Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody

Vznik tohoto výukového materiálu byl podpořen projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253.

Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody Materiál je určen studentům k předmětu Úvod do spektrálních metod pro analýzu léčiv bakalářského studia oboru Analýza léčiv

Zpracoval a editoval kolektiv autorů pod vedením prof. Dr. RNDr. Pavla Matějky

Obsah Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody ............... 1 1.

Opticko spektroskopická charakterizace farmaceutických systémů ............................................... 7 1.1.

Úvod – charakterizace pevných farmaceutických látek a léčiv ............................................... 7

1.2.

Elektromagnetické záření a jeho základní charakteristiky ...................................................... 8

1.3.

Vibrační spektroskopie .......................................................................................................... 10

1.3.1.

Základní uspořádání spektrometru ................................................................................... 11

1.3.2.

Infračervená spektroskopie v blízké a střední infračervené oblasti .................................. 12

1.3.3.

Instrumentace pro střední infračervenou oblast .............................................................. 13

1.3.4.

Technika zeslabeného úplného odrazu - ATR.................................................................... 15

1.3.5.

Aplikace vibrační spektroskopie ........................................................................................ 15

1.3.6.

Příklady farmaceutického využití ATR-FT-IR spektroskopie .............................................. 16

1.4.

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti .......................................................................... 17

1.4.1.

Teorie absorpce v blízké infračervené oblasti ................................................................... 17

1.4.2.

Instrumentace pro blízkou infračervenou oblast .............................................................. 18

1.4.3.

Kvalitativní a kvantitativní analýza NIR dat ....................................................................... 21

1.4.4.

Farmaceutické aplikace NIR spektroskopie ....................................................................... 23

1.4.5.

NIR spektroskopie a polymorfismus .................................................................................. 26

1.4.6.

Pseudopolymorfismus, hydráty a solváty ......................................................................... 27

1.4.7.

Ověřování léčiv a odhalování padělaných a klonovaných verzí ........................................ 28

1.4.8.

Příklady dalšího farmaceutického použití NIR spektrometrie ........................................... 29

1.5.

Ramanova spektroskopie ...................................................................................................... 31

Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 1


1.5.1.

Teorie Ramanova rozptylu ................................................................................................ 31

1.5.2.

Instrumentace Ramanovy spektroskopie .......................................................................... 34

1.5.3.

Farmaceutické aplikace Ramanovy spektroskopie............................................................ 35

1.5.4. Ramanova spektrometrie jako technika pro proces monitorování, degradace, stability a krystalizace ........................................................................................................................................ 36 1.5.5.

Polymorfismus a použití Ramanovy spektroskopie ........................................................... 40

1.5.6.

Pseudopolymorfismus a Ramanova spektroskopie........................................................... 42

1.5.7.

Využití Ramanovy spektroskmopie jako procesní analytické techniky v rámci PAT ......... 44

1.5.8.

Ramanova spektroskopie – další příklady farmaceutických aplikací................................. 46

1.6.

Chemické zobrazování a mapovací mikrospektroskopické techniky .................................... 48

1.6.1.

Principy spektrálního zobrazování a mapování ................................................................. 48

2. Spektroskopie nukleární magnetické resonance jako nástroj pro studium farmaceutických systémů ................................................................................................................................................. 51 2.1.

Principy spektroskopie nukleární magnetické resonance ......................................................... 51

2.2.

Farmaceutické aplikace NMR spektroskopie ............................................................................ 53

2.3.

Využití NMR spektroskopie těžších jader ve farmacii ............................................................... 53

2.4.

NMR spektroskopie a polymorfismus ....................................................................................... 54

2.5.

Analýza léčivé látky a lékové formy pomocí NMR..................................................................... 56

2.5.1. 3.

Konformace, stereochemie a interakce vodíkových vazeb ................................................... 56

Terahertzová pulzní spektroskopie ............................................................................................... 57

3.1.

Teoretický úvod k THz spektroskopii ......................................................................................... 57

3.2.

Instrumentace THz spektroskopie ............................................................................................. 57

3.3.

Příprava vzorku a manipulace s ním .......................................................................................... 59

3.4.

Nedávný rozvoj THz instrumentace .......................................................................................... 60

3.5.

Farmaceutické aplikace THz spektroskopie............................................................................... 60

4.

Termická analýza – konvenční techniky ........................................................................................ 74

4.1.

Úvod do termické analýzy ......................................................................................................... 74

4.2.

Diferenční skenovací kalorimetrie ............................................................................................. 74

4.2.1.

Měření tepelného toku ......................................................................................................... 75



4.2.2.

Derivační křivky při DSC ......................................................................................................... 76

4.2.3.

Praktické pokyny pro DSC experiment .................................................................................. 77

4.2.4.

Enkapsulace pro DSC měření ................................................................................................. 77

4.2.5.

Teplotní rozsah běžných DSC měření .................................................................................... 79

4.2.6.

Rychlost skenování při DSC experimentu .............................................................................. 80

4.2.7.

Ustavení rovnováhy v DSC přístroji ....................................................................................... 81

4.2.8.

Kalibrace DSC ......................................................................................................................... 82

4.2.9.

Faktory ovlivňující DSC kalibraci ............................................................................................ 82

4.2.10.

Systém DSC s dvojitou pecí.................................................................................................... 83

4.2.11.

Systém DSC s jednoduchou pecí............................................................................................ 84

4.3. 4.3.1.

Diferenční termická analýza (DTA) ............................................................................................ 85 Modulovaný profil teploty..................................................................................................... 86

4.4.

Postupné/krokové metody termické analýzy............................................................................ 87

4.5.

Termogravimetrická analýza (TGA) ........................................................................................... 88

4.5.1.

Design přístroje pro TGA ....................................................................................................... 88

4.5.2.

TGA kalibrace – základní pokyny ........................................................................................... 89

4.5.3.

Praktická upozornění pro TGA experiment ........................................................................... 89

4.5.4.

Interpretace TGA záznamu vzorku ........................................................................................ 92

4.6.

Dynamická mechanická analýza (DMA) .................................................................................... 93

4.6.1.

Definice dynamické mechanické analýzy .............................................................................. 93

4.6.2.

Principy dynamické mechanické analýzy .............................................................................. 94

4.7.

Zjištění chování pevných krystalických látek v průběhu tání .................................................... 97

4.7.1.

Vyhodnocení přechodu bodu tání ......................................................................................... 98

4.7.2.

Určení bodu tání pro identifikaci vzorků ............................................................................... 99

4.8.

Polymorfismus a termická analýza .......................................................................................... 100

4.8.1.

Význam polymorfismu ve farmaceutických aplikacích........................................................ 101

4.8.2.

Termodynamické a kinetické aspekty polymorfismu: enantiotropie a monotropie........... 102

4.8.3.

Charakterizace polymorfů pomocí diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) ...................... 105

4.8.4.

Zjišťování polymorfní čistoty pomocí diferenční skenovací kalorimetrie ........................... 108



4.8.5.

Interpretace naměřených DSC termogramů vzorků vykazujících polymorfismus .............. 113

4.8.5.1.

Křivky typu 1: Přechod pevná látka-pevná látka ............................................................. 113

4.8.5.2.

Křivky typu 2: Rekrystalizace kapalina-tavenina ............................................................. 114

4.8.5.3.

Křivky typu 3: Zjišťování bodu tání .................................................................................. 114

4.9.

Solváty a hydráty (pseudopolymorfismus) a termická analýza ............................................... 115

4.9.1.

Faktory ovlivňující experimentální DSC křivky hydrátů a solvátů ....................................... 115

4.9.2.

Typy desolvatace/dehydratace v termické analýze ............................................................ 117

4.9.2.1.

Křivky typu 1: Dehydratace/desolvatace bez rekrystalizace ........................................... 117

4.9.2.2.

Křivky typu 2: Dehydratace/desolvatace provázená rekrystalizací ................................ 119

4.10.

Spřažená emisní termogravimetrická analýza (EGA) a simultánní měření ......................... 120

4.11.

Složení amorfních látek a jejich význam ve farmacii ........................................................... 122

4.11.1.

Úvod k amorfním látkám ..................................................................................................... 122

4.11.2.

Charakterizace amorfní pevné látky pomocí termických metod: teplota skelného přechodu 123

4.11.3.

Kvantifikace amorfních látek použitím diferenční skenovací kalorimetrie ......................... 126

4.12.

Stanovení čistoty preparátů použitím diferenční skenovací kalorimetrie .......................... 129

4.12.1.

Typy nečistot ve farmacii..................................................................................................... 129

4.12.2.

Diferenční skenovací kalorimetrie jako metoda pro stanovení čistoty ve farmacii ............ 130

4.12.3.

Praktické provedení termické analýzy a potenciální interference ...................................... 132

4.13.

Kompatibilita pomocných látek........................................................................................... 135

4.13.1.

Screening kompatibility pomocné látky pomocí diferenční skenovací kalorimetrie .......... 136

5.

Mikroskopie ................................................................................................................................. 142

5.1.

Úvod k mikroskopickým technikám ........................................................................................ 142

5.2.

Mikroskop jako analytický přístroj .......................................................................................... 143

5.3.

Jaký mikroskop použít? ........................................................................................................... 144

5.4.

Optická mikroskopie ................................................................................................................ 145

5.4.1.

Polarizační optický mikroskop pro studium vlastností látek v pevné fázi ........................... 147

5.4.2.

Příprava vzorku pro optickou mikroskopii........................................................................... 150



5.4.3. Charakterizace krystalických a amorfních materiálů s využitím polarizační optické mikroskopie ......................................................................................................................................... 152 5.4.4.

Určování optických vlastností krystalů ................................................................................ 153

5.4.5.

Měření indexu lomu pevných látek ..................................................................................... 161

5.4.6.

Určení mikrorozpustnosti pevných látek............................................................................. 162

5.5.

Tvar krystalů ............................................................................................................................ 164

5.6.

Velikost částic .......................................................................................................................... 166

5.7.

Optická mikroskopie za nestandardních podmínek ................................................................ 168

5.7.1.

Termomikroskopie .............................................................................................................. 169

5.7.2.

Stupeň vlhkosti .................................................................................................................... 178

5.7.3.

Stolek pro mrazové sušení .................................................................................................. 179

5.7.4.

Výzkum tekutých krystalů s využitím optické mikroskopie za nestandardních podmínek . 180

5.8.

Skenovací elektronová mikroskopie ........................................................................................ 182

5.8.1.

Princip řádkovací elektronové mikroskopie (SEM).............................................................. 185

5.8.2.

Příprava vzorku pro řádkovací elektronovou mikroskopii .................................................. 187

5.8.3.

Interakce elektronového paprsku se vzorkem .................................................................... 190

5.8.3.1.

Sekundární elektrony ...................................................................................................... 191

5.8.3.2.

Zpětně rozptýlené elektrony ........................................................................................... 193

5.8.3.3.

Rentgenové záření v elektronové mikroskopii ................................................................ 195

5.8.3.4.

Katodoluminiscence ........................................................................................................ 195

5.8.3.5.

Environmentální SEM a VP SEM (mód s proměnným tlakem - „variable pressure“ mód) 196

5.8.4. 5.9.

Kvantitativní analýza SEM obrazů ....................................................................................... 198 Prvková rentgenová mikroanalýza .......................................................................................... 200

5.9.1.

Detekce rentgenového záření ............................................................................................. 201

5.9.2.

Rentgenové emisní spektrum.............................................................................................. 202

5.9.3.

Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza jednotlivých částic a mapování prvků ....... 203

5.10.

Mikroskopie atomárních sil ................................................................................................. 205

5.10.1.

Princip jednotlivých technik mikroskopie atomárních sil .................................................... 207



5.10.1.1.

Zobrazování ..................................................................................................................... 207

5.10.1.2.

Příprava vzorku ................................................................................................................ 210

5.10.2.

Aplikace AFM ve farmaceutické analýze ............................................................................. 211

5.10.2.1.

Morfologická analýza....................................................................................................... 211

5.10.2.2.

Analýza lokálních interakcí mezi sondou a vzorkem ....................................................... 217

5.10.3.

Vyhlídky do budoucnosti ..................................................................................................... 220



1. Opticko spektroskopická charakterizace farmaceutických systémů

1.1.Úvod – charakterizace pevných farmaceutických látek a léčiv Fyzikální a fyzikálně chemická charakterizace pevných farmaceutických látek a pevných léčiv je nedílnou součástí procesu vývoje léčiv, a dále je také nezbytnou součástí kontroly výroby farmaceutických látek i léčiv v konkrétních formulacích. Charakterizace farmaceutických látek i léčiv v jednotlivých formulacích hraje důležitou roli i z hlediska patentových práv a také z hlediska kontroly léčiv dozorovými autoritami. Již dlouho je známo, že farmakav pevné fázi mohou existovat ve více než jedné pevné formě (např. polymorfní krystaly a podchlazené amorfní kapaliny – viz Haleblian a McCrone 1969). Jednotlivé pevné formy léčiv mohou vykazovat výrazně odlišné fyzikální a chemické vlastnosti, včetně barvy, morfologie, stability, rozpustnosti, sypkosti, tableting behaviour a biologické dostupnosti (Holzgrabe a kol. 1999) {poznámka překladatele: Biologická dostupnost je údaj, který vyjadřuje procento podané dávky, které je organismem využito}. Běžně se pro vývoj finálního produktu volí termodynamicky nejstabilnější forma, ale v posledních letech se začínají uplatňovat metastabilní formy, z důvodu vyšší rozpustnosti nebo profilu biologické dostupnosti. Ve všech případech je úplná charakterizace aktivní farmaceutické složky nezbytná pro pochopení chemických a fyzikálních vlastností materiálu. Při rozšíření uvedeného konceptu musí kvalitativní analýza zahrnovat aktivní farmaceutickou složku ve dvou úrovních: jako samotnou léčivou látku a stejně tak ve finálním léčivu. V návaznosti na tento krok je nezbytná rovněž kvantitativní analýza obou forem. V minulosti byla charakterizace aktivní farmaceutické složky založena na optické mikroskopii, rentgenové difrakci a termálních technikách, včetně diferenciální skenovací kalorimetrie a termogravimetrické analýzy. V roce 1940 se další využívanou technikou v multidisciplinárním postupu Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 7


charakterizace pevných farmaceutických látek stala infračervená spektroskopie. Nedávno byly do arzenálu používaných technik přidány spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR), Ramanova spektroskopie, nukleární magnetická rezonance pevné fáze a terahertzová spektroskopie. Výběr a správná aplikace těchto analytických technik pro charakterizaci pevných farmak závisí na požadované analytické informaci a fyzikální a chemické povaze vzorku. Všechny tyto techniky zahrnují měření interakce elektromagnetického záření externího zdroje se vzorkem a schopnost vzorku podstoupit další energetické změny. Energie tohoto elektromagnetického záření určuje fyzikálně-chemické vlastnosti vzorku, které mají být zkoumány. Je proto vhodné důkladně zopakovat vlastnosti samotného elektromagnetického záření.

1.2. Elektromagnetické záření a jeho základní charakteristiky Elektromagnetické spektrum pokrývá oblast vibračních energií a vlnových délek od několika metrů do 10-2 nanometru (kosmické záření). Bylo demonstrováno, že elektromagnetické záření se chová jednak jako vlnění a jednak jako proud částic. Vlnění můžeme popsat pomocí klasického sinusoidálního vlnového modelu. Elektromagnetické záření můžeme proto charakterizovat jeho vlnovou délkou, λ, frekvencí, v, rychlostí šíření, c, a amplitudou (obr. 3.1). Vlnová délka je vzdálenost dvou následujících bodů s odpovídající fází vlny a je rovna podílu rychlosti záření jeho frekvencí (jednotka: metr). V molekulové spektroskopii je vlnová délka často z pohodlnosti vyjádřena v nanometrech (nm) nebo mikrometrech (µm) (nanometr je 10-9 m; mikrometr, někdy též hovorově mikron, je 10-6 m). Frekvence, ν, značí počet kompletních vlnových cyklů, které proběhnou za sekundu

(jednotka:

Hz/s-1)

(Murray

and

Williams

1987).

Rychlost elektromagnetického záření, c, je konstanta nazývaná rychlost světla (ve vakuu c = 2.997925. 108 ms−1). Vzájemný vztah vlnové délky, frekvence a rychlosti ve vakuu je popsán následující rovnicí:



Energie fotonu (jakožto kvanta) elektromagnetického záření je přímo úměrná jeho frekvenci a tedy nepřímo úměrná vlnové délce. Převrácená hodnota vlnové délky je známa jako vlnočet, ̃ (jednotka: cm-1):

λ λ ̃

⁄

Obr.: Schématické znázornění elektromagnetické vlny: rovinně polarizovaný vektor elektrického pole Energie elektromagnetického záření, E, je přenášena v diskrétních svazcích či kvantech, nazývaných fotony a je vztažena k frekvenci (nebo vlnočtu) přes Plankovu rovnici ̃ kde

h

je

Plankova

konstanta

(h

=

6.626

196

10−34

J

s).

Elektromagnetické záření je příčné vlnění a nevyžaduje pro svůj přenos „hmotné“ či podpůrné prostředí, tj. je schopné šiřit se vakuuem. Sinusoidálně vlnový model popisu elektromagnetického záření není schopen odpovídajícím způsobem popsat absorpci a emisi zářivé energie. Tyto jevy lépe popisuje částicový (kvantový) model elektromagnetického záření. V tomto modelu je záření představováno proudem oddělených (diskrétních) částic (vlnových balíků), které nazýváme fotony. Oba uvedené modely se vzájemně doplňují v popisu vlastností EM záření, a proto obvykle mluvíme o vlnově-částicovém chování EM záření. Energie EM záření je přímo úměrná jeho frekvenci (Murray a Williams 1987).



Vlnový model EM záření rozlišuje elektrickou a magnetickou složku, které jsou navzájem kolmé, jsou kolmé ke směru šíření, a jejich sinusoidální oscilace jsou ve fázi. V případě lineárně polarizovaného záření je elektrická složka omezena jednou rovinou – rovinou vibrace. Magnetický vektor osciluje rovněž v jediné rovině, kolmé k rovině vibrace, kterou nazýváme rovinou polarizace (obr. 3.2). Je to právě elektrická složka EM záření, která se uplatní při spektroskopických jevech: absorpce, průchod, reflexe a refrakce při interakci s materiálem. Při každém z těchto procesů molekula absorbuje energetický foton a dojde k přechodu molekuly ze základního na vzbuzený rotační, vibrační nebo elektronový energetický stav. Tento přechod provází absorpce odpovídajícího množství energie, ΔE, a molekula tak může absorbovat pouze takový foton, jehož energie odpovídá frekvenci charakteristické vibrace molekuly. Oblast elektromagnetického záření může být rozdělena na několik podoblastí, které nám pomohou vhodně zvolit analytickou techniku (obr. 3.3).

1.3. Vibrační spektroskopie Infračervená oblast elektromagnetického spektra leží v oblasti 800 až 1000000 nm (0,8 až 1000 µm). Spektra se nejčastěji měří s linearizovanou stupnicí, která je inverzní k vlnové délce a nazývá se vlnočet ( ̃, jednotka: reciproký centimetr), protože vlnočet je přímo úměrný k energii a frekvenci absorpčního přechodu a nabývá smysluplnější číselné hodnoty vůči kterým je spektrum vynášeno. IR oblast můžeme rozdělit na tři podoblasti: rozsah 12500 až 4000 cm -1 (0,8 – 2,5 µm) je známa jako blízká infračervená oblast; střední infračervenou oblastí nazýváme rozsah 4000 až 400 cm-1 (2,5 – 25 µm) a rozsah 400 až 10 cm-1 (25 – 1000 µm) je nazýván dalekou infračervenou oblastí (někdy též terahertzová oblast) (Murray and Williams 1987). Při farmaceutické analýze se využívá oblast střední nebo blízká infračervená. Blízkou infračervenou oblast můžeme dále dělit na rozsahy 780 až 1100 nm (Herschlova oblast) a 1100 až 2500 nm. Tato oblast se při farmaceutické analýze využívá častěji. Ramanova spektroskopie se zabývá měřením neelastického rozptylu monochromatického záření koherentního zdroje na zkoumaném vzorku. Frekvenční posun odpovídající jednotlivým vazebným vibračním módům je stejný jako odpovídající vlnočet absorpčního pásu ve střední infračervené oblasti. Ramanova spektroskopie a spektroskopie ve střední infračervené oblasti jsou proto komplementárními technikami.



1.3.1.

Základní uspořádání spektrometru

Molekulární spektroskopie využívá pro analýzu nejčastěji jedno ze dvou základních uspořádání: transmisní a reflexní měření. V prvním případě záření s žádanou vlnovou délkou nebo s určitým rozsahem délek prochází kolmo přes kyvetu, s fixní optickou dráhou, obsahující měřený analyt. Intenzita záření vystupujícího z kyvety je porovnávána s intenzitou záření vystupujícího z referenční kyvety (obvykle obsahuje stejné prostředí, ve kterém se nachází měřený analyt; tímto prostředím může být vzduch, sintrované PTFE, rozpouštědlo aj. – obr. 3.4) Reflexní spektroskopie využívá dopadajícího záření dané vlnové délky, resp. rozsahu vlnových délek, a měří intenzitu záření reflektovaného (odraženého) vzorkem. Dopadající a odražený paprsek se měří v úhlu 45° k rovině neprůhledného difusně reflexního vzorku (obr. 3.4). Intenzita reflektovaného záření je porovnávána s intenzitou záření reflektovaného neabsorbujícím standardem (např. sintrované PTFE – Spectralon v NIR spektroskopii nebo lisovaný práškový síran barnatý). Oba typy instrumentací pracují s mírou absorpce záření o dané vlnové délce (resp. vlnových délkách při měření celého spektra). Označme intenzitu vstupujícího záření (záření prošlé slepým vzorkem nebo reflektované standardem) při jednotlivých vlnových délkách jako I0 a záření prošlé či reflektované vzorkem při stejné vlnové délce jako I. Obr. 3.4 Základní konfigurace spektrometru v reflexním a transmisním uspořádání (převzato z Practical NIR spectroscopy with applications in food & beverage analysis). Transmitance, T, je pak dána poměrem:

běžně vyjadřované jako procenta transmitance, %T, dané vztahem:

Reflektance, R, je obdobně dána poměrem



Reflektance i transmitance jsou definovány jako poměr a jsou tedy bezrozměrné, hodnoty nabývají v rozsahu 0 až 1. Pro každou vlnovou délku je při měření vzorku v transmisním uspořádání absorbance, A, definována jako: ( )

( )

Při měření v reflexním uspořádání je absorbance, A, definována obdobně jako: ( )

( )

Absorbance je rovněž bezrozměrnou veličinou. V reflexním uspořádání nabývá hodnot od 0 do 2 (například v NIR oblasti s využítím 99% PTFE reflexního standardu), v transmisním módu, v závislosti na zvoleném rozsahu a citlivosti detektoru může absorbance nabýt hodnot od 0 do 6. Výjimečně může být hodnota absorbance i vyšší (intenzita záření prošlého na detektor je nižší nebo rovna miliontině intenzity záření dopadajícího na vzorek).

1.3.2.

Infračervená spektroskopie v blízké a střední infračervené oblasti

Spektroskopie v blízké i střední infračervené oblasti se zabývá studiem rozptylu, reflexe, absorpce nebo propustnosti infračerveného záření. Spektra vznikají na základě absorpce infračerveného záření odpovídající vibračním modům molekuly. Z hlediska vibračních módů rozlišujeme dva druhy valenčních vibrací (změna v délce vazby) a čtyři módy deformačních vibrací (změna vazebného úhlu). U infračerveného spektra nás zajímá několik charakteristik: počet vibračních pásů a jejich vlnočet, intenzita a šířka vibračního pásu. Každá molekula léčiva bude mít (3N-6) vibračních módů, kde N značí počet atomů v molekule. Tyto módy označujeme jako fundamentální a vyžadují pro svou excitaci energii ve střední infračervené oblasti spektra. Avšak pouze nejintenzivnější vibrace budou detekovány s přesným přiřazením vlnočtu. Tyto vlastnosti závisí jak na síle vazby, tak na hmotnosti vázaných atomů. Obecně, při pokojové teplotě, většina vazeb bude v základním energetickém stavu. Přechod ze základního stavu, v=0, na vzbuzený fundamentální stav (v=1) se projeví absorpcí dodané



infračervené energie s fundamentální frekvencí. Tyto fundamentální frekvence jsou charakteristické pro danou vazbu a umožňují tak identifikovat jednotlivé funkční skupiny. Běžné vibrace jsou uvedeny v tabulce 3.1. Infračervená spektra jsou ale mnohdy složitější, především v oblasti 1800 až 400 cm-1. Tato „oblast otisku palce“ je bohatá na úzké absorpční pásy (malá pološířka linií), z nichž většina je nepřiřaditelná k dané funkční skupině. Přesto navzdory komplexnosti dané oblasti, zůstávají použitelné jako charakteristické absorpce celé molekuly, Tabulka: Charakteristické infračervené přechody a umožňují tak identifikaci (například s využitím počítačových vyhledávacích databází nejintenzivnějších absorpčních pásů nebo porovnáním s tabelovanými a knihovnovými spektry. Přístroje s Fourierovou transformací (FT) mají excelentní poměr signál-šum, přesnou frekvenci a stabilitu. Spektroskopie ve střední IR oblasti je nejstarší ze všech tří vibračně-spektroskopických technik a s využitím tradiční instrumentace trpí několika nevýhodami. Záření MIR neprochází přes většinu obvyklých optických materiálů a omezuje tak vzorkovací možnosti (není například možné analyzovat pevný vzorek ve skleněné vialce). Mnoho materiálů má vysokou molární absorptivitu ve střední IR oblasti. Z tohoto důvodu musí být pevné vzorky často připravovány v tabletách alkalických halogenidů nebo jako tenké filmy v tekutém parafinu (Nujol) mezi okénky z alkalických halogenidů (např. NaCl, KBr). Hydratované vzorky musí být ve formě velmi tenkých filmů, protože páry vody jsou rovněž interferentem.

1.3.3.

Instrumentace pro střední infračervenou oblast

Většina MIR spektrometrů využívaných při farmaceutické analýze je buď dispersní povahy či mnohokanálového

multiplexního

typu

(využívájící

Fourierovu

transformaci).

Multiplexní

spektrometry využívají obvykle Michelsonův interferometr a jsou jednopaprskové. Tento typ využívá pohyblivé zrcadlo, které se posouvá plynulým pohybem o konstantní rychlosti úsekem vlnových délek (rozsah 50 – 1000 µm). V případě spektrometrů ve střední a blízké IR oblasti je toto zrcadlo obvykle přiděláno na plovoucím, vzduchovém polštáři voně mezi přesnými nerezovými objímkami. Zrcadlo je poháněno pomocí lineárního motoru, který zvyšováním napětí v elektromagnetické cívce umožňuje Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 13


zrcadlu pohyb konstantní rychlostí. Dráha pohybu zrcadla v interferometru se pohybuje od 1 do 20 cm s obvyklou skenovací rychlostí 0,01 až 10 cm/s (Skoog a kol.). Spektrometry s Fourierovou transformací dosahují ve střední IR oblasti více jak o řád lepší poměr signálu k šumu v porovnání s vysoce výkonným dispersním spektrometrem. Díky tomu umožňují rychlé měření (doba měření: několik sekund) akceptovatelných spekter, s malým počtem kompletních skenů. Kromě toho umožňují přístroje s Fourierovou transformací vysoké rozlišení (<0,1 cm-1), přesnost a reprodukovatelnost

frekvenční škály.

Většina dispersních MIR spektrometrů je

naopak

dvoupaprskových, a to z důvodu relativně malé intenzity infračervených zdrojů záření, nízké citlivosti detektorů a především kvůli absorpci MIR záření atmosférickou vodní parou a oxidem uhličitým (může vyvolat interference). Referenční paprsek kompenzuje tyto atmosférické absorpce a fluktuace výkonu zdroje záření, což se projeví stabilní základní linií na hodnotě 100%T. Záření zdroje je rozděleno do dvou paprsků, přičemž polovina záření prochází vzorkovým prostorem a polovina slouží jako srovnávací (referentní). Intenzita srovnávacího paprsku je zeslabena pohybem hřebenu, procházejícím příčně skrz paprsek. Pro dělení referenčního a měřícího paprsku se využívá nízkofrekvenční dělič (5 až 13 rotací za sekundu). Tento motorem řízený disk střídavě propouští měřící paprsek a odráží paprsek srovnávací. Oba paprsky následně prochází přes monochromátor (hranol nebo mřížka) a rozdělují se podle vlnových délek, které jsou detegovány, převedeny na napětí a zaznamenány (Skoog a kol.). Při měření pevných vzorků zahrnuje příprava vzorku buď tvorbu lisovaných diskových tablet vzorku v halogenidu alkalického kovu (např. KBr) nebo suspenze vzorku v uhlovodíku s dlouhým řetězcem (např. Nujol), která je umístěna mezi dvě okénka halogenidu. První je měřeno srovnávací

spektrum/interferogram pozadí a až následně je do paprsku umístěn

analyzovaný vzorek. Žádané spektrum je pak dáno poměrem spektrálního záznamu vzorku a spektra referentního. Ve střední infračervené oblasti se obvykle akumuluje více jednotlivých skenů pro každé měření. V případě fourierovských přístrojů jsou jednotlivé interferogramy sčítány, u přístrojů dispersních se jednotlivá měření průměrují (obvykle 16 nebo 32 kompletních skenů pro oba typy spektrometrů).



1.3.4.

Technika zeslabeného úplného odrazu - ATR

Spektroskopie totální vnitřní reflexe, označovaná častěji jako technika zeslabeného úplného odrazu (attenuated total reflection (ATR)) je technika umožňující měřit infračervená spektra vzorků, u nichž by standardní techniky nešly použít (Skoog a kol.). Z farmaceutického hlediska může být takovým materiálem například obtížně rozpustitelné léčivo a pomocné látky, tenké filmy, práškové vzorky a pasty. Příklad ATR modulu je uveden na obrázku 3.5. Spektrometrie zeslabeného úplného odrazu je založena na jevu reflexe záření při průchodu záření z opticky hustšího prostředí do prostředí opticky řidšího. Během tohoto procesu část energie dopadajícího paprsku projde do velmi tenké vrstvy opticky řidšího prostředí (obr. 3.5). Hloubka průniku záření je závislá na vlnové délce, úhlu dopadu optického paprsku a indexu lomu obou optických materiálů. Obr.: Schématické znázornění přístroje pro měření zeslabeného úplného odrazu: (a) vzorek umístěný na vnitřně reflexní vrstvě; (b) internal reflection adapter Běžně se hloubka průniku pohybuje od zlomků vlnové délky záření až po několik jednotek vlnové délky. Pronikající záření je známo jako evanescentní vlna. Spektroskopie zeslabeného úplného odrazu je běžně dostupná jako přídavný nástavec většiny moderních infračervených spektrometrů (obr. 3.5). Vzorek se pouze přiloží na vnější stranu transparentního krystalu o vysokém indexu lomu (např. bromid thalný/jodid thalný, germaniová destička nebo selenid zinečnatý). Úhel dopadu záření je nastaven tak, aby nastalo několik vnitřních reflexí na rozhraní krystalu a vzorku předtím, než záření dorazí na detektor. {pozn. překladatele: uvedené platí pro případ víceodrazového ATR, jednoodrazové ATR využívá právě jednu reflexi} Při každé této reflexi nastane absorpce záření vzorkem a tedy zeslabení intenzity záření. Spektra zeslabeného úplného odrazu jsou velmi podobná běžným absorpčním spektrům, včetně polohy jednotlivých vibračních pásů. Relativní intenzity jednotlivých pásů se liší od tradičnítransmitanční MIR spektrometrie. Běžně záření proniká do hloubky několika mikrometrů vzorku.

1.3.5.

Aplikace vibrační spektroskopie

FT-IR s využitím zeslabeného úplného odrazu se široce využívá pro charakterizaci farmaceutických látek v pevném stavu. Metoda se využívá i pro studium interakcí mezi jednotlivými složkami léku, míry rozpustnosti (dissolution rate) a uvolnění léčiva z polymerní matrice (polymer-drug formulation) Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 15


(Park a kol. 1999). ATR FT-IR využili Kazarian a Matirosyan (Kazarian a Matirosyan 2002) při in situ studiu vysokotlaké superkritické impregnace (impregnation) PVP ibuprofenem v superkritickém CO2. Autoři ve své práci ukázali, že je tato technika vhodná pro studium impregnace široké skupiny polymerů molekulami léčiva v prostředí superkritické kapaliny. Dále bylo ukázáno, že superkritická kapalinová impregnace léčiva do polymerní matrice vede k molekulárně rozptýlenému léčivu v polymerní matrici, bez krystalizace léčiva. Další zkoumání bylo provedeno analýzou pomocí Ramanovy spektroskopie. Autoři popsali využitelnost tohoto postupu pro optimalizaci (tailor) rychlosti uvolňování léčiva s řízeným uvolňováním, snadněji kontrolovatelnému díky absenci krystalické fáze. Spektra ATR FT-IR prokázala interakci mezi léčivem a polymerní matricí, specifickou vodíkovou vazbou mezi hydroxy- skupinou ibuprofenu a karbonylovou skupinou PVP; tato interakce tedy potlačuje asociaci molekul ibuprofenu. Interakce ibuprofenu s karbonylovou skupinou PVP potlačuje pohlcování vody. Závěrem lze říct, že bylo prokázáno, že metoda je použitelná pro přípravu impregnovaných polymerních filmů; CO2 změkčuje PVP film, usnadňuje difundování léčiva do filmu, a jako rozpouštědlo se snadno odstraňuje. Metoda soupeří s tradiční metodou přípravy pevných disperzí, zejména s použitím ve vodě špatně rozpustného léčiva.

1.3.6.

Příklady farmaceutického využití ATR-FT-IR spektroskopie

Použití ATR-FT-IR spektroskopie pro charakterizaci pevné fáze zahrnuje identifikaci látky, její kvantifikaci a určení krystalové formy. V porovnání s tradiční MIR spektrometrií je nutná jen mírná předúprava a drobné množství vzorku (řádově miligramy) může být rychle analyzováno, přičemž získáme ostré intenzivní spektrální pásy s vysokým poměrem signálu k šumu. Tabulka 3.2 uvádí deset nejintenzivnějších pásů vyskytujících se u práškových léčivých a pomocných látek (řazeno podle klesající intenzity) při analýze ATR technikou. Tato tabulka zdůrazňuje použitelnost metody pro rychlou nedestruktivní identifikaci a roztřídění práškových, krystalických materiálů. Vybrané ukázky ATR FT-IR spekter α-laktózy (monohydrát a bezvodá forma) jsou uvedeny na obrázku 3.6 a 3.7. Obrázky 3.8 a 3.9 ukazují spektra naměřená pro kofein a paracetamol a na obrázku 3.10 je ukázka spektra stearátu hořečnatého (lubrikant). Technika je rovněž schopna odlišit jednotlivé polymorfní



formy materiálu. Ukázka identifikace a odlišení dvou polymorfních forem Salmeterol xinafoate_u je popsána v tabulce 3.3 a na obrázcích 3.11 a 3.12. Tabulka 3.2 Pozice ATR FT-IR absorpčních pásů běžných farmaceutických a pomocných látek (řazeno podle klesající intenzity, lineárně interpolováno ze záznamu prvních derivací spekter, rozsah vlnočtů: 4000,4 – 648,08 cm-1). Obr.: ATR spektrum monohydrátu α-laktózy Obr.: ATR spektrum bezvodé α-laktózy

1.4.Spektroskopie v blízké infračervené oblasti Spektroskopie v blízké infračervené oblasti z velké míry spadá do vibrační spektroskopie, ale vzhledem k jejím specifickým aspektům se často probírá samostatně.

1.4.1.

Teorie absorpce v blízké infračervené oblasti

Absorpce v blízké infračervené oblasti (NIR) odpovídá svrchním tónům (overtonům), kombinačním a rozdílovým přechodům odpovídajících fundamentálních vibračních přechodů (obr. 3.13), ale také některým nízkoenergetickým elektronovým přechodům. NIR

absoprce

projevuje se v rozsahu

vlnových délek cca 700 – 2500 nm (14300 – 4000 cm-1). Jelikož jsou tyto přechody z hlediska kvantové mechaniky pro případ harmonického oscilátoru zakázané, mají tendenci být oproti MIR pásům slabší. Ačkoliv se při NIR absorpci uplatňují fotony s vyšší energií, jsou propouštěny běžnými optickými materiály i sklem. Molární absorptivita těchto materiálů je v NIR oblasti o dva až tři řády slabší než v MIR oblasti a tyto materiály tak propouštějí NIR záření do větší hloubky. Při NIR analýze tak není nutná tak důkladná příprava vzorku, nebo použití tenkých filmů. Je naopak možná neinvazivní analýza pomocí vláknové optiky nebo přes skleněnou nádobu. Z tohoto důvodu je tato technika široce užívána farmaceutickými firmami při výrobě k identifikaci pomocných látek. Obr. ATR spektrum paracetamolu Obr. ATR spektrum bezvodého kofeinu



Dokonce i po smíšení práškových látek, tvorbě tablety nebo kapsle můžou být tyto kompaktní formy nebo kapsle analyzovány pomocí difusní reflexe nebo transmisního měření. Kubelka-Munkova teorie difusní reflexe se běžně využívá při popisu interakce NIR záření s pevnou látkou (Kortüm 1969). Všechny práškové farmaceutické látky rozptylují dopadající NIR záření. Tento rozptyl je závislý na vlnové délce velikosti částic a jejich tvaru. Při průchodu záření přes vzorek zpět na detektor dojde k opoakovanému rozptylu na jednotlivých částicích látky. Kromě toho mohou částice v průběhu rozptylu část záření rovněž absorbovat. Důsledkem toho je, že spektra pevných látek obsahují kromě absorpčních pásů prohnutou či posunutou základní linii. Surová reflektanční spektra mohou být převedena pomocí matematické Kubelka-Munkovi funkce, která vztáhne reflektanci k teoretickým absorpčním (přímá úměra (direct relationship)) a rozptylovým koeficientům (nepřímá úměra). Obr. ATR spektrum stearátu hořečnatého Tabulka 3.3 Pozice deseti nejintenzivnějších absorpčních pásů ATR spekter práškových polymorfních forem Salmeterol xinafoate_u (forma I a II), získané pomocí zero-crossing point první derivace spektrálního záznamu (sedmibodový filtr typu Savitzky-Golay, kubický polynom) Obr. ATR infračervené spektrum Salmaterol xinafoatu (polymorfní forma I) Obr. ATR infračervené spektrum Salmaterol xinafoatu (polymorfní forma II) Obr. Hladiny vibrační energie v diatomické molekule. Fundamentální přechod (ν=0 ν=1); první svrchní tón (ν=0 ν=2); druhý svrchní tón (ν=0 ν=3) Mnoho literárně publikovaných aplikací pak využívá buď další matematické předzpracování surových dat (např. převod na absorbanci,

( ⁄ )) nebo samotná surová data (reflektanci, R,

nebo transmitanci, T). Základním požadavkem teorie difusní reflexe je nekonečná tloušťka vrstvy práškového materiálu. V praxi bylo zjištěno, že práškový vzorek by měl být ve vrstvě alespoň 1 cm, aby bylo dosaženo reprodukovatelných spekter s vysokým poměrem signál/šum (Yoon a kol. 1998); u tablet většinou postačí několik milimetrů.

1.4.2.

Instrumentace pro blízkou infračervenou oblast

Spektrometry pro blízkou infračervenou oblast jsou svým designem velmi podobné UV-Vis spektrometrům a můžeme je dělit na tři základní typy podle způsobu spektrálního výběru: disperzní,



interferometrické a netermální. První dva typy využívají širokospektrální tepelný zdroj záření, nejčastěji žhavené vlákno (např. halogenovou výbojku – quartz tungsten). Netermální design obsahuje studený zdroj záření a výběr vlnových délek je inherentně dán díky širokému spektrálnímu rozsahu emitovaného záření (Osborne a kol. 1993). Disperzní přístroje rozdělují širokopásmové záření zdroje prostorově (úhlově) použitím hranolu nebo mřížky. Hranol se stává neefektivním a trpí slabou nelineární, anomální disperzí (především rozptyluje spektrální oblast ve které absorbují –OH vazby a to i v případě záření z IR čistého křemene). Z tohoto důvodu se v těchto přístrojích více používají difrakční mřížky. Vesměs se jedná o holografické reflexní mřížky z vysoce leštěného kovu (např. hliník) s laserově nebo photo-etched ekvidistantními drážkami. Alternativní dispersní systém využívá akusticko-optický laditelný filtr (AOTF). Tento typ využívá anisotropického krystalu (např. TeO2) jako disperzního prvku. Tento krystal is formed into aligned, cut a leštěného krystalu s rovinnou akustické vlny procházející transverzálně skrz krystal. Blízké infračervené záření dopadá na krystal kolmo k akustické rovině a interaguje s periodicitami v indexu lomu materiálu (periodicity je rovna vlnové délce akustického vlnění). Krystal tak pracuje jako podélná difrakční mřížka. Změnou frekvence akustického signálu se změní vlnová délka, při které jsou oba signály ve fázi. S využitím širokopásmového rovině polarizovaného zdroje je tedy možné, aby krystal fungoval jako laditelný úzce pásmově propustný filtr. Akustický signál je generován jedním nebo více piezo-elektrickými převodníky (transducers), které jsou vakuově přivařené ke straně krystalu. Pro NIR oblast záření pracují převodníky s frekvencemi 20 – 150 MHz a spotřebovávají jen několik watů. Využívané radiofrekvenční zdroje produkují vysoce stabilní frekvenční pásmo s rychlou změnou frekvence (několik mikrosekund). Vysokofrekvenční stabilita obvykle znamená kratší kalibraci než v případě mřížkového difrakčního systému (Osborne a kol. 1993). Interferometrické systémy využívají k spektrálnímu výběru optickou interferenci. Klasickým interferometrem je ten vytvořený Michelsonem v roce 1891 a nesoucí název Michelsonův interferometr (obr. 3.14). Základním principem, na kterém je systém postaven je rozdělení vstupního záření na dva samostatné paprsky, prodloužení optické dráhy jednoho z paprsků a jejich opětovné spojení. Základní sestava interferometru obsahuje dvě kolmá zrcadla, jedno pevné a druhé pohyblivé umístěné souběžně se vstupujícím zářením. Mezi oběma zrcadly je v úhlu 45 stupňů umístěn dělič paprsků, který rozděluje vstupující záření na dva paprsky a po odrazu na příslušném ze dvou zrcadel oba paprsky opět Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 19


kombinuje. Pokud je pohyblivé zrcadlo v základní poloze, jsou obě zrcadla, fixní i pohyblivé, ve stejné vzdálenosti od děliče paprsků. Optická dráha odraženého a znovu složeného paprsku je tak dvojnásobkem vzdálenosti zrcadel od děliče. Pokud je tedy pohyblivé zrcadlo v základní poloze, neexistuje žádný dráhový rozdíl (zpoždění (retardation)) mezi oběma rozdělenými paprsky a při jejich kombinaci dochází ke konstruktivní interferenci. V případě monochromatického záření dochází při posunu zrcadla o λ/4 k dráhovému rozdílu λ/2 a tedy k destruktivní interferenci obou paprsků, která vyústí v nulový detekovaný signál. Obr. Schéma Michelsonova interferometru (převzato z Osborne, Fearn & Hindle (1993), Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis) Zrcadlo interferometru se pohybuje konstantní lineární rychlostí a vytváří sinusoidální změny v intenzitě detekovaného signálu. Signál je zaznamenáván ve formě interferogramu, který je závislostí variability signálu na čase, resp. zpoždění (retardation). Protože používané zdroje jsou širokopásmové, je výsledný interferogram součtem jednotlivých sinusoidálních signálů odpovídajících každé vlnové délce. K rekonstrukci spektra z interferogramu je potřeba počítač, který využívá algoritmus inverzní Fourierovi transformace (iFFT) a výpočet probíhá téměř okamžitě. Interferometrické přístroje jsou mnohokanálové (multiplexní), protože všechny části spektra jsou měřeny současně. Existuje rovněž několik modifikací Michelsonova interferometru. Příkladem může být interferometr na obr. 3.15, využívající místo zrcadel refrakční hranoly (Buhler NIRVIS, Buhler ANATEC AG, Uzwil, Švýcarsko). Zdroje záření pro NIR oblast jsou obecně širokopásmové a emitují záření od viditelné oblasti až po vlnovou délku 3 µm. Záření emitované zdrojem nemusí mít v celém rozsahu stejnou intenzitu, ale musí být stabilní v čase. Většina spektrometrů využívá žhavené objekty, emitující záření černého tělesa, kterým je typicky křemeno-wolframová halogenová žárovka s maximem okolo 1 µm a běžnou provozní teplotou 2400 K. Pro dosažení delší životnosti, obvykle několik tisíc hodin, není používána maximální teplota a výkon (až 3200 K), ale teplota nižší, která nevyvolává takové ztráty wolframu ve vlákně a prodlužuje životnost výbojky (Osborne a kol. 1993:69). Detektory, používané v NIR spektroskopii se liší svou citlivostí pro tuto oblast. Fotodiody z křemíku a germánia jsou citlivé v oblasti Vis-NIR. Křemíkové diody jsou nejcitlivější v oblasti vlnových délek od uv-A (0,38 µm) nebo viditelné (0,4 µm) až po 1 µm, s maximem u ca. 0,85 µm.



Germániové detektory mají maximum okolo 1,3 µm. Častěji jsou používané detektory z olověných solí (sulfidu, PbS, a selenidu, PbSe), využívající fotoelektrický jev. Obr. Schématické znázornění FT-NIR spektrometru (Buhler FT-NIR Universal Spectrometer, System NIRVIS, převzato z Buhler NIRVIS manual, Buhler Anatec, Uzwil, Švýcarsko) Detektory ze sulfidu olovnatého jsou nejcitlivější v rozsahu 1 – 2,5 µm, zatímco selenidové jsou celkově méně citlivé, s použitelnou citlivostí v rozsahu vlnových délek 2,5 – 3 µm. Nejnovějším detektorem pro NIR oblast jsou detektory z indium-galium arzenidu (InGaAs), pracující v rozsahu 1 – 1,8 µm, s maximem odezvy u 1,7 µm. Citlivost tohoto detektoru je o několik řádů vyšší než u detektoru z PbS, kratší je rovněž doba odezvy (<1 µs versus 100 – 200 µs)(Osborne a kol. 1993). Optické součásti používané pro NIR spektroskopii jsou stále častěji z křemíku (oblast: viditelná – 2,5 µm) nebo z bezvodého IR-čistého (IR-grade) křemene (VIS – 3,5 µm). Stále častější je ve farmaceutické analýze, především při řízení a kontrole procesů, použití optických vláken. Jejich použití umožňuje umístit spektrometr mimo nebezpečné či nevhodné prostředí (s nebezpečím požáru, exploze, mechanických vibrací či s expozicí rozpouštědel aj.) a dokonce při užití více optických vláken umožňuje měření a kontrolu na více místech výrobního procesu, tedy odstraňuje potřebu použití více spektrometrů a s tím spojených investic.

1.4.3.

Kvalitativní a kvantitativní analýza NIR dat

Surová NIR spektra často obsahují široké a překrývající se absorpční pásy, které dělají interpretaci složitější než v případě MIR spekter. NIR spektra pevných látek kromě toho často obsahují efekty vícenásobného rozptylu, které jsou funkcí vlnové délky, distribuce velikosti částic, kompaktnosti vzorku a jeho vlhkosti (O’Neil a kol. 1998). Rozptyl interagujícího NIR záření nastává na částicích, které jsou mnohem větší než vlnová délka záření (0,78 – 2,5 µm, Tyndall, 1869) a tento jev tak nastává u práškových farmaceutických materiálů, které mají velikosti částic v rozsahu několika mikrometrů až po 1 mm. Na soustředěné vrstvě částic nastává několikanásobný rozptyl a produkuje neostrý difusní odraz. Malá část interagujícího záření může být absorbována i z jediné vrstvy částic, tento jev je výrazně zesílen při mnohonásobném rozptylu, který nastane uvnitř silnější vrstvy částic (protože celková optická dráha interagujícího



fotonu může být až 80-krát síla vrstvy (Butler a Norris, 1960)). Kubelka-Munkův matematický popis difusní reflexe vedl k vývoji fenomenologické teorie difusní reflexe (Kubelka a Munk, 1931). Jejich teorie uvádí, že pro neprůsvitnou nekonečně silnou (v praxi 1 cm a více) vrstvu difusně reflektujících částic může být intenzita difusně reflektovaného záření, R, vztažena k stupni rozptylu (ratio of a scatter), s, a absorpčnímu koeficientu, k. Tento vztah je označován jako Kubelka-Munkova funkce, F(R∞), a je dán následující rovnicí: (

(

)

)

Analogicky k Lambert-Beerovu zákonu můžeme uvažovat, že absorpční koeficient, k, je součinem koncentrace, c, a absorptivity, a (Kortüm 1969). Uvedenou rovnici pak můžeme přepsat: (

)

(

)

Efekt difusní reflexe se projeví v surových NIR spektrech pevných látek, prášků nebo kompaktních vzorků obvykle prohnutou či posunutou základní linii. NIR spektra pevných látek tak obsahují informace o chemické i fyzikální podstatě vzorku. Přítomnost obou typů informace může být přínosem pro kvalitativní aplikace, kde jsou velikost částic a obsah vody důležitými parametry. Pro ostatní aplikace, například pouhou identifikaci, způsobuje kolineární povaha spektra (díky nelineární základní linii) potíže při užití surových spekter. Tyto aplikace vyžadují předzpracování spekter, za účelem odstranění rozptylových efektů. Pro odstranění těchto jevů lze použít například digitální polynomický vyhlazovací algoritmus (například Savitzky-Golay, druhé derivace spektra), tvořící derivované spektrum ve kterém jsou chemické pásy rozlišené. Spektra druhé derivace jsou podobná MIR oblasti otisku palce a jsou tedy často používána při identifikaci. Kromě výpočtu spektrálních derivací můžeme minimalizovat efekt vícenásobného rozptylu použitím metody SNV (standard normal variate) a multiplikativní korekce rozptylu (MSC). MSC vyžaduje znalost průměrného spektra materiálu pro výpočet alfa a beta koeficientů pro opravu posunu základní linie a efektu vícenásobného rozptylu v jednotlivých spektrech materiálu. SNV i MSC předzpracování dat může být užito samostatně nebo v kombinaci s derivacemi.



