki/File:Supported_bilayer.svg, staženo 24. 3. 2014. 53. Jackman J. A., Knoll W., Cho N. J.: Materials 5, 2637 (2012). 54. Naumann R., Schiller S. M., Giess F., Grohe B., Hartman K. B., Karcher I., Koper I., Lubben J., Vasilev K., Knoll W.: Langmuir 19, 5435 (2003). 55. Koper I.: Mol. Biosyst. 3, 651 (2007). 56. Terrettaz S., Mayer M., Vogel H.: Langmuir 19, 5567 (2003). 57. Plant A. L.: Langmuir 9, 2764 (1993). 58. Guidelli R., Becucci L., Dolfi A., Moncelli M. R., Buoninsegni F. T.: Solid State Ion. 150, 13 (2002). 59. Love J. C., Estroff L. A., Kriebel J. K., Nuzzo R. G., Whitesides G. M.: Chem. Rev. 105, 1103 (2005). 60. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem.
9. Danielli J. F., Davson H.: J. Cell. Comp. Physiol. 5, 495 (1935). 10. Robertson J. D.: Prog. Biophys. Mol. Biol. 10, 343 (1960). 11. Benson A. A.: Annu. Rev. Plant. Physiol. 15, 1 (1964). 12. Singer S. J., Nicolson G. L.: Science 175, 720 (1972). 13. Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser C. A., Krieger M., Scott M. P., Zipursky L., Darnell J.: Molecular Cell Biology. W. H. Freeman, New York 2000. 14. Bulickova J., Sokolova R.: Modern Electrochemical Methods XXXIII: Adsorption of 1,2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine on Au(111) and HOPG, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Peckova K., ed.), http://www.bestservis.eu/upload/file/ Sbornik_2013.pdf, BEST Servis, Jetrichovice 2013, p. 29. 15. Sokolova R., Bulickova J., Parisova M., Navratil T., Gal M.: Modern Electrochemical Methods XXXIII: The Adsorption of Phospholipids at the Interface, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Peckova K., ed.), http://www.bestservis.eu/upload/file/ Sbornik_2013.pdf, BEST SERVIS, Jetrichovice 2013, p. 187. 16. Pike L. J.: J. Lipid Res. 44, 655 (2003). 17. Alwarawrah M., Dai J., Huang J. Y.: J. Chem. Theory Comput. 8, 749 (2012). 18. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Molecular Biology of the Cell. Garland Science, New York 2002. 19. Encyclopaedia_Britanica: Cytoplasmic membrane. http://media-2.web.britannica.com/ebmedia/74/53074-004-9F65D813.jpg, staženo 10.5.2014. 20. Kotyk A.: Chem. Listy 97, 37 (2003). 21. Tien H. T., Carbone S., Dawidowi E. A.: Nature 212, 718 (1966). 22. Mueller P., Tien H. T., Rudin D. O., Wescott W. C.: Z. Kreislaufforsch. 52, 534 (1963). 23. Doublelayer preparation. http:// upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/84/ Black_lipid_membrane.svg, staženo 25. 3. 2014. 24. Kramar P., Miklavčič D., Kotulska M., Lebar A. M., Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes; 11 Elsevier Inc., 2010. 25. Hanyu Y., Yamada T., Matsumoto G.: Biochemistry 37, 15376 (1998). 26. Kotnik T., Miklavcic D.: Biophys. J. 90, 480 (2006). 27. Langmuir I., Blodgett K. B.: Kolloid-Zeitschrift 73, 257 (1935). 28. Langmuir, Langmuir-Blodgett and LangmuirSchaefer techniques. http://www.ksvnima.com/ technologies/langmuir-blodgett-langmuir-schaefertechnique, staženo 24. 3. 2014. 29. Melzak K. A., Melzak S. A., Gizeli E., Toca-Herrera J. L.: Materials 5, 2306 (2012). 174
Chem. Listy 109, 166–175 (2015)
Referát
653, 7 (2011). 61. Silin V. I., Wieder H., Woodward J. T., Valincius G., Offenhausser A., Plant A. L.: J. Am. Chem. Soc. 124, 14676 (2002). 62. Yosypchuk B., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI: Monolayers at Electrodes as Basis for Models of Natural Membranes, Jetrichovice, (Barek J., Navratil T., ed.), http://www.bestservis.eu/ upload/file/Sbornik_metody11.pdf, BEST Servis, Jetrichovice 2011, p. 195. 63. Naumann C. A., Prucker O., Lehmann T., Ruhe J., Knoll W., Frank C. W.: Biomacromolecules 3, 27 (2002). 64. Kugler R., Knoll W.: Bioelectrochemistry 56, 175 (2002). 65. Naumann R., Baumgart T., Graber P., Jonczyk A., Offenhausser A., Knoll W.: Biosens. Bioelectron. 17, 25 (2002). 