Typické aplikace, v případě pevných látek, jsou identifikace velkého množství farmaceutických pomocných látek, srovnání šarží multikomponentních tabletových (dosage) forem nebo kontrola meziproduktu oproti uloženému průměrnému spektru. Kvalitativní a kvantitativní aplikace NIR spektroskopie jsou založeny na použití vícerozměrných statistických metod analýzy "celého spektra". Pro identifikaci jsou využívány metody jako například Analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis, PCA) a příbuzná technika SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy). Kvantitativní stanovení je obecně založeno na vícerozměrných regresních metodách, například regrese hlavních komponent (Principal components regression, PCR) nebo regrese částečných nejmenších čtverců (Partial least squares, PLS). Pro získání žádaných informací (například obsah aktivní složky, velikost částic, obsah vlhkosti) z NIR dat jsou vytvářeny regresní modely. Tyto modely umožňují předpověď hodnot žádaných proměnných z následných NIR měření. Pro dosažení optimální správnosti a přesnosti modelu jsou většinou aplikovány některé techniky předzpracování dat (např. korekce rozptylu). Rovněž je nutné sestavit kalibrační a testovací soubory dat. Sestavení kvalitativního či kvantitativního NIR modelu je proto časově náročný proces vyžadující odborné znalosti chemometriky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti není technikou stopové analýzy a v případě multikomponentního pevného vzorku vyžaduje pro detekci přítomnost alespoň 1% obsahu analytu. Technika se nejlépe hodí pro kvantifikaci složek s obsahem mezi 10 a 90 %hm. Pro kompaktní pevné materiály se při stanovení obvykle dosahuje větší přesnosti a správnosti u transmisního měření než u techniky reflexní, protože toto měření je méně citlivé na nehomogenitu.

1.4.4.

Farmaceutické aplikace NIR spektroskopie

V poslední době je NIR spektroskopie široce využívanou analytickou technikou ve farmaceutickém průmyslu. Na tuto skutečnost upozornili v roce 1998 ve své přehledové práci Blanco a kol. (Blanco a kol., 1998). V roce 1999 akceptovala tuto techniku (spolu s dalšími) pro kontrolu farmaceutického výrobního procesu, od kontroly vstupních materiálů po zpracování meziproduktů (např. kontrola práškových směsí) do konečných lékových forem, americká agentura pro kontrolu léčiv (U.S. Federal Drug Agency’s Process Analytical Technology (PAT) initiative (www.fda.gov/cder/OPS/PAT.htm)).



Cílem této instituce je podporovat lepší pochopení farmaceutických výrob a provádět jejich kontrolu v souladu s aktuálním systémem kvality. Kvalita tedy nemůže být testována v konečném produktu, ale musí být implementována v celém procesu. FDA původně definovala PAT jako systém pro návrh, analýzu a řízení výroby pomocí měření kritických kvalitativních a výkonnostních parametrů surových materiálů a meziproduktů v reálném čase za účelem zajištění kvality finálního produktu. Procesní analytická technologie (PAT), jako celek, zahrnuje širokou paletu nástrojů pro zajištění výroby s "řízeným rizikem". NIR spektrometrie, jako moderní procesní analytická technika, je důležitým nástrojem většiny farmaceutických procesů. Další nástroje zahrnuté v PAT jsou techniky vícerozměrného sběru dat a vícerozměrné analytické nástroje (např. pro interpretaci vícerozměrných NIR dat); nástroje k monitorování a určení konce procesu (jako například sondy s vláknovou optikou a stroje se softwarovou zpětnou vazbou) a nástroje pro kontinuální vylepšení a management znalostí (například lepší pochopení výrobního procesu a jeho kritických parametrů). Již dříve popsali zajímavou aplikaci NIR spektroskopie pro zjištění shody fyzikálních a chemických vlastností farmaceutických přísad s předpisem Plugge a van der Vlies (1993). S použitím trihydrátu ampicilinu jako modelového léčiva demonstrovali autoři schopnost určit konec uvolňování na základě NIR měření, čímž nahradili předepsané testování (compendial identification), určení obsahu vody a assay tests a vytvořili tak nový parametr pro určení přijatelnosti, známý jako index shody. Později autoři implementovali novou metodu kontroly kvality, založenou na NIR spektroskopii. Tato metoda zahrnuje transformaci souboru spekter do polárních souřadnic a pro každé transformované spektrum vypočítává těžiště. Tato jsou následně zobrazena do kartézkých souřadnic a umožňují rozlišení podobných materiálů, pomocí klastrové analýzy, (např. formy laktózy) mírně se lišících fyzikálními a chemickými vlastnostmi (např. amorfní, bezvodé, monohydrát, odlišné velikosti částic). Metoda byla rozšířena, aby ukázala potenciál NIR spekter pro kontrolu homogenity směsí s použitím analýzy rozptylu. Hailey a kol. v roce 1996 a Sekulic a kol v roce 1998 popsali automatický systém pro on-line monitoring a kontrolu míchání práškových vzorků za pomoci NIR spekter. V těchto pracích je míchací zařízení řízeno v reálném čase pomocí vláknové optiky a softwarové zpětné vazby. Studie zkoumá skupinu technik pro předzpracování spektrálních dat a jejich kombinace – např. metodu SNV, polynomický rozklad metodou kvadrátů nejmenších čtverců či druhé derivace spektra – a úspěšně demonstruje vztah mezi změnami ve spektrální variabilitě a homogenitou směsi. Dále zde byly Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 24


použity k zajištění on-line procesní kontroly metody SIMCA a blokově prováděný výpočet směrodatné odchylky. Jinou on-line aplikaci vícekanálové NIR techniky zavedli k monitorování obsahu směsi v granulátoru s fluidační lože Rantanen a kol. (Rantanen et al., 1998). Metoda zkoumala tři granulovací postupy a jeden peletovací (vytvářené vytlačováním přes předlohu - extrusionspheronization). Při porovnání s referenční metodou úbytku hmotnosti při sušení (loss-on-drying) bylo dosaženo nejistoty směrodatné odchylky (standard error on prediction) 0,2 % pro granulovací postup. Byl studován efekt různých průtoků kapaliny (liquid flow rates) a koncového sušení a bylo zjištěno, že technika je vhodná ke stanovení konce a řízení farmaceutických procesů. Aplikace pro monitorování a kontrolu procesu potahování tablet byla popsána Anderssonem (Andersson et al., 1999). Tloušťka potahu tablety dvou granulovaných jader může být monitorována s využitím metody vícenásobné korekce rozptylu, PCA a PLS. Maximální tloušťka potahu, která umožňuje stanovit základní chemické složení, byla stanovena v rozmezí 0,1 – 0,2 mm. Využití NIR měření pro předpověď tvrdosti tablety popsali Kirsch a Drennen (1999). Autoři použili dvě metody kalibrace – PCR a fitovací algoritmus. Byly vytvořeny modely pro tablety Cimetdine s obsahem 1-20 %hm a tvrdostí tablet mezi 1-7 kp. Směrodatná odchylka kalibrace pro PCR a fitovací model byla O,42 a 0,46 kp. Charakteristické rysy chemických složek pozorované v NIR spektrech je činí použitelnými pro identifikační a kvantifikační účely. Identifikační metody obvykle vyžadují databázi referenčních spekter vzorku. Jednoduché metody identifikace pevných látek zahrnují například vhodnou transformaci do druhé derivace (např. Savitzky-Golay) a porovnání šesti nebo deseti nejintenzivnějších pásů oproti těm z databáze (Jee 2004). Pro účely pozitivní identifikace je obvykle dostatečná tolerance několika desítek nanometrů na obě strany od referenční hodnoty. NIR spektra farmaceutických pevných látek obyčejně poskytují více než 20 spektrálních pásů. Uživatel tak musí pečlivě volit pásy reprezentující jedinečné chemické absorpce (Jee, 2004). Alternativní metodou diskriminační analýzy, která využívá celé spektrum, je metoda SIMCA. Tato metoda využívá konstrukci separátního PCA modelu z NIR spekter pro každý materiál. Metoda křížové validace (Cross-validation) je využívána pro určení použitého počtu hlavních komponent v každém modelu (například použitím PRESS statistiky (Predicted residual error sum of squares) Následně měřená spektra jsou vždy přiřazena ke třídě, se kterou dosahují minima PRESS statistiky (Jackson, 1991). Využití této metody pro identifikaci pomocných látek popsali Candolfi a kol. (Candolfi et al., 1999). Autoři využili hlavní komponenty, Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 25


které popisovaly více než 1% spektrální variability. Ačkoliv bylo při použití omezeného datového souboru 15 % spekter každé třídy neidentifikováno při využití 95 a 99% intervalu spolehlivosti, nedošlo k žádné chybné identifikaci (pokud bylo spektrum identifikováno, bylo přiřazeno správně). Bylo zjištěno, že korekce rozptylu identifikaci neovlivňuje. V roce 2003 byla popsána NIR metoda kvantifikace Kofeinu v neporušených jednotlivých tabletách (Laasonen et al., 2003). Tablety obsahují 58,82 %hm Kofeinu. Předzpracování spektrálních dat zahrnovalo druhou derivaci algoritmu SavitzkyGolay s následnou aplikací SNV a centrováním spektrálních dat na průměr. K předpovědi koncentrace kofeinu byl vyvinut jednofaktorový PLS model. Přesnost metody byla validována (relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti a tzv. střední přesnost byly nižší než 0,75 %hm). Správnost se významně nelišila od HPLC stanovení. Limit stanovení pro NIR experiment byl stanoven na 13,7 %hm a rutinní NIR analýza se tak stala flexibilnější a rychlejší metodou než tradiční HPLC. Jak je již dlouho známo, fyzikální vlivy na průběh NIR spekter pevných farmaceutických látek jsou díky rozptylu velmi významné Rozptylový jev je závislý na vlnové délce i velikosti částic a tak celkově velikost částic a jejich distribuce, tvar a kompaktnost ovlivňují průběh NIR spekter práškových farmaceutických látek. O’Neil, Jee a Moffat (1998, 1999) ukázali, že medián a rozpětí distribuce velikosti částic práškových léčivých a pomocných látek může být modelován pomocí opakované lineární regrese (MLR) a regrese hlavních komponent (PCR). Pozdější práce ukázala, že kompletní procentuální četnost zrnitosti mikrokrystalické celulózy může být předpovězena z NIR spekter pomocí regrese částečných nejmenších čtverců. Metoda byla necitlivá pro směsi s obsahem analytu od 0,9 do 4,8 %hm. Navíc u všech metod bylo dosaženo lepší kalibrace s použitím surových reflektančních dat.

1.4.5.

NIR spektroskopie a polymorfismus

Je známo, že spektra v blízké infračervené oblasti jsou ovlivněna morfologií krystalu (polymorph). Aaltonen a kol. (2003) popsali screeningovou metodu polymorfního typu Sulfathiazolu jako modelové látky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti byla potvrzena jako rychlá screeningová metoda pro určení polymorfní konfigurace a monitorování procesu indukované transformace. Surová data byla převedena na druhou derivaci a podrobena analýze PCA. Graf hodnot SCORE analýzy PCA byl využit pro určení klastrů odlišných polymorfů. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 26


Vliv vnitřní konverze polymorfních forem, ke kterému může dojít při granulaci na mokré cestě, může mít významný vliv na fyzikálně-chemické vlastnosti krystalických léčiv. Wong a Mitchell například zjistili, že chlorpromazin hydrochlorid přechází z formy II na formu I při sušení z přechodně hydratované fáze (směsné rozpouštědlo ethanol:voda, 80:20 %) při 70°C (Wong and Mitchell, 1992). Polymorfní transformace, která nastává při sušení vlhkého granulátu, byla monitorována také pomocí NIR spektroskopie (Davis et al., 2004). Autoři vytvořili polymorfní formy glycinu (α a γ formy) rekrystalizací ze zahřátého roztoku (redestilovaná voda a 15% ledová kyselina octová). První roztok byl za konstantního míchání zchlazen na pokojovou teplotu, druhý roztok byl zchlazen bez míchání. K identifikaci fází a polymorfní čistoty výsledných krystalů byla použita rentgenová difrakční analýza. Stejné krystaly byly analyzovány i NIR spektrometrií. Spektra byla transformována pomocí SNV a převedena na druhou derivaci. Jednorozměrné kalibrační modely byly vytvořeny ze zpracovaných spekter krystalických vzorků a vzorků zředěných na 50% koncentraci mikrokrystalickou celulózou. Roztokem iniciovaná přeměna polymorfní formy byla také sledována v rámci nasyceného roztoku kalů/suspenzí. Odebrané vzorky byly vakuově filtrovány, analyzovány pomocí NIR spektroskopie a koncentrace každého polymorfu byla stanovena pomocí kalibrační metody nejmenších čtverců. Studie vlhkého granulátu byly provedeny s 50% směsí γ-glycinu v mikrokrystalické celulóze s použitím vody jako pojiva. Granulát byl sušen buď fluidačně při 60 nebo 80 °C nebo vsádkově (tray dried) při 21°C v kontrolované atmosféře s nízkou vlhkostí (26-32% relativní vlhkost). U stabilního γ-glycinu byl pozorován kinetický záchyt metastabilního α-glycinu při rychlém fluidním sušení (sušení při 80 °C přineslo 9,2% α-glycinu, sušení při teplotě 60 °C poskytlo 6,9% αglycinu). Při pomalém vsádkovém sušení při nižší teplotě byla pozorována nižší vnitřní konverze (0,9 % α-glycinu). Kvantitativní NIR modely se ukázaly jako schopné analyzovat nízké úrovně obsahu polymorfních forem (až 0,9 %), což bylo prokázáno srovnáním s rentgenovou difrakcí.

1.4.6.

Pseudopolymorfismus, hydráty a solváty

Pro studium tvorby hydrátů i on-line monitorování mokrých granulačních procesů dvou strukturně blízkých bezvodých látek – kofeinu a theophyllinu byly využity Ramanova a NIR spektrometrie (Jorgensen et al. 2002). Na základě druhé derivace NIR spekter bylo možno odlišit hydratovanou a bezvodou formu přes absorpční pás u ca 1690 nm, odpovídající vlhkosti (tento pás u bezvodé formy Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 27


chybí). Bylo zjištěno, že při nízké vlhkosti hydratuje lépe theophyllin než kofein (druhý uvedený vyžaduje 0,9 mol vody na jeden mol látky, aby byl ve spektru pozorován pás vlhkosti). Během postupného přidávání vody a vlhnutí byla postupně snímána NIR spektra a následně byl vyvinut tříkomponentní PCA model, postihující 99,9 % spektrální variability. Interpretace křivky zátěží prokázala silnou vazbu k O-H kombinačním pásům (první PC, tj. hydrát) a svrchním tónům (overtonům) C-H (1. PC); C-H overtonům (druhá PC) a O-H kombinačním pásům (třetí PC, volná voda). První komponenta tak vystihuje tvorbu hydrátu. Křivka zátěží pro první a druhou hlavní komponentu rovněž dokázala, že tvorba hydrátu vede k postupné změně absorpčních C-H pásů mezi 1600 – 1700 nm. Křivka zátěží třetí komponenty ukazuje, že tato komponenta popisuje absorpci volné vody. Třídimenzionální zobrazení hodnot SCORE odhalilo celkový časový trend: počáteční vzestup hodnot score (1. a 2. PC) s rostoucím obsahem vlhkosti (a tedy tvorbu hydrátu) až do 1,4 molů vody na mol bezvodé formy, následované prudkým poklesem hodnot score podél třetí hlavní komponenty při tvorbě granulí (reprezentující výskyt volné vody). Model tak zřetelně popsal tvorbu hydrátu a granulí a učinil tak z vícerozměrné analýzy vizuální prostředek. NIR analýza byla považována za účinnější při charakterizaci hydrátů a obsahu volné vody než Ramanova spektrometrie.

1.4.7.

Ověřování léčiv a odhalování padělaných a klonovaných verzí

Padělání léčiv je závažný a globální problém. Falšování farmaceutických látek bylo objeveno i v rámci legitimních dodavatelských řetězců (Deisingh, 2005). Neoficiální nákup léku spotřebitelem přes internet je spojen s vysokým rizikem získání padělků (Deisingh 2005). Tato situace představuje výzvu pro analytické oddělení regulačních agentur: vysoké množství léků, podezřelých z padělání, nebo které by mohly být cílem padělatelů, musí být plošně testováno. Vysoké náklady a dlouhá doba analýzy spojené s tradičními chemickými testy na mokré cestě, jako je vysoce účinná kapalinová chromatografie, vyvolaly velký zájem o využití rychlých, nedestruktivních metod molekulární spektrometrické analýzy vzorku. NIR spektrometrie byla testována pro ověřování léčiv a odhalování padělaných (Scafi et al., 2001). Makroskopická NIR reflexní analýza vzorků, např. celých neporušených jednotlivých dávek, poskytuje spektra, která jsou reprezentativní i pro vícesložkové matrice a jsou tak reprodukovatelné. Nedávná práce se zabývala vývojem přenosného



transmitančního NIR spektrometru pro použití v terénu (O’Neil et al., 2008). Tato práce ukázala užitečnost oblasti třetího overtonu pro ověřování léčiv. Kvalitativní analýza s použitím PCA a metody modelování tříd na základě nerovnoměrné variability (UNEQ) aplikované na hodnoty SCORES byla schopna identifikovat originální léčivo (tablety Viagry a Cialis) a detekovat falešné napodobeniny s vysokou mírou správného přiřazení. Kohonenova samoorganizující se mapa (SOM) s učením „bez učitele“ – neuronová síť – byla použita k modelování NIR transmitančních dat dvou tablet originální a padělané verze léků a dále transmitančních spekter suchých tablet čistých pomocných látek a aktivní složky. Výsledky ukazují, že spektra padělků jsou v některých oblastech mapována do sousedních neuronů a naznačují tak několik zdrojů původu. Kromě toho, zařazení spekter některých padělků na neurony sousedící se špatnou aktivní či pomocnou látkou ukazuje na rozdíly v matrici padělaných tablet v porovnání s originály. Dosažené výsledky byly u některých padělaných tablet ověřeny pomocí referenční analytické metody (HPLC) – tato prokázala přítomnost špatné aktivní složky (přestože se jednalo o stejnou terapeutickou třídu) v těchto tabletách a to na úrovni vyšší než je nominální hodnota.

1.4.8.

Příklady dalšího farmaceutického použití NIR spektrometrie

Blízké infračervené spektroskopie se běžně používá jako metody pro identifikaci surovin. Ačkoli spektra vykazují široké, překrývající se absorpční pásy, pocházející z overtonů a kombinací fundamentálních vibrací, a nerovnoměrnou základní linii vyplývající z vícenásobného rozptylu, využitím matematických postupů, zejména druhé spektrální derivace (metoda Savitzky-Golay) můžeme eliminovat offset základní linie a zakřivení a tím rozlišit většinu absorpci. Pozice rozlišeného absorpčního pásu je obvykle počítána s použitím algoritmu těžiště (centre-of-gravity). Tabulka 3.4 ukazuje deset nejintenzivnějších absorpčních pásů pro 13 obvyklých léčivých a pomocných látek. Pro správnou identifikaci většinou dostačuje šest až deset pozic pásů, údaje ukazují, že na základě NIR spekter může být identifikován každý materiál. Výběr materiálů obsahoval polymorfní formy (laktóza), hydráty i bezvodé látky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti může být použita i k identifikaci odlišných polymorfních forem, solvátů a amorfních materiálů. Absorpce okolo 1934 nm odpovídá kombinaci O-H valenční a O-H deformační vibrace (Osborne et al., 1993).



Tabulka 3.4 Pozice deseti nejintenzivnějších absorpčních pásů (seřazeny podle intenzity druhé derivace absorbance, blízká infračervená oblast: 1340.6-2488.2 nm) FT-NIR spekter práškových vzorků farmaceutických pomocných látek získaných prostřednictvím těžiště negativních pásů druhé derivace spekter (11 bodový vyhlazovací algoritmus Savitzky- Golay, kubický polynom). Tato absorpce je intenzivní ve spektru monohydrátu α-laktózy (druhý nejintenzivnější pás) a mnohem méně intenzivní ve spektru bezvodé α- a β-laktózy a ve spektru bezvodého kofeinu (Tab. 3.4). Tato absorpce byla zjištěna ve sprejově sušené laktóze. Dihydrát askorbátu vápenatého vykazuje intenzivní absorpci při 1455.8 nm, která je spojena s prvním overtonem O-H valencni vibrace. Absorpce při 1943.2 nm, pro tento materiál spojená s kombinací O-H valenční a O-H deformační vibrací nastane u delší vlnové délky než u spektra monohydrátu a sprejově sušené laktózy. Rozdíl v pozici tohoto pásu je pravděpodobně důsledkem intenzivnější absorpce dihydrátu a asymetrické povahy píku. Druhá derivace spekter různých vzorků laktózy, po vyhlazení algoritmem Savitzky-Golay, je uvedena na obrázcích 3.16-3.19. Průběhy derivace bezvodého kofeinu (Obr. 3.20) a dihydrátu askorbátu vápenatého (obr. 3.21), jsou také uvedeny. Odlišení různých druhů laktózy může být dosaženo pomocí vícerozměrné analýzy. Analýza hlavních komponent druhé derivace absorbančních spekter ukazuje přesně definované shluky spekter jednotlivých druhů laktózy (obr. 3.22). Oblast hodnot SCORE do které se při PCA promítnou spektra každé formy laktózy lze definovat pomocí 95 % pravděpodobností elipsy. Alternativní vícerozměrná klasifikační metoda, která je běžně využívána pro třídění a identifikaci, je metoda SIMCA. Tato metoda vyžaduje vývoj samostatných SIMCA modelů pro každý materiál, který chceme identifikovat a představuje tak nesouvislé modelování tříd (termed disjoint class modeling). To je dosaženo použitím dále používané hlavní komponenty a pro každé spektrum je vypočtena residuální vzdálenost k modelu, která by pro přiřazení spektra k dané třídě měla být nižší než empirická nebo statisticky významná prahová hodnota. Příklad použití SIMCA pro třídění spekter monohydrátu α-laktózy je na obr. Spektra dalších forem laktózy mají výraznější reziduální vzdálenost a jsou tak označeny jako nepříslušející k dané třídě. Obr. Obr. Obr.



Obr. Obr. Obr. Obr. Obr. Absorpční NIR spektra (druhá derivace) polymorfních forem léku salmeterolu Xinafoate (formy I a II) jsou uvedeny na obr. 3.24 a 3.25. Hlavní absorpční pásy řazené podle sestupné intenzity (Tabulka 3.5), jsou výrazně odlišné, s rozdíly v relativní intenzitě a pozici pásů (například u formy I je nejintenzivnější pás při 2258,2 nm, u formy II je tento pás při 2263,6 nm - slabší intenzita, druhý nejsilnější pás). Analýza hlavních komponent spekter obou dvou forem rovněž vykazuje zřetelné seskupování příslušných hodnot spektrálního skóre (obr. 3.26).

1.5.

Ramanova spektroskopie

Ramanova spektroskopie je molekulárně spektroskopická metoda založená na jevu Ramanova rozptylu, předpovězeného v roce 1923 A.G.S. Smekalem a pozorovaného v roce 1928 C.V. Ramanem.

1.5.1.

Teorie Ramanova rozptylu

Ramanova spektroskopie studuje neelastický rozptyl monochromatického záření vzorkem. Obrázek Figure 3.27 znázorňuje přechody, které mohou probíhat během tohoto procesu. Pokud je vzorek ozařován monochromatickým zářením o dostatečné energii, probíhá elektronový přechod stejně jako v UV-Vis spektroskopii. Při využití méně energetického zdroje dojde k porušení rovnoměrnosti elektronového oblaku doprovázejícího s kovalentní vazbou. Lze to považovat za přechod do virtuálního stavu. Když se molekula vrací zpět do základního stavu, uvolní během tohoto procesu foton o stejné frekvenci, jakou má foton ze zdroje. Tento proces se označuje jako Rayleighův neboli elastický rozptyl. Nicméně, v některých případech se molekula okamžitě nevrací do základního stavu, ale na vyšší vibrační stav, než je základní. Během tohoto procesu se emituje foton o nižší



frekvenci než je frekvence dopadajícího fotonu (o delší vlnové délce). Tento neelastický rozptyl je označován jako Stokesův Ramanův rozptyl.

Obrázek Druhá derivace NIR absorpčního spektra polymorfu I salmeterol xinofoatu (Savitzky –Golay digitální polynomický vyhlazovací filtr, kvadratický polynom, velikost filtru 7 datových bodů)

Obrázek Druhá derivace NIR absorpčního spektra polymorfu II salmeterol xinofoatu (Savitzky –Golay digitální polynomický vyhlazovací filtr, kvadratický polynom, velikost filtru 7 datových bodů) Tabulka Polohy pásů 10 nejintenzivnějších absorpčních pásů (seřazené podle druhé derivace absorbance, blízká infračervená oblast:1340,6 – 2493,0 nm) v FT-NIR spektrech práškových vzorků dvou polymorfů Salmeterol Xinofoatu (formy I a II) získané pomocí těžiště negativních pásů ve spektrech druhé derivace (Savitzky-Golay, velikost filtru 7, kubický polynom)

Obrázek Graf skóre analýzy hlavních komponent spekter polymorfních forem I a II salmeterol xinofoatu ukazující elipsoidy Hotelling’s T2 95% spolehlivosti ohraničující skóre pro každý polymorf. Model odvozený od NIR absorpčního spektra druhé derivace (Savitzky – Golay digitální polynomický vyhlazovací filtr, kvadratický polynom, velikost filtru 7 datových bodů) polymorfů I a II Salmeterol Xinofoatu. Převzato z Bharati, M. H. and MacGregor, J. F., Multivariate Image Analysis for Real-Time Process Monitoring and Control, Ind. Eng. Chem. Res. 37: 4715–4724. Copyright (1998) with permission from American Chemical Society V menším procentu přechodů, proběhne excitace do vyššího virtuálního stavu z energetické hladiny vyšší, než je základní stav. V tomto případě, návrat do základního stavu povede k uvolnění fotonu o vyšší frekvenci (kratší vlnové délce) než u dopadajícího záření. Tento proces se nazývá antiStokesův Ramanův rozptyl. Protože v excitovaném stavu je zpočátku méně molekul, tato forma rozptylu je méně intenzivní než Stokesův Ramanův rozptyl a Stokesova část spektra je proto většinou ta, která se měří. Spektra se zaznamenávají ve tvaru intenzity jako funkce Stokesova Ramanova frekvenčního posunu (cm-1). Jelikož se jedná o posun ve frekvenci od monochromatického zdroje, který se měří, je proto tento jev nezávislý na vlnové délce použité excitace. Jak je zřejmé z Obr. 3.27, Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 32


Stokesův Ramanův frekvenční posun doprovázený s kovalentní vazbou odpovídá fundamentální frekvenci ve střední infračervené oblasti. Obě techniky jsou navzájem komplementární. Ramanova spektroskopie proto nepřímo zkoumá vibrační přechody a pozorované posuny mají stejný rozsah energií jako u FT-IR absorpce. Hlavní rozdíl mezi Ramanovou a FT-IR spektroskopií je pravděpodobnost pozorování spektrálních linií. FT-IR absorpce jsou většinou pozorovatelné s daleko větší pravděpodobností než Ramanovy posuny. Ramanův jev je slabý s rozptylem zhruba 10-10 krát nižší než odpovídající IR absorpce ve střední oblasti. Další nevýhodou v Ramanově spektroskopii je konkurenční jev fluorescence, zvláště v případech, kde zdroj excitace je viditelné záření (například 514,5 nm). Signál fluorescence, který může být vyvolán buď analytem, nebo nečistotami ve vzorku, může přesáhnout a překrýt signál Ramanova rozptylu. Nedávný vývoj a využití NIR zdrojů (například 1064 nm lasery), zvláště ve spojení s Michelsonovým interferometrem, do značné míry vyřešilo problém fluorescence, protože NIR excitace je energeticky podstatně nižší než většina elektronových přechodů zodpovědných za fluorescenci. Obrázek Diagram energetických hladin (Jablonskiho) ukazující možné přechody: A) Elektronový přechod s nezářivým přechodem; B) Rayleighův rozptyl; C) Stokesův Ramanův rozptyl; D) AntiStokesův Ramanův rozptyl. S0 je základní stav singletu, S1 je nejnižší excitovaný stav singletu a ν představuje energetické vibrační hladiny uvnitř každého elektronového stavu Navzdory skutečnosti, že Ramanův rozptyl je slabší při delších vlnových délkách, je pozorován vyšší poměr Ramanova rozptylu k signálu fluorescence, což umožňuje analýzu širší škály vzorků. FT Ramanova spektroskopie, podobně jako FT-IR spektroskopie, vykazuje další výhodu, co se týče frekvenční přesnosti a vysokého spektrálního rozlišení. Společnou vlastností Ramanovy a NIR spektroskopie je možnost rychlých a neinvazivních analýz vzorků. V závislosti na instrumentaci, není potřeba ani drobná nebo jiná příprava pevných vzorků. Zařízení spojené s mikroskopy nevyžadují většinou žádnou úpravu vzorku, zatímco u FT spektrometrů, které lze považovat za třídu I, co se týče laserových zařízení s uzavřenými kyvetovými prostory, je zpravidla vyžadováno malé množství vzorku umístěného do vzorkovacího kalíšku. Kalíšek má uprostřed vyvrtaný malý otvor s průměrem větším než fokusovaný laserový paprsek – přibližně 100 mikrometrů. Ramanovy přístroje se liší v intenzitě svých laserů od několika miliwattů až do 1500 mW. Je třeba být opatrní při výběru intenzity laseru využitého během zaznamenávání spektra. Studie podle Johanssona a kol, 2002 využila přímé tepelné Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 33


zobrazování ke studiu míry ohřevu škály práškových pomocných látek a léčiv během analýzy Ramanovou spektroskopií. Některé materiály byly během analýzy citlivější na ohřev s teplotami pohybujícími se mezi 38 a 60°C. Cílem této práce bylo testování využití rotace vzorku jako prevence proti přechodu z pevného stavu do tepelně citlivých sloučenin (theophylline monohydrát) a zároveň aplikace kinetických modelů ke zjištění rychlosti otáčení, která by mohla snižovat ohřev vzorku na požadovanou hodnotu. Předpoklady byly experimentálně potvrzeny, a proto se jedná o využitelnou metodu, kterou mohou být analyzovány tepelně citlivé materiály.

1.5.2.

Instrumentace Ramanovy spektroskopie

Ramanovy spektrometry lze rozdělit buď na dispersní, nebo nedispersní (s Fourierovou transformací). Dispersní přístroje rozdělují rozptýlený Ramanův signál prostorově do jednotlivých vlnových délek. Intenzitu spektrálních složek lze měřit jednokanálovým detektorem, s využitím skenovací mřížky nebo lze měřit paralelně s využitím plošných detektorů. Nedisperzní, spektrometry s Fourierovou transformací nevytváří prostorovou separaci vlnových délek; jsou modulovány pro každou vlnovou délku nesoucí charakteristickou modulační frekvenci. Všechny Ramanovy spektrální prvky se měří najednou (multiplex) jako interferogram, ze kterého se inverzní Fourierouvou transformací (jejíž algoritmus je prováděn prakticky okamžitě s měřením s využitím připojené počítačové jednotky) vypočítá spektrum. Použitá vlnová délka je klíčový faktor pro úspěšnou analýzu Ramanovou spektroskopií (navzdory tomu, že teoreticky nemá použitá vlnová délka žádný vliv na pozorovaný Ramanův posun). Kratší vlnové délky většinou vykazují větší průřez, a proto umožňují detekci s vysokým kvantovým výtěžkem a menší hladinou šumu a zdokonalit tak citlivost. Nicméně, s kratší vlnovou délkou (např. 406, 515 nm) se stává fluorescence pravděpodobnější, aby byla pozorována ve spektru, protože v ultrafialové a viditelné oblasti dochází k elektronovým přechodům. Aby neměl tento efekt vliv na naměřené spektrum, mohou se využít excitace laseru s delší vlnovou délkou, jako např. NIR lasery (například 1064 nm). Kratší průřez laseru znamená, že poměr signál/šum je nižší a z toho důvodu je potřeba zvýšit intenzitu laseru nebo počet akumulovaných skenů. Excitační vlnové délky při 850 nm nebo Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 34


vyšší (1064 nm) obvykle vyžadují, aby byl spektrometr nedispersní s Fourierovou transformací z důvodu nízké použitelnosti vhodných multikanálových detektorů pro posuny o vlnových délkách vyšších než 100 nm a tím se lze vyhnout obvyklým problémům při měření s viditelnými excitačními vlnovými délkami. Lasery využívané pro analýzy farmaceutik a většinu analytických aplikací obvykle pracují nepřetržitě a nemají bezpečnostní rizika spojená s pulsními lasery o vyšší intenzitě a obvykle lepší frekvenční stabilitě (<1 cm-1). Snímání rozptýleného Ramanova signálu může být v 90° uspořádání nebo v 180°uspořádání, pokud měření zpětně rozptýleného signálu je od vzorku nebo objektivu mikroskopu. Výběr detektoru závisí na excitační vlnové délce laseru, citlivosti a typu spektrometru. Detektor bude také ovlivněn rychlostí měření a požadovaným spektrálním rozsahem. Dispersní, multikanálové spektrometry využívají většinou lasery o excitační vlnové délce menší než 900 nm a jsou tak schopny využívat křemíkové detektory se zařízením s vázaným nábojem (chargecoupled device CCD), které jsou limitovány do přibližně 1100 nm. Křemíkové CCD poskytují tomuto spektrometru vysoký poměr signál/šum.

1.5.3.

Farmaceutické aplikace Ramanovy spektroskopie

V poslední době existuje několik výukových materiálů zahrnující charakterizaci farmaceutik v pevné fázi řadou spektroskopických technik jako je Ramanova spektroskopie (Bugay 2001; Wartewig a Neubert 2005). Aplikace Ramanovy spektroskopie pro charakterizaci farmaceutik v pevné fázi lze rozdělit do studií polymorfismu (identifikace a kvantifikace), proces monitorování a kontroly (například, hydrolytická degradace, vysoce účinná polymorfní krystalizace, stanovení počátku krystalizace, krystalické stability, účinků na tvorbu krystalů během zpracování, organická syntéza); chemického zobrazování a mapování (například, ke stanovení krystalické formy); charakterizace a sledování tvorby hydrátů a adsorpce vodní páry; kvantitativní stanovení účinných složek farmaceutik ve vícesložkovém složení a stanovení stupně krystalinity.



1.5.4.

Ramanova spektrometrie jako technika pro proces monitorování, degradace, stability a krystalizace

Dřívější farmaceutické aplikace NIR FT-Raman spektroskopie popisuje výhody FT-Raman spektroskopie pro charakterizaci farmaceutik (Tudor a kol. 1990). Tři specifické farmaceutické systémy byly odzkoušeny: práškové, krystalické sympatomimetické aminy (arterenol, fenylefrin a efedrin), biomedicinské polymery citlivé na hydrolýzu (poly(sebacic) anhydrid) a profilování koncentrace léčiva (Diclofenac, koncentrační rozsah: 0,01 – 60 %) kromě polymerní matrice. Aby se demonstrovala použitelnost této techniky pro identifikaci strukturně podobných (příbuzných) sloučenin, byly vybrány tři aminy: ty, které byly jednoduše rozlišitelné od spektrální oblasti „otisku prstu“ ukazující výrazné vibrační pásy substituovaných skupin (např. skupinu meta-disubstituovaného benzenu v fenylefrinu u 996 cm-1 díky dýchací vibraci trigonálního kruhu) umožňující jejich identifikaci. Ukázalo se, že obecně mohou fenylové skupiny výborně rozptylovat Ramanův signál. Degradace poly(anhydridů), které jsou používány během reakcí ke kontrole rychlosti uvolňování léčiva z polymerní matrice přes chemickou modifikaci uhlíkového řetězce, byla studována pomocí dvou charakteristických karbonylových vibrací anhydridů (které byly odděleny 50 – 70 cm-1). Tyto páry absorpcí se lišily pro každý anhydrid, umožňující jejich identifikaci. Byla také zjištěna možnost studovat a sledovat degradaci těchto polymerů v pevném stavu pomocí dvojice pásů anhydridu (1803 a 1739 cm-1), u kterých klesá intenzita s degradací a současně se sleduje vznik a nárůst intenzity komplementárního pásu karbonylové skupiny (1640 cm-1). Autoři spekulují, že by tato technika mohla být vhodná pro kvantifikování kinetiky degradace v polymerech. Uvolňování léčiva (Diclofenac) z matrice alginátu polymeru se také posuzovalo pomocí FT-Ramanovy spektroskopie. Dva silné aromatické pásy díky Diclofenacu byly pozorovány u 1578 a 1603 cm -1 s alginátem, který vykazuje slabý Ramanův rozptyl. Tato studie prokázala hodnoty FT-Ramanovy spektroskopie pro in-situ charakterizaci pevných látek (jak kvantitativní tak kvalitativní) takového systému dodání léku. Disociace vysoce krystalického hydrochloridu nějakého léčiva do amorfní formy, volné báze byla studována s využitím FT Ramanovy spektroskopie (Williams a kol. 2004). Zkoumaným procesem byla výroba tablet pomocí granulace mokrou cestou a bylo zjištěno, že transformace krystalické formy do amorfní volné báze měla za následek změny vlastností tablet, zejména nárůst tvrdosti tablet. Faktory



upravující konverzi/přeměnu byly stanoveny výrobou tablet z vodných a nevodných granulačních tekutin, vystavením granulí ve vlhkém prostředí po určité období předcházející sušení a skladování a vystavení tablet při 40°C/75% relativní vlhkosti. Bylo zjištěno, že vystavení API do vlhkého prostředí po delší dobu urychlilo disociaci léčiva; tento jev byl minimalizován při použití bezvodé (absolutní etanol) granulovací kapaliny a vyvarování se zpoždění díky výrobě a skladování produktu v uzavřeném prostředí. Bylo zjištěno, že metoda Ramanovy spektroskopie je vynikající pro sledování disociace a byla také spolehlivě schopna detegovat přítomnost obou forem léčiva, krystalické a amorfní, amorfní až na hladinu nižší než 1 % a umožnila vývoj vhodného procesu a stabilní tvorby. Rozsáhlý přehledový článek (Morissette a kol. 2004) o „high throughput“ krystalizaci, polymorfech, solích, ko-krystalech, solvátech farmaceutických pevných látek konstatuje, že taková HT-technologie využívá, při jeho konečné analýze krystalických pevných látek, Ramanovu spektrometrii, buď samotnou nebo v kombinaci s práškovou Roentgenovou difrakcí, k charakterizaci a rozlišení mezi různými pevno-látkovými formami (polymorfy, formy solí, solvatované formy a hydráty) s podílem rychlosti přeměny vzorků pro analýzy, které jsou závislé na faktoru upravujícího volbu techniky. Ramanova spektrometrie se také hodí k rychlé analýze vzorků a je často primárním prostředkem „high-throughput“ vytvářených charakterizací krystalů. Autoři upozorňují, nicméně na problém fluorescence a potřebu v určitých případech použít delší vlnové délky NIR laserů aby se snížil vliv fluorescence. Interpretace Ramanových spekter HT krystalických vzorků může být dosaženo pomocí klastrovacích technik s použitím spočítané míry podpobnosti jako je Tanimotův koeficient. Tato statistika je odvozena ze spekter s filtrovaným pozadím a z přiřazených poloh pásů a intenzit. Analytik je schopen nastavit toleranci polohy pásu a filtrované intenzity pásů, aby provedl spektrální třídění a interpretace. FT-Ramanova spektrometrie se využila k posouzení konformačních změn ve struktuře proteinu lysozomu (Elkordy a kol. 2004). Surové, sprejově-sušené a krystalické přípravy enzymu byly podrobeny extrémním podmínkám za různých teplot a relativní vlhkosti (4 – 60°C, 2 – 75% relativní vlhkosti). Sekundární struktury těchto vzorků byly analyzovány při různých Ramanových posunech: amide I (1660 cm-1) pro α-helix; amide II (1250 – 1350 cm−1) – charakteristický u proteinů. Pás u 1255 cm-1 byl použit k označení amidu III. Spektrum enzymu ve vodném roztoku bylo použito jako Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 37


referenční spektrum, ukazující charakteristické rysy pro strukturu α-helix. Toto spektrum se použilo k porovnání spekter pevných látek, uchovaných při různých teplotách a vlhkosti. Nebyla pozorována žádná degradace pevných vzorků (surové, sprejově-sušené a krystalické) uchovaných při 4°C a 2% relativní vlhkosti po dobu 20 týdnů. Uchování při 20°C a 65% vlhkosti nebo 30°C a 65% vlhkosti po dobu 20 týdnů vedlo ke vzniku nového absorpčního pásu u sprejově-sušeného vzorku, připisovaného k agregaci a současně změně v Ramanovém posunu amidu I o 9 cm-1. U vzorků uchovávaných při 40°C a 75% vlhkosti po dobu 20 týdnů, oba nezpracované a sušené lysozomy ukázaly štěpení a posun pásu amidu I; ve spektru surového vzorku se objevil nový pás u 1788 cm-1 a ve spektru sušeného vzorku nový pás u 1715 cm-1.Druhý pás byl připsán agregaci a nestabilitě proteinu. V případě krystalického vzorku byla pozorována malá změna, kromě nepatrné změny v posunu pásu amidu I o několik málo cm-1, což naznačuje, že tento vzorek je docela stabilní, což bylo také potvrzeno měřením. Analýza rozpuštěných vzorků a samotná jejich měření odhalila, že teplota ovlivňovala stabilitu sušeného vzorku, zvláště co se týče změny posunu: u amidu I o 4 cm-1, a amidu II o 8 cm-1. Spektra pevných vzorků, uchovávaných při různých teplotách a různých hodnotách relativní vlhkosti odhalila, že nezpracované a krystalické vzorky byly stabilní více než 20 týdnů. Zpracování superkritické tekutiny lysozomu a jeho vysrážení z roztoku bylo také studováno Ramanovou spektrometrií (Moshashaee a kol. 2003). Analýza pevných vzorků FT-Ramanovou spektrometrií, s 1064-nm excitací a výkonem laseru 200 mW superkriticky vysráželo lysozom pomocí (vodným) roztokem zesílenou disperzí nadkritickou kapalinou (SEDS). Malé změny byly pozorovány ve spektrech lysozomů tvořených následujícím SED procesy. Oblast spektra amidu I, která je charakteristická pro α-helix (1660 cm-1) vykazovala změnu plus 4 cm-1 následující SED vysrážení, v souladu se snížením počtu vodíkových vazeb a úpravou sekundární struktury. Další důkaz změny v sekundární struktuře byl poskytnut negativním přemístěním oblasti absorpčního pásu amidu III na 1250 cm-1. Celkově, bylo zjištěno, že změny v Ramanových spektrech pevných vzorků, viz změny v Ramanových posunech absorpčních pásů, dobře odpovídají s biologickou aktivitou v rozpuštěném stavu. Strukturální změny v léčebné protilátce (therapeutic antibody), vyvolané sušením, se přezkoumávaly Ramanovou spektrometrií (Sane a kol. 2003). Výsledky ukázaly, že bylo možné kvantifikovat barvivem indukované sekundární strukturální změny pomocí sledování pásu amidu I a



autoři spekulují, že by to mělo poskytnout větší porozumění procesu denaturace proteinu se sušením a metody rozvinuté k překonání a minimalizaci takových změn. Dlouhotrvající stabilitu sprejem sušených a lyofilizovaných forem by mohlo jít předpovědět ze strukturního stavu protilátky okamžitě po každém sušícím procesu. Bylo také ukázáno, že Ramanova spektrometrie umožňuje rychlejší způsob výběru vhodných pomocných látek a jejich koncentraci během studií pro vývoj formy než složitější studie stability (několik hodin s první jmenovanou metodou versus několik měsíců s druhou jmenovanou metodou). Absorpce tetracainu z bioadhezivní gelové náplasti byla posuzována Ramanovou spektrometrií. Tato analytická technika se ukázala jako použitelná z několika důvodů. Zaprvé, umožnila posouzení fyzikálních interakcí mezi léčivou látkou a složkami gelu. Žádné interakce nebyly pozorovány, což také bylo podpořeno klinickými údaji o účinnosti. Sledováním zavádění následující aplikace gelu na pokožku ukázalo rozšíření absorpčních pásů u 774, 848 a 907 cm-1. Bylo to v souladu se změnou fáze léčivé látky po aplikaci na pokožku. Pokles intenzity pásu tetracainu u 1600 cm-1 v gelu dokazoval absorpci léčiva přes pokožku a kompletní absorpce léčiva byla pozorována 40 minut po podání, s malým množstvím dalších změn ve spektrech. Bylo to v souladu s nasycením stratum corneum (vrstvy pokožky) se zásobou tetracainu. Autoři z toho vyvodili závěry, že Ramanova spektrometrie byla vhodná k charakterizaci takových farmaceutických přípravků na bázi gelu, jednoduchá, rychlá a prakticky neinvazivní technika. Monitorovací proces syntézy Metoprololu pomocí Ramanovy spektrometrie, s excitací laseru 785 nm a optickými vlákny, byl v poslední době studován (Svensson a kol. 2000). Metoda využila chemometrickou analýzu dat, hlavně PCA a PLS. Žádná kvantifikovaná data nebyla potřeba ke kalibrování statistického modelu pomocí multivariační analýzy, nebylo nutné řešit vlivy překryvu pásů v meziproduktech a konečném produktu. Multivariační regulační diagramy Euklidovské vzdálenosti PCA nebo PLS skóre byly použity ke stanovení koncového bodu (výsledný ukazatel); autoři demonstrovali, jak aplikace PAT umožňuje redukci během dávkovacího cyklu. Ramanova mikro-spektrometrie ke stanovení polymorfní formy se využila ke zjištění začátku krystalizace Sulfathiazolu (Anderson a kol. 2001). Ramanova mikro-spektrometrie jednoduchých



krystalů 5 polymorfních forem podala více informativní a ucelené výsledky než IR analýza ve střední oblasti spektra. Děje se tak pravděpodobně díky kolísání v přítomnosti vzorku a mid-IR spektroskopie analyzuje více než jeden krystal, a tak se spíš podobá analýze velkoobjemové.

1.5.5.

Polymorfismus a použití Ramanovy spektroskopie

Obě základní metody vibrační spektroskopie, a to FT-IR (za využití reflexní techniky DRIFTS) a FTRamanova spektrometrie, byly použity současně ke studiu 13 velkoobjemových farmaceutických příprav Spironolactonu (Neville a kol. 1992). Tyto techniky byly také použity k detekci zbytků rozpouštědel, hydrolytického vedlejšího produktu, thiooctové kyseliny, enolických tautomerizačních forem a polymorfních forem. Benzen byl detekován v jednom vzorku. Enolické tautomery nebyly nalezeny. Čtyři různé polymorfy byly detekovány oběma metodami (DRIFTS: 3600 – 3200 cm-1; Raman 1800 – 400 cm-1). Bylo zjištěno, že je možné přiřadit všechny valenční vibrace C=O a C=C vazeb od 3600 – 3200 cm-1 overtone a oblasti kombinačního pásu. Navíc, Ramanovy linie 637 a 655 cm-1 byly přiřazeny přítomnosti dvou C-S valenčních módů kyseliny thiooctové. V později publikované studii byla také využita IR a Ramanova spektrometrii pro studium polymorfů acetazolamidu (Griesser a kol. (1997). Ze dvou polymorfních forem, které charakteristicky krystalizují z vody buď jako jehličky nebo rovinné krystaly, žádná neprokázala konformační polymorfismus. Obě formy vykazují asociační typ polymorfismu – pro nějž jsou charakteristické rozdíly ve tří-dimenzionálních vodíkových strukturách. Obě IR i Ramanova spektroskopie ukázaly rozdíly ve spektrech forem I a II. Bylo zjištěno, že N(4)-H· · ·O(1) ve formě II vede k posunu valenční frekvence vazby C=O k nižším frekvencím (IR: 1679 cm-1 s formou II cf. 1701 cm-1 a formou I; Raman 1675 cm-1 s formou II cf. 1704 cm-1 s formou I). Navíc, symetrické a antisymetrické N-H valenční vibrace formy II ((3301, 3182, 3094 cm−1) se vyskytly u nižších vlnočtů než ve formě I (3337, 3228, 3152 cm−1), což vypovídá o silnějších intermolekulárních vazebných silách. Ramanova spektroskopie také ukázala zřetelné rozdíly v oblasti vibrací krystalické mřížky, pod 200 cm-1. Byla vyvíjena semi-kvantitativní metoda pro stanovení dvou polymorfů, A a B, ve vlastní sloučenině. Tato metoda byla vyvíjena použitím připravených směsí dvou polymorfů s formou A a B Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 40


přítomných ve směsi (koncentrační rozsah formy A: 1.8 – 15.4% m/m). Bylo zjištěno, že relativní intenzita dvou charakteristických pásů, 1716 a 1724 cm-1 je lineárně úměrná relativnímu množství každé formy. Přehledná studie Findlay a Bugay (1998) demonstrovala široké využití Ramanovy a IR spektroskopie pro identifikaci rozpouštědla (cyklohexanu), odlišeného od polymorfní formy. Výhodou Ramanovy spektroskopie oproti IR spektroskopie byl širší spektrální rozsah, pokrývající oblast 500 – 25 cm-1 – tento rozsah je použitelný pro studium mřížkových vibrací. Vliv teploty na krystalizaci byl sledován pomocí přesycených roztoků mentolu v etanolu. Léčiva v pevné fázi přítomná v tabletách a kapslích různých léků: enalapril maleate, prednisolone (formy I and II), bezvodá forma theophyllinu a monohydrát theophyllinu a warfarin sodium clathrate byly vyhodnocovány Ramanovou spektrometrií (Taylor a Langkilde 2000). Přítomnost léčiva by mohla být detegována na úrovni nižší než 1 % hmotnostních dávkovacích jednotek (dosage unit’s mass) a v některých případech jako krystalická forma. Bylo zjištěno, že pro studium o přítomnosti léčiva jsou použitelné pásy odpovídající aromatickým C-C a karbonylovým skupinám (například, pásy mezi 1750 – 1500 cm-1 odpovídají vibracím prednisilonu, dominantní vibraci karbonylu v prednisolonu spřažené s vibracemi nenasycených uhlíků v sousedním kruhu u 1653 cm-1) jako malé interference nastalé od vibrací pomocné látky. Screening metoda pro stanovení a získání nejstabilnějšího a žádoucího polymorfu léčiva během tvorby byla popsána Millerem a kol. (2005). Použitím sady různých rozpouštědel o různé polaritě, byla studována konverze zprostředkovaná rozpouštědlem Ritonaviru z formy I na formu II technikou XRPD a Ramanovou spektrometrií. Obě formy byly připraveny rekrystalizací ze směsi rozpouštědel (2:1 ethylacetate : heptan a aceton, resp.) a jejich formy stanoveny technikou XRPD. Další léčivo, uvedené jako sloučenina A bylo studováno obdobným způsobem. Ramanova spektrometrie byla využita ke studiu konverze in-situ nasycené suspenze rozpouštědlo/krystal léčiva v různých testovaných systémech rozpouštědel. Aplikace PCA na spektra mezi 1145 – 1200 cm-1 umožnila stanovení míry polymorfní konverze a kinetiky procesu. Celková in situ metoda Ramanovy spektrometrie usnadnila výběr vhodného rozpouštědla o relativně nízké rozpustnosti pro navýšení, které poskytlo vysokou výtěžnost krystalizace. Použití Ramanovy spektroskopie pro odlišení polymorfní formy od 14 léčiv bylo hodnoceno statisticky (Mehrens a kol. 2005). Variační analýza (ANOVA) byla použita na pásy forem každého Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 41


léčiva. Srovnáním rozdílů v pozici pásu uvnitř a mezi polymorfy byli autoři schopni nastavit limitní posun v pozici píku o 1.6 cm-1 pro správnou identifikaci alternativní polymorfní formy léčiva. Důkladná studie charakterizace falicaine hydrochloridu a isomorphic dyclonine hydrochloridu v pevném stavu byla provedena pomocí několika technik FT-IR a FT-Ramanovy analýzy. Obě techniky byly zjištěny jako komplementární a ukázaly reprodukovatelné rozdíly ve spektrech polymorfních forem každého léčiva, s posunem polymorfních pásů mezi 3 a 6 cm-1. Nejvíc patrné rozdíly ve spektrech kteréhokoli polymorfu léčiva byly pozorovány mezi 2980–2960 cm−1 (FT Raman), v oblasti odpovídající valenčním C-H vibracím alkylového řetězce; 1700–1600 cm−1 (FT-IR), valenční vibrace karbonylu a amino skupiny, 1500–1000 cm−1 (FT-IR), molekulové vibrace a 200–50 cm−1 (FT-Raman), vibrace krystalické mřížky. Tyto mřížkové vibrace jasně ukázaly rozdílné krystalické mřížky polymorfních forem. Byla studována krystalizace z metanolu (Anquetil a kol. 2002) in-situ a Ramanovou analýzou v reálném čase polymorfní formy carbamazepinu (formy I a III). V této studii se testovaly mikrolitrové objemy a bylo zde možné stanovit rozpustnost a krystalizační formu léčiva a také se ukázala schopnost reprodukovatelně studovat polymorfní formu z teplotně-řízených podmínek a to s minimem vzorků.

1.5.6.

Pseudopolymorfismus a Ramanova spektroskopie

Účinek tvorby solvátu a následující dehydratace na krystalovou strukturu carbamazepinu byla zkoumána FT Ramanovou spektrometrií (McMahon a kol. 1996). S využitím polymorfních forem I a III (forma III připravená z formy I zahřátím při 170°C a struktura potvrzena diferenční skenovací kalorimetrií, dihydrát každé formy byl tvořen pozastavením tvorby anhydridu každé formy v destilované vodě a mícháním po dobu 24 hodin. Tvorba dihydrátu byla potvrzena Karl Fischerem a termogravimetrickou analýzou (TGA) za vlhka. Hydratované formy byly uchovávány při laboratorní/pokojové teplotě a 55-60% relativní vlhkosti, aby se udržela celistvost hydrátu. Za podmínek, kde vlhkost může být snadno odstraněna, analýza Ramanovou spektroskopií odhalila, že při dehydrataci dihydrát přešel zpět do polymorfní formy I, bez ohledu na začínající tvorbu krystalu; spektra dehydratovaného materiálu byla v souladu se spektry formy I. Ramanovou spektroskopií bylo zjištěno, že vzorky dihydrátu zahřívané a dehydratované v DSC misce při 110°C také přecházejí zpět k jejich příslušným výchozím polymorfním formám (I a III, resp.). Strukturní rozdíly mezi dihydráty



byly studovány oběma technikami, Ramanovou spektroskopií (oblast mřížkových vibrací: 50–200 cm−1) a difuzně reflexní infračervenou spektrometrií s Fourierovou transformací (DRIFTS). Ramanova spektrometrie byla preferována pro odlišení začínající bezvodé konformace dihydrátu od vody, vykazující slabý signál Ramanovy rozptylu, což nevedlo k vibracím, které by zakryly signály z léčiva samotného. Dihydrát tvořený z formy III byl nejjednodušeji identifikován solvát pomocí analýza Ramanovou spektrometrií. Za podmínek blízkých podmínkám uskladnění, ve kterých vlhkosti nebylo dovoleno uniknout, zahřívání dihydrátů vytvářených z obou bezvodých forem vedlo také k vytvoření jejich příslušných bezvodých forem. A tak autoři usoudili, že patrnou „paměť“ v krystalech dihydrátu lze vysvětlit formou dihydrátu (produkované z kterékoli bezvodé formy), která není zřetelná. Interakce vodní páry s amorfními polymery (PVP: K90 & K12; PVP/Va a PVAc) přes vodíkové můstky byla studována Ramanovou spektrometrií (Taylor a kol. 2001). Tato studie se prováděla, protože fyzikální absorpce vody hydrofilními polymery má tendenci pozměnit fyzikální a chemické vlastnosti, zahrnující chemickou stabilitu, sypkost a stlačitelnost, plasticitu, volný objem a teplotu skelného přechodu. Vztah mezi obsahem vody a teplotou skelného přechodu byl zkoumán s cílem stanovit

optimálního

obsahu

vody,

který

by

snížil

teplotu

skelného

přechodu,

na

odpovídající životnímu prostředí a tím umožnit konverzi polymeru z viskózního skelného stavu do méně viskózního pružného stavu. Tyto polymery nejsou schopny tvořit inter- nebo intramolekulární vodíkové vazby, protože nejsou přítomny žádné kyselé protony, terciární amidová funkční skupina v PVP je hydrofilní a tak schopna tvořit vodíkové vazby s molekulami vody. Použitím dobře sušených vzorků, Ramanova spektra každého polymeru byla získána a použita k reprezentaci spektra bez vodíkových vazeb, čistého vzorku. Vzorky pak byly vystaveny vzdušné vlhkosti a byla sledována oblast karbonylu v Ramanově spektru. S rostoucím obsahem vlhkosti byl sledován pozorovatelný posun pozice pásu k nižšímu vlnočtu, dokazující tvorbu vodíkových vazeb. Stejný trend posunu pozice pásu karbonylu byl pozorován pro další tři polymery po vystavení vlhkosti. Analýza hlavních komponent (PCA) spekter (oblast 1550–600 cm−1) každého polymeru, uchovaných při různých hodnotách relativní vlhkosti, byla provedena. Ve všech případech skóre první hlavní komponenty viditelně dobře korelovalo s relativní vlhkostí. Narušení linearity v těchto grafech skóre versus relativní vlhkost se ukázalo tak, že odpovídalo obsahům vody, při kterých se polymery transformovaly ze skleného do



pružného stavu pro PVP K 12 a PVP/VA, a přibližně také pro PVP K90; ne příliš jasné trendy byly pozorovány pro PVAc. Tvorba hydrátů a sledování granulace vlhkou cestou během procesu byly studovány oběma Ramanovou a NIR spektrometrií pro dvě strukturně příbuzná bezvodá léčiva: kofein a theophylline (Jorgensen a kol. 2002). S Ramanovou spektrometrií, tvorba hydrátu theophyllinu byla charakterizována ztrátou dvou absorpčních pásů u 1699 a 159 cm-1 (valenční C=O vibrace) se současným výskytem pásu u 1680 cm-1. Byl zjištěn posun obou pásů pro oba hydráty k nižším vlnočtům na tvorbu hydrátu theophyllinu. Spektra theophyllinu vlhkých vzorků s 1,3 moly vody na 1 mol bezvodé formy neukázala pozorovatelné rozdíly od spekter monohydrátu. Spektrum vlhkého vzorku s 0,3 moly vody na mol bezvodé formy se podobalo spektrům bezvodé formy, jejíž vzorek s 0,7 moly vody na mol bezvodé formy ukázalo charakteristické rysy meziproduktů obou bezvodé i monohydratované formy. S kofeinem, hydratovaná forma byla charakterizovaná výskytem nového pásu u 1650 cm-1 a současně posunem dalšího pásu směrem k vyšším vlnočtům. Ramanova spektra vlhkých vzorků kofeinu s vlhkostí mezi 0,3 a 0,9 moly na mol bezvodé formy se podobalo spíše bezvodé formě. Z toho důvodu tvorba hydrátu vypadala, že nastává s theophyllinem při mnohem vyšší vlhkosti vzorku než v případě kofeinu. Navíc, protože Ramanova spektra kofeinu a jeho hydrátu byla méně variabilní než theophyllinu a jeho hydrátu, autoři usuzují, že větší přeuspořádání ve struktuře theophyllinu probíhá při tvorbě hydratované formy.

1.5.7.

Využití Ramanovy spektroskmopie jako procesní analytické techniky v rámci PAT

Možnost aplikace Ramanovy spektroskopie jako procesní analytické techniky PAT bylo nedávno studováno Islamem a kol. 2004. Studovaly se procesy výroby lokálních/povrchových forem léků – gel a emulze. Při nastavení přístroje se využilo vláknové optické sondy připojené ke spektrometru. Spektra surových materiálů a šarží vyrobených gelů byla získána, aby se ověřily charakteristické vibrace. Pomocí této informace bylo zjištěno, že je možné monitorovat a detegovat rozdílné výrobní stupně procesu, které zahrnovaly přidávání zahušťovadla a emulgátorů. Autoři na závěr shrnuli, že



Ramanova spektroskopie má potenciál, aby byla využitelná jako PAT technika pro kontrolu jakosti lokálního/povrchového gelů a krémů. Další příklad in-line sledování procesu mísení peletů Diltiazem HCL a kuliček parafinového vosku s využitím přístroje s vláknovou optickou sondou bylo poskytnuto Vergotem a kol. 2004. Po procesu výroby následovalo přezkoumání odchylky mezi po sobě následujícími měřeními Ramanovou spektrometrií, získanými v reálném čase. Velká spektrální odchylka byla pozorována během počátečních stádií mísení a bylo to přiřazeno nehomogenitě vzorku. Jak pokračovalo mísení, spektrální odchylka se zmenšovala v souladu dosažení homogenity. Validace Ramanovy spektroskopie pro sledování procesu a detekci konce procesu byla potvrzena HPLC analýzou vzorků odebraných vzorkovačem. Nedávný přehled o studii procesů krystalizace pomocí analytických technologických metod poznamenává, že čidla v takovýchto procesech zahrnují molekulové spektroskopické metody Ramanovy, NIR a ATR FT-IR spektroskopie (Yu a kol. 2004). Několik příkladových studií je uvedeno, zdůrazňování kontroly kritických PAT aspektů pro stanovení kvality výrobku: velikost, tvar, polymorfní forma a to vše pomocí uvedených analytických metod. Kombinace Ramanovy spektrometrie s chemometrickou analýzou dat, byla použita k identifikování a kvantifikaci množství několika polymorfních forem přítomných v tabletách Ranitidine hydrochloridu. Chemometrická analýza zahrnující třísložkovou analýzu hlavních komponent se ukázala jako nutná pro rozlišení různých forem, které byly spektrálně podobné a ne příliš jednoduše rozlišitelné od jejich surových spekter. Skóre hlavních komponent byla použita k vývoji kvantitativního modelu pro stanovení relativního obsahu každé přítomné formy. Studie detailně popisuje použití Ramanovy a NIR metody pro in situ sledování a sledování v reálném čase procesů krystalizace, zvláště pro vývoj robustních procesů k minimalizaci nespecifikovaných šarží, kvantifikaci úrovně přítomnosti polymorfu a kontroly léčivého účinku procesu. Polymorfy progesteronu byly rozsáhle studovány Ramanovou spektrometrií. Toto farmaceutikum má minimálně pět definovaných polymorfů, ačkoli jen u forem I a II bylo zjištěno, že jsou důležité pro studium během krystalizace. Bylo zjištěno, že vibrační pás karbonylu se mezi těmito dvěma formami liší (forma I: 1662 cm−1 a forma II: 1667 cm−1) a pozice tohoto pásu byla tak použita ke kvantifikaci každé formy in situ. Studováním polymorfních přechodů v široké oblasti podmínek a Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 45


teplot, kinetiky procesu byly pak stanoveny z těchto dat, umožňující pracovníkovi soustavně vyrábět jednu ze dvou polymorfních forem – v souladu s charakterem PAT. Dodatečný krystalizační proces, produkce sloučeniny „MK-A“, byl studován in situ pomocí Ramanovy spektrometrie. Meziprodukt „semi-pure“ procesu se skládal z několika forem krystalu: bezvodé formy A a C, hemihydrát a dihydrát. Ramanova spektra těchto odlišných forem byla získána a pak použita k sestavení kvantitativního modelu pro předpověď jejich hladiny zastoupení z následujících procesních spekter. Kinetika transformace dvou polymorfních způsobů (cest) byla úspěšně objasněna: hemihydrát na formu C a forma C na formu A. Tato metody umožnila vývoj nového robustního procesu pro stejný produkt MK-A v požadované polymorfní formě.

1.5.8.

Ramanova spektroskopie – další příklady farmaceutických aplikací

Použitelnost Ramanovy spektroskopie pro charakterizaci farmaceutik v pevné fázi bude nyní předvedena na nějakých farmaceutických příkladech. Analogicky k ATR FT-IR spektroskopii, Ramanova spektrometrie může být také použita pro identifikaci farmaceutických materiálů v pevném stavu. Pozice Ramanových pásů vibrací 13 běžně dostupných práškových léčiv a pomocných látek jsou uvedeny v Table 3.6. Protože Ramanovy pásy mají tendenci být symetrické, pozice pásů mohou být vypočítány z první derivace vibračních spekter (například pomocí Savitzky-Golay digitálního polynomického vyhlazovacího algoritmu). Pozice pásů lze vypočítat první derivací spektra pomocí lineární interpolace – jako poloha Ramanova posunu, při které je derivace rovná 0 (metoda hledání průsečíku s nulou the 0 -point crossing method). Paracetamol (Acetaminophenol v US) velmi dobře rozptyluje Ramanův signál, s 24 dobře definovatelnými vibračními pásy. ASTM jej doporučuje jako kalibrační standard pro Ramanův posun (ASTM 2002). Ramanovo spektrum paracetamolu je ukázáno na obrázku Figure 3.28. První derivace tohoto vibračního spektra paracetamolu, ukazující „0-point crossing“ pozici každé vibrace, je uvedena na obrázku Figure3.29. Ramanova spektrometrie je hodnotná technika pro studium krystalických forem farmaceutických materiálu v pevném stavu. Jako příklad, pomocná látka laktózy má dva dobře definované polymorfy,



α- a β-, a také se vyskytuje ve formě hydrátů, pseudo-polymorfní formě. Navíc sprejově sušená laktóza může často existovat i v amorfním stavu. Ramanova spektroskopie je použitelná technika pro charakterizaci takových forem pomocných látek a léčiv, protože tyto látky vykazují odlišnosti v intenzitách pásů (a relativních intenzitách) a posuny v polohách pásů. Tabulka Table 3.7 ukazuje polohy 6 nejintenzivnějších Ramanových pásů pro různé formy laktózy: sprejově sušená (částečně amorfní), α-bezvodá, α-monohydrát, β-bezvodá. Tato tabulka ukazuje, že rozdíly ve spektrech mezi odlišnými formami laktózy jsou rozpoznatelné podle jejich prvních 6 nejintenzivnějších vibrací a tuto informaci lze využít k odlišení a identifikaci těchto forem. Další využitelná informace pro jejich charakterizaci může být studována přezkoumáním rozdílů v polohách pásů a intenzitách všech pásů. Roztříděním těchto forem laktózy na: α-polymorfní (bezvodá, monohydrát), bezvodá (α- a β-formy) a amorfní (sprejově sušená versus α-monohydrát) je možné identifikovat rozdíly ve spektrech uvnitř každé třídy pro charakterizaci solvátu, polymorfní a amorfní formy, resp. Tabulka Table 3.8 ukazuje řádově rozdíly v intenzitách (100% do 0% libovolné intenzity) pásů forem laktózy (třetí a čtvrtý sloupec napravo tabulky), ignorující ty pásy, které jsou v běžném a v řádově odpovídajícím intensitním-pořadí podle pořadí vzorků. Graf překrývajících se spekter těchto forem také ukazuje spektrální rozdíly (Figure 3.30). Dalším klasickým příkladem schopnosti Ramanovy spektrometrie rozlišit polymorfní formy látek v pevném stavu je u léčiva Sulfathiazol. Toto léčivo má 5 popsaných polymorfních forem. Standardní normální variabilitou transformovaná Ramanova spektra forem I, II, III a V jsou ukázána na obrázku Figure 3.31. Tato spektra ukazují zjevné rozdíly v intenzitách pásů a jejich polohách. PCA analýza spekter vyžaduje právě dvě komponenty k odlišení spekter každé polymorfní formy (Figure 3.32). Grafy PC zátěží (hlavních komponent) první komponenty (Figure 3.33) a druhé komponenty (Figure 3.34) odhalují Ramanovy posuny, s velmi negativními a pozitivními hodnotami zátěží, spojené se spektrální odchylkou a tedy schopnosti diskriminace. Tabulka Pozice absorpčních pásů běžných farmaceutik a pomocných látek, lineárně interpolované ze spekter první derivace (rozsah Ramanova posunu: 200 – 1971 cm-1)



Obrázek Ramanovo spektrum práškového paracetamolu (získané s excitací laseru 1064 nm)

Obrázek Ramanovo spektrum první derivace práškového paracetamolu (Savitzky-Golay digitální kubický polynomický vyhlazovací algoritmus, velikost filtru 7 datových bodů, získáno s excitací laseru 1064 nm) Tabulka Ramanovy posuny 6 nejintenzivnějších pásů pro různé formy práškové krystalické laktózy

1.6.Chemické zobrazování a mapovací mikrospektroskopické techniky Pro získání chemických informací v kombinaci s mikroskopickými technikami se využívají dva základní přístupy záznamu dat, které označujeme jako zobrazování (imaging) a mapování (mapping).

1.6.1.

Principy spektrálního zobrazování a mapování

Spřažení optických mikroskopů s NIR a Ramanovými spektrometry umožňuje detailní analýzu malých ploch pevných farmaceutik. Zpravidla, je vzorek analyzován v režimu buď jednobodovém, bod po bodu nebo mapování v přímce, nebo případně jako celý vzorek, analyzovaný mapováním v přímce nebo bodovým mapováním tvořícím mřížku. Tento postup pak vytváří trojrozměrné (3D) údaje obsahující jak spektrální, tak prostorovou (x, y, z) informaci a označuje se pak jako hyperspektrální zobrazení. Schematická reprezentace multivariačního 3D zobrazení je ukázána na obrázku Figure 3.36. Mapování bod po bodu a v přímce je u farmaceutik často zdlouhavý proces vyžadující několik hodin až dnů dlouhou dobu snímání. V případě NIR zobrazování, nicméně, nedávná kombinace ohniskových plošných detektorů, jako jsou ty založené na indium antimonide, s laditelnými filtry tekutých krystalů (LCTF) výrazně urychlila proces zobrazování, neboť všechna zobrazovaná 3D spektra jsou získávána paralelně s dobou analýzy obvykle řádově několika minut. Jako s NIR a Ramanovou spektroskopií, je vyžadována malá příprava vzorku a vzorek může být často analyzován neporušený a neinvazivně. Příklad schématického diagramu typického NIR zobrazovacího spektrometru je uveden na obrázku Figure 3.35.



Chemické zobrazování a mapování je využito při odstraňování problémů a při vytvářejícím se vývoji. Clarke, a kol. (2001) skombinoval Ramanovu a NIR mikroskopii, aby studoval příčiny špatného tabletování pomocí měření plochy pásu. Jelikož tento typ analýzy často generuje rozsáhlé sady multivariačních zobrazovacích dat, metody multivariační zobrazovací analýzy (MIA) jsou často využívány k dosažení správné interpretace. Tyto metody jsou obvykle založené na technikách multivariátních latentních proměnných: PCA a PLSR. Vícecestný PCA rozklad surových nebo předem upravených

hyperspektrálních 3D dat lze

vypočítat pomocí rozvinuté metody PCA. S touto metodou, 3D data, kde X je závislá linie po vektoru v zobrazené rovině, k vytvoření dlouhého tenkého 2D

matice (pole) spekter. Analýza hlavních

komponent se pak provádí na odvíjené (rozložené) matici, například pomocí algoritmu NIPALS postupný výpočet jednotlivých hlavních komponent. Výsledná PC skóre jsou zpětně skládané k vytvoření 3D zobrazení skóre, které má menší počet skóre než je počet zobrazovaných vlnových délek (Figure3.26). Modely vícecestné PCA vyžadují interaktivní interpretaci grafů skóre, čímž uživatel rýsuje polygon známý jako maska oblasti zájmu (region-of-interest ROI) okolo shluku skóre spekter, o diskrétní oblasti intenzit (obvykle 8-bit, tj. 256 diskrétních hodnot), které jsou zobrazeny na obrazovce počítače jako barevně kódovaný 3D frekvenční histogram. Počítačový program se používá k identifikaci prostorových umístění pixelů v oddělených ROI třídách masek. Proces se opakuje pro různé ROI masky. Tímto způsobem, prostorová umístění v zobrazované scéně jednotlivých složek lékové formy mohou být určena a proto metoda může být považována za semi-kvantitativní (navzdory dvou-cestné PCA jako metody kvalitativní analýzy). Alternativní metodou pro kvantitativní analýzu multivariačních zobrazení je vícecestná PLSR. Tato metoda potřebuje ke stanovení sadu zkušebních dat zobrazení materiálů. Každá ze všech chemických tříd složek materiálu musí být známa. Například lze zobrazit čisté složky. Pro účely modelování, tyto odezvy (X) čistých složek jsou kombinovány do jednoho 3D zobrazení rozsáhlých dat. 3D graf předpovězených (predictor) dat (Y) je syntetické pole (falešné proměnné, kde jeden bod označuje pixel čistého materiálu anebo nepřítomnost tohoto materiálu). A tak může být tato metoda považována za formu diskriminační analýzy (Lied a kol. 2000).



Tabulka Účinky hydratace, krystalinity a typu polymorfu laktózy na pozice hlavního pásu v Ramanově spektru a relativní intenzity pásu – kromě porovnání mezi pomocnými látkami laktózy (n=38 Ramanovy pásy celkem na jeden případ, rozsah Ramanova posunu: 200 – 1971 cm-1)

Tabulka Seznam různých pulzních sekvencí NMR pevné fáze používané pro charakterizaci pevné fáze

Obrázek Ramanova spektra různých pevných forem laktózy jako pomocné látky

Obrázek SNV transformovaná Ramanova spektra 4 polymorfů Sulfathiazolu: I, II, III a V

Obrázek Graf PCA skóre (první a druhá komponenta) skóre SNV transformovaných absorpčních spekter polymorfů Sulfathiazolu: I, II, III a V (ukazující elipsy 95% spolehlivosti)

Obrázek Graf zátěží PC 1 modelu PCA SNV transformovaných absorpčních spekter polymorfů Sulfathiazolu: I, II, III a V

Obrázek Graf zátěží PC 2 modelu PCA SNV transformovaných absorpčních spekter polymorfů Sulfathiazolu: I, II, III a V

Hlavní výhodou multivariační zobrazovací analýzy je, že interpretovaná sada dat může být zobrazena graficky a není potřeba prozkoumávat velké tabulky dat. Bharati a MacGregor (1998) použili příklad LANDSAT satelitního zobrazení, aby demonstrovali využitelný potenciál analýzy tohoto typu dat pro řízení a monitoring průmyslových procesů v reálném



čase. Příklad aplikace je kontrola procesu krystalizace k výrobě 1 nebo 2 polymorfních forem léčiva Salmeterol (Figures 3.37–3.39). Vícecestná PCA prováděna na výsledných zobrazeních umožnila rozlišování polymorfní formy pomocí první a čtvrté hlavní komponenty (PCs).

2. Spektroskopie nukleární magnetické resonance jako nástroj pro studium farmaceutických systémů 2.1.Principy spektroskopie nukleární magnetické resonance Spektroskopie nukleární magnetické resonance (NMR) prozkoumává atomové prostředí založené na různých resonančních frekvencích vyvolanými jádrem v silném magnetickém poli. Spousta odlišných jader je pozorovatelná NMR, ale nejčastěji jsou studovány vodíkové a uhlíkové atomy (Haleblian a McCrone 1969). Nukleární magnetická resonanční spektra nemohou být měřena v pevném stavu stejným způsobem, kterým jsou běžně získávána v roztocích, protože NMR linie z pevných látek jsou obvykle příliš široké (Holzgrabe a kol. 1999). V roztoku všechny interakce kromě chemického posunu a nepřímých propojení jsou průměrovány až na nulovou úroveň tepelnými pohyby molekul; kapalný roztok se chová jako isotropní prostředí. Spektroskopie nukleární magnetické resonance roztoků se běžně využívá pro určení struktury; nicméně, techniky NMR spektroskopie pevných látek jsou mimořádně významné pro charakterizaci krystalických forem pevných farmaceutik (Newman a Byrn 2003). NMR pevných látek má poměrně málo problémů se vzorkováním při provádění studií kvalitativní fyzikální charakterizace. Nespornou výhodou této techniky je, že analýza celého objemu je dosažena s velmi malým, pokud vůbec nějakým, vlivem od jednotlivých částic materiálu. NMR spektroskopie pevných látek poskytuje účinnou metodu pro porovnání fyzické formy léčivé látky po zpracování a výrobě. Mimoto NMR spektroskopie pevných látek poskytuje metodu pro analýzu směsí pevných forem v čistých léčivech i v lékových formách (Tishmack a kol. 2003). Přesto studie o léčivém produktu ukazují další komplikaci pro charakterizaci. Hlavní problémy souvisí s citlivostí a specifitou. Typicky, složka, na kterou je kladen zájem v léčivém produktu, je Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 51


aktivní farmaceutikum, které se může nacházet v docela nízké koncentraci (∼< 10% w/w). Protože NMR pevných látek je ze své podstaty necitlivé, klesající koncentrace zájmové složky může způsobit problémy při experimentování (delší průměrování signálu, je nutná pro analýzu léčivého produktu). Navíc, může být kompromitována specifita. Diagnostická resonance zájmu může být překročena resonancí přiřazené pomocné látce. V tomto případě vyšší spektrální rozlišení může být potřeba (vyšší intenzita magnetického pole) nebo využití technik spektrální dekonvoluce, jako je fitování křivky. Navíc, vyvažování rotoru, jenž obsahuje vzorek, je klíčové, aby se získala potřebná frekvence rotace (spin rates) k odstranění anisotropie chemického posunu, ale toto lze překonat jednoduše se správnými experimentálními technikami (Bugay, 2001). Četné pulsní sekvence se se vyvíjely pro NMR pevné fáze a mnoho z nich je aplikovatelných pro charakterizaci pevných farmaceutik; Tabulka 3.1 dává dohromady počet těchto pulsních sekvencí zahrnující stručný popis a citace vhodné literatury. Použití spektroskopie NMR pevné fáze pro výzkum polymorfismu lze pochopit na základě následujícího modelu. Jestli existuje sloučenina ve dvou, skutečných polymorfních formách označených jako A a B, každá formy se liší ve své krystalografické struktuře. A proto, jádra uhlíku ve formě A mohou být umístěna v mírně odlišném molekulovém prostředí než stejná jádra ve formě B. Ačkoli kovalentní chemická vazba specifických jader uhlíku je stejná v každé formě, lokální prostředí se může lišit z důvodu omezeného pohybu v pevné fázi. Tyto omezené pohyby způsobují rozdíly v lokálním prostředí okolo jednoho nebo více uhlíků v každé polymorfní formě, protože jejich prostorové uspořádání se liší s ohledem na další jádra v molekule. NMR spektra pevné fáze ukazují tento rozdíl jako změnu v izotropním chemickém posunu odpovídajícího uhlíku v každé polymorfní formě. Pokud lze získat čistý materiál pro obě formy, analýza a přiřazení NMR spekter pevné fáze takových dvou forem může vést k původu krystalografických rozdílů v těchto dvou polymorfních formách (Tishmack a kol. 2003). Existuje počet podstatných výhod při použití NMR spektroskopie pevné fáze pro studium polymorfismu. V porovnání s DRIFT, Ramanovou spektroskopií a Roentgenovou práškovou difrakcí, NMR pevné fáze je technika měření celého objemu, ve které vlivy velikosti částic mají malý dopad na Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 52


intenzitu měřeného signálu. Navíc, v případě dodržení správné procedury měření lze NMR pevné fáze využít i jako kvantitativní techniku. Proto, intenzita signálu bude přímo úměrná počtu jader, která na ni působí. V některých výzkumech polymorfních forem, dostatečně kvalitní jednotlivý krystal nemůže být dostatečný pro stanovení struktury X-ray krystalografií. Nicméně, vhodným resonančním přiřazením NMR spektra, může být původ polymorfu odvozen z rozdílů chemického posunu pro identická jádra v každé polymorfní formě (Tishmack a kol. 2003).

2.2.Farmaceutické aplikace NMR spektroskopie Jsou různé aplikace spektroskopie NMR pevné fáze, které jsou důležité pro farmaceutický výzkum. Některé z nich zahrnují analýzu pevných fází (polymorfy, solváty), vodíkové vazby a krystalové uspořádání, amorfní pevné látky, stereochemie a interakce pevná fáze-pevná fáze (přeměny pevné fáze, aktivační energie pohybu molekul a reakce v pevné fázi). Některé z těchto obecných použití spektroskopie NMR v pevné fázi pro farmaceutický výzkum byly popisovány detailně jinde (AboulEnein 1990; Bugay 1993, 2001, 2002: 467–499; Aliev a Law 2001; Tishmack a kol. 2003; Offerdahl a Munson 2004).

2.3.Využití NMR spektroskopie těžších jader ve farmacii Experimenty založené/známé

31

P-NMR pevné fáze a novodobé

19

F-NMR byly použity

v komplementárním přístupu k popisu chování fluorovaných léčiv, flufenamová kyselina, v modelových membránách fosfolipidů (Grage a kol. 2000). Dehydratace klodronátu sodného byla studována jen jedna

31

P CP/MAS nmR. Rychlý teplotní nárůst odhalil, že klodronát sodný ztrácí vodu z mřížky a

31

P resonance se měří, zatímco pomalý pokles teploty převádí krystalickou formu na

bezvodou formu, která zobrazuje ne-ekvivalentní atomy fosforu (dvě oddělené resonance) (Timonen a kol. 1998). Některé studie NMR pevné fáze farmaceutických sloučenin zahrnulo popisování struktury a hygroskopické povahy dehydrátu erythromycinu A (Stephenson a kol. 1997a) a stanovení fyzikální formy BHA (2-tert.butyl-4-methoxy-phenol) na běžných farmaceutických pomocných látkách (Remenar a kol. 2004). Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 53


Z důvodu specifity spektroskopie NMR pevné fáze, je tak ideální technikou ke studiu inkluzních komplexů a membránových interakcí s léčivem. Studie o inkluzních komplexech zahrnují indomethacin-α-, β-, γ - cyclodextrinové komplexy v PEG 6000 nosiči (Wulff et al. 2002), inkluzní sloučenina S-ibuprofenu v β-cyclodextrinu (Braga a kol. 2003), bropirimine s β-cyclodextrinem (Ahmed a kol. 1991), flurbiprofen s β-cyclodextrinem a heptakis (2, 3, 6, -tri-O- methyl) - βcyclodextrin (Imai a kol. 1988), amorfní pevné komplexy tlbutamidu s 2-hydroxypropyl- α- a βcyclodextrinem (Kimura a kol. 1999) a inkluzní komplexaci prostaglandinu F2 alfa s γ - cyclodextrin (Uekama a kol. 1984). Spektroskopie NMR pevné fáze se použila pro zkoumání interakce membrána-léčivo s použitím 14

N a

31

P NMR pevné fáze ke studiu léčivých interakcí cholesterolu a antidepresiva s fosfolipidy

(Santos a kol. 2002). Interakce Chlorpromazinu s fosfatidylserinem byla studována pevné fáze (Underhang a kol. 2004), a rotací pod magickým úhlem

13

C a

31

P NMR

13

C-NMR pevné fáze a

diferenciální skenovací kalorimetrií (Nerdal a kol. 2000). Další interakce studované NMR spektroskopií pevné fáze zahrnují poly (etylen oxid) s ketoprofenem (Schachter a kol. 2004) a použití

13

Ca

113

Cd CP/MAS nmR v chemických a in vivo

studiích interakce mezi kadmiem a vitaminem B6 (Couce a kol. 1992).

2.4.NMR spektroskopie a polymorfismus Studie polymorfismu je jedna z nejběžnějších aplikací NMR spektroskopie pevné fáze pro farmaceutické sloučeniny. Pevná farmaceutika mohou existovat v několika pevných formách, kdy každá forma má odlišné vlastnosti farmaceutického významu, zahrnující stabilitu a biodostupnost. Počet těchto forem a jejich vlastnosti jsou velmi nepředvídatelné a případ od případu se značně liší. Pevná farmaceutika lze rozdělit na krystalické a amorfní pevné látky založené na Roentgenové práškové difrakci a/nebo na mikroskopickém zkoumání. Krystalické pevné látky se mohou dále třídit na polymorfní formy, formy mající stejné chemické složení, ale různé krystalické struktury a proto odlišné hustoty, body tání, rozpustnosti a další vlastnosti; a solváty, formy obsahující molekuly rozpouštědla uvnitř krystalické struktury, vedoucí ke vzniku unikátních rozdílů v rozpustnosti, odezva na vzdušnou vlhkost, ztráta rozpouštědla a další vlastnosti. Někdy může být léčivá látka Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 54


desolvatovaný solvát, který se vytvoří, když je rozpouštědlo odstraněno ze specifického krystalického solvátu, za zachování krystalické struktury. Mnoho důležitých vlastností je jedinečných pro takovou formu. Odlišné fyzikální formy léčivé látky mohou vykazovat radikálně odlišné rozpustnosti, které ovlivňují rozpouštěcí a biodostupnost charakteristiky dané sloučeniny. Navíc, chemická stabilita jedné formy, ve srovnání s jinou, může kolísat. Klíčová je také fyzikální stabilita polymorfů. Během různých kroků procesu (mletí, mísení, tvorba tablet atd.) fyzikální forma léčivé látky může být narušena, což následně vede k problémům s rozpuštěním. Z těchto důvodů, úplná charakterizace polymorfních systémů

je

rozhodující

pro

četné

skupiny

ve

vývoji

komerčních

léčiv;

jmenovitě

preformulační/fyzikální farmacie, vývoj chemických procesů, regulační záležitosti, duševní vlastnictví, a analytický rozvoj. Jsou publikovány CP/MAS

13

C NMR studie v pevné fázi zaměřena na polymorfismus steralin

hydrochloridu, antidepresiva (Novoselsky a Glaser 2002) a na polymorfní formy benoxaprofenu, nabilonu a cefazolinu (Byrn a kol. 1985). NMR a Rentgenova krystalografie v pevné fázi jsou doplňkové techniky pro studie charakteristiky pevné fáze. U dvou polymorfních forem acetohexamidu, antidiabetika bylo pomocí

13

C v pevném

stavu a Roentgenové krystalografie (Stephenson a kol. 1997b) zjištěno, že se nachází v ketotautomerní formě. Polymorfní formy vitaminu B12 se analyzovaly s 13C, 15N, 31P, and 59Co NMR spektroskopií. 13C NMR data poskytla nejvíc informací, protože krystalický materiál produkoval ostré resonance většiny uhlíků v této poměrně složité organické molekule (Medek a Frydman 2000). Většina aplikací NMR spektroskopie pevné fáze, které byly použity ve výzkumu polymorfních forem farmaceutik, jsou prováděny ve spojení s dalšími analytickými technikami. Je to případ roxifibanu, metylester proléčivo potenciální nepeptidické protilátky glykoprotein IIb/IIIa receptoru, dochází tak k inhibici agregaci krevních destiček a k zajištění mechanismu pro antitrombotickou terapii, u kterých bylo zjištěno, že existují ve dvou polymorfních formách. Tyto polymorfy byly detegovány RTG práškovou difrakcí a NMR v pevné fázi. Nepatrný rozdíl mezi dvěma polymorfy byl Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 55


také detegován izotermální mikrokalorimetrií; avšak žádné rozdíly nebyly pozorovány diferenční skenovací kalorimetrií, infračervenou nebo Ramanovou spektroskopií (Maurin a kol. 2002). Další významné případy zahrnují fosinopril sodný (Brittain a kol. 1993), rifampicin (Agrawal a kol. 2004) a CNS aktivní sloučeninu (org 13011) (Van Hoof a kol. 2002). Použití NMR pevné fáze a vibrační spektroskopie pro studium polymorfů léčiva a solvátů se diskutovalo (Brittain 1997).

2.5.Analýza léčivé látky a lékové formy pomocí NMR Několik kvantitativních analýz farmaceutických sloučenin pomocí NMR v pevné fázi bylo publikováno (Gao 1996; Lefort a kol. 2004).

13

C nmR spektra pevné fáze mofebutazonu,

phenylbutazonu a monohydrátu a bezvodého oxyphenbutazonu byla publikována (Stoltz a kol. 1991). Spektroskopie nukleární magnetické resonance je obecně docela použitelná technika pro analýzu směsí sloučenin v roztoku nebo pevné fázi. Může tak být použitá pro analýzu formulovaných léčivých přípravků pro přeměny a interakce. NMR pevné fáze v kombinaci s 13C značení může, ve vhodných případech, být použitá jako strategie ke studiu účinku formulace na polymorfismus nízké dávky léků jako ve zkoumání účinku tabletování na polymorfismus Org OD14 (steroidní lék) (Booy a kol. 2005). Charakterizace ústně podávaných lékových forem CP/MAS NMR byla publikována (Reutzel-Edens a Bush 2002). 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine (MDMA) byl analyzován

13

C NMR

spektroskopií pevné fáze v tabletách „extáze“ (Lee a kol. 1999). 13

C NMR spektra pevné fáze tablet nebo kapslí prednisolonu, enalapril maleatu, lovastatinu,

simvastatin, ibuprofenu, fluorpiprofenu, kyseliny mefenamic, indomethacinu, diflunisalu, sulindacu a piroxicamu byla získána v CP/MAS režimu při 50MHz (Saindon a kol. 1993). Aspirin a tablety rozpustného aspirinu byly studovány 13C NMR v pevné fázi (Chang a kol. 1986 a Diaz a kol. 1987).

2.5.1. Konformace, stereochemie a interakce vodíkových vazeb Diastereomery vykazují odlišná NMR spektra. Pevná forma troglitazonu, je nové ústní antidiabetikum, které zdokonaluje citlivost a reakční schopnost inzulinu, léčivá látka a její Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 56


diastereomery byly charakterizovány NMR v pevné fázi, která by mohla rozlišit hydratované a nehydratované RR/SS formy lépe než RTG difrakce. NMR pevné fáze ve výsledku podpořila názor, že léčivá látka troglitazone obsahuje diastereomery jako jednoduchou fyzikální směs (Suzuki a Kawasaki 2005). 13C NMR měření vzdálenosti a úhlu byla využita ke studiu konformací cimetidinu, protilátky histamin H2 receptoru (Middleton a kol. 2000). Symetrie a interakce vodíkových vazeb olanzapinu, nového činidla benzodiazepinu použitého při léčbě schizofrenie a obdobných psychóz, byly charakterizovány 13C a 15N CP/MAS spektroskopií (Reutzel-Edens a kol. 2003). Tato sekce pokrývá některé metody poslední doby a aplikace NMR spektroskopie pevné fáze, která by se, doufejme, mohla stát více používanou pro studium pevných farmaceutických látek.

3. Terahertzová pulzní spektroskopie 3.1. Teoretický úvod k THz spektroskopii Terahertzová oblast elektromagnetického spektra zasahuje mimo střední infračervenou oblast do daleké infračervené oblasti a až do mikrovlnné oblasti (Figure 3.3). Frekvenční rozsah je: 60 GHz–6 THz (2–200 cm−1). Záření v této oblasti má podstatně nižší energii, než je energie spojená s většinou molekulových vibrací, ale shoduje se s energiemi spojenými s intermolekulovými vibracemi (Taday 2004). Absorpce THz záření takovým materiálem, jako jsou pevná krystalická farmaceutika, je tak charakteristická pro daný materiál a jeho strukturu a umožňuje přímé sledování fononových mřížkových módů materiálu a popis vlastností krystalu (Zeitler a kol. 2007). Příklad terahertzových spekter polymorfních forem karbamazepinu je uveden na obrázku Figure 3.40.

3.2.Instrumentace THz spektroskopie Terahertzové spektrometry (Figure 3.41) využívají kryogenního chlazení (tzn. chlazení kapalným dusíkem), tepelné detektory známé jako bolometry. Detektor je polovodičový materiál vyrobený Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 57


z arsenidu galia (GaAs) o přibližné tloušťce 500 μm a působí jako fotoelektrický spínač. Fotoelektrický emitor/vysílač, který je upevněn sendvičově na substrátu, se skládá ze dvou tenkých kovových proužků. DC potenciálový rozdíl je aplikován napříč tyto dva kovové proužky. Využívá se schopnost laseru produkovat femtosekundové pulsy. Typickým příkladem je titan:safírový NIR laser (800 nm). Intenzita těchto laserů je přibližně 1 μW až 300mW (Taday a kol. 2003]; Zeitler a kol. 2007). Terahertzové pulsy o 75 fs jsou generovány laserem při opakovací frekvenci přibližně 800 MHz. Paprsek je rozdělen na dva děliče paprsků. Jeden z paprsků je zeslaben (obvykle 25%) a je fokusován a veden přímo na polovodičový materiál s otevřeným spínačem. Fotony pulsu mají dostatečně velkou energii, aby překonaly zakázané pásmo a produkovaly páry elektron-díra v polovodičovém substrátu. Elektrony, jako nosiče náboje, jsou pak urychleny aplikovaným elektrickým polem skrz substrát, generující, během procesu, krátké záblesky koherentního, širokopásmového terahertzového záření. Fotoelektrický spínač se tak chová jako anténa. Mimoosé parabolické zrcadlo (OAP) kolimuje THz záření a další zrcadlo je použito k odrazu fokusovaného paprsku záření skrz testovaný materiál s paprskem o průměru přibližně 1 mm. Další sada zrcadel zaměřuje/cílí a odráží přeměněný paprsek na detektor (jako je Telurid zinečnatý (ZnTe)). Druhý laserový paprsek, odražený od děliče paprsku (zeslabený 75%) se kombinuje s přeměněným THz paprskem a fokusuje na ZnTe krystal. THz záření modifikuje polarizaci vzorkovacího paprsku a Wollastonův hranol je použit pro rozdělení polarizačně modifikovaného vzorkovacího -paprsku do jeho jednotlivých složek. Rovnovážný pár fotodiod deteguje a monitoruje změny ve vzorkovacím paprsku. Jejich výstupní signál je zesílen a změna v elektrickém poli jako funkce časového zpoždění se zaznamenává

jako

interferogram.

Inverzní

Fourierovou

transformací

časově

rozlišeného

interferogramu se vypočítá spektrum analytu ve frekvenční oblasti. Spektra lze získat buď v režimu step-scan, s vysokým rozlišením (například 1 cm-1), nebo v režimu rychlý sken (s nižším spektrálním rozlišením, několik cm-1). Získávání celého spektra trvá obvykle méně než 1 minutu a to s rozlišením 1 cm-1 v režimu step-scan. Rychlejší analýza v režimu rychlý sken umožňuje získání celého spektra během 100 ms; tento režim je nejvhodnější pro aplikace vyžadující Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 58


rychlá, nepřetržitá měření v reálném čase, jako je řízení procesu a monitoring. Např. graf ukazující změnu v terahertzovém spektrálním profilu v čase (5-minutový interval získávání spektra) pro fázovou přeměnu krystalického karbazepinu, z polymorfní formy III na I během izotermálního procesu při 165°C je znázorněn na obrázku Figure 3.42. Jelikož Terahertzová spektroskopie využívá laserové pulsy k vytvoření širokopásmového koherentního terahertzového pulsu, označuje se obvykle jako terahertzová pulsní spektroskopie (TPS). Spektrometry vyžadují nenáročnou údržbu a nízký výkon laseru (ve srovnání s Ramanovými spektrometry), což znamená, že tepelně indukované změny ve struktuře pevných vzorků jsou podstatně méně pravděpodobné.

3.3.Příprava vzorku a manipulace s ním Spektra terahertzové pulsní spektroskopie se během studie získávala v režimu transmitance z lisovaných tablet pevného materiálu. Pokud tento materiál není snadno stlačitelný a schopen vytvořit fyzikálně stabilní kompaktní formu, musí se nejprve zředit a smísit s neabsorbujícím stlačitelným práškovým materiálem (buď polyetylen nebo poly)tetrafluoretylen, PTFE, přibližně 5 – 40 mg analytu) a poté se musí lisovat do tablety. Rozměry tablety jsou obvykle 5 – 30 mm v průměru a tloušťka tablety 0,5 – 3 mm. Rovněž je důležitá distribuce velikosti částic a většinou by měla být 100 μm nebo méně, aby se minimalizoval rozptyl.

Obrázek TPS spektra přechodu pevného karbamezapinu z formy III (černá) na formu I (světle šedá) při konstantní teplotě 165°C. Spektra se zaznamenávala v 5-minutových intervalech. Převzato z Zeitler, J. A., a kol., J. Pharm. Pharmacol., 59: 209–223. Copyright (2007) se souhlasem American Association of Pharmaceutical Scientists

Vodní pára vykazuje velmi intenzivní rotační spektra a úzké absorpční linie v THz oblasti. Aby se minimalizovaly interference absorpce vodní páry s testovaným analytem, je kyvetový prostor buď očištěn vysušeným dusíkem, nebo evakuován a uchováván v čistém nebo vakuovém prostředí po celou dobu spektroskopické analýzy. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 59


3.4.Nedávný rozvoj THz instrumentace Poslední rozvoj v instrumentaci pro THz spektroskopii umožňuje, aby byla možná ATR měření (s využitím křemenného krystalu) prášků a kapalin, s kratší dobou měření (několik sekund), a tak nebylo třeba připravovat vzorek. Terahertzové pulsní zobrazování (TPI) je v poslední době dalším předmětem vývoje, který umožňuje prostorově řešenou chemickou analýzu vzorku v x, y, z souřadnicích (v rovině a z obou povrchu i pod povrchem). Většinou se vyžadují snímky v reflexním režimu (i když snímky v transmisním režimu jsou také možné). Aplikace zahrnují chemické zobrazování vícesložkových farmaceutických materiálů a lékových forem. Hloubka průniku záření je mezi 1 a 3 mm pod povrchem. 4D zobrazení (x, y, z fyzikální rozměry a intenzita při daném vlnočtu) získané v TPI se provádělo v rámci jednoho skenu během mapování.

3.5.Farmaceutické aplikace THz spektroskopie Aplikace TPS pro rozlišení polymorfních forem Ranitidin hydrochloridu bylo popsáno v dřívějším článku (Taday a kol. 2003). Toto zvláštní léčivo má dva dobře charakterizované polymorfy, formy I a II. Analýzou těchto dvou polymorfů pomocí TPS se získala spektra, která byla na první pohled odlišná s evidentními rozdíly v absorpční oblasti okolo 1.1 THz, charakteristické pro každou polymorfní formu a použitelné tak pro jejich identifikaci. Forma I vykazovala v THz spektru absorpční ekvi-distanční pásy (vykazující téměř harmonický charakter) v intervalu přibližně 250 GHz, od 0,95 do 2,04 THz. Autoři se domnívali, že tyto absorpce mohou pocházet z torzních pohybů v jedné z molekulových funkčních skupin. Tyto absorpční pásy naopak chyběly ve spektru formy II, autoři předpokládali, že je to způsobeno sterickým bráněním ve stejné funkční skupině. THz spektra dvou odlišných forem se porovnávala s THz spektry získanými ze dvou tablet Ranitidin hydrochloridu (obě přibližně 54% m/m Ranitidin hydrochloridu). Spektra se viditelně lišila a spektrum jedné tablety se jevilo jako spektrum formy I. Ačkoli autoři předpokládají, že další forma byla forma II, bylo mnohem těžší rozeznat toto spektrum od spektra čisté formy II (která vykazovala mnohem méně absorpčních pásů).