66. Wikipedia: T-BML. http://en.wikipedia.org/wiki/ File:T-BLM.png, Downloaded: 24. 3. 2014. 67. Tien H. T., Ottova-Leitmannova A.: Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes. Academic Press, 2005. 68. Edwards K. A., Baeumner A. J.: Talanta 68, 1432 (2006). 69. Liu Q. T., Boyd B. J.: Analyst 138, 391 (2013). 70. Liposomes. http://1.bp.blogspot.com/-Fp75IS1eg6A/ Tu1ACdx6KKI/AAAAAAAAAEs/UUg5LmcrTZU/ s1600/liposom.jpg, staženo 24. 3. 2014. 71. Davey M. R., Anthony P., Power J. B., Lowe K. C.: Biotechnol. Adv. 23, 131 (2005). 72. Hoffmannova H., Hof M., Krtil P.: J. Electroanal. Chem. 588, 296 (2006). 73. Sykora J., Slavicek P., Jungwirth P., Barucha J., Hof M.: J. Phys. Chem. B 111, 5869 (2007). 74. Rieber K., Sykora J., Olzynska A., Jelinek R., Cevc G., Hof M.: BBA-Biomembranes 1768, 1050 (2007). 75. Benda A., Benes M., Marecek V., Lhotsky A., Hermens W. T., Hof M.: Langmuir 19, 4120 (2003). 76. Novakova K., Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Chylkova J.: Chem. Listy 108, 219 (2014). 77. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 78. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 79. Navratil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2996 (2011). 80. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 81. Navratil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009). 82. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 36, 2767 (2003). 83. Navratil T., Senholdova Z., Shanmugam K., Barek J.: Electroanalysis 18, 201 (2006). 84. Skopalova J., Navratil T.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 961 (2007).
85. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 86. Selesovska R., Bandzuchova L., Navratil T.: Electroanalysis 23, 177 (2011). 87. Selesovska-Fadrna R., Fojta M., Navratil T., Chylkova J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007). 88. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007). 89. Fischer J., Vanourkova L., Danhel A., Vyskocil V., Cizek K., Barek J., Peckova K., Yosypchuk B., Navratil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007). 90. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 91. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 92. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 93. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 94. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011). 95. Alvarez P. E., Gervasi C. A., Vallejo A. E.: J. Biol. Phys. 33, 421 (2007). 96. Valincius G., Meskauskas T., Ivanauskas F.: Langmuir 28, 977 (2012). 97. Maherani B., Arab-Tehrany E., Mozafari M. R., Gaiani C., Linder M.: Curr. Nanosci. 7, 436 (2011). 98. Davey M. R., Anthony P., Power J. B., Lowe K. C.: In Vitro Cell. Dev. Biol.: Anim. 40, 16a (2004). 99. Neher E., Sakmann B.: Nature 260, 799 (1976). 100. Bebarova M.: Gen. Physiol. Biophys. 31, 131 (2012). 101. Cooper M. A.: J. Mol. Recognit. 17, 286 (2004). 102. Yavorskii V. A., Lukyanetz E. A.: Neurophysiology 43, 417 (2012). K. Novákováa,b (a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, b Institute of Environmental and Chemical Engineering, University of Pardubice): Model Biological Membranes: Their Characterization and Utilization Biological membranes are an essential part of living systems. They make an interphase between the outer and inner medium of the cell. Depending on their structure they often perform very complex functions. The structure of the biological membrane is very complex and often not yet precisely defined and explained. Model lipid membranes are used to obtain more detailed information on their properties and associated processes. Electrochemical impedance spectroscopy proved to be a useful tool for elucidation of the behavior of model lipid membranes (such as planar and supported lipid bilayers, tethered lipid membranes, liposomes).
175