Dřívější studie zkoumající potenciál terahertzové spektroskopie pro kvantitativní analýzu účinné látky ve farmakologickém přípravku popsal Taday (2004). Tato práce se zaměřila na dvě léčiva – aspirin a paracetamol – které byly smíchány s celulózou a práškovou laktózou. Procentuální obsah paracetamolu a laktózy se lišil (od 0 do 67% m/m) a obsah celulózy byl konstantní (přibližně 33% m/m). Ačkoli autor potvrdil, že spektrální pásy ve spektru daného materiálu zůstávají z velké části nepřiřazené, je možné provést dobré kvantitativní kalibrace pomocí regrese nejmenších čtverců první derivace absorpčního spektra. Z testovaných vzorků o 9 různých koncentracích se vytvořily čtyři vzorky. Pomocí metody PLS s využitím 6 hlavních komponent, směrodatná odchylka křížové validace byla 2,85 % m/m pro paracetamol a 3,65% m/m pro laktózu. Nezávislá kalibrační a validační sada nebyla nicméně testována. V novější studii se zkoumalo použití terahertzové spektroskopie pro kvantitativní stanovení obsahu polymorfu mefenamové kyseliny (Otsuka a kol. 2010). Použilo se toto modelové léčivo, protože má dvě dobře popsané polymorfní formy I a II. Tyto formy se připravily rekrystalizací. Krystaly formy I byly produkovány z ledem chlazeného přesyceného roztoku acetonu. Krystaly formy II se připravily z roztoku N,N-dimethylformamidu, obsahujícího léčivo (0.6 g ml−1), chlazeného na -40°C. Dvě krystalické formy byly použity k přípravě 11 práškových směsí o různém obsahu formy I (obsah formy I: 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) pomocí achátového vibračního mlýnku. Terahertzová spektra dvou krystalických forem a jejich směsí se zaznamenávala v režimu transmitance v rozsahu 0,60 – 6,05 THz. Každá prášková směs byla analyzována terahertzovou spektroskopií v režimu transmitance a ve 4 různých místech pro každý testovaný vzorek, celkem bylo získáno 44 spekter. Multivariační regresní modely pomocí regresní metody částečných nejmenších čtverců spektrálních a koncentračních dat byly použity ke kalibraci spekter pro obsah polymorfu. Vliv vyhlazení, plošné normalizace, korekce základní linie, derivatizace a korekce rozptylu (SNV) správnost a přesnost kalibračního modelu byl vyhodnocen pomocí leaveone-out křížové validace plné/s vynecháním jednoho bodu. Vyhlazení a normalizace všech spekter odhalilo izobestický bod u 3.70 THz. Oblast terahertzového spektra byla vyhlazena, plošně normalizována spektra ukázala v rozsahu 0,5 – 3,70 THz dobrou korelaci transmitance a obsahu formy I. Spektrální data byla rozdělena do pěti oblastí a byl zkoumán vliv spektrální oblasti na správnost a přesnost kalibračního modelu. Nejlepší shoda dat byla od oblasti 0,46 – 6,05 THz, se standardní odchylkou kalibrace 8,60 % a korelačním koeficientem r=0,9692. Vektor regrese každého Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 61


modelu byl vykreslen, aby se zjistily frekvence (a pásy) se schopností předvídat formu I. S modelem derivovaným z vyhlazených a plošně normalizovaných dat a pomocí spektrální oblasti: 0,46 – 8,05 THz, vektor regrese ukázal pás pozitivně korelovaný s formou I u 1,45 THz a pás negativně korelovaný s formou I (a proto pozitivně korelovaný s formou II) u 2,25 THz. Podobný průběh byl pozorován s modely vyrobenými z transformovaných dat druhé derivace. Tato práce jasně prokázala schopnost THz spektroskopie, spřažené s vhodnou úpravou dat, kvantifikovat obsah polymorfu v krystalických prášcích. Charakterizace polymorfů v lyofilizovaném manitolu se také prováděla terahertzovou spektroskopií (Chakkittakandy a kol. 2009). Terahertzová spektroskopie v pseudo-blízkém poli skrz frekvenční rozsah 0,5 – 7,5 THz byla využita ke studiu, kdy různé podmínky vymrazování mají vliv na polymorfní formu výsledného krystalizovaného manitolu. Tři jednotlivé polymorfy pomocných látek byly připraveny Walter-Leviho metodou, čímž byly připraveny 0,4, 0,8, a 1,2 M roztoky a 10 ml každého roztoku se nechalo odpařit na samostatných hodinových sklíčkách při laboratorní teplotě, poskytující vždy směsi třech polymorfů. Bylo možné vizuálně identifikovat krystaly odpovídající každému polymorfu: krystaly α-polymorfu byly neprůhledné, svislé a lišejnikovité, krystaly βpolymorfu byly průsvitné zkosené hranoly a krystaly δ-polymorfu byly získány jako průsvitné, jehličkovité struktury ve sferulitové morfologii. Lyofilizovaný koláč Manitolu a lyofilizované vzorky vyrobené z obojího - jemných i velkých kapiček byly studovány Roentgenovou práškovou difrakcí, spolu s práškovým Manitolem. Vymrazování/lyofilizace z kapky byla studována, protože by se mohla zvětšit sublimační plocha a rychlost a šlo by tak ovlivnit vytvářený polymorf. Manitolový prášek jako počáteční materiál byl ukázán Roentgenovou práškovou difrakcí, že se skládá z β-polymorfu. U Manitolu, lyofilizovaného z jemných kapiček, se ukázalo, že se jedná o δ-polymorf; u manitolu lyofilizovaného z větších kapek se ukázalo, že se jedná převážně o β-polymorf se stopami krystalů δformy. Obvyklý koláč manitolu byl směs β- a δ-forem. A tak Roentgenová difrakce ukázala, že podmínky při vymrazování mají výrazný vliv na vyrobenou polymorfní formu nebo směs forem. Terahertzová spektroskopie připravených β- a δ-forem ukázala zřetelné rozdíly. β-forma ukázala absorpční pásy u 1,12, 2,26, 2,88, 3,28, 4,22, 4,77 a 5,66 THz. δ-forma ukázala absorpční pásy u 1,9, 2,19, 2,3, 3,74, 3,98 a 5,36 THz. Bylo tak možné jednoduše rozlišit tyto dva polymorfy. Terahertzová spektra vzorků koláče lyofilizovaného manitolu vykazovala pásy odpovídající oběma β- a δ-formě (βpolymorf absorpční frekvence: 2,88 and 3,28 THz; δ-polymorf absorpční frekvence: 3,74, 3,98 a 5,36 Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 62


THz). Z výsledků plyne, že β-polymorf byla nejhojnější forma, v souladu s výsledky Roentgenové práškové difrakce. Manitol lyofilizovaný z jemných kapek vykazoval absorpční pásy u 3,74, 3,98, a 5,36 THz a jednalo se tedy pouze o δ-formu. Terahertzové analýzy roztoku Manitolu lyofilizovaného z větších kapek ukázaly pásy obou β- a δ-forem. Práce jasně ukázala (demonstrovala), že charakterizace polymorfní formy manitolu pomocí terahertzové spektroskopie byla v souladu s výsledky z Roentgenovy práškové difrakce a umožnilo se stanovení podmínek účinků vymrazování na polymorfní formu. Tloušťka potahu a povrchová morfologie potažených tablet se nedávno studovaly terahertzovým pulzním zobrazováním (TPI) (Ho a kol. 2009). Osm dávek tabletek se vyrobilo ke studiu účinků různých tlouštěk vrstvy, rovnoměrnosti vrstvy léčivé látky a jejich vliv na rychlost uvolňování pro tablety s postupným uvolňováním. Deset tablet z každé dávky bylo vybráno náhodným vzorkováním a zobrazeno pomocí TPI. To pak bylo schopno odhalit tloušťku vrstvy jader, které se podstatně lišily mezi jednotlivými dávkami. Dávka s 8,2% w/w přírůstkem hmotnosti potahu ukázala průměrnou tloušťku vrstvy 66 μm; další dávka, s 12,5% w/w přírůstkem hmotnosti potahu ukázala průměrnou tloušťku vrstvy 102 μm. Technika také detegovala velkou rozmanitost v tloušťce vrstvy v tabletách v každé dávce. Terahertz electric field peak strength (TEFPS), parametr související s fyzikálně chemickými vlastnostmi potahu nebo dávkovací formy, byl také měřen a studován pro theophylinem potažené cukerné jádro. Čtyři dávky potažených sugar cores se připravily: dvě s PVAc/PVA-PEG filmem a u dvou dávek jádra byla provedena úprava materiálu tablet k docílení správného tvaru a fyzikálních vlastností (spheronization) výsledných tablet před provedením povrchové úpravy – za účelem výroby hladšího povrchu léků. Hodnoty TEFPS získané z TPI map tablet odhalily podstatné rozdíly v povrchových morfologiích dávek vyrobených ze sferonozivaných jader s hladkou vrstvou léku a s hrubší lékovou vrstvou. Obecně, bylo zjištěno, že nižší hodnoty TEFPS svědčí o vyšší povrchové drsnosti potahu. TEFPS dvourozměrné TPI mapy tablet (peletů) byly schopny ukázat variabilitu v tloušťce potahové vrstvy s rovnoměrností léčivé vrstvy. Tablety (pelety) vyrobené z hladkých drug layered cores měly vyšší tloušťku potahové vrstvy než ty vyrobené z hrubě vrstvenými jádry. Účinky léčby na profily rozpustnosti byly méně jisté. Další práce (Ho a kol. 2009) zkoumala použití TPI pro hodnocení/posouzení účinnosti povlaku tabletových jader a detekce



nedostatečně potažených oblastí jader. S pozvolným uvolňováním, byla použita oboustranně vypouklá tabletová jádra. Bylo zjištěno, že TPI je schopno identifikovat odlišnosti jako kolísání v tloušťce potahové vrstvy a povrchové drsnosti pomocí podobných TPI parametrů jako v předchozí práci. Central band region oboustranně vypouklých tablet byla identifikována jako plocha nejvíce náchylná k nerovnoměrnostem v pokrytí povrchu. Snahy zesílit teoretické porozumění a interpretaci terahertzových spekter krystalických farmaceutických materiálů byly zkoumány Kingem a kol. (2010). Teoretická metoda výpočtu funkcionálu hustoty (DFT) pevných látek byla použita k simulaci krystalické struktury a terahertzových spekter obou (S)-(+)-ibuprofenu a racemického (RS)-ibuprofenu a přiřazení experimentálně stanovených terahertzových absorpčních pásů enantiomeru a racemátu k vibračním módům. Prováděné strukturní a spektrální simulace byly schopny přiřadit všechny spektrální rysy k jednomu nebo více vypočítaným vibračním módům.

References Aaltonen, J., Rantanen, J., Siiria, S., Karjalainen, M., Jorgensen, A., Laitinen, N., Savolainen, M., Seitavuopio, P., Luohi-Kultanen, M. and Yliruusi, J. (2003) Anal. Chem. 75: 5267–5273. Aboul-Enein, Y. (1990) Spectroscopy 5: 32–40. Agrawal, S., Ashokraj, Y., Bharatam, V., Pillai, O., Panchagnula, R. (2004) European J. Pharm. Sci. 22 (2–3): 127–144. Ahmed, M., Naggi, A., Guerrini, M., Focher, B., Int. J. Pharm. (1991) 77(2–3): 247–254. Aliev, E., Law, V., Nuclear Mag. Reson. (2001) 30: 214–310. Al-Zoubi, N., Koundourellis, J. E. and Malamataris, S. (2002) J. Pharm. Biomed. Anal. 29: 459–467. Anderson, J. E., Moore, S., Tarczynski, F. and Walker, D. (2001) Spectrochimica Acta Part A. 57: 1793– 1808. Andersson, M., Josefson, M., Langkilde, F. W. and Wahlund, K. -G. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 20: 27–37.



Anquetil, P. A., Brenan, C. J. H., Marcoll, C. and Hunter, I. W. J. (2002) Pharm. Sci. 92: 149–160. ASTM Standard E1840–96 (2002), Standard Guide for Raman Shift Standards for Spectrometer Calibration ASTM International, PA, USA. Beer, de, T. R. M., Vergote, G. J., Baeyens, W. R. G., Remon, J. P., Vervaet and Verpoort, F. (2004) Eur. J. Pharm. Sci. 23: 355–362. Bharati, M. H. and MacGregor, J. F. (1998) Ind. Eng. Chem. Res. 37: 4715–4724. Blanco, M., Coello, H., Iturriaga, S., Maspoch, S and Pezuela, de la, C. (1998) Analyst. 123: 135R–150R. Booy, J., Wiegerinck, P., Vader, J., Kaspersen, F., Lambregats, D., Vormans, H., Kellenbach, E. (2005) J. Pharm. Sci. 94(2): 458–463. Braga, S., Goncalves, S., Herdtweck, E., Teixeira, D., Jose, C. (2003) New Journal of Chemistry 27(3): 597–601. Breitenbach, J., Schrof, W. and Neumann, J. (1999) Pharm. Res. 16: 1109–1113. Brittain, G. (1997) J. Pharm. Sci. 86(4): 405–412. Brittain, G., Morris, R., Bugay, D., Thakur, B., Serajuddin, M. (1993) J. Pharm. Biom. Anal. 11(11–12): 1063–1069. Bugay, D. E. (1993) Pharm. Res. 10(3): 317–327. Bugay, D. E. (2001) Advanced Drug Delivery Reviews 48: 43–65. Bugay, D. E. (2002) Handbook of Pharmaceutical Analysis. Marcel Dekker, Inc., New York. Butler, W. L. and Norris, K. H. (1960) The spectroscopy of dense light scattered material. Arch. Biochem. Biophys. 87: 31–40. Byrn, R., Gray, G., Pfeiffer, R., Frye, J. (1985) J. Pharm. Sci. 74(5): 565–569. Campbell-Roberts, S. N., Williams, A. C., Grimsey, I. M. and Booth, S. W. 2002. J. Pharm. Biomed. Anal. 28: 1135–1147. Candolfi, A., Maesschalck, de, R., Massart, D. L., Hailey, P. A. and Harrington, A. C. E. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 19: 923–935. Chakkittakandy, R., Corver, J. A. W. M. and Planken, P. C. M. (2009) J. Pharm. Sci., 99: 932–940.



Chang, J., Diaz, E., Morin, F., Grant, M. (1986) Mag. Reson. in Chem. 24(9): 768–771. Clarke, C., Jamieson, M. J., Clark, D. A., Hammond, S. V., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (2001) Anal. Chem. 73: 2213–2220. Cory, D. (1988) Che. Phys. Lett. 152: 431–434. Couce, D., Valera, M., Sanchez, A., Casas, S., Sordo, J., Lobez-Rivadulla, M. (1992) J. of Inorg. Biochem. 46(1): 17–22. Davis, T. D., Peck, G. E., Stowell, J. G., Morris, K. R. and Byrn, S. R. (2004) Pharm. Res. 21: 860–866. Deisingh, A. K. (2005) Analyst. 130: 271–279. Delacroix, S., Titman, J., Hagemeyer, A., Spiess, H. (1992) J. Magn. Reson. 97: 435–443. Dennis, A. C., McGarvey, J. J., Woolfson, A. D., McCafferty, D. F. and Moss, G. P. (2004) Int. J. Pharm. 279: 43–50. Diaz, E., Frydman, L., Olivieri, C., Alejandro, C., Frydman, B. (1987) Anal. Lett. 20(10): 1657–1666. Dixon, W., Schaefer, J., Sefcik, M., Steyskal, E. and Mckay, R. (1982) J. Magn. Reson. 49: 341–345. Donso, M. and Ghaly, E. S. (2005) Pharm. Dev. Technol. 10: 211–217. Duong, N.-H., Arratia, P., Muzzio, F., Lange, A., Timmermans, J. and Reynolds, S. (2003) Drug Dev. Ind. Pharm. 29: 679–687. Elkordy, A. A., Forbes, R. T. and Barry, B. W. (2004) Int. J. Pharm. 278: 209–219. Findlay, W. P. and Bugay, D. E. (1998) J. Pharm. Biomed. Anal. 16: 921–930. Frye, J. (1989) Concepts Magn. Reson. 1: 27–33. Gao, P. Pharm. Res. (1996) 13(7): 1095–1104. Geen, H. and Bodenhausen, G. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 1579–1580. Grage, L., Gauger, R., Selle, C., Phole, W., Richter, W., Ulrich, S. Physical Chemistry Chemical Physics (2000) 2(20): 4574–4579. Griesser, U. J., Burger, A. and Mereiter, K. (1997) J. Pharm. Sci. 86: 352–358.



Hailey, P. A., Doherty, P., Tapsell, P. Oliver, T. and Aldridge, P. K. (1996) J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 551–559. Haleblian, J., McCrone, W. (1969) J. Pharm. Sci. 58: 911–929. Harris, R. (1985) Analyst 110: 649–655. Ho, L., Cuppok, Y., Muschert, S., Gordon, K. C., Pepper, M., Shen, Y., Siepmann, F., Siepmann, J., Taday, P. F. and Rades, T. (2009) Int. J. Pharm. 382: 151–159. Ho, L., Muller, R., Kruger, C., Gordon, K. C., Kleinebudde, P., Pepper, M., Rades, T., Shen, Y., Taday, P. F. and Zeitler, J. A. (2009) J. Pharm. Sci. 99: 392–402. Holzgrabe, U., Wawer, I. and Diehl, B. (1999) NMR Spectroscopy in Drug Development and Analysis. Wiley-VCH, Weinheim, pp. 231–256. Imai, T., Otagiri, M., Saito, H., Uekama, K., Chem. & Pharm. Bull. 36 (1) (1988) 354–359. Islam, M. T., Rodriguez-Hornedo, N., Ciotti, S. and Ackermann, C. (2004) Pharm. Res. 21: 1844–1851. Jackson, J. E. 1991. A User’s Guide to Principal Components. John Wiley & Sons, Inc., New York. Jarvie, T., Went, G., Mueler, K. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 5330–5331. Jee, R. D. (2004) Near-infrared Spectroscopy. In: Moffat, A. C., Osselton, M. D., Widdop, B and Galichet, L. Y. (eds.) Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons. 3rd ed. Pharmaceutical Press. pp. 346– 357. Johansson, J., Pettersson, S. and Folestad, S. (2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 39: 510–516. Johansson, J., Pettersson, S. and Taylor, L. S. (2002) J. Pharm. Biomed. Anal. 30: 1223–1231. Jorgensen, A., Rantanen, J., Karjalainen, M., Khriachtchev, L., Rasanen, E. and Yliruusi, J. (2002) Pharm. Res. 19: 1285–1291. Jorgensen, A. C., Strachan, C. J., Pollanen, K. H., Koradia, V., Tian, F. and Rantanen, J. (2009) J. Pharm. Sci. 98: 3903–3932. Kazarian, S. G. and Matirosyan, G. G., (2002) International Journal of Pharmaceutics 232: 81–90. Kimura, K., Hirayama, F., Arima, H., Uekama, K. (1999) Pharm. Res. 16(11): 1729–1734. King, M. D., Buchanan, W. D. and Korter, T. M. (2010) J. Pharm. Sci., DOI 10.1002/jps.22339 1–14.



King, T. H., Mann, C. K. and Vickers, T. J. (1985) J. Pharm. Sci. 74: 443–447. Kirsch, J. D. and Drennen, J K. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 19: 351–362. Kontoyannis, C. G. (1995) J. Pharm. Biomed. Anal. 13: 73–76. Kortüm, G. (1969) Reflectance Spectroscopy. Springer Verlag, New York. Kubelka, P. and Munk, F. (1931) Ein Beitrag zur Optik der Farbanstriche. Z. Tech. Phys. (Leipzig) 12: 593–601. Laasonen, M., Harmia-Pulkkinen, T., Simard, C., Rasanen, M. and Vuorela, H. (2003) Anal. Chem. 75: 754–760. Langkilde, F. W., Sjoblom, J., Tekenbergs-Hjelte, L. and Mrak, J. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 15: 687–696. Lee, H., Craig, C., Kannangara, K., Dawson, M., Conn, C., Robertson, J., Wilson, A., J. (1999) Forensic. Sci. 44(4): 761–771. Lefort, R., De Gusseme, A., Willart, J., Daneda, F., Descamps, M. (2004) Int. J. Pharm. 280(1–2): 209– 219. Lied, T. T., Geladi, P. and Esbensen, K. H. (2000) J. Chemometrics 14: 585–598. Lyon, R. C., Lester, D. S., Lewis, E. N., Lee, E., Yu, L. X., Everett, H. J. and Hussain, A. S. (2002) AAPS PharmSciTech. 3(3, article 17): 1–15. Maurin, B., Vickery, D. Rapel, C., Rowe, M., Everlof, G., Nemeth, A., Campell, C., Foris, M., J. Pharm. Sci. (2002) 91(12): 2599–2604. McMahon, L. E., Timmins, P., Williams, A. C. and York, P. (1996) J. Pharm. Sci. 85: 1064–1069. Medek, A., Frydman, L. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 684–691. Mehrens, S. M., Kale, U. J. and Qu, X. (2005) J. Pharm. Sci. 94: 1354–1367. Middleton, A., LeDuff, S., Peng, X., Reid, G., Saunders, D., J. Am. Chem. Soc. (2000) 122(6): 1161– 1170. Miller, J., Collman, B. M., Greene, L. R., Grant, D. J. W. and Blackburn, A. C. (2005) Pharm. Dev. Technol. 10: 291–297.



Morissette, S. L., Almarsson, O., Peterson, M. L., Remenar, J. F., Read, M. J., Lemmo, A. V., Ellis, S., Cima, M. J. and Gardner, C. R. (2004) Adv. Drug. Del. Rev. 56: 275–300. Moshashaee, S., Bisrat, M., Forbes, R. T., Quinn, E. A., Hakan, N. and York, P. (2003) J. Pharm. Pharmacol. 55: 185–192. Murray, I. and Williams, P. C. (1987) Chemical Principles of Near-Infrared Technology. In: Williams, P. and Nonis, K. (eds.) Near Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries. American Association of Cereal Chemists, Inc. pp. (ch. 2) 17–34. Nerdal, W., Gundersen, A., Thorsen, V., Hoiland, H., Holmsen, H., Biochimica et Biophysica Acta, 1464 (1) (2000) 165–175. Newman, A. W. and Byrn, S. R. (2003) Drug Discovery Today 8: 898–905. Neville, G. A., Beckstead, H. D. and Shurvell, H. F. (1992) J. Pharm. Sci. 81: 1141–1146. Nguyen, L. T, Wiencek, J. M. and Kirsch, L. E. (2003) PDA J. Pharm. Sci. Tech. 57: 429–445. Novoselsky, A., Glaser, R. (2002) Mag. Reson. in Chem. 40(11): 723–728. Offerdahl, J., Munson, J., Am. (2004) Pharm. Rev. 7(1): 109–112. Okumura, T. and Otsuka, M. (2005) Pharm. Res. 22: 1350–1357. O’Neil, A. J., Jee, R. D., Lee, G., Charvill, A. and Moffat, A. C. (2008) J. Near Infrared Spectrosc. 16 (3): 327–333. O’Neil, A. J., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (1998) Analyst. 123: 2297–2302. O’Neil, A. J., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (1999) Measurement of the cumulative particle size distribution of microcrystalline cellulose using near-infrared reflectance spectroscopy. Analyst 124: 33–36. Opella, S. and Frey, M. (1979) J. Am. Chem. Soc. 101: 5854–5856. Osborne, B. G., Fearn, T. and Hindle, P. T. (1993) Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis. Longman Scientific & Technical, Harlow. Otsuka, M., Kato, F., Matsuda, Y. and Ozki, Y. (2003) AAPS PharmSciTech. 4(2): Article 19. Otsuka, M., Nishizawa, J., Shibata, J. and Ito, M., (2010) J. Pharm. Sci. 99: 4048–4053. Park, J. W., Lee, D. J., Yoo, E. S., Im, S. S., Kim, S. H. and Kim, Y. H. (1999) Korean Polym. J., 7: 93–101. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 69


Pines, A., Gibby, M., Waugh, J., J. Chem. Phys. 59 (1973) 569–590. Plugge, W. and Vlies, van der, C. (1993). J. Pharm. Biomed. Anal. 11: 435–442. Plugge, W. and Vlies, van der, C. (1996) J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 891–898. Pratiwi, D., Fawcett, J. P., Gordon, K. C. and Rades, T. (2002) European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 54: 337–341. Rantanen, J., Lehtola, S., Ramet, P., Mannermaa, J. -P., Yliruusi, J. (1998) Powder Technol. 99: 163– 170. Remenar, F., Wenslow, R., Ostovic, D., Peresypkin, A. (2004) Pharm. Res. 21(1): 185–188. Reutzel-Edens, M., Bush, K., Am. Pharm. Review (2002) 5(2): 112–115. Reutzel-Edens, M., Bush, K., Magee, A., Stephenson, A. R. Byrn, R. (2003) Crystal Growth and Design 3(6): 897–907. Ringqvist, A., Taylor, L. S., Ekelund, K., Ragnarsson, G., Engstrom, S. and Axelsson, A. (2003) Int. J. Pharm. 267: 35–47. Saindon, J., Cauchon, S., Sutton, A., Chang, J., Peck, E., Byrn, R. (1993) Pharm. Res. 10(2): 197–203. Sane, S. U., Wong, R. and Hsu, C. C. (2003) J. Pharm. Sci. 93: 1005–1018. Santos, S., Lee, K., Hallock, J., Ramamoorthy, A. (2002) Recent Res. Dev. in Phys. Chem. 6: 179–211. Sasic, S., Clark, D. A., Mitchell, J. C. and Snowden, M. J. (2005) Appl. Spectrosc. 59: 630–638. Scafi, S. H. F. and Pasquini, C., (2001) Analyst 126: 2218. Schachter, M., Xiong, J., Tirol, C. (2004) Int. J. Pharm. 281(1–2): 89–101. Schmidt, A. C. (2005) Eur. J. Pharm. Sci. 25: 407–416. Sekulic, S. S., Wakeman, J., Doherty, P. and Hailey, P. A. (1998) J. Pharm. Biomed. Anal. 17: 1285– 1309. Skoog, D. A., Holler, F. J. and Nieman, T. A. (1998) Principles of Instrumental Analysis. 5 edn. Thomson Learning, London. Skoulika, S. and Georgiou, C. (2003) Appl. Spectrosc. 57: 407–412.



Spiegeleer, de, B., Seghers, D., Wieme, R., Schaubroeck, J., Verpoort, F., Slegers, G. and Vooren, van, L. (2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 39: 275–280. Stephenson, A., Pfeiffer, R., Byrn, R., Stephen, R. (1997a) Int. J. Pharm. 146(1): 93–99. Stephenson, A., Stowell, G., Toma, H., Pfeiffer, R., Byrn, R. (1997b) J. Pharm. Sci. 86(11): 1239–1244. Stoltz, M., Oliver, W., Wessels, L., Chalmers, A. (1991) J. Pharm. Sci. 80(4): 357–362. Suzuki, N., Kawasaki, T. (2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 37(1): 177–181. Svensson, O., Josefson, M. and Langkilde, F. W. (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 141–155. Szostak, R. and Mazurek, S. (2002) Analyst. 127: 144–148. Taylor, L. S. and Langkilde, F. W. (2000) J. Pharm. Sci. 89: 1342–1353. Taday, P. F. (2004) Phil. Trans. R. Soc. Lond. 362: 351–364. Taday, P. F., Bradley, I. V., Arnone, D. D. and Pepper, M. (2003) J. Pharm. Sci. 92: 831–838. Taylor, L. S., Langkilde, F. W. and Zografi, G. (2001) J. Pharm. Sci. 90: 888–901. Tekely, P., Brondeau, J., Elbayed, K., Retournard, A. and Canet, D. (1988) J. Magn. Reson. 80: 509– 516. Thosar, S. S., Forbess, R. A., Ebube, N. K., Chen, Y., Rubinovitz, R. L., Kemper, M. S., Reier, G. E., Wheatley, T. A. and Shukla, A. J. (2001) Pharm. Dev. Technol. 6(1): 19–29. Timonen, T., Pohjala, E., Nikander, H., Pakkanen, T. (1998) Pharm. Res. 15(1): 110–115. Tishmack, P., Bugay, D., Byrn, S. (2003) J. Pharm. Sci. 92(3): 441–474. Tudor, A. M., Melia, C. D., Binns, J. S., Hendra, P. J., Church, S. and Davies, M. C. (1990) J. Pharm. Biomed. Anal. 8: 717–720. Tyndall, J. (1869) On the blue colour of the sky, the polarization of skylight and on the polarization of light by cloudy matter generally. Phil. Mag. 37: 384–394. Uekama, K., Hirayama, F., Fujise, A., Otagiri, M., Inaba, K., Saito, H. (1984) J. Pharm. Sci. 73(3): 382– 384. Ufret, C. and Morris, K. 2001. Drug Dev. Ind. Pharm. 27: 719–729.



Underhang, G., Anja, H., Holm, N., Nerdal, W. (2004) Biochimica et Biophysica Acta 1682(1–3): 28–37. Van Hoof, P., Lammers, R. Van Puijenbroek, R., Vander Schans, M., Carlier, P., Kellenbach, E. (2002) Int. J. Pharm. 238(1–2): 215–228. Vehring, R. (2005) Appl. Spectrosc. 59: 286–292. Vergote, G. J., Vervaet, C., Remon, J. P., Haemers, T. and Verpoort, F. (2002) Eur. J. Pharm. Sci. 16: 63–67. Vergote, G. J., Beer, de, T. R. M., Vervaet, C., Remon, J. P., Baeyens, W. R. G., Diericx, N. and Verpoort, F. (2004) Eur. J. Pharm. Sci. 21: 479–485. Ward, S., Perkins, M., Zhang, J., Roberts, C. J., Madden, C. E., Luk, S. Y., Patel, N. and Ebbens, S. J. (2005) Pharm. Res. 22: 1195–1202. Wartewig, S. and Neubert, R. H. H. (2005) Adv. Drug. Del. Rev. 57: 1144–1170. Watts, P. J., Tudor, A., Church, S. J., Hendra, P. J., Turner, P., Melia, C. D. and Davies, M. C. 1991. Pharm. Res. 8: 1323–1328. Wikstrom, H., Marsac, P. J. and Taylor, L. S. (2005) J. Pharm. Sci. 94: 209–219. Williams, A. C., Cooper, V. B., Thomas, L., Griffith, L. J., Petts, C. R. and Booth, S. W. (2004) Int. J. Pharm. 275: 29–39. Wong, M. W. Y. and Mitchell, A. G., Physicochemical characterization of a phase change produced during the wet granulation of chlorpromazine hydrochloride and its effects on tabletting, (1992) Int. J. Pharm. 88: 261–273. Wu, X., Zilm, K. (1993) J. Mag. Reson. 102: 205–213. Wulff, M., Alden, M., Tegenfeldt, J. (2002) Bioconjugate Chemistry 13(2): 240–248. Yang, H. and Irudayaraj, J. (2002) J. Pharm. Pharmacol. 54: 1247–1255. Yang, L., Venkatesh, G. and Fassihi, R. (1996) J. Pharm. Sci. 85: 1085–1090. Yoon, W. L., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (1998) Analyst. 123: 1029–1034. Yu, L. X., Lionberger, R. A., Raw, A. S., D’Costa, R., Wu, H. and Hussain, A. S. (2004) Adv. Drug. Del. Rev. 56: 349–369.



Zeitler, J. A., Taday, P. F., Newnham, D. A., Pepper, M., Gordon, K. C. and Rades, T. (2007) J. Pharm. Pharmacol., 59: 209–223.



4. Termická analýza – konvenční techniky 4.1.Úvod do termické analýzy Běžně používaná metoda u většiny R&D laboratoří je termická analýza (TA), konkrétně diferenční skenovací kalorimetrie (Differential Scanning Calorimetry (DSC)), která je vhodná pro pochopení fyzikálních vlastností léčivových substancí, interakcí léčivových substancí s neaktivními substancemi (většinou nosiči léčiv) a stability konečného produktu obsahujícího léčivo. Termická analýza je termín používaný pro popis všech analytických technik, které měří fyzikální a chemické vlastnosti vzorku jako funkci teploty nebo času. Tato kapitola si klade za cíl vysvětlit použití DSC a termogravimetrické analýzy (TGA) při výzkumu a kvantifikaci různých fyzikálněchemických parametrů důležitých během charakterizační fáze vývoje farmaceutického produktu. Tam, kde to bude nutné k pochopení metodologie, budou uvedeny příklady z literatury. Další termická technika, která bude zmíněna, je dynamická mechanická analýza (DMA), jejíž aplikace byly nedávno vyvinuty pro farmaceutické materiály použitím tabletových držáků a nádobek pro práškový materiál. Každá z těchto technik bude diskutována s ohledem na odpovídající praktické uplatnění v různých oblastech aplikace. Vzhledem k tomu, že praktické využití DSC je často považováno za velmi důležité, bude tomuto tématu věnována větší pozornost. Informace v této kapitole jsou z větší části převzaty z kapitoly Principles and Applications of Thermal Analysis (Gabbot 2008), kde lze o této technice nalézt detailnější informace.

4.2. Diferenční skenovací kalorimetrie Diferenční skenovací kalorimetrie je nejrozšířenější používanou termickou technikou poskytující rychlou a snadnou metodu pro získání velkého množství informací o materiálu ať už je jeho použití jakékoliv. Tato technika je používána k měření změn energie, které nastávají, když je vzorek ohříván, ochlazován nebo udržován v isotermickém prostředí, stejně tak k měření teploty, při které tyto změny nastávají. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 74


Tyto změny energie umožňují uživateli nalézt a kvantitativně změřit přechody, které nastávají ve vzorku, a tak charakterizovat materiál vzhledem k procesům tání, skelným přechodům a dalším složitějším dějům. Při analýze DSC je třeba vzorky neprodyšně uzavřít, což lze snadno provést buď bez úpravy vzorku a nebo jen s malou úpravou, a proto může být měření provedeno snadno a rychle.

4.2.1. Měření tepelného toku Hlavní veličina, která je měřena DSC, je tepelný tok (tok energie do vzorku (endotermický děj) nebo ze vzorku (exotermický děj)), který je zaznamenáván jako funkce teploty nebo času a v termickém záznamu je obvykle uváděn na ose y v jednotkách mW. Ty odpovídají mJ/s, a proto je tepelný tok často popisován jako tok energie za jednotku času. Zahřívání nebo ochlazování vzorku se na záznamu projevuje ve formě píků nebo schodů na základní linii, někdy velmi malých, jejichž zdrojem jsou přechody ve vzorku. Počátek křivky na ose y může být zvolen jako jeden z počátečních parametrů a měl by být umístěn blízko nebo přímo do nuly. Existují dvě různé konvence pro zobrazování křivky tepelného toku, jedna zobrazuje endotermy v klesajícím směru, druhá v rostoucím. U většiny programů si lze toto nastavení zvolit. Při analýze DSC dat je důležité stanovit směr tepelného toku. V této kapitole je většina dat zobrazena s rostoucími endotermami. Typický DSC sken vzorku v oblasti tání je ukázán na obrázku 4.1. Bod tání je určen jako průsečík píku a extrapolovaného začátku nárůstu teploty. Pokud je materiál amorfní (není krystalický), pak může být pozorován skelný přechod jako schod v základní linii obvykle následovaný rekrystalizací a následným táním, jak je ukázáno na obrázku 4.2.

Obrázek Bod tání (Tm) krystalu je určen z extrapolovaného začátku tání, který je označen šipkou. Skupenské teplo tání je získáno z plochy pod křivkou. (Endoterma je zobrazena v rostoucím směru.)

Obrázek Typická křivka získaná zahříváním amorfního (skelného) materiálu. Skelný přechod (Tg) je v oblasti vzestupu tepelného toku. Malý pík na vrcholu tohoto schodu je relaxační jev. Následuje Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 75


studená krystalizace v oblasti širokého exotermického píku, za níž následuje endotermický pík, který odpovídá tání vzniklých krystalů.

Pokud je použita odpovídající metodologie, mohou být také provedena specifická měření, která berou do úvahy příspěvek tepelného toku z pece, pánvičky použité pro vzorek a referenčního měření. Většina farmaceutických aplikací však nevyžaduje stanovení isobarické tepelné kapacity (Cp), jejíž měření vyžaduje více práce, a proto se většinou používá pouze měření tepelného toku.

4.2.2. Derivační křivky při DSC Derivační křivky jsou snadno získatelné z křivek tepelného toku matematickým algoritmem a pomáhají interpretovat data. Mohou pomoci při definování výpočetních limitů a při rozlišení dat, obzvláště když jsou v záznamu překrývající se píky. Křivka první derivace je užitečná pro vyhodnocení postupných přechodů, jako je skelný přechod a je velmi užitečná pro TGA studie, ve kterých má ztráta hmoty za následek schod. Druhá derivace píku je snadněji interpretovatelná než první derivace, protože také vytváří pík. V tomto případě jsou data invertována, ale jakákoliv raménka v původních datech se zobrazí jako separátní píky v křivce druhé derivace. To je obzvláště užitečné při zkoumání procesů tání při identifikaci ramének v píku v případě několikanásobných jevů. Příklad je ukázán na obrázku 4.3. Druhá derivace vytváří maximum nebo minimum pro každý inflexní bod původní křivky. Čím vyšší je úroveň derivace, tím vyšší je generovaný šum, a proto je pro vyšší derivační studie potřeba dobrá kvalita dat. Fitovací a vyhlazovací techniky mohou být velmi užitečné při redukci šumu analyzované křivky, pokud jsou uplatněny před derivací dat. Obecně se dá říct, že ostré jevy a inflexní body vytváří nejlepší derivační křivky. Studie při vysokých rychlostech také vytváří velmi dobré derivační křivky, protože děj probíhá rychleji.

Obrázek Indomethacinová forma 2 skenovaná při 500 °C/min. Raménko na křivce tání vytváří ve druhé derivaci samostatný pík. 2. derivace křivky tání tak vytváří dublet směřující dolů. (Zdroj:



Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.2.3. Praktické pokyny pro DSC experiment Čistota je pro DSC to nejdůležitější. Kontaminace nastává, pokud je pánvička položena na špinavý povrch a poté je dána do pece. Proto udržujte přístroj a pracovní oblast čistou a uklizenou a odstraňujte použité pánvičky, abyste se vyhnuli jejich zaměnění s čistými. DSC pece by také měly být udržovány čisté odpovídajícími čistícími metodami dle instrukcí výrobce. Vyvarujte se abrazivům a dávejte zvýšený pozor při použití hořlavých rozpouštědel. Postupujte dle specifických instrukcí pro každý konkrétní typ pece. Konkrétně: 

nepřeplňujte pánvičku,



nepřehřívejte a nerozkládejte vzorky v DSC (kromě kontrolovaných experimentů pro to určených),



nezahřívejte hliníkovou pánvičku nad 600 °C,



nepracujte v peci s oxidující atmosférou nad její doporučený limit,



nepoužívejte nadbytečnou sílu při čištění pece.

4.2.4. Enkapsulace pro DSC měření Enkapsulace je nezbytná pro předejití kontaminace analyzátoru a pro dobrý tepelný kontakt vzorku s pecí. Většina výrobců poskytuje různé pánvičky na vzorky určené pro různé účely, s různými velikostmi, materiály, ze kterých jsou pánvičky vyrobeny a pro které jsou vždy stanoveny odpovídající rozsahy teplot a tlaků. Při výběru pánvičky a enkapsulace vzorku by měla být věnována pozornost následujícím bodům:



Množství vzorku. Nepřeplňujte pánvičku. Kontaminace je nejčastěji způsobena použitím příliš velkého množství vzorku, obzvláště pokud bude vzorek roztaven, mohl by vytéct z pánvičky a způsobit tak chybu v měřených datech. Zmenšení objemu vzorku při tání nebo měknutí může způsobit šum během nebo po přechodu do jiného stavu. Zmenšením objemu vzorku se zmenšuje šance, že se výše uvedené stane. Často je dostačující několik mg, obvykle se jedná o 1–3 mg farmaceutické látky, ale pro velmi slabé změny stavů a pro přesné měření skupenského tepla je zapotřebí vzorku více. Poznámka: Pokud uvažujete přesnost měření energie, měli byste vzít také do úvahy přesnost vah. Pro většinu analýz jsou třeba pětimístné váhy, šestimístné (schopné měřit mikrogramová množství) jsou třeba pro přesnější měření skupenského tepla. A ještě jedna poznámka, pokud je plánováno, že vzorek roztaje, je třeba navážit ho menší množství a vybrat pánvičku, do které se dané množství vejde. Teplotní rozsah. Ujistěte se, že pánvička je určena pro požadovaný teplotní rozsah a nebude tát během měření. Pamatujte, že hliník nemůže být použit nad 600 °C. Pánvičky ze zlata (teplota tání 1063 °C), platiny nebo hliníku mohou být použity při vyšších teplotách. Narůstání tlaku a deformace pánvičky. Narůstání tlaku v nevhodně zvolené pánvičce způsobuje problémy. Je důležité zjistit, zda je potřeba analyzovat vzorek v hermeticky uzavřené pánvičce nebo ne. Suché vzorky, u kterých není pravděpodobné uvolňování velkých množství těkavých látek, ještě než dojde k rozkladu vzorku, není třeba hermeticky uzavírat. Při analýze v hermeticky uzavřené pánvičce může narůstající vnitřní tlak deformovat pánvičku (ne nutně viditelně), což má za následek špatnou reprodukovatelnost a možný výskyt artefaktů na křivce kvůli změně přenosu tepla do vzorku. Únik vzorku má většinou za následek kontaminaci analyzátoru. Nejlepším řešením pro takový systém je pracovat se zvlněnými pánvičkami nebo použít víčka s otvory. V případě materiálu obsahujícího vodu je důležité hermetické uzavření, protože ztráta těkavých látek může zakrývat jiné přechodové jevy a vysušovala by vzorek. V tom případě je nezbytné použít vhodný typ pánvičky schopný vydržet předpokládaný tlak. Běžně jsou dostupné různé typy pánviček s tlakovou odolností kolem 150 bar. Pro zacházení s rizikovými vzorky by měly být použity pozlacené pánvičky, které vydrží velký tlak a které by měly být ke vzorku inertní.



Čistota pánviček. Většina pánviček může být použita rovnou po obdržení, ale někdy se stane, že je dodávka slabě kontaminována, pravděpodobně stopami oleje z přístrojů vyrábějících pánvičky. Pokud tomu tak je, pánvičky musí být vyčištěny odtěkáním oleje. Zahřátí na 300 °C je proto víc než dostačující. Pokud použijete plotýnku, nezahřívejte příliš pánviček pohromadě, neboť se mohou spojit navzájem. Použití čistých pánviček je také důležité při velmi citlivých analýzách, například při rychle skenující DSC. Po enkapsulaci se vzorek zkontroluje a odstraní se jakákoliv kontaminace z pánvičky, obzvláště z jejího dna. Na odstraňování práškového materiálu je vhodný měkký kartáček. Pánvičky s velmi malými otvory. Ke zvýšení rozlišení výsledných píků odpovídajících ztrátě hmoty byly vyvinuty některé typy pánviček a víček s velmi malými otvory, obvykle okolo 50 mikrometrů v průměru, které jsou určené k použití pro hydráty a materiály obsahující rozpouštědla. Mohou být použity i pro běžné vzorky pro uvolnění vnitřního tlaku dokud není otvor zablokován. Tepelný kontakt. Je třeba, aby byly vzorky v dostatečném tepelném kontaktu s pánvičkou. Kapaliny a stlačené prášky poskytují dobrý tepelný kontakt, ale ostatní vzorky nebo větší kousky materiálu by měly být rozetřeny po povrchu pánvičky. Vyvarujte se použití hrudkovitých materiálů, pokud si nejste jisti, že materiál nebude měnit svoje vlastnosti. Pokud je to možné, filmy by neměly být převrstvovány, aby se předešlo opakovaným efektům pocházejících ze stejného přechodového jevu, ačkoli převrstvování může být jediná cesta jak dodat dostatečné množství vzorku do pánvičky. V tom případě se ujistěte, že jsou k sobě filmy velmi dobře stlačeny. Malá hustota vzorků vykazuje nízký přenos tepla, a proto by měly být vzorky stlačeny. Některé analyzátory to dělají automaticky. U ostatních je dobré stlačit vzorek mezi dvěma spodními částmi pánviček. Dávejte pozor, abyste nezdeformovali pánvičku a odstraňte všechny pánvičky, u kterých máte podezření na deformaci. Některé pánvičky s tenkou vrstvou hliníku mohou poskytnout lepší přenos tepla, protože mají tenčí dno.

4.2.5. Teplotní rozsah běžných DSC měření Počáteční teplota by měla být zvolena dostatečně nízko pod začátkem prvního přechodu, který chceme měřit, abychom jasně viděli vodorovnou základní linii. Je třeba si uvědomit, že ze začátku analýzy ještě není rychlost skenování plně kontrolována a základní linie není stabilní (viz sekce 4.2.7). Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 79


U běžných DSC systémů je počáteční teplota často kolem 30 °C. Konečná teplota měření by měla být pod teplotou rozkladu vzorku. Rozklad materiálu v DSC vede většinou ke vzniku velmi zašuměné fluktuující odezvy a uvolnění těkavých látek, které mohou kontaminovat systém. Je proto vhodné nejprve stanovit teplotu rozkladu použitím TGA analyzátoru a pak zastavit analýzu před zjištěnou teplotou rozkladu.

4.2.6. Rychlost skenování při DSC experimentu Nejčastěji používaná rychlost skenování je 10 °C/min, ale s komerčně dostupnými přístroji mohou být rychlosti měněny od jednotek po stovky °C/min, což poskytuje značné výhody. Výběr rychlosti skenování ovlivňuje následující oblasti: 

Citlivost. Čím vyšší rychlost skenování, tím vyšší citlivost. Důvod je ten, že DSC měří tok energie a během rychlého skenování tok energie vzrůstá, ačkoli analýza trvá kratší dobu. Protože se DSC data obvykle zobrazují s teplotou na ose x, vypadá to, že přechod je vyšší při vyšších rychlostech skenování (viz obrázek 4.4a a b). Protože zvýšená rychlost skenování vede ke zvýšené citlivosti, nedoporučuje se, pokud to není nezbytné, používat pomalé rychlosti kvůli následnému obtížnému zjišťování přechodů.



Rozlišení. Protože jsou ve vzorku teplotní gradienty, vyšší rychlost skenování rozlišení snižuje a pomalejší rychlost skenování rozlišení zvyšuje. Teplotní gradienty mohou být zmenšeny omezením velikosti vzorku a zlepšením tepelného kontaktu s pánvičkou vhodným zapouzdřením nebo použitím vodivějšího proplachovacího plynu, jako je helium.



Kinetika přechodu. Pomalé děje, jako je studená krystalizace, nemusí proběhnout úplně, pokud je použita velká rychlost skenování a mohou být posunuty k vyšším teplotám, kde probíhají rychleji. Při výběru rychlosti skenování nemusí být uvažována kinetika dějů.



Efekt rychlosti ochlazování na krystalizaci také nemusí být uvažován a je zde tedy potenciál pro využití vyšších rychlostí skenování.



ObrázekEfekt zvýšení rychlosti skenování na indium. Na obrázku 4.4a (horní křivka) je na ose x vynesen čas. Na obrázku 4.4b (dolní křivka) je na ose x vynesena teplota. Stejné energie tečou rychleji při kratších časech a vyšších rychlostech a poskytují tak vyšší píky. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.2.7. Ustavení rovnováhy v DSC přístroji Z důvodu vytvoření požadované rychlosti zahřívání trvá po zahájení analýzy nějakou dobu, než je energie přenesena jak do vzorku, tak do referenčního materiálu. Proto je zde vždy na počátku analýzy krátká doba nestability do té doby, než se ustaví stabilní ohřívání (nebo ochlazování). Tento jev se často projevuje jako endotermní schod, ale může být různě velký pro každou analýzu. Tato doba je označována jako doba ustavení rovnováhy (viz Obrázek). Na obrázku, kde jsou zobrazeny celé záznamy, je vidět ustavení rovnováhy jako nestabilita základní linie na začátku analýzy před tím, než začne být základní linie vodorovná. Čas potřebný k ustavení rovnováhy je různý pro každý přístroj, ale projevuje se vždy. Hodnoty mohou být malé, například sekundy, ale mohou být i několikaminutové, přičemž částečně záleží i na tepelné kapacitě pece. Po této době může základní linie vykázat malý sklon díky změněné tepelné kapacitě vzorku. Ustavení rovnováhy se také projevuje po dokončení skenu, například při změně na isotermu, a může příležitostně maskovat měření prováděná během isotermy. Pokud toto nastane, mělo by být možné minimalizovat efekty odečtením referenčního záznamu. Data použitá pro odečtení mohou být vzata z analýzy inertního vzorku o stejné hmotnosti, jakou měl analyzovaný vzorek.



4.2.8. Kalibrace DSC Je důležité rozlišovat mezi procesy kalibrace a procesy validace nebo kontroly. Pokud se jedná o přístroj nové značky, měla by provedena servisní prohlídka, nebo pokud je přístroj používán za nových podmínek, měla by být provedena kalibrace, ale i přístroj v běžném chodu by měl být pravidelně kontrolován a kalibrován, pokud výkon poklesne pod stanovená kritéria. Mnoho systémů, obzvláště ve farmaceutickém průmyslu, je provozováno použitím správné laboratorní praxe nebo jiných regulací a mají stanovené návody, kdy a jak často by měly být kontroly prováděny. Všeobecně jsou používány běžné výkonnostní testy. Pokud je systém kontrolován jednou za šest měsíců a pak je zjištěna chyba, je těchto šest měsíců práce pochybných. Pokud je po kontrole zjištěno, že přístroj vyžaduje kalibraci, pak se postupuje dle instrukcí popisujících provedení kalibrace. Pro dodržení přesnosti a opakovatelnosti měření musí být systém kalibrován a validován za podmínek použití. Dobrý přehled v současnosti používaných standardů pro DSC s ohledem na přesnost a postup je uveden v referencích (Della Gatta et al. 2006).

4.2.9. Faktory ovlivňující DSC kalibraci Je známo mnoho faktorů ovlivňujících odezvu systému, a pokud jsou měněny, je nutné nastavení různých podmínek kalibrace, které zahrnují: 

nastavení přístroje a stability,



použití chladicího systému,



rychlost skenování,



proplachovací plyn a jeho průtoková rychlost,



typ pánvičky.

Změna kteréhokoliv z výše uvedených faktorů může ovlivnit kalibraci. Tyto změny však mohou být různě významné pro různé typy přístrojů. Nejprve je třeba se ujistit, že je přístroj správně nastaven a všechna příslušenství jsou zapnuta a jsou stabilní. Většina analyzátorů může obsahovat analogové Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 82


okruhy, které způsobují malý posun při zahřívání, a proto by měl být nějakou dobu (obvykle alespoň hodinu) přístroj zapnutý než se provede kalibrace. V analyzátorech jsou také další nastavení, která ovlivňují kalibraci, takže by s nimi měl být uživatel seznámen, než začne s kalibrací. Použití chladicích systémů může způsobit změnu teploty, a proto je třeba se přesvědčit, že jsou zapnuty a stabilní. Pokud jsou použity různé rychlosti skenování, obzvláště při velmi vysokých rychlostech používaných v rychle skenujícím DSC, je třeba se ujistit, že je analyzátor vhodně nakalibrovaný pro danou rychlost skenování. Proplachovací plyny, jako je vzduch, kyslík a dusík, mají podobné tepelné vlastnosti a mohou být zaměněny mezi sebou bez ovlivnění rychlostí skenování. Vyšší vodivost helia nebo nižší vodivost argonu může mít velmi podstatný vliv na kalibraci, a proto musí být systémy kalibrovány s těmito plyny, pokud budou použity. Obvykle je helium používáno při nízkých teplotách nebo při vysokých rychlostech skenování, zatímco argon může být vhodnější při teplotách nad 500 °C. Různé typy pánviček obecně nemají takový vliv, ale pokud je změněn tepelný kontakt, například použitím různé tloušťky nebo materiálu pánvičky, pak to může kalibraci ovlivnit. V případě pochybností je to třeba zkontrolovat.

4.2.10.

Systém DSC s dvojitou pecí

Tento typ DSC, který je často označován jako výkon kompenzující DSC, měří energetický tok přímo v mW nebo J/s a skládá se ze dvou malých pecí, jedné pro vzorek a druhé pro referenční vzorek (obvykle prázdnou pánvičku). Referenční bývá pec vpravo (viz obrázek 4.5). Obě pece jsou zahřívány předem naprogramovanou rychlostí zahřívání (nebo ochlazování) a je kontrolován výkon, aby byla tato rychlost udržována. Ve výsledném DSC záznamu je porovnáván energetický tok do pece se vzorkem s tokem do pece s referenčním materiálem a zobrazen jako funkce teploty nebo času. Základní rovnice DSC je

DSC signál (W/g) = tepelná kapacita (J/K/g) × rychlost skenování (K/s) dH/dt = dH/dT × dT/dt Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 83


Z tohoto důvodu odpovídá nezpracovaný signál tepelného toku tepelné kapacitě. V praxi odráží DSC záznamy změny v tepelné kapacitě, a když jsou vzaty v úvahu příspěvky prázdných pánviček a referenčního vzorku, je získána její absolutní hodnota. Malé pece v tomto systému mohou být zahřívány nebo chlazeny velmi pomalu i velmi rychle a jsou ideální pro řadu různých technik, obzvláště pro rychle skenující DSC. Tento přístup také dovoluje skutečné isotermické operace, protože za konstantních teplotních podmínek je držen jak vzorek, tak referenční materiál. Teplotní rozsah použití je od teploty kapalného dusíku po přibližně 730 °C.

Obrázek Schéma dvojité pece (výkon kompenzující DSC). V tomto systému jsou vzorková a referenční pec zahřívány/chlazeny naprogramovanou rychlostí zahřívání/chlazení. Když nastane přechod ve vzorku, výkon kompenzující obvod zvýší nebo sníží výkon pece tak, aby byla udržena rychlost zahřívání. Výkon kompenzující obvod tím pádem odráží změny energie, ke kterým dochází ve vzorku, a jsou zobrazeny na obrazovce jako funkce teploty na čase. Tato technika tedy přímo měří změny energie. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.2.11.

Systém DSC s jednoduchou pecí

Tento typ DSC (DSC tepelného toku) využívá jednu pec se senzorem (nebo více senzory) teploty pro pánvičky se vzorkem i s referenčním materiálem umístěnými uvnitř pece (viz obrázek 4.6). Pánvičky se vzorkem a referenčním materiálem jsou umístěny na určených místech a pec je zahřívána předem naprogramovanou rychlostí zahřívání (nebo ochlazování). Když ve vzorku nastanou přechody, vznikne teplotní rozdíl mezi vzorkem a referenčním materiálem. Při pokračování v zahřívání po přechodu se tento rozdíl teplot snižuje, protože systém dosahuje rovnováhy v souladu Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 84


s časovou odezvou systému. Základní měřený parametr je rozdíl teplot nebo t signálu. Moderní analyzátory jsou pečlivě kalibrovány tak, aby byl t signál převeden na ekvivalent tepelného toku, který je následně zobrazen jako funkce teploty na čase. Důvod pro použití rozdílu teploty lze snadno vysvětlit na tání. Když nastává tání jednoho krystalu, výsledná směs pevné látky a kapaliny zůstává při bodu tání, dokud není tání dokončeno, a tak teplota vzorku poklesne pod teplotu referenčního materiálu. Typická jednoduchá pec může být použita od teploty kapalného dusíku po přibližně 700 °C, podobně jako analyzátory se dvěma pecemi. Vysokoteplotní DSC (nebo DTA) systémy také používají tento princip, ale podstatně se liší vnitřním uspořádáním.

Obrázek Schéma jednoduché pece (DSC tepelného toku). V tomto systému je vystaven jak vzorek, tak referenční materiál stejnému tepelnému toku, ale příkony energie se liší. Efekty zahřívání nebo ochlazování se liší, což vede k vytvoření rozdílu teplot mezi vzorkem a referenčním materiálem. Tento rozdíl v teplotě je převeden na ekvivalent energie analyzátorem a poskytuje tak známý DSC signál v mW. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.3. Diferenční termická analýza (DTA) Princip diferenční termické analýzy a její uspořádání jsou podobné jako v případě DSC tepelného toku s tím rozdílem, že t signál zůstává ve formě signálu v mikrovoltech a není konvertován na ekvivalent tepelného toku. Toto byl původní princip takovéhoto zařízení do té doby, než bylo vyvinuto kvantitativní měření energie za použití DSC. Tohoto principu stále využívají zařízení schopná dosáhnout teplot okolo 1500 °C a jsou označována jako DTA analyzátory. Uspořádání pece je dost odlišné od systémů pracujících při nižších teplotách, ačkoli moderní přístroje mohou nabídnout volbu signálu tepelného toku nebo signálu v mikrovoltech.



4.3.1. Modulovaný profil teploty Když je na vzorek aplikován sinusoidní teplotní profil, signál tepelného toku bude oscilovat následkem teplotního programu a velikost oscilace bude funkcí tepelné kapacity vzorku. Z tohoto důvodu může být z amplitudy signálu tepelného toku získána hodnota tepelné kapacity. Přínos této metody oproti již existujícím metodám poskytujícím měření tepelné kapacity je ten, že měření tepelné kapacity je odděleno od potenciálně překrývajících se dějů, jako jsou reakce, relaxace tlaku, a je také dosaženo vyšší citlivosti vzhledem k pomalým lineárním rychlostem běžných DSC. Sinusoidní Readingův přístup (Reading et al. 1994; Reading and Hourston 2006) zavedl terminologii obráceného tepelného toku, pro který je nezbytná křivka tepelného toku, celkový tepelný tok pro průměrnou modulovanou křivku tepelného toku, což je běžná DSC křivka, a neobrácený tepelný tok pro kinetickou odezvu. Protože je Tg pozorován jako schod v křivce tepelného toku, je ke změření Tg použit signál obráceného tepelného toku. Tato křivka by měla ukázat děje, které jsou opravdu obrácené v tom smyslu, že stejné děje mohou být pozorovány opětovným zahřáním nebo ochlazením. Skelný přechod může tedy být odlišen od relaxace, rekrystalizace a dalších dějů, které mohou nastat, a to činí toto měření jasnějším. Relaxace a další neobrácené děje by se tak měly objevit na neobrácené křivce a pro získání relaxační energie spjaté se skelným přechodem může být provedeno měření této křivky. Teplotně modulovaná DSC (MTDSC) může být také použita v kvazi termickém módu tak, že není vložena teplotní rampa, což umožňuje měřit Cp hodnoty v jednom bodě. To může zlepšit rozlišení dějů, při kterých je pozorována změna v Cp. Pozornost by také měla být věnována analýze profilů tání, protože během tání je materiálem absorbována latentní tepelná energie a ustálený stav není vždy dosažen, což činí analýzu dat složitější.



4.4. Postupné/krokové metody termické analýzy Použitím postupné/krokové metody se výpočet termodynamické (obrácené) a isokinetické základní linie (neobrácené) liší od metod popsaných v předešlé sekci. Obvyklý přístup k výpočtu tepla používá postupnou metodu, při které je isoterma následována teplotní rampou. Běžně je teplotní rampa přes 10 °C, ale pokud je rampa omezena na jeden stupeň nebo méně a opakována mnohokrát, pak jsou data ekvivalentní k obrácenému tepelnému toku (viz obrázek 4.7). Kinetika nebo neobrácená odezva je získána z isotermických částí dat. Pro dosažení rozumné (pokud použijeme aproximaci) separace v obrácených nebo rychlých a neobrácených nebo pomalých signálech je důležité, aby byla správně vybrána doba isotermy. Pokud je příliš krátká, objeví se nepřirozeně vysoký signál v neobrácené křivce. Dá se říct, že by isotermická doba měla být dostatečně dlouhá pro dosažení stability systému, typicky 30–60 s. Typická křivka získaná při průchodu vzorku Tg a následnou rekrystalizací je ukázána na obrázku 4.8. Aktuální tepelná kapacita vzorku při rekrystalizaci je získána z modulované křivky oddělené od rekrystalizačního tepla.

Obrázek 4.7 Diagram teplotního profilu používaného v metodě založené na jednotlivých krocích a výsledný signál tepelného toku. Tepelná kapacita je spočítána buď z výšky píku jako u klasické metody nebo z plochy píku křivky tepelného toku. Kinetická odezva je získána z isotermické části. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Obrázek 4.8 Křivka získaná analýzou polyethylentereftalátu zobrazená jako funkce času. V horní křivce znázorňující Cp odpovídá schod skelnému přechodu, zatímco při rekrystalizaci vzorku také nastává malá redukce. Toto měření je odděleno od energie rekrystalizace. Kvantitativní data tepelné kapacity mohou být získána odečtením základní linie v souladu s požadavkem standardních Cp Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 87


metod. Pokud to ale není provedeno, mohou být získána kvantitativní data znázorňující jednotlivé děje. Křivka odpovídající dolní obálce oscilujících dat tepelného toku se nazývá základní linie IsoK. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.5. Termogravimetrická analýza (TGA) Ve většině farmaceutických laboratoří je DSC analýza doplněna termogravimetrickou analýzou (TGA), kde se změny hmotnosti vzorku měří jako funkce teploty nebo času. Velmi často jsou tato měření jednoznačná a umožňují stanovení zbytkových rozpouštědel, nebo tepelné či oxidační stability materiálu. Měření jsou také velmi užitečná, ne-li nezbytná, při interpretaci endotermních křivek z DSC. Ztráta rozpouštědla nebo vody může vypadat velmi podobně jako vrchol tání v DSC křivce, ale lze snadno rozeznat použitím TGA. Proto může být velmi užitečné použití DSC spolu s TGA analýzou vzorku.

4.5.1. Design přístroje pro TGA Existuje řada typů přístrojů, které jsou dostupné s různými specifikacemi a nastaveními. Pokud je nutné použít malou hmotnost vzorku (což je obvykle případ mnoha farmaceutických laboratoří), pak je potřeba mít váhy s velmi vysokou přesností. Většina moderních vah je založena na kompenzaci síly, jejichž princip spočívá v měření síly, která je potřebná k udržení stejné pozice vah a která se pak přepočítává na hmotnost. Toto uspořádání poskytuje nejlepší účinnost. Na trhu v zásadě existují tři různé typy analyzátorů: a)

S vertikálně sestupným uspořádáním, kde je vzorek umístěn v pánvičce zavěšené na drátku pod vahami. Vzhledem k tomu, že se pánvička bude vždy houpat vertikálně, eliminuje toto uspořádání polohu vzorku a pohybové efekty.

b)

S vertikálně vzestupným uspořádáním, které je jednodušší na používání.



c)

S horizontálním uspořádáním.

Pro vysokou účinnost je důležité se přesvědčit, aby jak horizontální, tak vertikálně vzestupné váhy byly navrženy pro minimalizaci efektu způsobeného různou pozicí vzorku. Mnoho moderních TGA systémů také zahrnuje možnost měřit tepelný tok a jsou označovány jako simultánní systémy, protože TGA a DSC signál lze získat současně. To je samozřejmě velmi užitečné, ale používané metody nejsou naneštěstí optimalizovány pro DSC analýzy a získané DSC signály nemusí mít stejnou kvalitu jako ty, které jsou zjištěny z DSC analyzátoru pro tento účel určeného. Teplotní rozsah většiny TGA přístrojů je od laboratorní teploty do 1000 °C, i když vysokoteplotní systémy dosahují i 1500 °C a výše, a některé systémy mohou být chlazeny pod laboratorní teplotu. Možnost chlazení může být užitečná nejen ke snížení teploty v průběhu cyklu, ale umožňuje vložit vzorek při laboratorní teplotě, což je výhodnější, neboť při vyšší teplotě je rychlost ztráty těkavých látek ze vzorku vyšší a dochází tak k chybě při určování počáteční hmotnosti.

4.5.2. TGA kalibrace – základní pokyny Při práci s analyzátorem je důležité řídit se pokyny výrobce. U většiny analyzátorů se bude jednat o měření teploty, měření hmotnosti a regulaci teploty, které vyžadují kalibraci, a jejichž principy jsou stejné jako pro kalibraci DSC, viz sekce 4.2.8. Pro kalibraci teploty je lepší použít bod tání standardů než curiovy body, což umožňuje mnoho moderních analyzátorů použitím křivky tepelného toku získané z analýzy standardů.

4.5.3. Praktická upozornění pro TGA experiment Korekce na vztlak. Jak se zvyšuje teplota vzorku, hustota atmosféry kolem vzorku se snižuje, což zdánlivě vede ke zvýšení hmotnosti vzorku se zvyšující se teplotou. Přístroj již může zahrnovat postup k minimalizaci tohoto efektu například tím, že automaticky odečte předem zaznamenanou základní Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 89


linii, ale i tak je důležité si uvědomit, že se mohou objevit účinky vztlaku. Pokud je nutné přesné měření, pak nejlepší přístup ke korekci vztlaku je změřit prázdnou pánvičku při požadovaném teplotním rozsahu a za stejných podmínek, a to odečíst od vzorku. 

Hmotnost vzorku. Obvykle se používá 3 až 5 mg, lze použít i méně pokud není dostatek vzorku, ale hmotnost by měla být dostatečná, aby bylo dosaženo požadované přesnosti. Mnoho standardních operačních postupů specifikuje požadovanou hmotnost. Pokud se používají velká množství vzorku, pak je přesnost zjištění ztráty hmoty lepší, ale snižuje se rozlišitelnost dějů. Při vyšších hmotnostech mohou být také patrné účinky pohybu vzorku.



Ztráta vlhkosti. Jsou-li vzorky, které byly před tím ponechané na vzduchu, umístěny do suchého prostředí TGA, je často pozorováno okamžité snížení hmotnosti. To může být na obtíž, protože může dojít ke ztrátě různého množství látky ještě před začátkem analýzy. Pokud je to významné, je třeba se přesvědčit, že metoda je dobře nastavena a připravena ke spuštění jakmile je vložen vzorek. Také je třeba zvážit, zda by mohla být použita nějaká forma zapouzdření, viz poznámka pod odstavcem „vzorkovací pánvičky“ uvedeném níže.



Rychlost skenování. Obvykle se provádí skenování při 10 °C/min. Rychlejší skenování nemusí poskytnout dostatek času na požadovanou ztrátu hmotnosti a může způsobit malé rozlišení. Pokud je ale požadováno pouze zjištění celkové ztráty hmotnosti při dané teplotě, může být vzorek rychle zahřán na požadovanou teplotu a udržován při této teplotě potřebnou dobu. Je-li potřeba větší rozlišení, může být skenovací rychlost snížena. Nevýhodou je pouze zvýšená doba potřebná k analýze. To je jeden z důvodů pro použití proměnlivé rychlosti nebo metod kontrolovaných vzorků (SCTA), které umožňují zvýšit rozlišení v časových blocích, které nejsou příliš rozsáhlé.



Atmosféra. Dusík je pravděpodobně nejpoužívanější proplachovací plyn pro všechny TGA analyzátory, ale pokud je vyžadována oxidační reakce nebo spálení vzorku, může být použit vzduch nebo kyslík. Z tohoto důvodu jsou užitečná pomocná příslušenství umožňující kontrolu toku plynu a automatické přepínání plynu. Může být také použito helium, obzvláště pokud je pro analýzu plynů použit hmotnostní spektrometr. Důvodem je



možnost záměny iontů dusíku o molekulové hmotnosti 28 s oxidem uhelnatým, který má stejnou molekulovou hmotnost, takže helium je dobrou alternativou. Helium také umožňuje lepší přenos tepla do a ze vzorku, což může mít za následek lepší rozlišení (v případě, že je přenos tepla rozhodujícím krokem) a také je výhodnější pro rychlejší ochlazování vzorku. Další plyny, jako je argon, nejsou neobvyklé. Rovněž může být použito redukční prostředí. Ve všech případech je třeba pracovat v rámci pokynů výrobce, zejména pokud se používají reaktivní nebo redukující plyny. 

Vzorkovací pánvičky. Pánvičky z platiny nebo oxidu hlinitého jsou normou pro TGA a za předpokladu, že jsou čisté, mohou být znovu použity. Čištění často jednoduše spočívá ve vypálení. Pokud i poté zůstanou na pánvičce zbytky, může být znovu použita za předpokladu, že v průběhu analýzy nedochází k úbytku hmotnosti a že zbylý materiál nijak neovlivňuje nově nanesený vzorek. V případě potřeby mohou být použity různé typy vložek do pánviček. Při použití autosamplerů se stále více využívají hliníkové pánvičky, protože mohou být uzavřeny a pak automaticky otevřeny těsně před použitím, což zabrání vysychání vzorku nebo jeho interakci s atmosférou před samotným měřením. Pánvičky s velmi malým otvorem (typicky 50 mikronů v průměru) mohou posloužit stejně dobře, i když všechna tato uspořádání také způsobují úbytek hmoty při vyšších teplotách. Otevřené hliníkové pánvičky jsou také užitečné, protože jsou levné a mohou být po použití zlikvidovány. Poznámka: hliníkové pánvičky nelze použít nad 600 °C.



Typ vzorku. Velké krystaly nebo kusy vzorku mohou způsobit vystřikování či jiné mechanické efekty, zatímco jemný prášek má tendenci vést k lepším údajům. Zjemnění vzorku nemusí být možné, protože mohou být vyvolány nechtěné změny, takže pokud je to možné, je lepší zvolit jemnější vzorek. Pokud je to nezbytné, zjemňujte vzorek opatrně teprve potom, co se ujistíte, že to neovlivní výsledné vlastnosti vzorku.



4.5.4. Interpretace TGA záznamu vzorku Nejobvyklejší křivka získaná z TGA zobrazuje křivku ztráty hmotnosti v procentech, méně často se používá křivka aktuální hmotnosti, ačkoli obě tyto možnosti jsou běžně dostupné. Navíc se často zobrazuje první derivace křivky, která je velmi užitečná pro interpretaci a umožňuje určení mezních hodnot a počet dějů, které nastaly. Obrázek 4.9 ukazuje typickou TGA křivku s výpočty v každém kroku pro síran měďnatý. Mezní hodnoty pro výpočty první derivace jsou užitečné při rozhodování, kdy děje začínají nebo končí, nebo jsou nejlépe odděleny. Obrázek 4.10 ukazuje rozklad šťavelanu vápenatého spolu s křivkou první derivace (DTG). Zatímco TGA umožňuje kvantitativní měření množství těkavých látek uvolněných během zahřívání, neidentifikuje je. Možnost spřažené emisní termoanalýzy (EGA) může být velmi užitečná. Nejčastěji se provádí pomocí TGA-FTIR nebo TGA-MS technik, viz obrázek 4.11, ve kterém jsou identifikovány plyny uvolňované ze šťavelanu vápenatého.

Obrázek 4.9 Rozčlenění TGA křivky pentahydrátu síranu měďnatého při 10 °C/min. Jednotlivé kroky odpovídají postupným eliminacím následujících molekul: 2 H2O, 2 H2O, 1 H2O, SO3, 0,5 O2. Zbytek je Cu2O. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Obrázek 4.10 Postupný rozklad monohydrátu šťavelanu vápenatého: hmotnost vzorku 19 mg, rychlost zahřívání 30 °C/min, dusík. TGA křivka byla normalizována (vydělena hmotností vzorku), a proto začíná na 100 %. Teplotní rozsah tří ztrát hmotnosti je obvykle jasný v normalizované první derivaci nebo DTG křivce. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



Obrázek 4.11 TGA-DTG-MS křivky termického rozkladu monohydrátu šťavelanu vápenatého měřeného při 30 °C/min v 70 L hliníkové pánvičce. Proplachovací plyn argon, 50 ml/min. Diagram ukazuje, že se monohydrát šťavelanu vápenatého rozkládá ve třech jednotlivých krocích. Fragmentované ionty MS křivek pro vodu (m/z 18), CO (m/z 28) a CO 2 (m/z 44) ukazují píky odpovídající jednotlivým krokům TGA křivky. První ztráta hmoty odpovídá eliminaci a odpaření krystalické vody (1); druhý krok odpovídá rozkladu bezvodého šťavelanu vápenatého za tvorby CO (2); a třetí krok odpovídá rozkladu uhličitanu vápenatého na oxid vápenatý a CO2 (3). Křivka iontu m/z 44 ukazuje, že se CO2 také tvoří ve druhém kroku při 550 °C (vedle CO). To je výsledek disproporcionační reakce CO na CO2 a uhlík. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.6. Dynamická mechanická analýza (DMA) Nedávný vývoj měřicích systémů, které umožnily jednoduché a účinné měření prášků, znamenal, že různé metodiky dynamické mechanické analýzy (DMA) mohou nyní významně přispět k vývoji a pochopení farmaceutických výrobků.

4.6.1. Definice dynamické mechanické analýzy Dynamická mechanická analýza je technika pro měření tuhosti nebo tvrdost materiálu spolu s aspekty viskosní povahy vzorku (McCrum et al. 1967). Tyto techniky jsou používány již mnoho let k měření vlastností termoplastů a kompozitů a nyní s příchodem měřicích systémů umožňujících analýzu prášků byly aplikace rozšířeny do farmaceutických laboratoří, kde mohou být prostudovány



fyzikální vlastnosti léčiv, zejména oblast skelného přechodu amorfních materiálů. To platí i pro roztoky a materiály, které jsou kapalné při pokojové teplotě, protože mohou být vloženy do vhodné nádoby a zmraženy v analyzátoru před samotným měřením.

4.6.2. Principy dynamické mechanické analýzy Pokud jsou různé materiály natažené nebo ohnuté konstantní silou, je zřejmé, že čím bude materiál měkčí, tím více se bude deformovat, a čím bude materiál tvrdší, tím méně bude deformován. To je základ DMA. V podstatě je materiál deformován známou silou a měří se rozsah deformace. Působící síla je popisována jako aplikovaná zátěž, kdy se bere do úvahy velikost a tvar vzorku, a výsledná deformace je popisována jako zátěž vztažená na velikost a tvar vzorku. Zátěž podělená deformací odpovídá tvrdosti vzorku, která se nazývá modul pružnosti materiálu. Youngův modul pružnosti a Hookův zákon by měly být známé pojmy. Hookův zákon říká, že deformace je úměrná zátěži, viz obrázek 4.12. Sklon křivky vypočtené jako podíl zátěže a deformace odpovídá modulu pružnosti. Tento přístup lze označit jako statický test, protože je k dispozici dostatek času k tomu, aby pružina dosáhla maximálního napnutí a setrvává v této pozici, zatímco je prováděno měření. V DMA však síla působí na vzorek sinusoidním způsobem. Tento přístup spočívá v měření frekvence, neboť se zvyšující se frekvencí má vzorek stále méně času na to, aby se deformoval. To znamená, že čím vyšší je frekvence, tím vyšší je ve většině případů změřený modul pružnosti. To je patrné zejména u viskosních materiálů, neboť čím viskosnější materiál, tím pomaleji reaguje na aplikované změny síly. V sinusoidním systému může být tato zpožděná odezva měřena, neboť se projevuje jako rozdíl fázového úhlu mezi aplikovanou zátěží a výslednou deformací. Tato odezva se nazývá fázový úhel a obvykle se značí symbolem delta (δ), viz obrázek 4.13.

Obrázek 4.12 Efekt zvyšující se zátěže na pružinu ilustrující Hookův zákon. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 94


Obrázek 4.13 Ve viskoelastickém materiálu existuje zpoždění mezi aplikovanou zátěží a výslednou deformací. Toto zpoždění je znázorněno jako fázový úhel delta (δ).

Prakticky všechny materiály jsou viskoelastické, což znamená, že mají viskosní a elastické vlastnosti. Modul pružnosti měřený DMA je celkový modul pružnosti obsahující aspekty obou těchto vlastností. Pokud je znám fázový úhel, může být modul pružnosti rozdělen na jednotlivé složky. Vzhledem k tomu, že fázový úhel je jedna z hodnot naměřených v DMA, jsou získány tři hlavní křivky: 

Paměťový modul pružnosti. Měří se tvrdost materiálu a křivka odpovídá odezvě vzorku ve fázi nebo-li elastické odezvě. Pokud je získán z měření ohybu vzorku, vyjadřuje se jako symbol E´ (primární E).



Ztrátový modul pružnosti. Měří se viskosní odezva materiálu. Křivka odpovídá odezvě vzorku mimo fázi, nebo-li zjednodušeně viskosní odezvě. Pokud je získán z měření ohyb vzorku, vyjadřuje se pomocí symbolu E´´ (sekundární E).



Tangens delta. Vyjadřuje poměr ztrátového modulu pružnosti k paměťovému modulu pružnosti, což je tangenta k fázovému úhlu. Jak je vzorek zahříván přes skelný přechod a jiné děje, Tangens delta (tan δ) nabývá maximálních hodnot a poskytuje tak snadno odlišitelný pík.

Obrázek 4.14 ukazuje vztah těchto křivek. Celkový modul pružnosti je získán z DMA analýzy a skládá se z paměťové a ztrátové složky. Klasický příklad DMA záznamu lze získat změřením kompozitního materiálu jako je epoxid. V těchto materiálech může být těžké najít skelný přechod pomocí DSC, ale při Tg se fyzikální vlastnosti mění enormně, což se odráží v DMA křivce. Příklad je uveden na obrázku 4.15, kde bylo zjištěno, že se paměťový modul pružnosti výrazně snížil na logaritmické stupnici a odpovídající píky se nacházejí v křivkách tan δ a ztrátového modulu pružnosti.



Obrázek 4.14 Ukázka toho, jak je měření celkového modulu pružnosti (který je výsledkem dynamického měření na DMA analyzátoru) rozděleno do ztrátové (viskosní nebo-li mimo fázové) a paměťové (elastické nebo-li fázové) složky. Tangenta fázového úhlu delta (tan δ) nabývá maximálních hodnot při mnoha přechodech a poskytuje tak snadno odlišitelný pík.

Obrázek 4.15 Typický příklad měření skelného přechodu. Je vidět, že se paměťový modul pružnosti výrazně snížil na logaritmické stupnici a odpovídající píky se nacházejí v křivkách tan δ a ztrátového modulu pružnosti. Pro skelné přechody je k dispozici řada různých výpočtů poskytujících různé hodnoty. Výsledky je proto nejlepší uvádět i s metodou výpočtu.

Analýza prášků v praxi spočívá ve vložení vzorku do příslušné nádobky, ve které je prášek stlačen ocelovým obalem (nebo podobným zařízením), viz obrázek 4.16. Nádobka je pak umístěna do měřícího systému, například do jednoduchého nosníku, kde je jeden konec pevný a druhý je ohýbán. Je aplikována deformační síla (zátěž) a je měřena výsledná amplituda (deformace).

Obrázek 4.16 Prášky mohou být vloženy do nádobky tak, jak je uvedeno. Uvedený příklad nádobky je v podstatě ocelový plášť. Ten je pak vložen do DMA pracující v kmitajícím režimu. Do nádobky mohou být také vloženy kapaliny a analýza je provedena po jejich zmražení. Nejvíce DMA analýz je prováděno při frekvenci 1 Hz, pro kterou lze vybírat z různých materiálů pro nádobky. Nicméně multifrekvenční skenování má navíc tu výhodu, že děj, jako je skelný přechod, Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 96


který je frekvenčně závislý, může být odlišen od dějů tání nebo rekrystalizace, které frekvenčně závislé nejsou. Na obrázku 4.17 je ukázán příklad, kde lze Tg sacharosy identifikovat z posunu teploty jako funkce frekvence.

Obrázek 4.17 Sacharosa v nádobce při frekvenci 1 Hz (první pík) a 10 Hz (druhý pík). Vliv frekvence na pík u 75 °C indikuje, že se jedná o skelný přechod. Vyšší teplotní přechody nejsou frekvenčně závislé, a proto se pravděpodobně jedná a rekrystalizaci amorfní povahy. (Courtesy of Paul Royall, 2011)

Pomocí DMA může být také zjišťován vliv vlhkosti na chování vzorku. To vyžaduje použití generátoru vlhkosti, který je připojen k DMA, a dále též použití vhodného propustného zapouzdření. Například sacharosa na obrázku 4.17 byla vystavena prostředím s různou vlhkostí od suchého až po prostředí s 50% relativní vlhkostí a byly pozorovány účinky na přechody. Bylo zjištěno, že s rostoucí vlhkostí klesají teploty Tg a rekrystalizace (obrázek 4.18).

Obrázek 4.18 Vliv vlhkosi na sacharosu. Zvýšení vlhkosti z A (suché prostředí) na C (50% relativní vlhkost) má vliv jak na Tg, tak na rekrystalizaci. (Courtesy of Paul Royall, 2011)

4.7. Zjištění chování pevných krystalických látek v průběhu tání Snad nejčastější parametr získaný z DSC experimentu je bod tání testované sloučeniny. Bod tání krystalické pevné látky je teplota, při které se změní skupenství z pevného na kapalné (pokud se



stanovuje teplota opačného přechodu, tj. ze skupenství kapalného do pevného, označuje se jako bod tuhnutí). Během tání je měřena změna standardní entalpie (skupenské teplo tání), což je množství tepelné energie, které musí být pohlceno nebo uvolněno jedním gramem látky, který přešel z pevného skupenství do kapalného nebo naopak. U většiny látek jsou body tání a tuhnutí stejné, například bod tání a bod tuhnutí rtuti je 234,32 K (-38,83 °C, -37,89 °F). Nicméně některé látky mají různé teploty přechodů, například agar taje při teplotě 85 °C (185 °F) a tuhne od 32 do 40 °C (89,6 až 104 °F). V praxi vykazuje většina látek při ochlazení v DSC podchlazení (superpodchlazení), což činí přesné měření teploty tuhnutí velmi obtížným. Z toho důvodu také neexistují žádné doporučené standardy pro kalibraci DSC analyzátorů během ochlazování. Z hlediska termodynamiky je změna Gibbsovy volné energie (G) při teplotě tání vzorku nulová, protože jak entalpie (H), tak entropie (S) vzorku se zvyšují (H, S > 0). Tání nastává, když je Gibbsova volná energie kapaliny menší než pevné látky.

4.7.1. Vyhodnocení přechodu bodu tání Před provedením jakéhokoliv DSC pokusu je užitečné provést odpovídající termogravimetrickou analýzu (TGA) s cílem určit přesný bod rozkladu. Překročení rozkladné teploty se v DSC nedoporučuje, protože to může vést k chybným výsledkům v důsledku četných exotermních a endotermních dějů spojených s přechodem. Také z praktického hlediska mohou vést možné kondenzace organických těkavých látek ze vzorku ke kontaminaci DSC přístroje, což ovlivní následnou analýzu. Vzhledem k charakteru měření při DSC experimentu bude vždy patrné rozšíření píku související s jakoukoli změnou fáze. Teoreticky by mělo tání čistého monokrystalu při nekonečně pomalé rychlosti skenování vést k píku, který je nekonečně úzký, ale k rozšíření píku dochází vlivem teplotních gradientů, které se vyskytují napříč vzorkem. Teplotní gradienty jsou způsobeny časem potřebným pro přenos energie vzorkem. Důsledkem toho je jediná přesná metoda měření bodu tání čistého krystalického materiálu ta, ve které se extrapoluje začátek růstu teploty při začátku tání. Teplota odpovídající hodnotě v maximu píku se bude lišit v závislosti na velikosti částic a hmotnosti vzorku a Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 98


neodpovídá skutečnému bodu tání. Pokud by se naopak začátek růstu teploty neměnil se změnami těchto zmíněných parametrů a ani se změnami v rychlosti ohřevu, kalibrace byla provedena správně. Pro určení začátku růstu teploty, je křivka extrapolována ze sklonu náběžné hrany píku na ose x. Bod, ve kterém křivka protíná osu x je označován jako extrapolovaný začátek růstu teploty (obr. 4.1).

4.7.2. Určení bodu tání pro identifikaci vzorků Stanovení bodu tání analyzované sloučeniny umožňuje tuto sloučeninu identifikovat (pokud jsou k dispozici vhodné referenční standardy) a lze ho také použít k rozlišení mezi různými formami (polymorfy) (Giron 1995), různými izomery (Briehl a Butenuth 1992) a různými solemi stejné sloučeniny. To je mimořádně důležité v počátečních fázích vývoje produktů, protože polymorfy a sole jedné sloučeniny mohou mít nejen různé body tání, ale také různé rychlosti rozpouštění, různé „zdánlivé“ rozpustnosti a v některých případech i různou biologickou dostupnost (Kobayashi et al. 2000). Poznamenejme, že termodynamicky stabilnější polymorf může mít vyšší bod tání, ale není to vždy pravda. Diferenční skenovací kalorimetrie se ideálně hodí pro stanovení bodů tání, protože umožňuje přímé měření nejen bodu tání, ale také skupenského tepla tání dané látky. Hodnoty entalpie jsou získávány z plochy píku tání, jak je znázorněno na obrázku 4.1. Další výhodou použití DSC je, že vyžaduje pouze malé množství materiálu (obvykle jen několik mg), což je výhodné především proto, že v počáteční fázi vývoje farmaceutického produktu je k dispozici pouze velmi malé množství vzorku. Poznamenejme, že pokud se používají pouze malá množství vzorku, pak jsou k měření hmotnosti vzorku potřeba velmi přesné váhy, které by měly mít šest desetinných míst (tj. mikrogramová úroveň). Pro každou čistou sloučeninu je bod tání termodynamicky pevný bod, takže může být použit pro identifikaci materiálu. Mnoho léčiv vykazuje polymorfismus (viz kapitola 4.6), kde každá krystalová struktura má jiný bod tání. Proto měření bodu tání pomocí DSC v zásadě dává analytikovi schopnost



rozlišovat mezi různými krystalovými formami. To představuje jednu z největších aplikačních oblastí pro termické analýzy ve farmaceutickém průmyslu, což je rozepsáno podrobněji v následující části.

4.8. Polymorfismus a termická analýza Polymorfismus je vlastnost pevného materiálu existovat ve více než jedné formě nebo struktuře krystalové mřížky. Polymorfismus může být potenciálně nalezen v každém krystalickém materiálu včetně polymerů a kovů a odpovídá alotropii, která vypovídá o struktuře pevných látek (například grafit a diamant jsou alotropy uhlíku). Spolu s polymorfismem je kompletní morfologie materiálu popsána dalšími proměnnými, jako je krystalové uspořádání, amorfní frakce nebo krystalografické vady. V zásadě všechny organické molekuly existují ve více než jedné odlišné krystalové formě (tj. polymorfu). Skutečnost je taková, že pro přibližně 70 % všech léků na trhu bylo prokázáno, že mohou existovat ve více než jednom odlišném uspořádání bezvodé krystalické mřížky nebo odlišné polymorfní formě (McCronův zákon říká, že každá látka má různé polymorfní formy a že obecně je počet známých forem dané sloučeniny přímo úměrný času a penězům poskytnutým na výzkum této látky). Ve skutečnosti moderní počítačové programy předpovídají možnost existence více krystalových forem pro většinu léčiv, z nich jsou ale většinou objeveny pouze některé. Dříve se pojem „polymorfní“ obecně používal k popisu krystalového uspořádání bezvodé formy krystalické látky, ale polymorfismus, jak byl definován na Mezinárodní konferenci o harmonizaci (ICH) Guideline Q6A, viz Eur. J. Pharmaceut. Sci. 6, suppl. 1 (August 1998): S18, nyní zahrnuje solvatační/hydratační produkty a amorfní formy. Když je z DSC získán profil tání polymorfního materiálu, je často zjištěno, že obsahuje řadu endotermních píků odpovídajících tání různých krystalových forem, případně jsou odděleny exotermními píky, jak roztátý materiál rekrystalizoval do stabilnější formy. Obrázky 4.22, 4.23b a 4.24 (popsané níže) jsou příklady tohoto typu chování. Někdy jsou teploty tání různých forem tak blízko sebe, že jsou vidět jen jako raménka a nebo mohou být pozorovány neobvyklé tvary píků, jak se Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 100


jednotlivé děje překrývají, a proto je vhodné použít různé rychlosti skenování, aby se zjistilo, co se děje. Výběr rychlosti skenování by měl vzít v úvahu požadované rozlišení, citlivost a kinetiku dějů. Více informací o těchto možnostech je uvedeno v kapitole 4.2.6. Měly by být také změřeny TGA analýzy pro potvrzení, zda nějaké endotermické píky odpovídají ztrátě hmotnosti a jsou tedy výsledkem ztráty hmoty.

4.8.1. Význam polymorfismu ve farmaceutických aplikacích Polymorfní formy léčivových substancí mohou mít různé chemické a fyzikální vlastnosti včetně bodu tání, chemické reaktivity, zdánlivé rozpustnosti, rychlosti rozpouštění, optických a mechanických vlastností, tlaku par a hustoty (Pirttimäki a Laine 1994; Bartolomei et al 1999; Spartakov et al. 2002). Tyto vlastnosti mohou mít přímý dopad na výrobu léčivové substance a léčivového přípravku, stejně jako na stabilitu léčivového produktu, rozpouštění, biologickou dostupnost (BA) a bioekvivalenci (BE). Polymorfismus tak může ovlivňovat kvalitu, bezpečnost a účinnost konečného složení léčivového přípravku, a proto musí být důsledně kontrolován a sledován ve všech fázích procesu vývoje léku. Když jsou léčivové látky vystaveny celé řadě výrobních procesů, jako je sušení, mletí, mikronizace, vlhká granulace, sušení rozprašováním a zhutnění, mohou v závislosti na vzájemné stabilitě mezi různými polymorfními formami procházet konverzní fází. Vzorky použité pro analýzu by proto neměly být drceny nebo mlety před analýzou, protože to může změnit vzorek. Vystavení podmínkám prostředí s různou vlhkostí a teplotou může také vyvolat polymorfní konverzi (např. vznik hydrátu nebo změnu fáze pevné látky). Rozsah konverze obecně závisí na relativní stabilitě polymorfů, kinetických bariérách fázové konverze a aplikovaném tlaku. Nicméně přeměnami fází se není nutno obecně vážně zabývat za předpokladu, že dojde k trvalé přeměně, která je součástí validovaného výrobního procesu, který je dobře popsán a kontrolován a kde byla prokázána BA/BE léčivového přípravku.



Nejvíce termodynamicky stabilní polymorfní formy léčivové látky jsou často vybrány během vývoje z důvodu minimální možné konverze na jinou polymorfní formu a z důvodu její větší chemické a fyzikální stability. Méně stabilní (metastabilní) forma může být vybrána z různých důvodů (včetně zvýšení biologické dostupnosti), nicméně je třeba poznamenat, že tato forma je nestabilní s ohledem na termodynamickou stabilitu a v závislosti na použitých podmínkách zpracování a skladování může nastat přeměna na termodynamicky nejstabilnější polymorfní formu. Aby se zabránilo jakémukoli nečekanému selhání v pozdní fázi výroby nebo při skladování kvůli polymorfní přeměně, je ve vývoji většinou použita stabilní forma, která je obecně považována za nejvhodnější formu. V kapalných a plynných stavech, se polymorfy stejné sloučeniny chovají stejně, protože historie krystalové mřížky byla zcela odstraněna.

4.8.2. Termodynamické a kinetické aspekty polymorfismu: enantiotropie a monotropie Pokud je zjištěn polymorfismus v kterékoli sloučenině vybrané pro vývoj farmaceutických produktů, je nezbytné získat přesné znalosti vztahů termodynamické stability mezi různými pevnými fázemi, aby byl plně pochopen proces krystalizace a specifická stabilita pevné formy dané látky. Při krystalizaci materiálu ze zvoleného rozpouštědla v závislosti na rozsahu přesycení a teplotních křivkách rozpustnosti jednotlivých polymorfů nebo pseudopolymorfů, jsou obvykle první nukleační krystaly kineticky preferovány nebo tvořeny metastabilně. Následně, jak je obnovena termodynamická rovnováha v důsledku změn v rozpustnosti produktu při krystalizaci vzorku (tj. roztok se stává méně nasycený nebo koncentrovaný), prochází pevný vzorek rozpouštědlem zprostředkovanou fázovou konverzí do více stabilního stavu. Nicméně, v závislosti na faktorech, jako je růst krystalů, teplota a rozpustnost, nemusí tato konverze nastat a metastabilní forma převáží v pevné fázi. V případě enantiotropie se stabilní formy liší teplotou reverzibilní rovnováhy a za použitých podmínek dojde ke konverzi na konkrétní formu. Termín monotropie se používá v případě nevratného přechodu z jedné formy na druhou. Známý vztah mezi termodynamickými veličinami H (entalpie), G (volná energie), S (entropie) a T (teplota), lze často jednoduše použít pro reprezentaci



rovnovážných stavů vynesením volné energie G jako funkce teploty pro každou formu. Pokud se obě křivky protínají před bodem tání, jedná se o reverzibilitu, tj. enantiotropii, a pokud je tomu naopak, jedná se o monotropii (obrázek 4.19).

Obrázek 4.19 Vztah mezi Gibbsovou energií (G) a teplotou pro dvě modifikace v případě enantiotropické (reverzibilní) a monotropické (ireverzibilní) přeměny mezi formami. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

V případě monotropie je vždy forma s vyšším bodem tání termodynamicky stabilnější formou. V případě enantiotropie má forma s nižším bodem tání vyšší skupenské teplo v porovnání s formou s vyšším bodem tání a je termodynamicky stabilnější formou při teplotách pod bodem přechodu (forma s vyšším bodem tání je termodynamicky stabilnější formou při teplotách nad bodem přechodu). Vztah mezi entalpií tání dvou pevných fází A a B, HfA a HfB a skupenským teplem přechodu, Ht, je: Ht = HfA – HfB .

(4.1)

Bod přechodu může být měřen termickou analýzou, měřením rozpustnosti nebo kombinací měření rozpustností a entalpií tání. Forma, která je termodynamicky stabilní při teplotě a tlaku měření je ta, která má nejnižší volnou energii a zdánlivou rozpustnost. Pro každou modifikaci platí následující rovnice: log C = (–Hdiss + K) / (RT) kde C je rozpustnost, R je univerzální plynová konstanta, T je teplota, Hdiss je rozpouštěcí teplo (teplo rozpouštění) pro dané rozpouštědlo a K je konstanta. V případě enantiotropie mají obě formy



stejnou rozpustnost v bodě přeměny. Z měření DSC může být získán bod tání, entalpie tání a většinou i bod přeměny. Vztahy mezi polymorfy lze nejlépe ukázat na grafech termodynamických veličin H (entalpie) a G (volná energie). Obrázky 4.20 a 4.21 ukazují tyto grafy a DSC křivky, které lze získat analýzou monotropních nebo enantiotropních látek ve stabilním nebo metastabilním stavu. Tabulka 4.1 je přehledem termodynamických pravidel stanovených Burgerem a Ramburgerem (1979) pro snadné odlišení mezi monotropními a enantiotropními přechody.

Obrázek 4.20 Energetické diagramy znázorňující H (entalpii tání) a G (volnou energii) pro monotropní polymorfismus a odpovídající DSC křivky: TAf je teplota tání A; TBf je teplota tání B. DSC skeny: A) forma A s vyšším termodynamickým bodem tání taje; B) forma s nižší teplotou tání podstupuje exotermický přechod na A; C) B taje a A krystalizuje z taveniny, pak A taje. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Obrázek 4.21 Energetické diagramy znázorňující H (entalpii tání) a G (volnou energii) pro enantiotropní polymorfismus a odpovídající DSC křivky: T0 je teplota přechodu A na B; TAf je teplota tání A; TBf je teplota tání B. DSC skeny: A) endotermní přechod pevné látky na B, pak A nebo B taje a eventuálně B krystalizuje z taveniny; B) záznam je naměřen při pokojové teplotě, při které nastává spontánní exotermní přechod na A nebo tání B. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



Tabulka Termodynamická pravidla pro polymorfní přechody (Burger and Ramburger 1979). I je forma s vyšší teplotou tání. V některých případech bylo prokázáno, že tato pravidla neplatí, proto je není možné brát jako všeobecně platná pravidla. Enantiotropie

Monotropie

teplota přechodu < teplota tání I

teplota přechodu > teplota tání I

I je stabilní nad teplotou přechodu

I je vždy stabilní

II je stabilní pod teplotou přechodu přechod je reverzibilní

přechod je ireverzibilní

pod teplotou přechodu je rozpustnost I větší než rozpustnost II

rozpustnost I je vždy menší než II

nad teplotou přechodu je rozpustnost I menší než rozpustnost II přechod II  I je endotermní

přechod II  I je endotermní

HfI < HfII

HfI > HfII

hustota I < hustota II

hustota I > hustota II

4.8.3. Charakterizace polymorfů pomocí diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) Existuje celá řada metod, které mohou být použity pro charakterizaci polymorfů léčivové látky. Prokázání neekvivalentní struktury pomocí rentgenové difrakce jednoho krystalu (Cox a Wardell 2000) je v současnosti považováno za jednoznačný důkaz polymorfismu. Pro potvrzení existence polymorfů může být také použita X-ray prášková difrakce. Kromě toho jsou ale dále vyžadovány údaje získané z řady dalších doplňkových metod včetně mikroskopie za zvýšené teploty, spektroskopie, například infračervené (IR), Ramanovy (Pratiwi et al. 2002), nukleární magnetické rezonance v pevné fázi (ssNMR) (Vickery et al. 2002) a metod termické analýzy, především DSC. V literatuře existuje mnoho příkladů studií s použitím DSC jako metody pro predikci přítomnosti polymorfních sloučenin (Bottom 1999). Nedávným příkladem je karbamazepin, léčivo používané Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 105


k léčbě epilepsie. Pomocí DSC bylo úspěšně prokázáno, že existují tři odlišné polymorfy karbamazepinu. Toto zjištění bylo podpořeno výsledky experimentů z FT-IR a práškové rentgenové difrakce (XRPD) (Rustichelli et al. 2000). Nicméně, i když se DSC osvědčilo při zjišťování přítomnosti několika polymorfů měřením rozdílů v bodech tání, není vždy možné charakterizovat formy sloučeniny mající nižší bod tání (metastabilní látky). To proto, že materiál během tání často spontánně rekrystalizuje do více stabilních forem. Výsledkem tohoto děje je konkurenční exotermní odezva během endotermního tání (příklad je uveden na obrázku 4.22). Při rychlostech zahřívání používaných v běžných DSC experimentech (obvykle kolem 10 °C/min) forma karbamazepinu III taje a rekrystalizuje současně, takže píky nejsou odděleny. V tomto případě nelze přesně změřit skupenské teplo a ani rekrystalizační teplo. Tento děj pokračuje táním nové stabilnější formy. Je třeba poznamenat, že tato stabilnější forma nemusí být nutně termodynamicky stabilní formou materiálu. Jsou také metody využívající isotermickou kalorimetrii, která tyto informace poskytuje (Sturtevant 1987; Chowdrhy a Cole 1989; Wiseman et al. 1989; Noble 1995).

Obrázek 4.22 Typické polymorfní chování, jak je patrné z DSC. Počáteční krystalová forma taje při zahřívání (asi 175 °C) a poskytuje počáteční endotermu a rekrystalizuje do druhé formy, která poskytuje exotermu. Tato forma pak taje při vyšší teplotě. Je pravděpodobné, že píky tání původní formy a následné krystalizace nejsou zcela odděleny, takže v tomto případě nejsou možná měření energie těchto dějů. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Skutečnost, že jsou na obr. 4.22 pozorovány dva píky oddělené exotermou, je užitečná informace a křivky mohou být snadno interpretovány. Až příliš často se stává, že separace píku, jenž přísluší tání, není tak velká a je pozorován pouze jeden pík s raménkem indukující, že dochází k více než jednomu ději tání. Příkladem je pík odpovídající tání při vyšší teplotě v obrázku 4.22. Další příklad je uveden na obrázku 4.23a, kde může být pozorován velmi malý pík na konci hlavního píku odpovídajícího tání. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 106


Chcete-li zjistit další informace o tom, co se děje, je vhodné měnit rychlost skenování. Na obrázku 4.23b je stejný vzorek analyzován při rychlosti skenování snížené z 10 °C/min na 3 °C/min. Děje jsou nyní zřetelnější, protože je vidět, že jedna forma přechází na druhou formu. Přítomnost exotermy je jasným důkazem rekrystalizace. Další snižování rychlosti skenování může být také užitečné, často se používají různé rychlosti skenování k snadnější interpretaci probíhajících dějů.

Obrázek 4.23a V tomto příkladu se profil tání nevrací úplně na základní linii, což svědčí o možnosti přechodu v oblasti nad 110 °C. Tento předpoklad může být potvrzen snížením rychlosti skenování. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Obrázek 4.23b Při snížené rychlosti skenování může být pozorováno oddělení dějů. Počáteční forma taje a rekrystalizuje a výsledná forma taje při trochu vyšší teplotě. Rozlišit tyto děje může být často výzvou. Pomalejší rychlosti ohřívání a zmenšení hmotnosti vzorku pomáhají zlepšit rozlišení. V některých případech mohou vyšší rychlosti zahřívání úplně zamezit rekrystalizaci, což umožňuje změřit skupenské teplo počátečního tání (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Neobvyklé tvary píků mohou být také způsobeny špatným provedením analýzy. Například jestliže vzorek změní objem během tání, změny v teplotním kontaktu mohou vyvolat změnu tvaru píku. Z tohoto důvodu je obecně užitečné zkoumat jev tání na relativně malých vzorcích, typicky kolem 3



mg, které byly dobře komprimované v pánvičce, aby umožňovaly dobrý tepelný kontakt. Existuje-li pochybnost o naměřené křivce, je nejlepší měření zopakovat.

4.8.4. Zjišťování polymorfní čistoty pomocí diferenční skenovací kalorimetrie Rekrystalizační chování pozorované při relativně nízkých rychlost skenování má vliv na schopnost charakterizovat materiál umístěný v pánvičce, protože pozorované změny v materiálu ovlivňují měření. Konkrétně, polymorfní čistotu daného vzorku není možné určit ze skupenské entalpie metastabilního stavu a ani z měření píků odpovídajících tání při vyšší teplotě, protože se mohou, ale nemusí, tvořit během skenování. Pokud se vrátíme k příkladu karbamazepinu popsaného na obrázku 4.22, kvantifikace skupenské entalpie čisté formy III nebyla možná z důvodu současné rekrystalizace této formy z kapaliny tající na více termodynamicky stabilní formu I (při pomalé rychlosti skenování (5–10 °C/min)). Až donedávna nebylo pro tuto metastabilní formu stanoveno správné skupenské teplo. Tento typ měření však může být proveden s použitím velmi velkých rychlostí skenování (až 750 °C/min), které jsou u některých zařízení dostupné (Gabbott et al. 2003). Při vyšších rychlostech skenování nemá vzorek potřebný čas k rekrystalizaci na formu tající při vyšší teplotě, a proto mohou být provedena kvantitativní měření skupenské entalpie pro formu tající při nižší teplotě. Vysokorychlostní DSC metody (Hyper™) byly použity ke studiu karbamazepinu a bylo ukázáno, že při zvýšení rychlosti skenování byla rekrystalizace na formu I (termodynamicky stabilní stav) inhibována (McGregor et al. 2004). Obrázek 4.24 ukazuje, že i při 250 °C/min vzorek stále rekrystalizuje a tvoří formu s vyšší teplotou tání, zatímco obrázek 4.25 ukazuje, že při rychlosti skenování 500 °C/min je tento rekrystalizační přechod úplně potlačen (pro přehlednost je ukázána endoterma tání pro metastabilní formu).



Obrázek 4.24 Efekt zvýšené rychlosti skenování z 20 °C/min na 250 °C/min na tání karbamazepinu III. Při zvýšené rychlosti skenování je méně času na rekrystalizaci a pík počátečního tání se zvyšuje a pík koncového tání se proporčně zmenšuje. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Obrázek 4.25 Pouze při vysoké rychlosti skenování 500 °C/min je počáteční profil tání karbamazepinu bez následných dějů tání, což indikuje, že rekrystalizace byla plně potlačena. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Při inhibici rekrystalizace formy III na formu I bylo ukázáno, že je možné vypočítat skupenskou entalpii přímo z kalorimetrických dat. Naměřená hodnota 109,5 J/g by mohla být určena pouze z normálních DSC experimentů. Je třeba však poznamenat, že použitím podmínek rychlého skenování není možné v některých případech přechodu předejít (kvůli rychlé kinetice krystalizačních přechodů). Přesná kvantifikace je důležitá, pokud v léčivových materiálech existují polymorfní nečistoty jako samostatné krystalické fáze ve stopových množstvích. Znečištění léčivového materiálu jeho možnou metastabilní polymorfní formou, která se může objevit při nekontrolované precipitaci nebo neoptimalizované krystalizaci, zjemňování/mletí nebo jakékoliv jiné formě mechanických úprav, je vážný problém, protože přítomnost takové polymorfní nečistoty by mohla ohrozit i stabilitu a účinnost konečných produktů. S cílem omezit tyto nežádoucí pevné nečistoty ve farmaceutických materiálech se stala důležitým tématem přesná kvantifikace stopových množství těchto nečistot existujících jako samostatné krystalické fáze. Nejpoužívanější metody pro charakterizaci pevné fáze, jako je rentgenové práškové difrakce (pXRD), infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) a spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR), ale nejsou obvykle dostatečně citlivé pro Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 109


detekci relativně nízkých koncentrací (< 5 %) polymorfních nečistot. Měření polymorfní čistoty pomocí DSC použitím pomalé rychlosti skenování také není bez problémů, viz výše. McGregor a kol. (2004) použili DSC s vysokou rychlostí skenování pro stanovení polymorfní čistoty směsných systémů, které obsahovaly množství metastabilních forem, o kterých je známo, že podstupují současně tání i rekrystalizaci při malých rychlostech skenování, typicky 10 °C/min. Směsi obsahující známé poměry forem karbamazepinu I a III (0-100 % w/w) byly analyzovány s rychlostí skenování 250 °C/min a pro každou směs byly vypočítány entalpie endoterm tání. Obrázek 4.26 ukazuje typický teplotní profil získaný ze směsi obsahující 40 % a 60 % w/w) formy III. Zřetelně jsou detekovány endotermické přechody tání obou forem I a III a bylo dosaženo úplného rozlišení mezi dvěma přechody. U směsí, které obsahují i jen 1 % (w/w) formy III, byla také zjištěna endoterma tání. Když byl stejný vzorek analyzován při rychlosti skenování 10 °C/min, nebyla tato endoterma tání detekována, což ukazuje na užitečnost vysokorychlostního DSC pro detekci malých množství polymorfních nečistot, které by jinak nemohly být zjištěny.

Obrázek 4.26 DSC křivky směsí forem I a III karbamazepinu skenované při 250 °C/min. Tání malého množství krystalické látky může být obtížně detekováno při nízkých rychlostech, ale je snadné ho najít při vyšších rychlostech skenování, při kterých mohou být změřena i 1% množství. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Graf naměřené entalpie endotermního přechodu v závislosti na procentuálním obsahu formy III ve směsi je na obrázku 4.27. Pro srovnání je zahrnuta teoretická entalpie endotermního přechodu na procentuálním obsahu formy III. Teoretické entalpie byly vypočteny z entalpie endotermního přechodu čisté formy III a z množství formy III ve směsi.



Obrázek 4.27 Změřené entalpie tání karbamazepinové formy III jsou porovnány s teoretickými hodnotami pro různé složení směsi. Změřené hodnoty jsou výrazně nižší než očekávané, což vede k domněnce, že probíhají interakce mezi polymorfy. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Pro naměřené entalpie endotermního tání pro formu III ve směsi dvou krystalových forem bylo zjištěno, že jsou výrazně nižší oproti vypočteným hodnotám v celém rozsahu od 1 do 99 % (w/w) pro formu III. Bylo již ukázáno, že při rychlosti ohřevu 250 °C/min je nezbytná úplná inhibice rekrystalizace formy I při tání formy III. Nicméně bylo předpokládáno, že přítomnost formy I ve směsi před analýzou má za následek krystalizaci formy I a částečnou rekrystalizaci formy III, která při tání tvoří formu I. To potvrzují i naměřené entalpie endoterm tání pro formu I. Jak je ukázáno na obrázku 4.28, rekrystalizace formy s nižší teplotou tání vedla k relativnímu zvýšení entalpie endotermického přechodu pro formu I vzhledem k teoretickým hodnotám. Například entalpie při 99 % (w/w) byla 162,5 J/g v porovnání s vypočtenou hodnotou 107,7 J/g. Entalpie endotermního přechodu pro čistou formu I měřená při rychlosti ohřevu 250 °C/min byla, jak se očekávalo, srovnatelná s měřením při 10 °C/min. Teoretické entalpie byly vypočteny z této hodnoty a množství formy I ve směsi.

Obrázek 4.28 Změřené entalpie tání karbamazepinu formy I jsou porovnány s teoretickými hodnotami. Naměřené hodnoty jsou vyšší než očekávané a korelují s nižšími hodnotami zjištěnými pro formu III na bázi interakcí mezi krystalovými formami, viz obrázek 4.27. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell) Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 111


Když byly různé polymorfy fyzicky separovány v pánvičce tak, aby spolu nemohly vzájemně interagovat, byly získány údaje uvedené na obrázku 4.29, který srovnává naměřenou a teoretickou entalpii pro endotermní přechod jako funkci obsahu formy III.

Obrázek 4.29 Změřené entalpie tání karbamazepinu formy III jsou porovnány s teoretickými hodnotami pro směs karbamazepinu formy III a karbamazepinu formy I. V tomto experimentu byly jednotlivé polymorfy fyzicky separovány tak, aby spolu nemohly vzájemně interagovat. Fakt, že naměřené a teoretické hodnoty jsou totožné (po zmíněné separaci), indikuje, že dochází k interakci, když jsou látky ve vzájemném kontaktu. To bylo potvrzeno předchozími experimenty. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Z obrázku 4.29 lze vidět, že zde nejsou významné rozdíly mezi změřenou entalpií endoterm tání a vypočtenými teoretickými hodnotami, což indikuje, že nedochází k interakci a ani k částečné krystalizaci formy I při tání formy III. Tyto výsledky ukazují, že pomocí DSC s rychlostí zahřívání 500 °C/min je rekrystalizace formy III karbamazepinu inhibována, a proto je pro tento polymorf pozorována jedna endoterma tání, což umožňuje určení termodynamických parametrů, jako je skupenská entalpie metastabilního endotermního tání. Endoterma tání související s formou III byla zjištěna dokonce i při 1 % (w/w), a proto je třeba při kvantifikaci směsí pracovat pečlivě, protože interakce mezi formami mohou ovlivnit výsledky.



4.8.5. Interpretace naměřených DSC termogramů vzorků vykazujících polymorfismus Tato část stručně pojednává o některých typech DSC křivek, které lze získat při zkoumání polymorfních tendencí složek léčiv a také vysvětluje některá omezení při používání DSC ke studiu polymorfního chování. Při měření je důležité se přesvědčit, že nedochází ke ztrátě hmoty v měřícím rozsahu teplot přechodu, což lze zjistit z příslušné TGA křivky, a tak zajistit, že odezva není kvůli desolvataci/dehydrataci, ale kvůli tání metastabilního polymorfu. Z tohoto důvodu by měly být rutinně prováděny TGA skeny látek. Ty také indikují teplotu rozkladu látek a horní teplotní mez DSC měření by měla být nastavena pod tuto hodnotu, aby se zabránilo kontaminaci.

4.8.5.1. Křivky typu 1: Přechod pevná látka-pevná látka Obrázek 4.30 ukazuje DSC křivku vzorku podstupující nízkoteplotní, endotermický přechod pevná látka-pevná látka (při asi 25 °C).

Obrázek 4.30 DSC křivka vzorku podstupujícího endotermický přechod pevná látka-pevná látka při asi 25 °C. Na TGA křivce by neměla být odpovídající ztráta hmoty a děj by měl být reverzibilní. Pro transformaci pevná látka-pevná látka je tento přechod exotermní pro monotropii a endotermní pro enantiotropii. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Z DSC křivky ukázané na obrázku 4.30 je vidět, že nízkoteplotní přechod pevná látka-pevná látka nastává před hlavní endotermou odpovídající formě tání. Tento přechod může být odlišen od Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 113


nízkoteplotního desolvatačního procesu, protože pomocí TGA není detekována ztráta hmoty a přechod je reverzibilní (tj. při ochlazování bude také detekován opačný přechod). Buergerova Rambergerova pravidla naznačují, že pro transformace pevná látka-pevná látka je tento přechod exotermní pro monotropii a endotermní pro enantiotropii. Prakticky to závisí na rozsahu entropie a entalpie příslušného polymorfu při teplotě, při které je pozorován přechod.

4.8.5.2. Křivky typu 2: Rekrystalizace kapalina-tavenina Tento typ se týká materiálů, jako je již zmíněný karbamazepin, které při tání rekrystalizují do stabilnější formy, která pak taje při vyšší teplotě. Toto klasické polymorfní chování bylo pozorováno pomocí DSC, viz obrázek 4.21. Takový DSC sken může odpovídat jak monotropii, tak enantiotropii, přičemž vzorek je buď v čisté formě, nebo ve směsi. Rychlé skenování může kineticky skrýt tuto transformaci a lze tak získat podrobné informace o aktuálním složení vzorku. Experimenty by měly být prováděny na známé, čisté, nízkotající látce, aby se zjistilo, zda je tato inhibice rekrystalizace možná při rychlém zahřívání.

4.8.5.3. Křivky typu 3: Zjišťování bodu tání Každá krystalická modifikace má pík tání a není vidět konverze mezi jednotlivými formami. V souvislosti s termodynamickou stabilitou při pokojové teplotě nemůže být učiněn žádný závěr, výpočtem skupenské entalpie každého přechodu však lze získat informace týkající se čistoty vzorků obsahujících směs forem a lze tak spočítat vlastnosti čistých složek.



4.9. Solváty a hydráty (pseudopolymorfismus) a termická analýza V roce 1965 Walter C. McCrone představil pojem „pseudopolymorfismus“ (McCrone 1965). Podle jeho definice, pseudopolymorfní účinky zahrnovaly desolvataci/dehydrataci produktů, přechody druhého řádu a dynamický izomerismus, ale dnes je termín obecně omezen na všechny jevy spojené se solvatací a hydratací. Jakákoli látka používaná ve farmaceutickém průmyslu má schopnost tvořit tzv. krystalické hydráty nebo solváty. V těchto strukturách nejsou těkavé látky (buď voda, nebo rozpouštědlo) jen fyzicky sorbovány na rozhraní pevná látka-vzduch, ale jsou také začleněny do struktury krystalové mřížky (chemisorbovány) jako hostující molekuly, a to buď ve stechiometrických, nebo nestechiometrických množstvích. Zjišťování solvatačních stavů pro farmaceutický vývoj je třeba věnovat pečlivou pozornost, protože přítomná krystalická rozpouštědla jsou klasifikována jako nečistota ve vzorku a denní dávky tohoto specifického rozpouštědla by neměly překročit limity, jež jsou stanoveny v pokynech FDA (ICH Topic Q 3C (R3) Nečistoty: zbytková rozpouštědla).

4.9.1. Faktory ovlivňující experimentální DSC křivky hydrátů a solvátů Je důležité zvolit správný typ DSC pánvičky. Všimněte si, že je to ztráta těkavých látek (ztráta hmotnosti) z pánvičky, která vede ke vzniku velkého endotermního píku pozorovaného při zahřívání rozpouštědel v otevřené pánvičce, což odráží skutečnost, že odpařování materiálu vyžaduje značné energetické vstupy. Proto při zkoumání pseudopolymorfního chování pomocí DSC je třeba si uvědomit, že volba pánvičky může výrazně ovlivnit získanou křivku. S hermeticky uzavřenými pánvičkami je vzorek uzavřen v systému tak, aby těkavé látky nemohly uniknout a zůstaly v horním prostoru pánvičky i po odstranění vzorku. V tomto typu pánvičky může být pozorován pík tání rozpouštědla, ale ne ztráta těkavých látek. Pokud je vytvořena malá dírka v krytu pánvičky nebo pokud je použita zvlněná nebo otevřená pánvička, pak mohou těkavé látky uniknout, ale tvar DSC křivky a vývoj teploty bude záviset na rychlosti úniku těkavých látek, která závisí na rozsahu zvlnění nebo velikosti otvoru vytvořeného Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 115


v krytu pánvičky spolu s experimentálními podmínkami, jako je rychlost ohřevu a velikost vzorku. Výsledkem je, že získané údaje nemusí být dobře reprodukovatelné. V některých případech může docházet jak k tání rozpouštědla, tak k desolvataci v pevném skupenství, což vede ke dvěma endotermním píkům. Obrázek 4.31 ukazuje vliv typu pánvičky na analýzu síranu měďnatého. Pokud je použita otevřená nebo zvlněná pánvička, aby mohly těkavé látky snadno uniknout, jsou pozorovány dva široké, špatně rozlišitelné píky, protože se voda snadno uvolní ze vzorku a unikne z pánvičky. Použití zvlněné pánvičky může způsobit různé výsledky, protože se rozsah zvlnění může lišit pro každou pánvičku, což ovlivňuje rychlost ztráty těkavých látek. Pokud je ale spolu s pánvičkou použit kryt s otvorem 50 m, jsou pozorovány série ostřejších, reprodukovatelnějších a lépe rozlišených píků trochu posunutých k vyšší teplotě. V tomto případě se voda neztratila z pánvičky, dokud nedosáhla potřebný tlak k tomu, aby unikla skrz velmi malou dírku ve víčku. V případě čistého rozpouštědla toto nastane, když parciální tlak par přesáhne atmosférický tlak, což je definice bodu varu, takže tento přístup umožňuje stanovit bod varu kapalin. Je-li vzorek hermeticky uzavřen v pánvičce (uzavřený systém), nemůže být rozpouštědlo odstraněno a jsou pozorovány pouze fázové změny.

Obrázek 4.31 Vliv typu pánvičky na DSC křivky síranu měďnatého. Spodní křivka ukazuje typický záznam ze zvlněné pánvičky, odkud mohou těkavé látky snadno uniknout. Horní křivka ukazuje pánvičku s pouze 50 m otvorem, kterým mohou těkavé látky uniknout. To poskytuje podrobnější a reprodukovatelnější informace než z otevřené nebo zvlněné pánvičky. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Když je použita uzavřená pánvička, je třeba se ujistit, že je schopna odolávat vnitřnímu generovanému tlaku, a postarat se o to, aby byla správně uzavřena. Pokud pánvička nevydrží vznikající tlak, může se protrhnout a může způsobit vážné znečištění přístroje. Také si všimněte, že



přítomnost rozpouštědla nebo vody jako páry kolem krystalu v atmosféře pánvičky může umožnit vznik metastabilních forem bez rozpouštědla (v důsledku difúze par rozpouštědla do pevné fáze a výsledné rozpouštědlem indukované transformace pevná látka-pevná látka) a také amorfního stavu. Při provádění pokusů na DSC solvatovaných/hydratovaných sloučeninách se může termogram DSC často stát poměrně složitým kvůli mnoha dějům, které mohou probíhat. K interpretaci je nezbytné provést odpovídající TGA experiment tak, aby byl potvrzen teplotní rozsah ztráty těkavých látek. Důležité může být také zvýšení průtoku plynu, aby se odstranily těkavé látky ze systému. Velké množství uniklých těkavých látek může změnit atmosféru obklopující vzorek nebo pec a způsobit artefakty v důsledku změny tepelné vodivosti.

4.9.2. Typy desolvatace/dehydratace v termické analýze Tato část stručně pojednává o některých typech DSC křivek, které mohou být získány při zkoumání solvátů a hydrátů a také vysvětluje některé z faktorů, které mohou být zodpovědné za mylné interpretace dat.

4.9.2.1. Křivky typu 1: Dehydratace/desolvatace bez rekrystalizace Experimentální DSC křivky typu 1 jsou běžné ve vzorcích, které buď existují jako kanálková hydrátová/solvátová struktura (tj. těkavé látky jsou zkondenzovány v kapilárách nebo kanálcích uvnitř struktury) nebo ve vzorcích, u kterých dochází k dehydrataci/desolvataci za vzniku desolvatované/dehydratované mřížkové struktury a které zůstávají termodynamicky stabilní (nedochází ke spontánní rekrystalizaci na termodynamicky výhodnější bezvodé mřížkové uspořádání). Obrázek 4.32 ukazuje typickou DSC křivku získanou pro hydratovanou sloučeninu vykazující tento druh chování.



Obrázek 4.32 V tomto příkladu je první pík při 150 °C důsledkem ztráty těkavých látek (hydrátu) a pík při vyšší teplotě odpovídá tání krystalové struktury. Tento výsledek je potvrzen TGA, viz obrázek 4.33. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

V DSC křivce znázorněné na obrázku 4.32 odpovídá první endotermický pík termické desorpci molekul vody, které tvoří krystalickou hydratovanou formu. Na odpovídající TGA křivce uvedené na obrázku 4.33 je vidět profil ztráty hmoty zaznamenaný během tohoto rozsahu teplot, který odpovídá desorpci těkavých látek ze vzorku a následného odpaření z pánvičky. Poloha a energie tohoto endotermického píku závisí na fázovém diagramu dvou složek, léčivové látky a přítomného rozpouštědla, jakož i na stabilitě vytvořené směsi. Z tohoto důvodu mohou různé hydráty nebo solváty stejné sloučeniny nebo sérií sloučenin ztratit přítomné těkavé látky při různých teplotách. Obecně, pokud je vzorek pouze mokrý (vlhký), pak je získána široká endoterma typicky kolem 60 °C až 70 °C, která se stává ostřejší a je posunuta k vyšším teplotám, pokud je ztráta těkavých látek omezena v důsledku navázání na vzorek.

Obrázek 4.33 Překryv DSC dat obrázku 4.32 s TGA daty. Ztráta hydrátu je jasně identifikována. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



4.9.2.2. Křivky typu 2: Dehydratace/desolvatace provázená rekrystalizací U mnoha hydrátů a solvátů je hostující molekula začleněna do buněčné jednotky mřížkového uspořádání a má stabilizační účinek na krystalickou strukturu. Během tání nebo krátce po tání hydratovaného/solvatovaného stavu pak dochází k dehydratačnímu nebo desolvatačnímu procesu (obrázek 4.34). V takových případech nejprve hydrát/solvát taje a rozpouštědlo je eliminováno z kapalné fáze. Následný exotermický přechod nastává v důsledku krystalizace bezrozpouštědlové formy z taveniny do stabilnějšího bezvodého uspořádání. V tomto případě se překrývá tání rozpouštědla a desolvatace pevné fáze a následný vyšší endotermický přechod je výsledkem tání bezvodé formy. Je také možné, že je molekula vypuzena z krystalové struktury, a tak ji destabilizuje. Výsledná destabilizovaná struktura je pak náchylná k přeuspořádání ve velmi rychlém procesu, viz obrázek 4.35.

Obrázek 4.34 DSC a TG skeny látky, ve kterých se překrývají dehydratační děj a tání a bezvodá forma ihned krystalizuje z taveniny. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Obrázek 4.35 Příklad dehydratace bez tání vedoucí k následné extrémně rychlé rekrystalizaci pevného stavu. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



4.10.

Spřažená emisní termogravimetrická analýza (EGA) a simultánní měření

Během standardního TGA experimentu je hmotnost vzorku zaznamenávána jako funkce teploty nebo času za definovaných atmosférických podmínek a může být porovnána s výsledky získanými pro odpovídající DSC experiment. To umožňuje provádět kvantitativní analýzy složení za předpokladu, že uvolněné látky, které jsou tepelně desorbovány ze vzorku, jsou známy před analýzou. Vzhledem k tomu, že TGA je kvantitativní technika a ne kvalitativní technika, nemůže být použita k identifikaci neznámých těkavých látek. Emisní termoanalýza (EGA) je metoda, která dává kvalitativní informace, což umožňuje identifikovat produkované těkavé látky. To je často významné, protože mnohokrát uživatel předpokládá, že se může uvolňovat vlhkost nebo jiné očekávané těkavé látky, ale v praxi je to jen předpoklad nebo odhad. Jindy to může pomoci identifikovat simultánní reakce (Sorrenti et al. 1998; Fang et al. 2006). Příklad připojení TGA k vyhřívané lince určené pro připojení k hmotnostnímu spektrometru je uveden na obrázku 4.36.

Obrázek 4.36 TG-MS termostatované spojení. Hmotnostní spektrometr čerpá těkavé látky ze vzorku přes malou vyhřívanou kapiláru umístěnou vedle TGA pece. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Pro EGA lze použít dva různé přístupy. V nejpopulárnějším přístupu jsou dvě analytické metody spojeny za vzniku hybridního přístroje a látky jsou zkoumány v reálném čase. Příkladem jsou TG-FTIR nebo TG-MS analýzy, ve kterých lze těkavé produkty, které se uvolňují během zahřívání, sledovat současně druhým analyzátorem. Druhý (méně používaný) přístup je kombinovaná analytická technika, kde jsou těkavé látky absorbovány na vhodné médium (typicky chromatografickou Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 120


trubičku) a pak desorbovány na příslušný analyzátor, čímž vzniká technika TGGC-FTIR nebo podobná. GC krok může být vybrán, aby byl selektivní, a lze se tak zaměřit na konkrétní analýzu. Výběr systému pro emisní termoanalýzu může být ovlivněn zkušenostmi uživatele. Zkušený FTIR spektroskopista shledá obvykle FTIR spektra snadněji řešitelnými a zkušený hmotnostní spektrometrista shledá obvykle MS data jednodušší k řešení. Ačkoli může být FTIR užitečnější, když jsou produkovány velmi komplexní molekuly jako výsledek rozkladu polymerního produktu, a MS naproti tomu může být užitečnější, když jsou produkovány jednodušší molekuly, jako je rozpouštědlo z farmaceutik, což znamená, že tento typ systému převládá ve farmaceutickém průmyslu. Většina TG-MS systémů profituje z použití helia při proplachování, neboť to umožňuje měřit hmotnost 28. Na počátku měření v heliu je potřeba vyčkat krátkou dobu, než je vzduch v peci nahrazen heliem a je vytvořena stabilní atmosféra. Je třeba si ale uvědomit, že ne všechny těkavé látky uvolněné ze vzorku budou v tomto kroku monitorovány, a proto může být užitečné analyzovat vzorek od počátku analýzy, před stabilizací, a pak znovu opakovat měření po stabilizaci v heliu. Je třeba vzít na vědomí různé vlivy vztlaku vzduchu a helia, takže lze také předpokládat posun v zaznamenané hmotnosti v průběhu počátečního ustalování rovnováhy. Příklad křivky ztráty hmoty překryté různými křivkami detekcí iontů je ukázán na obrázku 4.37 a naznačuje, že se spolu může uvolňovat řada různých molekul.

Obrázek 4.37 Příklad křivky získané použitím TG-MS. Ztráta hmoty je zobrazena jako plná linka. Během jediného děje ztráty hmoty je identifikováno několik různých rozpouštědel. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



Nejen že je možné analyzovat uvolněný plyn, ale je také možné provést současné měření stejného vzorku spojením technik dohromady. Jak TG-DTA, tak i DSC měření jsou klasickým příkladem, ale je také možné současně vytvořit experimentální uspořádání pro DSC-FTIR měření a DSC-Ramanovo měření. Jednoduchost použití Ramanova systému a jeho schopnost identifikovat materiály nebo přesněji jednotlivé krystalové (i amorfní) formy při zahřívání vyvolala v posledních letech značný zájem nejen ve farmacii, a proto jsou nyní k dispozici komerční DSC-Ramanovy systémy využívané při termické analýze široké palety vzorků.

4.11.

Složení amorfních látek a jejich význam ve farmacii

4.11.1.

Úvod k amorfním látkám

Kromě dokonalých krystalů obsahují všechny krystalické pevné látky nějakou oblast poruchy nebo málo krystalickou oblast. Když tyto regiony s poruchami tvoří převážnou část materiálu, je možné říct, že materiál existuje v amorfní formě a pod Tg je definován jako skelný stav. Amorfní pevné látky lze odlišit od jejich krystalických protějšků chybějícími makroskopickými a mikroskopickými vlastnostmi, jako je tvar částic, dvojlom (Osaki et al. 1994) a frakční mechanismus. Při analýze pomocí rentgenových metod práškové difrakce vykazují široký „halo“ efekt bez znatelné difrakce (Murthy a Minor 1990). Dále je jejich NMR spektrum v pevné fázi široké nebo nezřetelné (Gustafsson et al. 1998). Důvodem je to, že amorfní materiály nemají pravidelné uspořádání krystalové mřížky v celém objemu, ale mají pouze lokální uspořádání velké obvykle několik Ångströmů. Amorfní formy materiálů jsou obvykle připraveny vymražováním (Craig et al. 1999), sušením rozprašováním (Yu 2001) nebo rychlým ochlazením z taveniny (Forster et al. 2001). Ochlazení z taveniny je použitelné pro anorganické materiály, ale méně vhodné pro léčiva, protože mnoho organických sloučenin se rozkládá v blízkosti jejich bodu tání. Amorfní léčiva byla také připravena lyofilizací s polymery (Badwan a Abu-Malooh 1991), jako je polyvinylpyrolidon (PvP) nebo polyethylenglykol (PEG).



Z hlediska stability jsou amorfní formy termodynamicky méně stabilní (metastabilní) než odpovídající krystalické formy. Teoreticky může být amorfní forma považována za rozšíření kapalného stavu i pod bodem tání pevné látky. Proto může být amorfní forma léčiva eventuálně přeměněna do krystalického stavu pomocí nukleace a růstu krystalů. Tento proces je nezávislý na typu sloučeniny a rychlost konverze bude záviset na nukleaci a rychlosti růstu, které se týkají pohyblivosti molekul v amorfním prostředí.

4.11.2.

Charakterizace amorfní pevné látky pomocí termických metod: teplota skelného přechodu

Jak již bylo řečeno, amorfní pevné látky nemají pravidelné uspořádání krystalové mřížky v celém objemu. Při použití termických metod, jako je DSC, ke studiu takových materiálů nemohou být tyto materiály charakterizovány výraznými endotermickými přechody tání, které jsou běžně pozorovány u odpovídajících krystalických struktur. Nicméně jeden přechod je pro amorfní pevné látky charakteristický, a tím je „skelný přechod“, často zkracovaný jako Tg (teplota skelného přechodu). Tg (charakteristická oblast pro každý systém) je teplota, pod kterou jsou molekuly konfiguračně zmraženy ve skelném stavu, a proto postrádají pohyby molekul, ke kterým obvykle dochází v kapalině. Nad Tg je amorfní materiál pružný a vykazuje určitý stupeň toku. Tg amorfního materiálu není jediný bod, ale je to teplotní rozsah a jeho hodnota se může lišit v závislosti na tom, jak se měří. Nicméně pro suchou a čistou amorfní pevnou látku by se měl skelný přechod vyskytovat v definované oblasti a neměl by se měnit v závislosti na čase a tlaku za předpokladu, že je látka uložena v suchém prostředí a při teplotě dostatečně nízko pod Tg. Fukuoka a kol. (1986, 1989, 1991) připravili řadu amorfních léčiv rychlým ochlazením z taveniny. Následně byla změřena Tg suché látky z charakteristických kroků v tepelné kapacitě a z neobvyklé endotermy v DSC křivce. Výsledky jejich výzkumu jsou uvedeny v tabulce 4.2. Je zřejmé, že poměr Tg/Tm (v Kelvinech) určený pro čistou, suchou a amorfní pevnou látku je mezi 0,7 a 0,85. Tato zdánlivá shodnost poměru Tg/Tm ukazuje, že teplota skelného přechodu (Tg) může být určena z bodů tání. Znalost teploty



skelného přechodu umožňuje předvídat teplotu skladování nezbytnou k zajištění stability amorfní látky, aby se zabránilo rekrystalizaci nebo transformaci (jak fyzikální, tak chemické).

Tabulka 4.2 Změřené Tg (K), Tm (K) a hodnoty poměru Tg/Tm pro řadu farmaceutických sloučenin (Fukuoka et al. 1989, 1991). Sloučenina

Tg (K)

Tm (K)

Tg/Tm

Acetaminofen

302

441

0.69

Antipyrin

256

380

0.67

Aspirin

243

408

0.59

Atropin

281

379

0.74

Cholekalciferol

296

352

0.84

Cholová kyselina

393

473

0.83

Dehydrocholová kyselina

348

502

0.69

Deoxycholová kyselina

377

447

0.84

Ergokalciferol

290

376

0.77

Ethakrynová kyselina

282

398

0.71

Fulfenamová kyselina

290

406

0.71

Griseofulvin

370

497

0.74

Methyltestosteron

270

421

0.64

Fenylbutazon

277

377

0.73

Progesteron

279

399

0.70

Quinidin

326

445

0.73

Quinidin ethyluhličitan

278

362

0.77

Salicin

333

466

0.71



Santonin

290

434

0.67

Stilbesterol

308

439

0.70

Sulfadimethoxin

339

465

0.73

Sulfathiazol

334

471

0.71

Sulfisoxazol

306

460

0.67

Vinná kyselina

289

430

0.67

Ačkoli Tg uvedené v tabulce 4.2 odpovídají čistým, suchým a amorfním pevným látkám, Tg může být významně snížena přidáním změkčovadel nebo hostující molekuly do matrice (například absorpce molekul vody během skladování při zvýšené relativní vlhkosti vzduchu). Toto chování je známé již mnoho let a bylo popsáno Zografim a jeho kolegy, kteří navrhli, že se tyto menší molekuly změkčovadla chovají jako nečistota po začlenění mezi molekuly amorfní pevné látky (Ahlneck a Zografi 1990). To účinně zvyšuje mezery a volný objem vzorku a má za následek zvýšení stupně molekulární mobility. Například „vůně nového auta“ je způsobena počátečním uvolňováním malých těkavých molekul změkčovadel používaných k úpravě plastového interiéru (jako je palubní deska), aby se předešlo popraskání v chladném a zimním počasí. V léčivech je velmi důležité, jak skladování nad teplotou skelného přechodu zvyšuje molekulární mobilitu a pravděpodobnost krystalizace. Například amorfní cefalexin absorbuje největší množství vody, když je vystaven zvýšené vlhkosti a skladován nad kritickým bodem relativní vlhkosti (75%), což má za následek dostatečnou plasticizaci skelného přechodu tak, že se amorfní forma stává pružnou a je schopna krystalizovat (Otsuka a Kaneniwa 1983). Proto, pokud existuje pravděpodobnost, že amorfní materiál bude začleněn do vzorků jako vedlejší produkt zpracování nebo výroby, je nezbytné, aby byla podrobně známa relativní stabilita začleněné amorfní frakce, stejně jako její velikost. Měření Tg může být provedeno DSC, jak je popsáno v další části a také DMA, viz kapitola 4.4. To poskytuje alternativní metodu stanovení Tg prášku a zároveň jsou modulované hodnoty jiné než kvantitativní a obsah amorfní látky může být odhadnut z výšky píku tangens delta křivky.



4.11.3.

Kvantifikace amorfních látek použitím diferenční skenovací kalorimetrie

Ačkoli se diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) často používá pro výzkum fázového chování, kompatibility a polymorfismu, není obvykle používána v oblasti stanovení amorfního obsahu. Většinou je obtížné kvantifikovat velmi nízké úrovně amorfního obsahu pomocí DSC (pod 10 % w/w) kvůli malým energetickým změnám spojeným s měřením skelného přechodu (Tg) při těchto nízkých úrovních (Saklatvala et al. 1999). Nicméně vysokorychlostní DSC (HyperDSCTM) byla úspěšně použita pro kvantifikaci malých úrovní amorfního obsahu identifikací a kvantifikací energetické změny spojené se skelným přechodem (Saunders et al. 2004). V této studii byl jako testovaná sloučenina použit monohydrát α-laktosy. DSC skeny amorfní laktosy odhalily oblasti skelného přechodu, krystalizace a tání (jak alfa, tak beta tání), ale pro tuto studii byl oblastí zájmu skelný přechod. Na obrázku 4.38 je zobrazen vliv zvyšující se rychlosti skenování na skelný přechod amorfní laktosy. Bylo zjištěno, že velikost DSC odezvy se podstatně zvyšuje se zvyšující se rychlostí skenování, změna tepelné kapacity (W/g) byla asi 1 při 100 °C/min, 3 při 250 °C/min, 5 při 400 °C/min a 10 při 500 °C/min. Rekrystalizace byla také posunuta k vyšším teplotám, což mělo za následek zřetelnější údaje při vyšších rychlostech skenování.

Obrázek Tg amorfní laktosy změřené na DSC použitím různých rychlostí ohřevu. Největší citlivost byla dosažena při nejvyšší rychlosti zahřívání. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



Pro amorfní vzorek může být v souladu s literaturou snadno pozorována suchá Tg okolo hodnoty 116 °C (Hill et al. 1998). I přes rychlé skenovací rychlosti až 500 °C/min byly stále pozorovány krystalizační exotermy, což indikuje rychlou mobilitu a kinetiku krystalizace malých molekul ve srovnání s polymery (Pijpers et al. 2002). Zkoumání vztahu mezi krystalizací a rychlostí ohřevu může být využito k charakterizaci mobility amorfního léčiva. Odezvy Tg pro směsi amorfní a krystalické laktosy jsou uvedeny na obr. 4.39 (hodnoty byly kvůli lepší přehlednosti Tg posunuty v ose y). Tg odezva pro 100% amorfní vzorek je příliš velká, aby se plně vešla na osu, ale za to je lépe vidět nižší amorfní obsah (např. 1,5 %). Nástup Tg nebyl ovlivněn rychlostí skenování (80 °C pro všechny rychlosti), ale byl mnohem nižší než přijatelná hodnota Tg laktosy, pravděpodobně kvůli vlhkosti.

Obrázek Oblast Tg pro směsi amorfní a krystalické laktosy změřená DSC při 500 °C/min (procenta složky sušené rozprašováním odpovídají amorfnímu obsahu). (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Při skenovací rychlost 500 °C/min je možné velmi dobře vidět detail Tg pro vzorek s obsahem 1 % amorfní látky. Fakt, že při vysoké skenovací rychlosti je snadné zjistit Tg těchto vzorků, výrazně zlepšuje tradiční přístupy. Saleki-Gerhardt a kol. (1994) ukázali, že aby mohl být vzorek detekován konvenčními DSC (použitím pomalých skenovacích rychlostí), měl by mít kolem 10 procent amorfního obsahu a tato hodnota nebyla od té doby nikdy zpochybněna. V jedné studii bylo ukázáno, že teplotou modulovaná DSC lze použít k detekci přibližně 1 % w/w amorfní látky (Guinot a Leveiller 1999). Údaje zde prezentované však ukazují, že vysoké skenovací rychlosti mohou rychle (mnohem rychleji než s pomalými modulovanými teplotními experimenty) detekovat Tg pro vzorky s velmi nízkým obsahem amorfní látky a bez potřeby čekat na temperování při měření. To přináší velkou Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 127


výhodu, protože tato metoda je schopna detekovat malý amorfní obsah. A vzhledem k tomu, že amorfní forma není termodynamicky stabilní, je další velkou výhodou schopnost rychlé detekce, čímž se minimalizuje šance na rekrystalizaci amorfní formy během experimentu. (I když je krystalizace velmi rychlá nad Tg, je také možné, aby látky krystalizovaly, byť pomaleji v blízkosti Tg, a byly tak ovlivněny relaxací, pokud jsou použity nedostatečné skenovací rychlosti.) Následně byla pro tyto vzorky laktosy stanovena změna v signálu tepelného toku při Tg jako změna výšky kroku od začátku do maximální výšky vzorku, což indikovalo změnu specifického tepla přechodu pro Tg. Tyto údaje tvoří lineární závislost od 0 do 100 % obsahu amorfní látky, jak je znázorněno na obrázku 4.40. Analýza dat ukázala detekční limit 1 % amorfního obsahu. Podle metody popsané Millerem a Millerem v United States Pharmacopoeia (Miller a Miller 1993) je možné stanovit teoretický limit pro detekci a kvantifikaci amorfní laktosy podle výše uvedené metody. Na základě těchto údajů je teoretická mez detekce této metody 0,57 % a mez kvantifikace 1,89 % amorfního obsahu, ačkoli pro sacharosu byly dokonce stanoveny nižší limity (Lappalainen et al. 2006).

Obrázek 4.40 Výška Tg jako funkce obsahu amorfní laktosy sušené rozprašováním smíchané s krystalickým alfa monohydrátem. Obrázek ukazuje lineární závislost mezi výškou Tg a amorfním obsahem. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



4.12.

Stanovení čistoty preparátů použitím diferenční skenovací kalorimetrie

4.12.1.

Typy nečistot ve farmacii

Nečistoty ve farmaceutickém odvětví jsou různé nežádoucí chemické látky, které zůstávají s aktivními farmaceutickými substancemi (API) po syntéze nebo které mohou vzniknout během všech kroků výrobního procesu nebo skladování a dopravy jak meziproduktů, tak i aktivní léčivé látky, stejně jako samotného konečného léčivého přípravku v konrétné formulaci. Obecně lze nečistoty rozdělit do následujících hlavních kategorií: 

organické nečistoty (související s procesem výroby a produktovým léčivem),



anorganické nečistoty (související s výrobním procesem a pomocnými látkami),



zbytková rozpouštědla (používaná v procesu výroby).

Organické nečistoty mohou vzniknout během výrobního procesu a nebo skladování nových léčivových substancí. Nečistoty mohou nebo nemusí být identifikovány, mohou být těkavé nebo netěkavé a zahrnují: 

výchozí materiál,



vedlejší produkty,



meziprodukty,



degradační produkty,



reakční činidla, ligandy a katalyzátory.

Anorganické nečistoty mohou vzniknout během výrobního procesu. Jsou většinou známé a identifikované a zahrnují: 

reakční činidla, ligandy a katalyzátory,



těžké kovy nebo zbytky kovů,





anorganické soli,



další látky (například složky filtrů, sorbentů, např. aktivní uhlí).

Rozpouštědla jsou anorganické nebo organické kapaliny použité jako transportní systémy pro přípravu roztoků nebo suspenzí při syntéze nové léčivové látky. Tato rozpouštědla mají známou toxicitu, a proto lze pro jejich stanovení snadno vybrat odpovídající metodu (ICH Q3C (R3): Impurities: Guideline on Residual Solvents). Přítomnost těchto nežádoucích chemických látek, a to i v malých množstvích, může mít vliv na účinnost a bezpečnost léčivových přípravků. Proto se profilování nečistot (zjištění shodnosti, stejně jako množství nečistot v produktu) nyní dostává významné pozornosti od regulačních orgánů. Různé lékopisy, například British Pharmacopoeia (BP) a United States Pharmacopoeia (USP) pomalu začleňují limity na povolené hladiny nečistot přítomných v API nebo léčivových formách. Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH) rovněž vydala pokyny týkající se nečistot v nových léčivových látkách, výrobcích a zbytkových rozpouštědlech (Q3A Impurities in New Drug Substances, Q3B(R) Impurities in New Drug Products, Q3C Impurities: Residual Solvents, and Q6A Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances). Obecně platí, že v souladu s pokyny ICH týkajícími se nečistot v nových léčivových přípravcích, se identifikace nečistot pod 0,1 % nepovažuje za nutnou, pokud nejsou očekávány potenciální nečistoty, které budou neobyčejně aktivní nebo toxické (nečistoty by ale měly být určeny ve všech případech). Pokud nejsou k dispozici údaje pro stanovení konkrétního množství nečistoty, je třeba provést studie k získání těchto údajů.

4.12.2.

Diferenční skenovací kalorimetrie jako metoda pro stanovení čistoty ve farmacii

Pokud je látka v DSC pomalu zahřívána až za bod tání, může být profil tání v principu použit ke zjištění čistoty látky s ohledem na organické nečistoty, které tvoří eutektickou směs s látkou. Zjištění čistoty látky ale vyžaduje znalosti o její molekulové hmotnosti. Spolehlivě může být měření Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 130


provedeno pro jednotlivé krystalické materiály s 96% a vyšší čistotou. V praxi je to často případ znečištění prekurzory a vedlejšími produkty, které jsou výsledkem výrobního procesu, a které mohou stále zůstávat v substancích v malých množstvích. Tato jednoduchá a rychlá metoda pro stanovení čistoty je tedy potenciálně významná pro aplikace, ale je to jen empirický přístup a jeho použití je omezeno interferencemi z jiných dějů, které se vyskytují současně s táním a ovlivňují tvar píku a následný výpočet čistoty. Mezi tyto interference patří například interakce pevná látka-kapalina a polymorfní transformace. Další nečistoty, které netvoří eutektické směsi a neinteragují žádným způsobem s látkou, nebudou brány podle tohoto výpočtu v úvahu a je třeba je posuzovat odděleně, i když je možná interakce neeutektických nečistot, a tím i ovlivnění bodu tání. Za předpokladu, že žádné interakce nemají vliv na tvar píku, není výpočet čistoty ovlivněn, takže je možné, aby byly z jediného skenu určeny jednotlivé čistoty dvou vzájemně nekompatibilních látek ve směsi. Povaha těchto omezení znamená, že je potřeba velká péče, pokud je technika aplikována na řadu neznámých vzorků, ale může dobře fungovat, pokud je použita pro kontrolování kvality látek, o kterých je známo, že nemají interference. Plato a Glasgow zjistili, že z 95 krystalických organických sloučenin, které analyzovali, by tato metoda mohla být úspěšně aplikována na více než 75 % z nich, pokud by byly dostatečně čisté (Plato a Glasgow 1969). Základní teorie je založena na poznatku, že přítomnost malého množství nečistot v organické sloučenině snižuje bod tání (Gustin 1980), viz obrázek 4.41. Bod tání se snižuje s rostoucím množstvím nečistot, a proto voda s přídavkem kuchyňské soli (NaCl) mrzne až při teplotě pod 0 °C. Vztah mezi snížením bodu tání a množstvím nečistoty pro zředěný systém je definován Van't Hoffovou rovnicí: T0 – Tm = RT02 X2 / Hf x 1 / F ,

(4.3)

kde T0 a Tm jsou absolutní teploty tání čistého a znečištěného materiálu, Hf je molární entalpie tání, F je odpovídající roztavená část při teplotě Tm a R je plynová konstanta. Vynesení Tm proti 1/F by mělo dát přímku, jejíž směrnice odpovídá molární frakci nečistoty (X2). Další podrobnosti o vývoji rovnic a jejich využití lze najít ve Grayově studii, který jako první použil techniku DSC a podrobně popsal termodynamické teorie, na kterých je založena (Gray 1966; Brennan et al. 1984).



Obrázek 4.41 DSC křivky ukazují efekt zvyšování množství nečistot na tvar píků tání phenacetinu. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

4.12.3.

Praktické provedení termické analýzy a potenciální interference

V praxi společnosti vyvíjející zařízení poskytují software za účelem provádění výpočtu čistoty, ale i tak je této metodě stále potřeba věnovat hodně péče. V první řadě je třeba poznamenat, že teplotní gradienty v celém vzorku budou mít vliv na rychlost tání a výsledný tvar píku. Z tohoto důvodu musí být velikosti vzorků malé, typicky asi 1 mg a rychlost skenování pomalá, asi 1 °C/min. I v tomto případě však bude mít rychlost přenosu tepla do vzorku, vyjádřená jako konstanta tepelného odporu R0, vliv na rychlost tání a tento odpor se bude lišit přístroj od přístroje a typu použité pánvičky. R 0 je typicky určen z rychlosti tání india (sklon předního okraje) a musí být stanoven za podmínek experimentu a použit ve výpočtech. Je velmi důležité to provést správně, protože metoda není založena na srovnání čistého materiálu oproti znečištěnému materiálu, ale ve skutečnosti je rychlost tání testovaného materiálu porovnávána s rychlostí tání 100% čistého materiálu (obvykle india) a pokud není tato hodnota (R0) správná, pak bude výsledek chybný. Například v některých případech může dát výpočet čistoty hodnotu vyšší než 100 % (v případě, že software nemá mezní hodnoty). To ukazuje na možné chyby v hodnotě R0. Je pravděpodobné, že použití helia jako čistícího plynu by mohlo zlepšit přenos tepla a umožnit analyzovat potenciálně větší vzorky za rychlejších podmínek, které můžeme najít u rychlých skenovacích technik, avšak pomalé rychlosti jsou také vyžadovány, aby mohlo být naměřeno potřebné množství bodů během ekvilibrace v oblasti tání. Pokud je tání příliš rychlé (ostré), pak je kompromisem částečná integrace. Ta se provádí při řadě teplot v průběhu tání pro získání hodnoty podílu taveniny jako funkce teploty. Je podmínkou, aby tato hodnota byla získána v rovnovážné



oblasti tání, kde vedle sebe existuje pevná látka a kapalina, a tak v ideálním případě dochází k tání pomalu. Byly navrženy metody, ve kterých byla čistota získána z řady izotermických kroků v místě pomalého skenování, ale většina software používá metodu pomalého skenování. Vzorek by měl být dobře stlačen v pánvičce pro zajištění dobrého tepelného kontaktu. Pokud je to možné, měly by být pánvičky uzavřeny, aby se zabránilo ztrátám těkavých látek nebo možné sublimaci při tání. Volný prostor nad vzorkem v uzavřené pánvičce může vést k mikroklimatu a možným „sněžným“ efektům, a proto je nejlépe se mu vyhnout. Interval tání se nejlépe určuje prostřednictvím rychlejšího skenování, které může být také použito k ukázání dalších dějů netýkajících se nečistoty a měření čistoty by mělo začít výrazně níž pod očekávaným rozsahem tání a pokračovat až do vytvoření ploché základní linie. Je s podivem, kolik látek může tát při nižších než očekávaných teplotách kvůli efektům nečistot, takže by měla být křivka vhodně rozšířena v ose y, aby byly tyto informace zobrazeny tak, aby mohly být správně vybrány integrační meze, viz obrázek 4.42.

Obrázek 4.42 Výběr integračních mezí pro integraci plochy píku pro výpočet čistoty. Je třeba se ujistit, že počáteční mez je vhodná pro nízkotající látky. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)

Jakmile jsou data získána, měla by být pečlivě prohlédnuta. Při zkoumání křivky může být detekována většina interferencí. Případné nesrovnalosti ve tvaru píku nebo možná raménka naznačují případné interference a údaje by měly být odstraněny. Samozřejmý postup pro zkoumání profilu tání je jiná indikace. Pro další kontrolu by měla být použita druhá derivace křivky. Někdy mohou být nesrovnalosti způsobeny pohybem vzorku v průběhu tání, což vede k předpokladu, že určení čistoty může být provedeno při opětovném zahřátí, ale šance, že se podaří ochlazení do stejného stavu bez jakékoli změny, je pro většinu materiálů malá, takže by se nemělo používat opakované zahřívání, pokud tento přístup nebyl již dříve ověřen. Objeví-li se podezření na pohyb vzorku, je třeba opakovat analýzu s novým vzorkem. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 133


Pokud se křivka jeví jako přijatelná, pak je možné začít se zjišťováním čistoty nastavením mezí pro částečnou integraci. V některých systémech mohou být meze určeny softwarem, v jiných vybrány operátorem. Počáteční část tání pod 5 % je pravděpodobně neužitečná a meze jsou často nastaveny mezi 5 % a 60 % plochy píku, které odpovídají rovnovážné oblasti tání (počáteční okraj tání) pro většinu látek (Plato a Glasgow 1969). Pokud 60% limit připadá na koncovou oblast píku, je to důkaz nadměrné energie pod touto oblastí, což může být díky interakcím pevná látka-kapalina, které mají tendenci mít za následek neúměrně symetrický tvar píku. Pokud dílčí oblast integrace vypadá přijatelně, pak může být získána křivka 1/F v závislosti na Tm. Ve skutečnosti je téměř vždy získána křivka, i když se očekává, že to bude přímka, viz obrázek 4.43. Příčinou je podhodnocení celkového tepla tání. To nemůže být vysvětleno ničím jiným než tím, že nečistota taje s malým množstvím hlavní složky v eutektickém bodě, který je pod hlavním bodem tání a zůstává nezměřen. Navíc může být zpochybněna přesnost měření 1 mg materiálu zahřívaného při 1 °C/min, protože generovaný tepelný tok bude velmi malý. Výsledkem je zahrnutí hodnot jiných skupenských tepel do algoritmu výpočtu, dokud není získána přímá fitovaná linie. Použitá korekce se nazývá x-korekcí a představuje odhad chyby v původním výpočtu skupenského tepla. Tato oprava by neměla být příliš velká. Hodnoty 5 % nejsou neobvyklé, ale hodnoty nad 10 % by měly při měření v moderním přístroji vyvolat znepokojení. Velikost odchylky by se také měla lišit v závislosti na množství nečistot.

Obrázek 4.43 Van’t Hoffův graf ukazující výpočet čistoty pomocí DSC. Čtverečky znázorňují původní data před použitím korekčního algoritmu. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)



Díky této korekci je možné použít výpočet čistoty, i když se vzorek rozkládá během tání. Za předpokladu, že počáteční oblast tání není ovlivněna rozkladem (tj. vypadá rovná a bez vad), je možné použít algoritmus x-korekce i v případě, kdy nemůže být provedeno přesné změření spalného tepla (i když pro tento konkrétní účel může být vybrán přesnější algoritmus). Stejný argument lze v zásadě použít i pro jiné interference, ale pokud existují pochybnosti o správnosti jeho použití, je moudré data nepoužívat. Analýzy by měly být pro jistotu opakovány a jako u všech extrapolovaných dat lze i zde očekávat jejich variabilitu. Do jisté míry to bude závislé na operátorovi, ale zpravidla by nejistota měla být několik desetin procenta. Metoda může být optimalizována pro danou látku dodržením doporučení, že čím je materiál čistší, tím by měla být použita pomalejší skenovací rychlost a naopak čím znečištěnější materiál, tím by měla být použita vyšší skenovací rychlost (protože píky budou širší). Bylo zjištěno, že 0,5 °C/min poskytuje nejpřesnější a nejreprodukovatelnější data pro jakýkoliv čistý materiál.

4.13.

Kompatibilita pomocných látek

Při vývoji jakéhokoliv léku pro úspěšný farmaceutický produkt je potřeba pro konečnou formu léčiva prokázat přijatelnou chemickou stabilitu při distribuci a podmínkách skladování a vhodnou trvanlivost. Všechna léčiva jsou vytvořena s řadou pomocných látek, jako jsou pojiva, rozvolňovadla, plniva a maziva. Je důležité, aby lék neinteragoval s některou z pomocných látek způsobem, který může snížit jeho účinnost, a proto je kompatibilita pomocných látek důležitá při posuzování stability léčiva. V průběhu let byly vyvinuty různé metody kompatibility pomocných látek jako vodítko pro výběr pomocných látek. Screening kompatibility pomocné látky je obecně považován za nezbytnou součást vývojového procesu, ale protože nejsou během počátečních fází vývoje k dispozici data v reálném čase, musí být vytvořeny zrychlené studie stability na modelovém složení léčiva pro odhadnutí a



předpovězení dlouhodobé stability za běžných podmínek. Tyto studie jsou nákladné a časově náročné, a proto je žádoucí minimalizovat počet provedených studií. Existuje mnoho způsobů jak provést screening kompatibility pomocné látky. Ve všech případech je ale základní postup stejný: smíchají se dvě nebo více látek a sledují se všechny následné reakce. V jednom typu studie jsou směsi léčiva a pomocné látky skladovány za podmínek zrychlené stability jako binární směsi, směsi léčivové formy v malém měřítku, nebo statisticky navržené směsi a pak analyzovány v průběhu času pomocí TLC, HPLC nebo spektrofotometrie. Nevýhodou této techniky je, že směsi musí být sledovány po dobu několika týdnů. Protože kvalita výsledků závisí na přesnosti testů, jsou také požadovány dobře vyvinuté a dostatečně ověřené metody.

4.13.1.

Screening kompatibility pomocné látky pomocí diferenční skenovací kalorimetrie

DSC byla navržena jako rychlá metoda pro vyhodnocení fyzikálně-chemické interakce mezi dvěma složkami a může poskytovat rychlé a spolehlivé informace o možných fyzikálních nebo chemických nekompatibilitách mezi složkami léčivové formy od vzniku, posunutí nebo vymizení endoterm či exoterm nebo změnách v příslušných hodnotách entalpie (Tan et al. 1992). Interpretace výsledků DSC není ale vždy snadná a je nutné promyšlené vyhodnocení pro vyvarování se nesprávného výkladu a chybného závěru (Hardy 1982). Základní přístup je ten, že se smíchají dvě složky (léčivo a pomocná látka) zpravidla v 50/50 směsi a pak je provedeno DSC měření. Profil tání jednotlivých složek je pak srovnán se skenem směsi. Pokud nedojde k žádné interakci, směs by měla v ideálním případě ukázat stejné přechody jako jednotlivé složky. Pokud tomu tak není, nastala nějaká interakce. Při analýze DSC křivek směsi však nastává problém, neboť není možné jednoznačně odlišit fyzikální a chemické interakce, přičemž chemické interakce jsou hlavní příčinou potíží při vývoji léčiva. Příkladem je roztok jedné ze složek v tavenině jiné látky. To znamená, že bude získáno mnoho „falešných“ výsledků, které je obtížné odlišit od výsledků, které jsou zdrojem problémů. Navíc Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 136


skutečnost, že interakce byly pozorovány při zvýšené teplotě, není nezbytně významná v případě, že teplota je mimo testované parametry. Validita použitím 50/50 směsi může být také diskutabilní. Dále, přítomnost interakce pevná látka-pevná látka nemusí nutně znamenat farmaceutickou nekompatibilitu (Van Dooren a Duphar 1983), ale mohlo by to být naopak výhodné, například jako vhodnější forma systému pro aplikaci léčiva (Bettinetti et al., 1988). Proto musí být ve spojení s DSC často použity další analytické metody pro adekvátní doložení výsledků, jako je mikroskopie horké fáze, hmotnostní spektrometrie a HPLC umožňující stanovení chemické čistoty. Po tom, co bylo řečeno, zkušení analytici uvádějí, že z DSC interakčních studií byly získány užitečné informace a je třeba zdůraznit, že údaje, které neindikují interakce, poskytují významné důkazy, že k žádné interakci nedochází. To může být ve skutečnosti velmi užitečná informace a lze ji z těchto studií získat. Alternativní přístup už byl vynalezen a spočívá v použití DSC metod rychlého skenování. Směsi, které byly dříve připraveny a zestárly, mohou být nyní zahřány použitím velkých rychlostí ohřevu, při kterých nejsou fyzikální interakce tak významné, protože není čas na to, aby nastaly.

Literatura Ahlneck, C. and Zografi, G. (1990) Int. J. Pharmaceut. 62: 87–95. Badwan, A. A. and Abu-Malooh, A. (1991) Eur. J. Pharm. Biopharm. 37(3): 166–170. Bartolomei, M., Bertocchi, P., Cotta Ramusino, M., Santucci, N. and Valvo, L. (1999) J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 21(2): 299–309. Bettinetti, G. P., Mura, P., Liguori, A., Bramanti, G. and Giordano, F. (1988) Farmaco Ed. Prat. 43: 331– 343. Bottom, R. (1999) Int. J. Pharmaceut. 192(1): 47–53. Brennan W. P., DiVito, M.P., Fyans, R. L. and Gray A. P. (1984) An overview of the Calorimetric Purity Measurement. In Purity Determinations by Thermal Methods (ed. Blaine, R. L. and Schoff, C. K.). American Society for Testing and Materials. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 137


Briehl, H. and Butenuth, J. (1992) Thermochimica Acta 211(10 December 1992): 121–130. Burger A. and Ramburger R. (1979) Mikrochim.Acta II: 259–271. Chowdhry, B. Z., Cole, S. C. (1989) TIBTECH 7: 11–18. Cox, P. J. and Wardell, J. L. (2000) Int. J. Pharmaceut. 194(2): 147–153. Craig, D. Q. M., Royall, P. G., Kett, V. L. and Hopton, M. L. (1999) International Journal of Pharmaceutics 179(2): 179–207. Della Gatta, G., Richardson, M. J., Sarge, S. M. and Stølen, S. (2006) Pure Appl. Chem. 78(7): 1455– 1476. Fang, M.X., Shen, D. K., Li, Y. X., Yu, C. J., Luo, Z. Y. and Cen, K. F. (2006) J. Anal. and Appl. Pyrolysis 77(1): 22–27. Forster, A., Hempenstall, J., Tucker, I. and Rades, T. (2001) Int. J. Pharmaceut. 226(1–2): 147–161. Fukuoka, E., Makita, M. and Nakamura, Y. (1991), Chem. Pharm. Bull. 39, 2087–2090. Fukuoka, E., Makita, M. and Yamamura, S. (1986) Chem. Pharm. Bull. 34(10): 4314–4321. Fukuoka, E., Makita, M. and Yamamura, S., (1989) Chem. Pharm. Bull. 37, 1047–1050. Gabbott, P. (ed.) (2008) Principles and Applications of Thermal Analysis. Wiley-Blackwell. Gabbott, P., Clarke, P., Mann, T., Royall, P., Shergill, S (2003) Amer. Lab. (August). Giron, D. (1995) Thermochimica Acta 248(2 January 1995): 1–59. Gray A. P. (1966) Determination of purity by differential scanning calorimetry. Thermal Analysis Newsletter No 5, The Perkin-Elmer Corporation. Guinot, S. and Leveiller, F. (1999) Int. J. Pharmaceut. 192: 63–75. Gustin, G. M. (1980) Thermochimica Acta 39(2): 81–93. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 138


Hardy, M. J. (1982) Anal. Proc. 19: 556–557. Hill, V. L., Craig, D. Q. M. and Feely L. C. (1998) Int. J. Pharmaceut. 161(1): 95–107. Kobayashi, Y. Ito, S., Itai, S. and Yamamoto, K. (2000) Int. J. Pharmaceut. 193(2): 137–146. Kunihiro Osaki, Tadashi Inoue, Eui-Jeong Hwang, Hirotaka Okamoto and Osamu Takiguchi (1994) J. Non-Crystalline Solids 172–174(2): 838–849. Lappalainen M., Pitkänen, I. and Harjunen, P. Quantification of low levels of amorphous kontent in sucrose by HyperDSC. (2006) Int. J. Pharmaceut. 307: 150–155. McCrone, W. C. (1965) Polymorphism in Physics and Chemistry of the Organic Solid. State, vol. II (ed. Fox, D., Labes, M. M. and Weissberger, A.). Interscience, pp. 726–767. Sorrenti, M., Bettinetti, G. P. and Negri, A. (1998) Thermochimica Acta 321(1–2): 67–72. McCrum, N. G., Read, B. E. and Williams, G. (1967) Anelastic and Dielectric Effects in Polymeric Solids. John Wiley & Sons, Ltd. McGregor, C., Saunders, M. H., Buckton, G. and Saklatvala, R. D. (2004) Thermochimica Acta 417(2): 231–237. Miller, J. C. and Miller, J. N. (1993) Statistics for Analytical Chemistry, 3rd ed. Ellis Horwood. Murthy, N. S. and Minor, H. (1990) Polymer 31(6): 996–1002. Gustafsson, C., Lennholm, H., Iversen, T. and Nyström, C. (1998) Int. J. Pharmaceut. 174(1–2): 243– 252. Noble, D. (1995) Anal. Chem. 67: 323A–327A. Otsuka, M. and Kaneniwa, N. (1983) Chem. Pharm. Bull. 31: 230–236. Phipps, M. A., and Winneke, R. A. (1997) Proc. Workshop Microcalorim. Energ. Mater.



Pijpers, F. J., Mathot, V. B. F., Goderis, B., Scherrenberg, R. L. and Van der Vegte, E. W. (2002) Macromolecule 35: 3601–3613. Pirttimäki, J. and Laine, E. (1994) Eur. J. Pharmaceut. Sci. 1(4): 203–208. Plato C. and Glasgow A. R. (1969) Anal. Chem. 41: 330. Pratiwi, D., Fawcett, J. P., Gordon, K. C. and Rades, T. (2002) Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 54(3): 337–341. Reading M. and Hourston D. J. (2006) Modulated Temperature Differential Scanning Calorimetry: Theoretical and Practical Applications in Polymer Characterisation. Springer. Reading, M., Luget A. and Wilson R. (1994) Thermochimica Acta 238(1–2): 295–307. Rustichelli, C., Gamberini, G., Ferioli, V., Gamberini, M. C., Ficarra, R. and Tommasini, S. (2000) J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 23(1): 41–54. Saklatvala, R., Royall, P. G. and Craig, D. Q. M. (1999) Int. J. Pharmaceut. 192: 1(1): 55–62. Saleki-Gerhardt, A., Ahlneck, C. and Zografi, G. (1994) Int. J. Pharmaceut. 101: 237–247. Saunders, M., Podluii, K., Shergill, S., Buckton, G. and Royall, P. (2004) Int. J. Pharmaceut. 274(1–2): 35–40. Spartakov, A., Trusov A. and Vojtylov V. (2002) Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 209(2–3): 131–137. Sturtevant, J. M. (1987) Ann. Rev. Phys. Chem. 38: 463–488. Tan, X., Meltzer, N. and Lindenbaum, S. (1992) Pharm. Res. 9: 1203. Van Dooren, A. A. and Duphar, B. V. (1983) Drug Dev. Ind. Pharm. 9: 43–55. Vickery, R. D., Nemeth, G. A. and Maurin, M. B. (2002) J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 30(1):125–129. Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J., Lin, L. (1989) Anal. Biochem. 79: 131–137. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 140


Yu, L. (2001) Advanced Drug Delivery Reviews 48(1): 27–42.



5. Mikroskopie 5.1.Úvod k mikroskopickým technikám Mikroskopické techniky, využívané při charakterizaci farmaceutik v pevném skupenství, poskytují specifické informace, které je s využitím ostatních technik možné získat jen nepřímo nebo vůbec. Mikroskopie umožňuje univerzální, rychlou a většinou nedestruktivní analýzu a charakteristiku malých množství vzorku z hlediska mnoha fyzikálně-chemických vlastností, například: tvar a velikost částic, optické vlastnosti, krystalografie, vlastnosti povrchu, krystalinita, krystalizace, rozpouštěcí a tepelná charakteristika. Přesněji, termín chemická mikroskopie, definovaný Émile Chamotem (Chamot 1915) jako „použití mikroskopu při řešení chemických problémů“, lépe popisuje využití mikroskopie (v širším smyslu) pro výzkum fyzikálně-chemických vlastností materiálů a pro porozumění těmto vlastnostem. Význam mikroskopie pro určení charakteristiky farmaceutik v pevném skupenství je uznáván již několik desetiletí, zejména v kombinaci s dalšími analytickými technikami (např. Biles 1962, Haleblian a McCrone 1969, Brittain a kol. 1991, Windram a Threlfall 1992, Byrn a kol. 1995, Threlfall 1995, Yu a kol. 1998, Bernstein 2002, Smoliga 2004, Nichols 2006). Přestože je využití mikroskopie podporováno mnoha výzkumníky v oblasti farmacie, možnost jejího plného využití jako analytické metody pro charakterizaci pevné fáze ještě není ve většině laboratoří zcela doceněna. Tato kapitola pojednává o využití zavedených mikroskopických technik, jako polarizační mikroskopie (včetně termomikroskopie), skenovací elektronové mikroskopie (včetně elementární rentgenové mikroanalýzy) a nedávno vyvinuté a rychle se rozvíjející mikroskopie atomárních sil. Kombinace těchto tří technik je využívána v mnoha průmyslových i akademických laboratořích při výzkumu a objasňování chování farmaceutických materiálů v pevném stavu. Samozřejmě, mikroskopie v jedné ze svých podob je využívána v každém výrobním průmyslovém závodě a specializované mikroskopické techniky vyvinuté jedním průmyslovým odvětvím jsou často využívány ostatními odvětvími. V této kapitole je kladen důraz na mikroskopickou charakterizaci farmaceuticky aktivních látek (Active Pharmaceutical Ingredients – APIs). Mikroskopické techniky jsou rovněž nedocenitelné při řešení problémů spojených s krystalizací a zpracováním, charakterizaci pomocných látek, vyhodnocování homogenity práškových směsí, určování velikosti a struktury zrn a



odlišování farmaceuticky aktivních látek od pomocných látek v konečných produktech jako tabletách, kapslích, suspenzích, inhalačních směsích, nitrožilních a lokálně aplikovaných přípravcích. Mikroskopie je rovněž nedocenitelná při detekci a identifikaci cizích částic v klinických a komerčních produktech. Mikroskopická pozorování jsou cenná sama o sobě, ale pokud jsou použity pro doplnění údajů získaných jinými technikami charakterizace pevné fáze, mohou poskytnout rozhodující informace potřebné pro vysvětlení neobvyklého nebo nečekaného úkazu. Zkušený mikroskopista je hodnotný pracovník, jehož speciální schopnosti by měly být využívány v průběhu charakterizace a vývoje farmaceutických materiálů.

5.2. Mikroskop jako analytický přístroj Mikroskop je užíván při zvětšení obrazu vzorku pro rozlišení jemných detailů, které jsou pouhým okem neviditelné. V případě mnoha materiálů, tyto jemné detaily se mohou stát viditelnými, když je kontrast obrazu zvýšen modifikací, například, technik přípravy vzorku, výběrem a kontrolou osvětlení mikroskopu nebo podmínek snímání obrazu, nebo zpracováním získaného obrazu. Mikroskopy poskytují nejen obrazy vzorků při různých zvětšeních, ale mohou sloužit i jako výkonné analytické přístroje pro základní výzkum i řešení problémů. Mikroskopie zahrnuje širokou škálu technik, které poskytují obrazy vzorků jak při nízkých rozlišeních umožňujících postihnout rysy velkého měřítka jako je tvar a velikost, tak při velmi vysokých rozlišeních za účelem získání informací na úrovni jednotlivých atomů. Jedinečné a charakteristické optické vlastnosti krystalů jsou určovány s využitím polarizační mikroskopie s nízkými až

středními

rozlišeními.

Skenovací

elektronový

mikroskop

vybavený

rentgenovým

mikroanalyzátorem se stává výkonným analytickým přístrojem, s jehož pomocí lze prozkoumat jemné detaily povrchu vzorku a určit jejich prvkové složení. Zisk informací o složité struktuře a chemických vlastnostech povrchů na molekulární úrovni umožňuje mikroskopie atomárních sil.



Mikroskopická pozorování neposkytují jen jedinečný pohled na krystalické a amorfní materiály, ale jsou používána i při rozhodování o potřebnosti dalších analýz a, což je důležitější, při výběru analytické metody nebo metod. S využitím mikroskopických metod lze získat velké množství diagnostických informací při použití malého množství vzorku, což je zvlášť významné při volbě a časných stádiích vývoje farmaceutických produktů.

5.3. Jaký mikroskop použít? Při analýze vlastností materiálů v pevné fázi závisí volba mikroskopu na tom, jaké informace o materiálu mají být zjištěny a jaká je jejich požadovaná přesnost. Pro studium optických vlastností a vnitřních rysů krystalů (jako jsou praskliny a inkluze) nebo pro určení tvarů a velikostí částic v práškových materiálech je nejvhodnějším přístrojem transmisní optický mikroskop. Pro studium povrchů krystalů a pro zjištění rozměrů malých částic, které nemohou být rozlišeny v optickém mikroskopu, by měla být použita skenovací elektronová mikroskopie nebo mikroskopie atomárních sil. Pokud je požadováno rozlišení na atomární úrovni, je optimální volbou mikroskopie atomárních sil nebo transmisní elektronová mikroskopie. Nicméně, všechny tyto techniky jsou navzájem komplementární a pro zahrnutí nejvhodnějších a nejinformativnějších technik by měl být navržen Když

je

vzorek

zkoumán

poprvé,

je

namísto

hledání

nejdražšího,

nejvýkonnějšího

a nejsofistikovanějšího mikroskopu vhodnější prohlédnout si vzorek pouhým okem nebo použít lupu. Při tomto úvodním přezkoumání lze zjistit takové vlastnosti vzorku, které nemusí být při vyšším rozlišení viditelné, jako barevnost, různé typy krystalů, plynulost pohybu částic při přesýpání vzorku, výskyt aglomerací, variabilita ve velikostech částic. Nikdy nepodceňujte význam prohlédnutí vzorku bez zvětšení. Vodítka pro určení tvaru částic v práškových materiálech umístěných ve skleněné vialce nebo pytli mohou být někdy získána při sledování materiálu při jeho přesýpání; plynulý pohyb částic indikuje jejich kulovitý nebo pravidelný tvar, zatímco nepravidelný pohyb lehkého, nadýchaného prášku napovídá, že jeho částice mají pravděpodobně tvar jehlic. Na základě výsledků těchto předběžných pozorování může být poté zvolen vhodný mikroskop, který bude sloužit pro podrobnější prozkoumání vzorku.



Nízkovýkonný stereobinokulární mikroskop, vybavený optikou pro vstupní i propuštěné záření, je nedocenitelný při přípravě vzorků, které mají být analyzovány jinými technikami. Krystalografisté používají stereobinokulární mikroskopy vybavené polarizačními filtry při rutinním výběru a pěstování krystalů vhodných pro difrakční analýzu jednotlivých krystalů. Transmisní optická mikroskopie mikroskopie je bezpochyby nejvšestrannější a nejrychlejší ze všech mikroskopických technik používaných při zkoumání mnoha vlastností farmaceutických materiálů v pevné fázi. Například pro zjištění rychlosti růstu krystalů z nasyceného roztoku, nebo pro zjištění, zda je přítomnost zbytkového rozpouštědla v práškovém materiálu zapříčiněná inkluzemi uvnitř krystalů, by měla být použita optická mikroskopie spíše než skenovací elektronová mikroskopie nebo mikroskopie atomárních sil. Přestože je tato kapitola zaměřena na aplikace polarizační optické mikroskopie, skenovací elektronové mikroskopie a mikroskopie atomárních sil, pro charakterizaci farmaceutických materiálů z fyzikálně-chemického hlediska může být využito mnoho dalších mikroskopických technik. Tyto techniky zahrnují: transmisní elektronovou mikroskopii, infračervenou mikroskopii s Fourierovou transformací, Ramanovu mikroskopii, mikroskopii v blízké infračervené oblasti, konfokální mikroskopii a metody povrchové analýzy, jako je fotoelektronová spektroskopie (XPS), Augerova spektroskopie a hmotnostní spektroskopie sekundárních iontů s ToF detektorem (ToF – SIMS).

5.4.Optická mikroskopie Optická mikroskopie je důležitá technika, s jejíž pomocí je možné korelovat data získaná s využitím jiných technik při charakterizaci látek z fyzikálně-chemického hlediska (např. Reutzel-Edens a kol. 2003, Panchagnula a kol. 2004) nebo pro vysvětlení změn tvaru krystalů (např. Brittain 1997). Většina pevných a polotuhých farmaceuticky aktivních látek a příměsí, s nimiž se lze setkat během vývoje farmaceutických produktů, je průhledná nebo průsvitná a může být zkoumána s využitím prozařovacího optického mikroskopu. Optická mikroskopie je nejdéle zavedenou z mnoha technik užívaných pro charakterizaci farmaceutik v pevném skupenství. První mikroskop, vybavený dvěma konvexními čočkami zasazenými v kovovém tubusu, byl vynalezen Hansem Janssenem okolo roku Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 145


1590 (Moe 2004). O téměř 250 let později, v roce 1834, sestrojil průkopník fotografie William Fox Talbot polarizační světelný mikroskop přidáním dvou optických hranolů do základního optického mikroskopu (Kile 2003). Tento stěžejní objev stál na počátku systematického zkoumání anorganických a organických krystalů a od těchto skromných začátků Prozařovací optický mikroskop bez polarizovaného světla může být použit při zjišťování vlastností krystalů jako barvy, tvaru a velikosti. Po přidání polarizačních filtrů se základní mikroskop v režimu světlého pole změní ve výkonný analytický přístroj, s jehož pomocí lze studovat mnoho optických vlastností krystalů. Polarizační mikroskopie se stala hlavní technikou optické mikroskopie používanou pro charakterizaci farmaceutických materiálů, a proto bude dále popsána v této kapitole. Různé formy pevných látek, jako polymorfy, hydráty, solváty, mezofáze a skla, mohou být při pozorování pod rovinně nebo křížově polarizovaným světlem navzájem rozlišeny díky rozdílným optickým vlastnostem. Optický mikroskop by měl být nedílnou součástí každé analytické laboratoře, jelikož poskytuje pracovníkům možnost nahlédnout do struktury látek na úrovni atomů na základě pozorování jejich interakce se světlem (Bowen a Sparenga, 2008). Optické krystalografické metody mohou být rovněž využity pro zařazení krystalu do jedné ze sedmi krystalografických soustav a, v některých případech, může poskytnout informace o struktuře krystalu (Hartshorne a Stuart, 1970). Směs obsahující různé polymorfy může být rovněž prozkoumána a jednotlivé polymorfy mohou být rozlišeny na základě různých optických vlastností. Optická mikroskopie je, ve spojení s dalšími mikroskopickými technikami, často používána při získávání odpovědí na řešení výzkumných otázek, které nemohou být získány s využitím jedné techniky. Například v rámci studie porovnávající tvary, chemické vlastnosti a topografie povrchů monokrystalů dvou polymorfů sulfamerazinu byla kombinována optická mikroskopie, mikroskopie atomárních sil a Ramanovy mikroskopie (Cao a kol. 2005). Jiným příkladem vhodné kombinace komplementárních technik, vedoucí k lepšímu poznání vlastností organických sloučenin v pevné fázi, je studie polymorfního farmaceutického meziproduktu, kyseliny p-hexadecylaminobenzoové (HABA) (Reffner a Ferrillo 1988). Pro studium polymorfismu HABA byly připraveny směsné vzorky, ale fázová přeměna z Formy II na Formu III nemohla být pomocí polarizační mikroskopie přímo pozorována.



Nicméně, s využitím FT-IR termomikroskopie mohly být tyto dvě fáze rozlišeny a fázová přeměna byla pozorována při 74°C.

5.4.1. Polarizační optický mikroskop pro studium vlastností látek v pevné fázi Jako rychlý testovací přístroj pro charakterizaci široké řady vlastností polymorfních krystalických látek a dalších pevných látek je polarizační mikroskopie nenahraditelná. Různé krystalové modifikace mají odlišné struktury, které se projevují rozdíly v optických vlastnostech, jako je index lomu, barva, extinkční úhel a optická disperze. Tyto jedinečné vlastnosti mohou být pozorovány s využitím rovinně polarizovaného světla, při pozorování mezi křížovými polarizátory lze rozlišit různé krystalové formy, a to jak v případě čistého vzorku jedné formy, tak v případě směsi více forem. Mezi další vlastnosti a jevy, které jsou s pomocí polarizačního mikroskopu snadno pozorovatelné, patří dvojčatění krystalů, aglomerace, distribuce krystalů různých velikostí, rozdíly ve vzhledu krystalů, rozpustnost krystalů v různých rozpouštědlech, sublimace a mezomorfie. Polarizační mikroskopie využívá dvojlomu, který je výsledkem uspořádání molekul v krystalu při jejich interakci s polarizovaným světlem. S využitím polarizačního mikroskopu mohou být pozorovány a popsány optické vlastnosti mnoha různých materiálů. Nejdražší a nejsložitější polarizační mikroskopy nabízejí mnoho vylepšení s pomocí kvalitní optiky a ergonomického designu, možné je též automatické ovládání stolku na vzorky a automatická fokusace pro obrazovou analýzu. Levnější mikroskopy bývají jednodušší, ale jsou dostatečně výkonné pro provádění rozhodujících optických stanovení za předpokladu, že kvalita optiky je odpovídající. Vysoká kvalita mikroskopie nezávisí na složitosti mikroskopu, ale na zkušenostech a zručnosti mikroskopisty, který umí připravit vzorky a ovládat mikroskop a dokáže rozpoznat a korigovat výchylky osvětlení. Nejdůležitější součástí optického mikroskopu není uvedena v žádném katalogu; je to kombinace oka a mozku mikroskopisty, který dokáže pozorovat, porozumět a interpretovat obrazy smysluplným a analytickým způsobem. Schematický nákres prozařovacího optického mikroskopu, využívajícího polarizované světlo, s nezbytnými součástmi potřebnými ke zobrazení a vyhodnocení optických vlastností vzorků, je uveden na Obrázku 9.1. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 147


Obrázek 9.1 Schematický nákres znázorňující hlavní součásti prozařovacího polarizačního optického mikroskopu Kromě součástí, z nichž se skládá základní mikroskop (např. iluminátor, kondenzor, sadu objektivů umožňujících pozorovat vzorek při větším nebo menším zvětšení, okulár), jsou v optické dráze světla jako pod, tak nad vzorkem, umístěny dva polarizační filtry, zvané polarizátor a analyzátor. Roviny světla procházejícího polarizátorem a analyzátorem jsou na sebe kolmé, aby bylo dosaženo jevu zvaného křížová polarizace (polarizátor je nastavený tak, že kmitová rovina má pravolevou orientaci). Aby mohl být vzorek zkoumán jak s využitím nepolarizovaného světla (bez polarizačních filtrú), tak i s využitím rovinně (pouze polarizátor) resp. křížově (polarizátor a analyzátor) polarizovaného světla, je nezbytné, aby mohly být jak polarizátor, tak analyzátor dočasně odstraněny z optické dráhy. V ideálním případě je jak polarizátor, tak analyzátor otočný a vzorek může být pozorován rovněž při polohách odlišných od polohy, v níž jsou polarizační filtry navzájem kolmé (bude diskutováno níže). Referenční zorné pole mezi zkříženými polarizátory je černé, protože žádné světlo neprochází, ale pokud je přítomen anizotropní (dvojlom vykazující) vzorek, bude při vhodné orientaci vykazovat jasné interferenční barvy (Harts;horne a Stuart 1970). Při určování některých optických vlastností musí být krystal pozorován pod různými úhly vzhledem k rovině polarizovaného světla. Taková pozorování mohou být snadno provedena, pokud je mikroskop vybaven otočným stolkem s úhlovou stupnicí. U dobře vyvinutých krystalů mohou být provedena měření úhlů, které spolu svírají krystalové roviny nebo hrany, a extinkčních úhlů (pokud je krystal mezi navzájem kolmo orientovanými polarizačními filtry ozařovaný pod extinkčním úhlem vzhledem ke krystalové rovině, jeví se tmavý). Aby byly úhly přesně změřeny, krystal musí být vyrovnán s nitkovým křížem, který je umístěn v jednom z okulárů. Tento nitkový kříž je orientován rovnoběžně s rovinami polarizace obou polarizačních filtrů. Do polarizačního mikroskopu mohou být umístěny další přídavné součásti pro zvýšení jeho všestrannosti při zkoumání optických vlastností krystalů. Speciální pomocné destičky, známé jako kompenzátory, mohou být umístěny do optické dráhy před vzorek. Pravděpodobně nejčastěji používaná je citlivá barevná destička (známá také jako červená destička prvního řádu, celovlnová



destička nebo sádrová destička), která zabarvuje zorné pole do jednotné tmavě purpurové barvy. Tento kompenzátor je velmi výhodný při zkoumání protáhlých krystalů mezi kolmo orientovanými polarizačními filtry pro zjištění, ve kterých směrech je index lomu vyšší a ve kterých nižší; například, pokud je index lomu nízký ve směru rovnoběžném s podélnou osou jehličkovitého krystalu, protože světlo se šíří rychleji ve směru, podél nějž je index lomu nižší. Plný popis využití citlivé barevné destičky a dalších, jako čtvrtvlnové destičky a křemenného klínku, je uveden ve specializovaných odborných knihách (např. Walhstrom 1960; Hartshorne a Stuart 1970). Vzorky jsou nejčastěji zkoumány kvůli zjištění vlastností jako tvar a velikost v normálním (nebo ortoskopickém) režimu s využitím rovinně polarizovaného světla a mezi navzájem kolmo orientovanými polarizačními filtry. Doplňkové informace o optických vlastnostech mohou být získány při zkoumání monokrystalů umístěných rovněž mezi navzájem kolmými polarizačními filtry, ale pozorovaných v konoskopickém módu, umožňujícího zobrazení obrazu na zadní ohniskové rovině objektivu. Při vhodné orientaci krystalu odhalí pozorování v konoskopickém módu charakteristické interferenční obrazce, skládající se z barevných a tmavých pruhů nebo izogyrů (Hartshorne a Stuart 1970). Existuje více možností, jak získat obraz v konoskopickém režimu, ale nejvšestrannější z nich (protože konoskopický obraz může být rovněž zobrazen a nahrán za pomoci kamerového systému) je založena na umístění pomocných čoček, zvaných Bertrandovy čočky, mezi analyzátor a okulár. Pozorování v konoskopickém režimu nabízí možnost, jak rychle rozlišit jednoosé a dvouosé krystaly (viz 9.4.4), což je zvláště důležité pro rozeznání odlišných polymorfů ve směsi, pokud patří do různých krystalových soustav (Nichols 2006). Některé vzorky obsahují složky, které jsou navzájem málo kontrastní (například amorfní léčiva ve směsi s polymerem v pevnou disperzi nebo polotuhá fáze v lokálně aplikovaných mastech a krémech) a běžný optický polarizační mikroskop pravděpodobně nebude vhodný pro pozorování rozdílů mezi jednotlivými složkami. Pro zvýšení kontrastu je možné vložit vzorek do kapalného média (viz 9.4.2), ale to není vždy praktické. Techniky pro zvýšení kontrastu, jako mikroskopie interferenčního kontrastu (využívá polarizované světlo) a fázově kontrastní mikroskopie (nejčastěji využívaná biology pro zobrazení buněčných struktur s nízkým kontrastem), se možná stanou nedocenitelnými při zkoumání vzorků obsahujících složky s nízkým kontrastem, protože i špatně viditelné nebo Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 149


neviditelné detaily jsou díky nim viditelné (Oldfield 1994). Na obrázku 9.2 je znázorněn příklad zvýšení viditelnosti pevných a polotuhých složek v komerčním krému pro lokální aplikaci při pozorování pomocí fázově kontrastního mikroskopu. Nezbytnou součástí optického mikroskopu při zjišťování vzhledu vzorku je kamera a většina mikroskopistů dnes používá digitální kamery. Digitální mikrofotografie poskytuje vysoce kvalitní snímky s dobrým rozlišením, za nízkou cenu a především umožňuje lepší kontrolu snímků, které je možné okamžitě vyhodnotit (rozhodující vlastnost při zkoumání labilních vzorků), a elektronickou archivaci. Při studiu vzorků za jiných než běžných podmínek, například při použití vyhřívaného stolku (sekce 9.7.1), je možnost nahrát videosekvenci, zachycující tepelně závislé změny pro jejich pozdější zhlédnutí, velmi výhodná. Mnohé mikroskopické snímky, které jsou součástí „nemikroskopických“ vědeckých

článků

a

časopisů,

jsou,

naneštěstí,

velmi

často

významně

nekvalitní,

v neakceptovatelných barvách, jsou rozostřené, jsou na nich viditelná rozmazaná zrnka prachu nebo jim chybí měřítko. Zručnost mikroskopisty je posuzována podle kvality mikrofotografií pořizovaných jako součást interních zpráv, prezentací a publikací. Mikroskopista zajišťuje kvalitu mikrofotografií správnou přípravou vzorků, správným nastavením osvětlení mikroskopu a vyvarováním se zobrazení v barvách, pokud je jednobarevný obrázek dostatečný pro znázornění požadovaných detailů. Digitální kamera nemusí být drahá ani složitá; dostatečně kvalitní mikrofotografie mohu být získány pomocí kompaktní ruční kamery, umístěné přímo v okuláru mikroskopu. Obrázek 9.2 Mikrofotografie tenkého filmu připraveného krému pro lokální aplikaci (Eumovate®), znázorňující nízkou viditelnost pod rovinně polarizovaným světlem (vlevo) a dobrou viditelnost při využití fázového kontrastu

5.4.2. Příprava vzorku pro optickou mikroskopii Mikroskopické preparáty, například prášky, připravené na mikroskopickém sklíčku, mohou být jak dočasné tak trvalé a většinou se skládají z malého množství vzorku rozptýleného v kapalném médiu, rozprostřeného mezi podložní a krycí sklíčko. Lze rovněž vyzkoušet přípravu vzorku za sucha, lae kontrast pak může být tak vysoký (kvůli velkému rozdílu hodnot indexů lomu vzduchu a vzorku), že částice, zejména malé, se mohou jevit jako neprůhledné. Dočasné preparáty se připravují



rozptýlením malého množství vzorku (1 – 2 mg) v nepřilnavém kapalném médiu, jako je silikonový olej, voda, glycerin nebo parafínový olej, a jsou prohlédnuty a před zlikvidováním případně vyfotografovány. Použité množství vzorku by mělo být natolik malé, aby dispergované částice nebyly viditelné, ale musí být dostatečné, aby mohlo být považováno za reprezentativní. Trvalé preparáty se skládají ze vzorku rozptýleného v průsvitné, bezbarvé pryskyřici, která tvrdne (ztuhnutím taveniny, odpařením rozpouštědla nebo po ozáření ultrafialovým zářením), a mohou být skladovány po neomezeně dlouhou dobu jako reference pro porovnávání s ostatními vzorky. Při přípravě mikroskopických preparátů z práškových vzorků je důležité ujistit se, že podložní i krycí sklíčko je čisté (nepředpokládejte, že jsou čistá, jen proto, že je to napsané na krabičce!) a že při přípravě nedošlo ke kontaminaci preparátu. Preparát by měl být co nejtenčí, aby byla potřebná hloubka ostrosti minimální a aby byly velké i malé částice dobře viditelné při malém a středním zvětšení. Pro předcházení problémům s hloubkou ostrosti, zejména při velkém zvětšení, je k dispozici snadno ovladatelný software zvyšující hloubku ostrosti snímáním sérií obrazů při různém stupni fokusace a jejich kombinací (Piper 2008). Pro přípravu preparátů je k dispozici mnoho různých typů vodných i nevodných podpůrných médií (McCrone a Delly 1973). Nejdůležitější je, aby se vzorek v podpůrném médiu nerozpouštěl ani s ním nereagoval a aby mezi médiem a částicemi vzorku byl dostatečný kontrast na to, aby byly částice viditelné. Pro přípravu dočasných preparátů je ideální silikonový olej, jelikož je prakticky inertní, rozpouští se v něm jen velmi málo pevných organických látek a má dobrý optický kontrast. Kontrast je zapříčiněn nízkým indexem lomu silikonového oleje (přibližně 1,4), který je mnohem nižší než indexy lomu většiny pevných organických látek (podle zkušeností autora se indexy lomu většiny pevných farmaceutik pohybují v rozmezí od 1,5 do 1,7). Na Obrázku 9.3a jsou znázorněny rozemleté krystaly sildenafil citrátu, jejichž viditelnost je nízká, jelikož jsou rozptýleny v kapalině o vysoké hodnotě indexu lomu, která je srovnatelná s hodnotou indexu lomu krystalů. Když je stejná sloučenina rozptýlena v kapalině, jejíž index lomu je odlišný (silikonový olej), kontrast mezi částicemi a kapalinou se zvýší a částice jsou snadno viditelné (viz Obrázek 9.3b).



Obrázek 9.3 Rozemleté krystaly farmaceuticky aktivní látky (sildenafil citrátu) rozptýlené (a) v kapalině s hodnotou indexu lomu téměř rovnou hodnotě indexu lomu látky, a (b)v silikonovém oleji (index lomu 1,4)

5.4.3. Charakterizace krystalických a amorfních materiálů s využitím polarizační optické mikroskopie Průhledné pevné látky jsou považovány za nekrystalické (amorfní) nebo krystalické a jejich optické vlastnosti mohou být zjištěny s využitím polarizační mikroskopie. Nekrystalické pevné látky jsou ty, jejichž molekuly jsou orientovány náhodně, bez uspořádání na velké vzdálenosti. Krystalické pevné látky jsou ty, jejichž atomy a molekuly jsou uspořádány v pravidelné, trojrozměrné mřížce s dalekodosahovým uspořádáním. Navíc, krystalické pevné látky mohou být jak izotropní (jejich vlastnosti nejsou závislé na směru pozorování), tak anizotropní, jejichž optické, fyzikální a chemické vlastnosti jsou závislé na směru pozorování. Pokud jsou anizotropní (dvojlomné) krystaly zkoumány mezi zkříženými polarizačními filtry, nabývají jasných barev, známých jako interferenční barvy nebo polarizační barvy (Hartshorne a Stuart 1970). Tyto barvy jsou výsledkem interakce světla s krystalovou strukturou. Rovinně polarizované bílé světlo vycházející z polarizačního filtru a vstupující do anizotropního krystalu je rozděleno na dva navzájem kolmé paprsky, jejichž směry sledují hlavní směry vibrací (které odpovídají rozdílným indexům lomu). Když tyto dva paprsky prostupují krystalem, jeden z nich je zpomalován více než druhý, protože prochází prostředím s vyšším indexem lomu. Poté, co oba paprsky opustí krystal, je jeden opožděn za druhým o několik nanometrů a barvy vznikají jako důsledek konstruktivní a destruktivní interference při rekombinaci obou paprsků v jedné rovině v analyzátoru. Opoždění narůstá s tloušťkou krystalu a s rozdílem mezi nejvyšší a nejnižší hodnotou indexu lomu. Rozdíly v tloušťce krystalu (například v důsledku šikmosti rovin) vedou ke vzniku různých barev, které jsou většinou pozorovány v barevných pásech, jež jsou ve skutečnosti zobrazením rovnoměrného zpomalení. Pokud je krystal orientován hlavními směry vibrací rovnoběžně s rovinami obou polarizačních filtrů, což je jev zvaný extinkce (bude diskutováno níže), žádné barvy nejsou viditelné. Izotropní



krystaly polarizační barvy nevytvářejí, protože světlo jimi procházející se šíří ve všech směrech stejně rychle a k interferenci nemůže dojít. Amorfní pevné látky (jako sklo, vymrazované nebo sprejově sušené prášky) a kubické krystaly (jako chlorid sodný) jsou izotropní a mají pouze jeden index lomu, značený n. Následkem toho nevykazují dvojlom a při pozorování mezi zkříženými polarizačními filtry nedávají vznik interferenčním barvám. Přestože jsou izotropní krystaly farmaceutických látek vzácné, možnost jejich výskytu ve vzorcích, i jen malého množství, by nikdy neměla být vyloučena (např. malé krystaly chloridu sodného vzniklé po neutralizaci kyseliny nebo báze). Častější jsou vymrazované nebo sprejově sušené materiály jako konečné produkty. Je nutné říct, že izotropní pevné látky (zejména rychle ochlazené sklo) může někdy vytvářet slabé interferenční barvy kvůli částečnému uspořádání molekul vzniklého v důsledku pnutí. Kromě krystalických pevných látek se řada farmaceutických látek vyskytuje ve formě kapalných krystalů nebo mezofází. Kapalné krystaly jsou látky s vlastnostmi pevných látek i kapalin a je snadné je zkoumat a charakterizovat s využitím polarizační mikroskopie, což bude detailněji popsáno v oddíle 9.7.4.

5.4.4. Určování optických vlastností krystalů Vzorek může být zkoumán bez polarizačních filtrů (t. j. nepolarizovaným světlem), nebo s využitím jednoduše polarizovaného (t. j. rovinně polarizovaného) světla, nebo mezi dvěma polarizačními filtry orientovanými kolmo na sebe (t. j. zkříženými polarizačními filtry). Při použití nepolarizovaného světla nemohou být optické vlastnosti vztaženy k rovině polarizace a zjištěny mohou být jen průměrné vlastnosti (jako index lomu nebo barva); tvary a velikosti částic mohou být rovněž určeny. Pozorování s využitím rovinně polarizovaného světla nabízí diagnostické analytické informace o optických vlastnostech krystalů, například o směrech, v nichž je hodnota indexu lomu nejnižší resp. nejvyšší, vzhledem ke krystalografickým osám nebo určitým plochám krystalu. V případě barevných anizotropních krystalů je další diagnostickou vlastností pleochroismus, při němž je při pozorování rotujícího krystalu pod rovinně polarizovaným světlem selektivně absorbováno světlo o určité vlnové délce (Hartshorne a Stuart 1970). Absorpce je řízena strukturou krystalu a pleochroismus nevykazují Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 153


bezbarvé krystaly, ale lze jej předpokládat u výrazně barevných farmaceuticky aktivních látek (žlutých, oranžových nebo červených) a je pozorován jako, někdy velmi nepatrná, změna barvy nebo její intenzity. Na rozdíl od izotropních materiálů, anizotropní krystaly jsou běžnými farmaceutickými látkami a při pozorování mezi zkříženými polarizátory vykazují jasné interferenční barvy díky dvojlomu. Jsou charakteristické tím, že mají dvě hlavní hodnoty indexu lomu (zvané „epsilon“ a „omega“, nebo E pro mimořádný (Extraordinary) a O pro řádný (Ordinary)) v případě jednoosých krystalů, nebo tři hlavní hodnoty indexu lomu (zvané „alfa“, „beta“ a „gamma“ nebo X, Y a Z v pořadí podle zvyšující se hodnoty indexu lomu) pro dvouosé krystaly (Hartshorne a Stuart 1970). Jednoosé krystaly mají jednu optickou osu a patří do hexagonální, trigonální nebo tetragonální krystalové soustavy. Dvouosé krystaly, které mají dvě optické osy, patří do orthorombické, monoklinické a triklinické soustavy. Pečlivým určením optických vlastností pevných látek (jak dobře formovaných krystalů, tak fragmentů nepravidelných tvarů) s využitím polarizační mikroskopie je možné velmi rychle zjistit, zda jsou amorfní nebo krystalické a zda jsou jednoosé nebo dvouosé. Hlavní hodnoty indexu lomu anizotropních krystalů mají jednoznačné směry, které jsou navzájem kolmé a které se shodují se směry, v nichž krystalem prostupuje světlo (Hartshorne a Stuart 1970). U hexagonálních, trigonálních, tetragonálních a orthorombických krystaly se tyto směry shodují rovněž s hlavními krystalografickými osami. V případě monoklinických krystalů se s krystalografickými osami shodují pouze dva směry šíření světla (nebo i tři v případě, že velikost krystalografického úhlu β je blízká 90°, přičemž tento krystal může být zaměněn za orthorombický krystal, tj. je pseudo-orthorombický). V případě triklinických krystalů, všechny tři, dva, jeden nebo žádný ze směrů šíření světla souhlasí se směrem krystalografických os. Při pozorném mikroskopickém zkoumání optických vlastností krystalů v různých směrech vzhledem k rovině polarizovaného světla je možné dát tyto vlastnosti do souvislosti s tvary krystalů a určit, do které krystalografické soustavy, a případně i bodové grupy, krystaly náleží. Pro měření krystalových ploch a orientovaných úhlů, které plochy svírají, s přesností nutnou pro výpočet poměrů os je třeba užít optickou goniometrii (pro mikroskopické krystaly) nebo kontaktní goniometrii (pro velké krystaly) a dobře formované monokrystaly (Terpstra a Codd 1961). Po stanovení těchto Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 154


základních parametrů mohou být identifikovány krystalové plochy a vypočítány Millerovy indexy. Tato metoda byla užívána krystalografy před téměř 100 lety, kdy ještě nebyla k dispozici metoda rentgenové difrakce. Při použití mikroskopu s otočným stolkem (t. j. používaným jako jednokruhový goniometr) je možné měřit skutečné úhly svírané sousedními krystalovými plochami, ale jen pokud jsou kolmé k rovině stolku (Donnay a O´Brien 1945). Krystalové plochy orientované šikmo k rovině stolku svírají zdánlivý úhel a skutečný úhel může být změřen pomocí grafických metod. Pro příliš malé krystaly (např. o velikosti 10 µm nebo menší) byly za účelem měření s využitím optického mikroskopu nebo v upevnění na dvoukruhovém goniometru využity obrazy krystalových ploch získané při měření na skenovacím elektronovém mikroskopu (Strom 1976). Nicméně, mikroskopické goniometrická měření by byla časově náročná a nejspíš nejsou praktickou alternativou moderních krystalografických technik používaných ve vytížených laboratořích s omezenými časovými možnostmi. Pro podporu regulací a patentových přihlášek farmaceutických látek, jednoznačné a co nejpřesnější zařazení krystalu do prostorové grupy vyžaduje přesnost rentgenové krystalografie. Některé krystalové struktury, které byly popsány před více lety s využitím rentgenových krystalografických metod, jsou dnes znovu měřeny kvůli opravám nepřesností v určení indexů hlavních ploch, příkladem budiž aspirin (Aubrey-Medendorp a kol. 2008). Mikroskopická pozorování jsou stále užitečná, protože pomáhají určení a ověření krystalové struktury. Popsané nákresy krystalů nejsou většinou pro regulační orgány nezbytné, ale mohou být užitečné při monitorování změn ve vzhledu krystalů během vývoje léčiv. Pokud nemůže být struktura krystalu určena, například u příliš malých krystalů, může samotné pozorování pod mikroskopem poskytnout dostatek informací pro rozlišení různých forem pevných látek a včasný výběr kandidátů pro další vývoj do doby, než budou k dispozici krystaly vhodné pro analýzu. Anizotropní monokrystal (t. j. neaglomerovaný a nezdvojčatělý) nebo jeho fragment je pozorován mezi zkříženými polarizačními filtry, interferenční barvy jsou nejlépe viditelné při otočení stolku o 90°. Mezi těmito čtyřmi maximy jsou čtyři polohy o minimální jasnosti, kde dochází k jevu známému jako extinkce (zhášení), při němž se krystal stane neviditelným, protože se navzájem kolmé optické směry překrývají s rovinami polarizace polarizátoru a analyzátoru. Extinkční úhly jsou diagnostickými optickými vlastnostmi a mohou být využity pro zjištění, zda je krystal monoklinický nebo triklinický



(Hartshorne a Stuart 1970). Některé dvouosé krystaly v extinkční poloze nezčernají úplně, ale zůstanou slabě zabarvené, nebo se jejich barva dokonce změní (např. ze žluté na modrou) po obou stranách okolo polohy o minimální jasnosti; tento jev je znám jako disperzní extinkce a dochází k ní například u monoklinického krystalu partacetamolu, který je pozorován podél osy b (Nichols 1998). Při měření extinkčního úhlu je přední hrana krystalu umístěna rovnoběžně s jednou z úseček nitkového kříže v okuláru mikroskopu (přitom je nutné dočasně vychýlit polarizační filtry ze zkřížené polohy) a je zaznamenána velikost úhlu na kruhové stupnici otočného stolku. Stolek je poté otáčen, dokud nedojde k extinkci, je zaznamenána aktuální velikost úhlu a velikost extinkčního úhlu je vypočtena jako rozdíl zaznamenaných velikostí (podle konvence velikost extinkčního úhlu nepřesahuje 45°). Hexagonální, trigonální, tetragonální a orthorombické krystaly vykazují přímou (nebo rovnoběžnou) extinkci a zčernají, pokud jsou jejich dlouhé hrany, které jsou rovnoběžné s optickými směry krystalu, rovnoběžné s úsečkami nitkového kříže v okuláru mikroskopu. Pokud není dlouhá hrana rovnoběžná s optickým směrem, může dojít k extinkci v poloze, v níž je hrana sdílená dvěma hlavními krystalovými rovinami půlená úsečkami nitkového kříže, a tato extinkce je nazývaná symetrická extinkce. Nicméně, v případě monoklinických krystalů bude stejný krystal v různých orientacích vykazovat jak přímou, tak šikmou (nebo nakloněnou) extinkci, což je nejvíce patrné u protáhlých krystalů, jako jsou jehlice a hranoly. K tomuto jevu dochází, protože monoklinický krystal bude při pozorování podél roviny souměrnosti, která obsahuje krystalografické osy a a c (t. j. která je kolmá na krystalografickou osu b), vykazovat přímou extinkci. Pokud není směr pozorování kolmý k této rovině, krystal bude vykazovat šikmou extinkci a pozorovaná velikost úhlu se bude zvyšovat až do maximální hodnoty, které dosáhne, když je krystal pozorován ve směru rovnoběžném s osou b. Pro objasnění je na Obrázku 9.4 znázorněn monoklinický monokrystal paracetamolu pozorovaný pod dvěma různými úhly při otáčení po krocích o velikosti 45° kvůli demonstraci jak přímé, tak šikmé extinkce (všimněte si, že tyto snímky byly pořízeny s využitím polarizačních filtrů lehce odkloněných od zkřížené polohy, a proto jsou extinkční polohy viditelné). Za účelem prohlédnutí pod různými, navzájem kolmými směry, byl krystal otočen v kapalném médiu o 90° a byl tedy pozorován jak ve směru kolmém na krystalografickou osu b, tak i v jejím směru.



V případě triklinických krystalů může dojít k přímé extinkci, ale není to běžné, charakteristická je šikmá extinkce. Při zkoumání nepravidelně tvarovaných krystalů nebo jejich rozdrcených úlomků nebude nejspíš možné určit, zda mají charakteristický extinkční úhel, pod nímž není viditelná žádná z hlavních hran krystalu. Nicméně, pečlivé prozkoumání úlomků krystalu může odhalit přítomnost lineárních charakteristik závislých na struktuře, jako jsou štěpné plochy nebo stopy okluzí kapaliny, které kopírují krystalové plochy, které mohou být využity při měření extinkčního úhlu. Izotropní částice může být ve formě dobře vyvinutého krystalu nebo, nejčastěji, ve formě skelného materiálu (jako jsou podchlazené taveniny nebo materiály získané sprejovým sušením nebo vymrazováním). Aby byly od sebe tyto formy odlišeny, částice by měla být prohlédnuta (s využitím rovinně polarizovaného světla) kvůli zjištění přítomnosti krystalových ploch nebo stop štěpných rovin (někdy jsou viditelné jako přímé rovnoběžné linie uvnitř krystalu), které mohou být nevyvratitelným důkazem, že jde o krystal. Nedeformované izotropní krystaly zůstávají při rotaci stolku trvale v extinkci. Částice skelného materiálu nemají tyto vlastnosti, ale jsou obvykle nepravidelného tvaru s ostrými hranami a pravděpodobně i se zakřivenými lomnými plochami. Částice získané sprejovým sušením mají sklený charakter a jsou často kulové a duté. Obrázek 9.4 Složená mikrofotografie znázorňující dva pohledy na monokrystal monoklinického paracetamolu v pozici přímé (vlevo) a šikmé (vpravo) extinkce při rotaci s krokem 45° z pozice o maximální jasnosti; je vyznačen úhel šikmé extinkce (asi 36°) při pohledu rovnoběžném s osou b, mikrofotografie byly pořízeny při mírném vychýlení polarizačních filtrů z navzájem kolmých poloh pro zviditelnění extinkčních poloh Polykrystalická částice, skládající se z mnoha malých krystalků, pravděpodobně nebude mít při pozorování mezi zkříženými polarizátory přesnou extinkční pozici. Práškové materiály mohou obsahovat tyto částice, které se mohou vyskytovat jako aglomeráty, shluky nebo jehlice (možná i jako sferulity ), vrstvy plochých krystalů, nebo dokonce jako pseudomorfy, které se zformovaly po konverzi mezi dvěma pevnými polymorfními fázemi nebo po desolvataci solvátu. Příklad polykrystalického pseudomorfu latovitého tvaru, jehož krystalky jsou orientovány nahodile jako mozaika, je uveden na Obrázku 9.5. Když je jeden z krystalků v extinkční poloze, sousední krystalky jsou jasné a naopak. Celkový efekt je ten, že polykrystalická částice nevykazuje při rotaci mezi zkříženými polarizátory jednu extinkční pozici. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 157


Dislokace v krystalu se obvykle objevují na úrovni molekul nebo atomů jako důsledek napětí způsobených rychlým růstem krystalu nebo mechanickou deformací (jako je mletí) a mohou způsobit ohnutí krystalové mřížky. Dislokace nejsou přímo viditelné v optickém mikroskopu, takže pro jejich detailní studium je nutno použít mikroskop s rozlišením na úrovni atomů, jako transmisní elektronový mikroskop nebo mikroskop atomárních sil. Nicméně pokud jsou dislokace v krystalu přítomny, mohou způsobit narušení mřížky napětím a mohou být rozeznány při pozorování mezi zkříženými polarizátory jako vlnitá extinkce. Vlnitá extinkce je patrná jako tmavá „vlna“ probíhající napříč monokrystalem, když je jím otáčeno na stolku a různé části krystalu se dostávají do extinkce. Tato nepřítomnost jediné extinkční polohy, způsobená napětím v krystalové mřížce, není totožná s disperzní extinkcí (popsána výše) nebo polykrystalinitou, přestože v polykrystalu může rovněž dojít k napětí mřížky v důsledku změn struktury při polymorfních přeměnách nebo desolvataci. Napětí krystalové mřížky, které je výsledkem krystalizace z rychle zchlazené taveniny, je detailněji popsáno v oddílu 9.7.1. Krystaly, v nichž došlo k napětí mřížky, se mohou rozpouštět rychleji než krystaly bez mřížkového napětí, protože napětí je spojeno s částmi krystalu majícími velkou krystalizační energii. Následkem toho může být napětí mřížky žádanou vlastností některých farmaceutických materiálů pro zvýšení jejich rozpustnosti. Polarizační mikroskopie může být tedy použita kvalitativně při zjišťování přítomnosti krystalů s napětím mřížky ve vzorku. Pro kvantitativní analýzu krystalů s napětím byl vyvinutý automatický mikroskop, s jehož pomocí lze, s využitím zobrazení monochromatickým světlem, rychle stanovit prostorové rozdělení změn dvojlomu napříč vzorkem (Glazer a Geday 2002). Obrázek 9.5 Polykrystalický pseudomorf vytvořený během vývoje farmaceuticky aktivní látky, na němž je patrná mozaikovitá textura krystalků, které při pozorování mezi zkříženými polarizátory nevykazují jednu určitou extinkční polohu Kvantitativní mikroskopie nebude vhodná pro mnoho práškových materiálů, zejména pro ty tvořené malými částicemi, a pro zjištění velikosti napětí v těchto vzorcích bude tedy vhodnější technikou prášková rentgenová difrakce, při níž bude sledováno rozšíření píku způsobené poruchou mřížky. U látek nevykazujících napětí ani dvojlom nejsou při pozorování mezi zkříženými polarizátory patrné interferenční barvy, tyto látky se jeví černé na černém pozadí. Je to cenná a snadno



pozorovatelná vlastnost, díky níž lze odlišit izotropní vzorky od anizotropních. Nicméně, jelikož nejsou viditelné, mohou být izotropní částice (jako je sklo) ve směsi s anizotropními krystaly při pozorování mezi zkříženými polarizátory přehlédnuty. Naštěstí existuje mnoho jednoduchých způsobů nastavení mikroskopu pro pozorování izotropních a anizotropních částic zároveň. Jedním z těchto způsobů je odchýlení jednoho z polarizátorů jen o několik stupňů tak, že se zorné pole zbarví do šeda a všechny částice se stanou viditelnými. Pro příklad, na Obrázku 9.6 je uvedena mikrofotografie směsi mleté sacharózy (anizotropní) a částeček v mrazu sušené sacharózy (izotropní) rozptýlené v silikonovém oleji, pořízená s využitím zkřížených polarizátorů. Jen pokud jsou polarizátory mírně vychýlené ze zkřížené polohy (asi o 10°), se skelné a houbovité částice v mrazu sušené sacharózy stanou viditelnými (Obrázek 9.6b). Interferenční barvy vznikající při pozorování anizotropních částic mezi polarizátory částečně vychýlenými ze zkřížené polohy budou podobné těm, které jsou pozorovány při zkřížené poloze polarizátorů. Anizotropní částice umístěné v extinkční poloze mohou být zaměněny za izotropní. Pro zjištění, zda jsou takové částice anizotropní, musí být stolek pootočen o několik stupňů dozadu a dopředu a sleduje se, zda částice opustí extinkční polohu. Další metodou zobrazení směsi izotropních a anizotropních částic je vložení citlivé barevné kompenzační destičky (byla popsána v oddíle 9.4.1), ale, mimo zbarvení pozadí do purpurova, nemá tato metoda, ve srovnání s polarizátory vychýlenými ze zkřížené polohy, žádné významné výhody, protože se při ní nelze vyhnout extinkční poloze. Aby bylo jisté, že všechny anizotropní částice budou ve všech orientacích jasné, jsou jejich extinkční polohy při použití kruhově polarizovaného světla vyloučeny. Toho je dosaženo zařazením dvou zkřížených čtvrtvlnových kompenzátorů (jeden pod a druhý nad vzorkem, ale zároveň mezi polarizačními filtry) a pro sledování izotropním i anizotropních částic ve směsi musí být polarizátory částečně vychýleny ze zkřížené polohy (McCrone a kol. 1979). Obrázek 9.6 Mikrofotografie znázorňující směs mleté anizotropní sacharózy a izotropních částic v mrazu sušené sacharózy rozptýlené v silikonovém oleji, pořízená mezi zkříženými polarizátory (a) a mezi polarizátory vychýlenými o 10°(b) pro zobrazení skelných, houbovitých částic v mrazu sušené sacharózy



Anizotropní částice pozorované s využitím kruhově polarizovaného světla jsou rovněž ideální pro obrazovou analýzu, jelikož všechny částice jsou jasné proti tmavému pozadí a obrazy jsou tedy dostatečně binárně rozlišené a připravené pro počítačový záznam obrazu bez nutnosti komplexního zpracování obrazů před analýzou. Polarizační optická mikroskopie může být samozřejmě použita pro detekci dvojlomu v malých množstvích vzorku pro zjištění, zda jsou krystalické, amorfní, nebo jde o směs obou dvou. Během vývoje farmaceuticky aktivních látek je vyvíjena velká snaha o zajištění jejich krystality, která umožňuje kontrolu čistoty a chemické stability, a o zajištění stálé produkce správné formy pevné látky. Nicméně, krystalický materiál je méně rozpustný ve vodě než amorfní forma stejné látky a proto může být výběr optimální formule o odpovídající vstřebatelnosti při orálním podání náročný. Pro překonání špatné rozpustnosti některých krystalických farmaceuticky aktivních látek ve vodě jsou mnohými vědci zkoumány nové formule, zvané pevné disperze. Osahují amorfní farmaceuticky aktivní látky, které jsou důkladně promíchány s amorfním polymerním stabilizátorem, jako je PVP nebo PEG, sprejovým sušením, lisováním horké taveniny nebo sušením v mrazu. Během vývoje pevných disperzí je pro pozorování interakcí krystalických farmaceuticky aktivních látek s polymerem za vysokých teplot často užívána polarizační termomikroskopie (Lloyd a kol. 1997); Lakshman a kol. 2008). Teplota, při níž farmaceuticky aktivní látka taje za vzniku pevné disperze, je rychle určena, jelikož se z ní stává izotropní kapalina (možná ve formě eutektika s polymerem) a při pozorování mezi zkříženými polarizátory nevykazuje žádné interferenční barvy. Roztavená farmaceuticky aktivní látky by měla být, v ideálním případě, mísitelná s polymerem, což je dokázáno ochlazením preparátu a potvrzením nepřítomnosti dvojlomných krystalů, které by vznikly při rekrystalizaci. Zařízení pro detekci dvojlomu mohou být umístěna do automatizovaného, vysoce výkonného systému pro kontrolu solí a polymorfů, aby bylo možno pátrat po známkách krystality v destičkách s mnoha prohlubněmi (Desrosiers 2004; Sugano a kol. 2006). Nicméně, použití polarizační mikroskopie pro detekci dvojlomu není způsob pro rozlišení mezi amorfními a krystalickými materiály. Některé skelné částice mohou vykazovat napětí, například kvůli rychlé krystalizaci při odpařování roztoku. Toto napětí může zapříčinit protažení molekul, při němž částice vykazují dvojlom



a často také interferenční barvy a extinkční polohy při pozorování mezi zkříženými polarizátory. Nepřítomnost interferenčních barev a extinkčních poloh rovněž neznamená, že jsou částice amorfní. Například trigonální nebo hexagonální krystal se při pozorování přesně ve směru jeho optické osy (která odpovídá krystalografické ose c) nachází v extinkční poloze při jakémkoli natočení stolku (Hartshorne a Stuart 1970). Taková částice může být při aplikaci testu pro charakterizaci krystality, navrženém USP (US Pharmacopoeia 2009a) chybně označena za nekrystalickou. Izotropní částice, které vykazují napětí, se budou naopak vyznačovat určitým stupněm uspořádanosti molekul a budou vytvářet interferenční barvy nízkého řádu a při každém pootočení o 90° budou vykazovat extinkční polohu. Díky tomu mohou být tyto částice chybně označeny za krystalické. Pro potvrzení krystalického charakteru vzorku by měla být použita rentgenová difrakce ve spojení s mikroskopií. Pro vyhodnocení stupně krystality není možné používat samostatně polarizační mikroskopii, a proto by měly být využívány další techniky, jako rentgenová difrakce, kalorimetrie nebo NMR pevné fáze.

5.4.5. Měření indexu lomu pevných látek Index (nebo indexy) lomu průhledné pevné látky patří mezi fyzikální konstanty a je cennou diagnostickou vlastností, která může být využita pro charakterizaci materiálů. Různé pevné fáze jedné sloučeniny (jako polymorfy a solváty) mají rozdílné hodnoty hlavních indexů lomu, protože jejich krystalové struktury jsou odlišné (Hartshorne a Stuart 1970). Indexy lomu pevných látek jsou snadno určeny s využitím optické mikroskopie při postupném vkládání krystalu nebo jeho úlomků do kapky kapaliny o známém indexu lomu (jako jsou ty dostupné u Cargille Laboratoires, New Jersey, USA) na podložním sklíčku. Beckova linie (pás jasného světla pohybující se při změně fokusace mikroskopu do částice a zase ven z částice) je využívána pro zjištění, zda je index lomu částic vyšší nebo nižší než index lomu kapaliny. Pokud má index lomu částic stejnou hodnotu jako index lomu kapaliny, nejsou částice viditelné, protože mají minimální kontrast (Wahlstrom 1960). Tento nedostatek kontrastu je znázorněn na Obrázku 9.3. Je potřeba pečlivě zajistit, aby se částice v kapalině nerozpouštěly (může být nezbytné prohlédnout preparát mezi zkříženými polarizátory pro ujištění, že částice jsou stále přítomny).



Izotropní materiály, jako je sklo a kubické krystaly, mají jedinou hodnotu indexu lomu (při určité teplotě a vlnové délce světla), která může být zjištěna s využitím nepolarizovaného světla na jakékoli částici v jakékoli orientaci. V případě anizotropních krystalů, které mají dvě (jednoosé krystaly) nebo tři (dvouosé krystaly) hlavní hodnoty indexu lomu, musí být pro definování roviny polarizace při osvitu použito rovinně polarizované světlo. Jednou z metod, při níž je potřeba určit průměrnou hodnotu indexu lomu práškového materiálu, je při výpočtu hodnoty podle Mieovy teorie při měření velikosti částic pomocí rozptylu laserového záření. Měření dvou nebo tří hodnot indexu lomu anizotropních krystalů je ztíženo kvůli skutečnosti, že krystaly musí být pečlivě orientovány vzhledem k rovině polarizátoru, což se provádí jejich otáčením v kapalině (Hartshorne a Stuart 1970). Jakmile je toto provedeno, je možné změřit dvě nebo tři hlavní hodnoty indexu lomu podél navzájem kolmých směrů v krystalu. Tato metoda byla použita pro měření a popis optických vlastností dvou forem paracetamolu (Nichols 1998).

5.4.6. Určení mikrorozpustnosti pevných látek Kvalitativní určení rozpustnosti sloučeniny v různých rozpouštědlech může být provedeno rychle za pokojové teploty s využitím malého množství vzorku nebo i jen jednotlivých krystalů při jejich pozorování v optickém mikroskopu. Jednoduchý způsob provedení tohoto testu rozpustnosti je založen na pomalém přikapávání rozpouštědla z mikropipety na hranu krycího sklíčka, pod nímž je umístěno několik částic látky. Částice by měly být pozorovány ve chvíli, kdy rozpouštědlo proniká pod krycí sklíčko a přichází s částicemi do kontaktu. Čas, který je potřeba na rozpuštění sloučeniny (pokud se rozpouští) je úměrný její rozpustnosti v daném rozpouštědle. Dobře rozpustné sloučeniny se většinou začnou rozpouštět už v parách rozpouštědla, které předchází kapalnou fázi a dostává se do kontaktu s částicemi dříve. U špatně rozpustných látek je patné pouze lehké zaoblení hran a rohů, a proto může být rychlost rozpouštění zvýšena rozdrcením částic nebo lehkým zahřátím sklíčka (pokud rozpouštědlo není příliš těkavé). Jiná metoda spočívá v přidání jediné částice testovaného vzorku do jedné kapky rozpouštědla na podložním sklíčku bez použití krycího sklíčka. I špatná rozpustnost látky může být potvrzena vznikem prstence z malých krystalů okolo okraje kapky nebo soustředných prstenců obkružujících částici při Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 162


odpařování rozpouštědla. Tyto malé krystaly mohou samozřejmě být solváty, ale jejich přítomnost naznačuje, že testovaná částice je v rozpouštědle do určité míry rozpustná. Příklad použití této citlivé metody je uveden na obrázku 9.7, kde je znázorněn úlomek phenacetinu o velikosti 1 mm, který byl vložen do malé kapky vody přibližně 10 minut předtím, než vyschla. Přestože je phenacetin jen částečně rozpustný ve studené vodě (přibližně 0,5 mg/ml), vytvořilo se mnoho malých krystalů, přičemž ty nejvíce vně odpovídají okraji kapky vody. Další mikroskopický test rozpustnosti, který může být použit pro jednotlivé částice o hmotnosti menší než 1 ng, spočívá ve vložení částice do par rozpouštědla. Oproti ostatním metodám má tato metoda výhodu v možnosti postupně vystavit stejnou částici parám několika různých rozpouštědel. Při této metodě je používána parní komora, skládající se ze skleněného kroužku (krátká část skleněné trubice s jemně zaoblenými konci) umístěného na podložním sklíčku a krycího sklíčka uzavírajícího komoru, pod něž se vkládá testovaná částice (McCrone 1983). Ke spodnímu okraji skleněného kroužku je přidána jedna kapka rozpouštědla a díky kapilaritě je vtaženo do parní komory ve formě syté páry. Obrázek 9.7 Mikroskopický test rozpustnosti potvrzující částečnou rozpustnost phenacetinu ve vodě při pokojové teplotě. Velký úlomek částečně rozpuštěného phenacetinu je obklopen kroužky malých krystalů phenacetinu, které rekrystalizovaly při odpařování kapky vody Částice je pozorována pod mikroskopem (při velkém zvětšení, pokud je to nutné) skrz krycí sklíčko a je sledováno, zda páry kondenzují a rozpouštějí částici. Při výměně rozpouštědla je krycí sklíčko opatrně nadzvednuto ze skleněného kroužku (aby mohl zbytek páry uniknout a aby, pokud je to nutné, mohla částice oschnout a rekrystalizovat) a poté je umístěno zpět, a procedura se může opakovat s dalším rozpouštědlem. Autor jednou použil tuto proceduru pro testování rozpustnosti jediné částice o velikosti 20 µm v sedmnácti různých rozpouštědlech a pro výběr nejlepšího rozpouštědla pro hmotnostní spektrometrii malého množství kontaminantu izolovaného z produktu pro parenterální použití. V ideálním případě by mělo být výhodné provést kvantitativní mikroskopický test rozpustnosti, zejména pokud je k dispozici pouze malé množství materiálu. Naneštěstí neexistuje žádná snadný způsob kvantitativního provedení mikroskopického testu rozpustnosti (W. C. McCrone, personální Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 163


komunikace, 18. leden 1994). Jeden způsob vyžaduje přesné určení hmotnosti jednotlivé částice nebo krystalu, a to vážením na ultramikrovahách nebo měřením jeho rozměrů pro výpočet hmotnosti ze vztahu objem x hustota. Jen poté může být rozpustnost určena při použití známého objemu rozpouštědla. Tato metoda může poskytovat výsledky zatížené chybami a nejspíš bude stále používána jen pro zjištění relativní rozpustnosti.

5.5. Tvar krystalů Při charakterizaci farmaceutických materiálů v pevném stavu poskytuje pozorování jejich krystalů v práškové nebo kašovité formě pod mikroskopem cenné informace o jejich tvarech. Vnější tvar krystalu, nebo přesněji jeho vzhled, je ovlivněn jeho vnitřní strukturou a společným růstem vzájemně symetrických ploch. Změna tvaru krystalů rostoucích z roztoku je silně ovlivněná mnoha faktory, mezi něž patří stupeň přesycení, rychlost ochlazování, polarita rozpouštědla, teplota a obsah nečistot (Davey a Garside 2000). Krystaly rostoucí z taveniny nebo páry nejsou ovlivněny rozpouštědlem a v důsledku toho ovlivňuje tvar krystalů teplota, rychlost ochlazování a tlak par. Tvary krystalů známým způsobem ovlivňují proces jejich zpracovávání, filtrovatelnost, chemickou a fyzikální stabilitu, chování při tabletování a chování při rozpouštění (Haleblian 1975; Tiwary 2001). Rozpoznání jakýchkoli změn, jakkoli nepatrných, ve tvaru krystalů z různých dávek sloučeniny může být varováním upozorňujícím na změny v průběhu krystalizace, které mohou ovlivnit zpracovatelnost výsledného produktu. Byla provedena i studie porovnávající experimentálně zjištěné tvary tří polymorfů jedné farmaceutické sloučeniny s tvary předpovězenými z krystalové struktury (Coombes a kol. 2002). Závěrem tohoto výzkumu bylo, že rozdíly mezi skutečnými a vypočítanými tvary potvrzují význam rozpouštědla při růstu krystalů. Krystaly jsou trojrozměrné objekty a pro přesný popis jejich tvarů je potřeba sledovat a změřit jejich délky, tloušťky a šířky. Nicméně jakmile je podložní sklíčko připravené, ploché a protáhlé krystaly budou mít tendenci se pokládat a ležet ve stabilní pozici na svých největších plochách (stav známý jako preferovaná orientace) a zobrazena je největší promítnutá oblast. Následkem toho není vždy patrná tloušťka krystalu a částice jsou pod mikroskopem pozorovány jako dvourozměrné Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 164


objekty. Bez znalosti jejich tloušťky nemůže být jejich tvar popsán s jistotou. Vědomí o jejich tloušťce může být získáno zaostřováním nahoru a dolů skrz krystal a jejich trojrozměrné tvary mohou být získány velmi rychle (je nutné poznamenat, že jemné zaostření optického mikroskopu je stupňováno po jednotkách o velikosti přibližně 1 µm). Jiný, praktičtější a rychlejší postup je otáčení krystalů tak, že jejich trojrozměrné tvary mohou být pozorovány, jemným pohybováním krycím sklíčkem po preparátu s pomocí jehlové sondy. Vzhled krystalů může být popsán pomocí mnoha termíny, z nichž většina je odvozená z termínů užívaných mineralogy a krystalografy. Specifické typy krystalů mají specifické názvy, jako osmistěn nebo hexagonální bipyramida, a může být obtížné je přiřadit, zejména pokud jsou tyto krystaly pozorovány jen v jednom směru, jejich růst nebyl pravidelný nebo byly popisovány spíš podle dvourozměrné mikrofotografie než podle „živého“ obrazu. Specifické názvy by proto měly být užívány, jen pokud neexistují žádné pochybnosti o tvaru krystalu; název jako „podobný osmistěnu“ stačí pro vyhnutí se jakékoli nejasnosti. Pro jednoduchost a srozumitelnost je zavedeno šest základních tvarů (Hartshorne a Stuart 1970; McCrone a Delly 1973). Ty s nízkým poměrem šířky k výšce mají vysokou symetrii, ať už jsou krychlovité nebo kulovité; destičky jsou ploché a mají vzhled tablet; vločky jsou ploché a tenké; laťky jsou dlouhé a lístkovité; hranoly jsou sloupcovité; jehlice jsou dlouhé a tenké s vysokým poměrem šířky k výšce. Na obrázku 9.8 jsou tyto základní tvary znázorněny a krystaly těchto tvarů mohou patřit do kterékoli ze sedmi krystalografických soustav. Obrázek 9.8 Šest základních tvarů krystalů Tyto názvy tvarů jsou doporučeny pro popis tvarů částic farmaceutických látek (US Pharmacopoeia 2009a). Další termíny, jako: stužkovitý, vláknitý, tyčinkovitý, čtvercového tvaru, šestiúhelníkového tvaru, zaoblený a hranatý, by měly být rovněž užívány pro detailnější a srozumitelnější podání informací o tvaru (Nichols 2006). Popis tvaru krystalu může být poněkud subjektivní, i pokud je jako vodítko užíváno šest základních tvarů. Mnoho vědců se pokoušelo (s různou úspěšností) odstranit vliv pozorovatele pomocí automatického rozeznávání tvarů s využitím obrazové analýzy. Automatizovaná analýza obrazu může být využita pro laboratorní vzorky v systému založeném na mikroskopu pracujícím v off-line režimu



(Faria a kol. 2003) nebo jako část systému monitorujícího růst krystalů různých tvarů v krystalizéru v reálném čase (Calderon De Anda a kol.2005). Rozdílné polymorfní formy sloučeniny jsou často charakteristické svými rozdílnými tvary. Například forma I paracetamolu (monoklinická) se vyskytuje ve formě destiček, kdežto forma II (orthorombická) ve formě jemných jehlic, jak je vidět na Obrázku 9.9. Obrázek 9.9 Jehličkovité krystaly formy II paracetamolu, které se mění při fázové přeměně v nasyceném roztoku benzylalkoholu na destičky formy I (měřítko=250 µm) Pokud tvoří jedna sloučenina krystaly různých tvarů, neznamená to vždy, že jde o různé polymorfy, ale spíše to znamená, že tyto krystaly rostly za různých podmínek. Obrázek 9.10 Různé tvary krystalů monomorfní farmaceuticky aktivní látky krystalizované z toluenu (vlevo) a z IPA (vpravo) Například, na Obrázku 9.10 jsou znázorněny dva výrazně odlišné tvary krystalů monomorfního protiplísňového léku, které krystalizovaly z roztoků v různých rozpouštědlech; výsledky práškové rentgenové difrakce těchto dvou vzorků potvrdily shodnost jejich krystalových struktur, přestože ukázaly výrazný vliv preferované orientace. Různé polymorfní formy téže látky naopak mohou být tvořeny krystaly stejných tvarů.

5.6. Velikost částic Chování látky v práškové formě neovlivňují jen tvary krystalů (viz kapitola 9.5), ale i distribuce částic různých velikostí bude mít velký vliv na její chování při rozpouštění, na tokové vlastnosti, na aerodynamické vlastnosti částic aerosolu a na stabilitu suspenzí (Brittain a kol. 1991). Mikroskopy zvětšují obrazy vzorků nad velikost viditelnou pouhým okem a jsou používány pro pozorování a měření částic, jejichž velikost se pohybuje v řádu od několika milimetrů v průměru do několika nanometrů v průměru. Většina práškových materiálů, s nimiž se lze setkat během vývoje medicínských produktů, má distribuci velikostí částic pohybující se mezi přibližně 1000 µm (1 mm) a přibližně 0,01µm (10 nm). Velikost krystalů farmaceuticky aktivních látek, vzniklých při krystalizaci z objemu roztoku, se pohybuje typicky od cca 1 mm do cca 10 µm a jsou snadno pozorovatelné Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 166


v optickém mikroskopu. Pro pozorování a měření částic mikropráškových materiálů o typických velikostech mezi cca 10 µm a 0,1 µm je nejvhodnější skenovací elektronový mikroskop. Pro měření ještě menších částic, například těch, jsou potřebná extrémně vysoká zvětšení poskytovaná mikroskopem atomárních sil nebo transmisním elektronovým mikroskopem. Výběr mikroskopu pro měření částic v určitém vzorku závisí na velikostech částic, které vzorek obsahuje, jak je znázorněno na Obrázku 9.11. Aby nebyly přehlédnuty žádné důležité rysy vzorku, může být výhodné použít při zkoumání vzorku více než jednu techniku; například velké shluky v mikroprášku nemusí být pozorovatelné (kvůli variabilitě vzorkování) pokud je práškový materiál zkoumán pouze s využitím SEM a nikoli s využitím optického mikroskopu. 

transmisní elektronový mikroskop

nanočástice



mikroskop atomárních sil

nanočástice



skenovací elektronový mikroskop

nanočástice, mikroprášek



optický mikroskop



stereobinokulární mikroskop

prášek farmaceuticky aktivní látky



pouhé oko

granule tablety, prášek farmaceuticky aktivní látky y

Obrázek 9.11 Diagram znázorňující typické intervaly velikostí částic některých farmaceutických materiálů a různé mikroskopické techniky použitelné k jejich měření Pokud je částice v prášku potřeba jen rychle přeměřit, například kvůli kontrole procesu krystalizace, je technikou volby optická mikroskopie, protože příprava vzorku je rychlá a jednoduchá. Složený optický mikroskop vybavený kalibrovanou měřící stupnicí umístěnou v okuláru, společně s objektivy s nízkým, středním a vysokým zvětšením, je velmi užitečný nástroj pro široké použití při měření částic o velikostech v rozsahu přibližně od 1000 µm do 1µm. Obraz měřící stupnice je položen na obraz částic a velikosti jednotlivých částic jsou zjišťovány přímo. Když je potřeba změřit několik stovek nebo tisíců částic pro statistické výpočty, není praktické provádět měření ručně z důvodu časové náročnosti, náchylnosti k chybnému měření a pracnosti. Pro odstranění těchto nevýhod byly Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 167


vyvinuty automatizované analyzátory obrazu ovládané počítačem, umožňující rychlé objektivní změření a spočítání částic stálým a opakovatelným postupem s využitím motorizovaného x-y stolku, který umožňuje získání více obrazů povrchů preparátů. Nejdůležitějším krokem při jakékoli obrazové analýze je příprava vzorku, nereprezentativní vzorek poskytne nereprezentativní výsledky, zejména v případě práškových materiálů s širokým rozsahem velikostí částic. Je nezbytné, aby částice byly dostatečně kontrastní (aby byla zajištěna jejich viditelnost), dobře dispergované (pro odstranění nebo minimalizaci překrývání částic) a aby byl částic dostatečný počet pro reprezentaci distribuce jejich velikostí v objemu vzorku. Jak je zmíněno v oddílu 9.4.4, využití kruhově polarizovaného světla může výrazně zlepšit viditelnost anizotropních částic při použití obrazové analýzy. Dostatečná a reprodukovatelná disperze částic je hlavní těžkostí při obrazové analýze a pro odstranění variability, která je při přípravě vzorků různými pracovníky nevyhnutelná, bylo vyzkoušeno mnoho technik (Jillavenkatesa a kol. 2001). Nedávno vyvinutý plně automatický systém pro analýzu obrazů, založený na optickém mikroskopu (the Malvern Morphology G3) obsahuje rovněž jednotku pro tvorbu suchých disperzí pro přípravu dobře dispergovaných vzorků před měřením velikostí a tvarů částic v práškových materiálech (Willen 2008). Ideálním tvarem částic pro jakoukoli metodu zjišťování velikosti je koule, protože její velikost je popsána jediným parametrem, průměrem. Nicméně, částice obsažené v práškových farmaceutických materiálech jsou kulovité jen zřídka (kromě sprejově sušených materiálů) a častěji bývají jehličkovité, destičkovité nebo nepravidelně tvarované. Pro tyto částice je jeden parametr velikosti nedostatečný; existuje mnoho možných rozměrů, jako je největší délka, minimální šířka, obvod, průměr zobrazené plochy (McCrone a Delly 1973), které mohou být změřena na jednotlivé nekulovité částici, všechny mohou být rozdílné a všechny jsou správné! Vyvíjeny jsou počítačové algoritmy pro automatické výpočty tvarů nekulových částic v práškových farmaceutických materiálech (Pons a kol. 2002).

5.7. Optická mikroskopie za nestandardních podmínek Optická mikroskopie za nestandardních podmínek je používána pro výzkum materiálů za různých teplot, vlhkosti a ve vakuu. Pozorování mohou pomoci interpretovat a vysvětlit data získaná z jiných analytických technik za nestandardních podmínek, jako diferenční kalorimetrie, dynamická sorpce Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 168


par a prášková rentgenová difrakce s kontrolovanou teplotou a vlhkostí (viz Kapitola 2.). Farmaceuticky aktivní látka může být během výroby, kdy dochází k její krystalizaci, je rozmíchávána, filtrována, sušena a mleta, vystavena různým teplotám a vlhkostem. Navazující procesy zahrnující granulaci za vlhka nebo za sucha, mrazové sušení, míchání, lisování a potahování filmem, vystavuje farmaceuticky aktivní látku dalším fyzikálně-chemickým podmínkám při její přeměně ve finální produkt. Pro porozumění změnám, které mohou nastat při převádění procesu do výrobního měřítka (jako je dehydratace hydrátů při nízkých vlhkostech, vznik hydrátů nebo lyotropních mezofází při vysokých vlhkostech, nebo polymorfní přeměny při vysokých teplotách) a jejich kontrolu, experimenty za nestandardních podmínek by měly být provedeny, co nejdřív je to možné v průběhu vývoje sloučeniny.

5.7.1. Termomikroskopie Termomikroskopie, nebo mikroskopie s vyhřívaným stolkem, je rychlá a univerzální technika, s jejíž pomocí lze charakterizovat malé množství vzorku na základě sledování jeho chování při zahřívání a ochlazování s využitím polarizační mikroskopie. Termomikroskopii vyvinuli Ludwig a Adelheid Koflerovi ve 40. letech 20. století pro identifikaci organických látek a farmaceutických materiálů na základě studia jejich chování při změnách teploty (Vitez a kol. 1998). Od té doby je termomikroskopie důležitou analytickou technikou pro charakterizaci pevných fází při vývoji farmaceutických látek. Vyhřívané stolky jsou využívány pro studium jednotlivých látek, pro zjištění jejich teplotně závislého chování, nebo pro studium vzájemné interakce dvou látek při různých teplotách (Kuhnert-Brandstätter 1971). V případě jednotlivých látek jsou s využitím termomikroskopie snadno určeny diagnostické vlastnosti jako: rovnovážná teplota tání, důkaz rozkladu, zjištění čistoty, desolvatace, sublimace, a je rychle

zjištěn

termodynamický

vztah

mezi

matastabilními

polymorfy

(McCrone

1957).

Termomikroskopie je v mnoha laboratořích skutečně často využívaná jako jedna z nejrychlejších, na množství vzorku nenáročných a nejvíce informativních technik, s jejichž pomocí lze zkoumat polymorfní charakter sloučeniny.



McCrone (1975) popisuje několik testů, v nichž může být termomikroskopie použita pro zjištění, zda má sloučenina nějaké polymorfní formy, nebo zda jsou dva vzorky dvěma různými polymorfy jedné sloučeniny. Tyto testy, při nich se předpokládá, že se sloučeniny při zahřívání a tání nerozkládají, zahrnují zahřívání několika krystalů rozptýlených na podložním sklíčku a jejich pozorování při tání, zjišťování zda stabilnější forma krystalizuje, ať už spontánně nebo na okolních kapičkách. Často používaný test, určitě ten nejestetičtější, spočívá v pozorování krystalizace v tenkých filmech taveniny mezi zkříženými polarizátory. Preparát z taveniny je připraven úplným roztavením malého množství testované sloučeniny mezi podložním a krycím sklíčkem a následným pomalým ochlazením (při ochlazení vyhřátého stolku) nebo prudkým ochlazením sklíčka na studeném povrchu. Tenký film je pozorován při tuhnutí a krystalizaci. Krystalizace, pokud k ní dojde, je často rychlá, ale může trvat i mnoho hodin a v tomto případě je nutná trpělivost. Pokud není krystalizace spontánní, může být někdy vyvolána novým ohřátím preparátu nebo škrábáním v okolí krycího sklíčka. Transformace jedné pevné formy na druhou je pozorována jako změna vzhledu krystalického filmu, jako je růst nových krystalů nebo změna interferenčních barev, jak je ilustrováno na příkladu paracetamolu na Obrázku 9.12. V případě mnoha transformací jedné pevné formy na druhou je změna jasně viditelná při pozorování mezi zkříženými polarizátory, jak je vidět při konverzi paracetamolu z formy II na formu I na Obrázku 9.12, při níž rekrystalizace zapříčinila vznik hrubých krystalů. Někdy může polymorfní přeměna v tavenině tak nepatrná, že není vizuálně pozorovatelná. Například transformace HABA z formy II na formu III nebyla viditelná, ale byla detekována s využitím infračervené spektroskopie (Reffner Ferrillo 1988). Pokud v podchlazené tavenině v preparátu vykrystalizuje velmi nestabilní forma sloučeniny a poté je přeměněna na stabilnější formu, může být transformace tak rychlá, že jediným důkazem přítomnosti pseudomorfu je vznik zákalu (Haleblian a McCrone 1969). Tyto metastabilní polymorfy jsou často tak nestabilní, že nemohou být izolovány za běžných podmínek krystalizace, a termomikroskopická pozorování umožňují lépe porozumět chování polymorfů na základě screeningu



pevných forem sloučenin. Pro příklad jsou na Obrázku 9.13 znázorněny roztavené kapičky acetanilidu (připravené rozptýlením krystalů na podložní sklíčko, bez krycího sklíčka, a jejich úplným roztavením při přibližně 120°C), které vykrystalizovaly po podchlazení při pokojové teplotě. Metastabilní forma II vykrystalizovala spontánně v izolovaných kapičkách ve formě redukovaných, „vějířovitých“ krystalů a při pokračující krystalizaci se okamžitě přeměnila na formu I (McCrone 1962). Obrázek 9.12 Preparát z rekrystalizované taveniny paracetamolu znázorňující přeměnu jedné polymorfní formy na druhou. (1) hraniční plocha mezi dvěma sferulity skládajícími se z paprskovitých, jemných, jehličkovitých krystalů formy II (krystalizované z taveniny při 65°C); (2) částečná přeměna formy II na formu I po zahřívání na 120°C po dobu 10 minut a; (3) úplná přeměna na hrubé krystaly formy I po dalších 10 minutách zahřívání na 120°C (měřítko = 100 µm) Obrázek 9.13 Vykrystalizované kapky acetanilidu s viditelnými tmavými, vějířovitými pseudomorfy formy II s paprskovitými krystaly formy I Pseudomorfy formy II byly jasně viditelné jako tmavé části vrostlé ve formě I. Při studiu preparátů z tavenin pro zjištění přítomnosti polymorfů může být pozorován růst zrn (nebo migrace přes fázovou hranici), který může být chybně interpretován jako fázová transformace mezi dvěma pevnými fázemi, protože oba tyto jevy mohou vypadat podobně (McCrone 1965). Růst zrn, který je příkladem pseudopolymorfismu, je vzácný (nebo vzácně popisovaný) jev, k němuž může dojít při vzniku pnutí v jednom nebo více směrech v krystalové mřížce anizotropní sloučeniny při její krystalizaci z podchlazené taveniny, a to kvůli velkým rozdílům v jejích koeficientech teplotní roztažnosti. Migrace přes fázovou hranici byla rozpoznána a dobře zdokumentována pro pesticid DDT a pro výbušninu TNT (McCrone a McCrone 2000). Jakmile jsou krystaly s vnitřním pnutím zahřáty, jsou žíhány a procházejí rekrystalizací v pevné fázi, při níž dojde k přesunu vnitřního pnutí a ke vzniku nových krystalů bez vnitřního pnutí, které jsou pozorovány v preparátu z taveniny. I když růst krystalů probíhá odlišně a nové krystaly bez vnitřního pnutí vypadají jinak než původní krystaly, jde o stejnou krystalovou formu. Krystaly s vnitřním pnutím a krystaly bez vnitřního pnutí jsou tudíž při analýze ostatními technikami analýzy pevné fáze nerozlišitelné. McCrone (1965) uvádí, že při rozeznání růstu zrn od polymorfismu odhalí pozorování rekrystalizace v pevné fázi skutečnost, že krystaly s vnitřním pnutím a krystaly bez vnitřního pnutí do sebe při zvyšování teploty vrůstají a rovnováha mezi krystaly s pnutím a bez pnutí se mění. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 171


Farmaceutický materiál, u něhož byl zjištěn růst zrn, byla sloučenina s azolovým kruhem v molekule (Nichols 1996). Růst zrn této nesolvatované, monomorfní sloučeniny byl zjištěn zrn při studiu preparátů z taveniny během rutinního zjišťování přítomnosti polymorfů při vývoji sloučeniny. Ze začátku panoval názor, že růst nových krystalů reprezentuje polymorfní přeměnu v pevné fázi z dříve neznámé metastabilní formy. I přes rozsáhlý výzkum, zahrnující práškovou rentgenovou difrakci při vyšší teplotě, nebyly nalezeny žádné další polymorfní formy. Prášková rentgenově difraktometrická měření ukázala, že se krystalová mřížka sloučeniny s azolovým kruhem při zahřátí z pokojové teploty těsně pod teplotu tání rozpíná podél jedné z krystalografických os asi čtyřikrát více než podél druhých dvou os. Na Obrázku 9.14 je znázorněna sekvence mikrofotografií vykrystalizované taveniny azolové sloučeniny, pořízených při růstu zrn mezi třemi paprskovitými sferulity. Potvrzení, že došlo k růstu zrn a ne k přeměně polymorfů, bylo dosaženo zjištěním, že nové, hrubší krystaly přestávají růst, když je teplota udržována na určité hodnotě a tedy jen část vzorku se zbaví pnutí. Při zvýšení teploty o několik stupňů růst zrn pokračoval, protože původní nežíhané krystaly získaly vnitřní pnutí při nové teplotě. Pro porovnání, polymorfní přeměna by začala při specifické teplotě a pokračovala by až do konce, i kdyby byl vzorek udržován při teplotě těsně nad teplotou přeměny. Termomikroskopie má mimořádnou cenu při použití k interpretaci nebo potvrzení výsledků získaných jinými technikami termické analýzy, jako je diferenční skenovací kalorimetrie (DSC). Například během charakterizace orthorombické polymorfní formy (forma II) paracetamolu, který vyrostl z roztoku, bylo zjištěno, že jeho teplotní chování je odlišně od téhož materiálu krystalizovaného z taveniny (Nichols a Frampton 1998). I když výsledky práškové rentgenové difrakce krystalů, které rostly z roztoku, ukázaly, že forma II není přítomna, diferenční skenovací kalorimetrická analýza ukázala, že téměř nepřítomna je forma I, protože hlavní endoterma tání se nachází u 171°C a ne u 157°C, což je teplota tání formy II (viz Obrázek 9.15). Navíc se neočekávaně objevil velmi slabý, široký, nízkoenergetický endotermický přechod, sotva rozeznatelný nad základní linií, se středem přibližně u 122°C. Při studiu krystalů formy II mezi zkříženými polarizátory s využitím termomikroskopie bylo zjištěno, že samostatné krystaly formy II se přeměnily na krystaly formy I v pevné fázi při změně teploty v intervalu zhruba 75°C, přičemž k nejvýraznější přeměně došlo



přibližně mezi 120°C a 135°C. Přibližně při 157°C několik zbývajících krystalů formy II roztálo, a jakmile přišla tavenina do kontaktu s krystaly formy I, přeměnila se spontánně na formu I. Obrázek 9.14 Růst zrn pozorovaný na rozhraní tří sferulitů ve vykrystalizované tavenině sloučeniny s azolovým kruhem v molekule. Na (1) začala rekrystalizace při teplotě 65°C a, (2) po 15 minutách při 65°C, růst zrn skončil, protože zaniklo pnutí. Na (3) byl preparát pro obnovení růstu zrn zahřát na 75°C a tato teplota byla udržována po dobu 15 minut. Na (4) může být další růst zrn vyvolán jen zahřátím preparátu na 90°C,načež po 15 minutách skončí. Měřítko = 100 µm Obrázek 9.15 Termogram z diferenční skenovací kalorimetrie pro paracetamol formy II krystalizovaný z roztoku, v němž je viditelný široký, nízkoenergetický endotermický pík na přibližně 122°C Obrázek 9.16 Mikrofotografie znázorňující přeměnu monokrystalu paracetamolu z orthorombické formy II na monoklinickou formu I (detaily viz text) Na Obrázku 9.16 je uvedena sekvence mikrofotografií (pořízených s použitím zkřížených polarizátorů s citlivou barevnou destičkou pro zviditelnění všech krystalů), na nichž monokrystal formy II, který má při 25°C (Obrázek 9.16A) přímou extinkci (protože je orthorombický) prochází přeměnou v pevné fázi na formu I při zahřátí na 110°C. Na Obrázku 9.16B je znázorněn krystal během přeměny (objevují se světlá místa) od dolního levého okraje podél úhlopříčky. Nakonec je přeměna dokončena (Obrázek 9.16C) a krystal tedy již nevykazuje přímou, ale šikmou extinkci (viz 9.4.4) a musí být otočen do nové extinkční pozice (jak je vidět na Obrázku 9.16D). Toto pozorování potvrzuje, že krystal prošel transformací z formy II (orthorombická) na formu I (monoklinická) (Nichols 1999). Jen pokud jsou termomikroskopická data použita pro porozumění výsledkům diferenční skenovací kalorimetrie a jejich interpretaci, je zřejmé, že se polymorfně čisté krystaly formy II paracetamolu přeměnily v pevném stavu tepelně indukovaným procesem vyvolaným přítomností defektů. Ty vznikly nejpravděpodobněji při rychlém růstu krystalů formy II po naočkování roztoku. Jiným příkladem, v němž je termomikroskopie potřebná pro vysvětlení dat z diferenční skenovací kalorimetrie, je charakterizace polymorfů chlordiazepoxidu. Nízkoenergetický ednotermický přechod v termogramu formy II je způsoben přeměnou jehliček formy II na malé destičky formy I (Singh a kol. 1998).



Komplexní zkoumání dvou bezvodých polymorfů a hydrátu hydrochloridu 2-amino-5methylthiazolu bylo provedeno s využitím mikroskopie s vyhřívaným stolkem (Jones a McCrone 1964). Jde o vynikající příklad aplikace mikroskopie s vyhřívaným stolkem jako rychlé a spolehlivé metody pro charakterizaci chování sloučeniny v pevné fázi. Dosud popsané metody jsou vhodné pro jednotlivé pevné látky. Adelheid Kofler vyvinula a použila kontaktní metodu pro studium interakcí mezi dvěma pevnými látkami, která se poté vyvinula v cennou kvalitativní techniku, jež je využívána pro identifikaci a charakterizaci organických látek a farmaceuticky významných sloučenin. Tato kontaktní metoda má mnoho využití, například při zjišťování, zda enantiomerní formy sloučeniny tvoří racemát nebo konglomerát nebo zda dvě rozdílné sloučeniny tvoří eutektikum, molekulární sloučeninu (známou také jako adiční sloučenina nebo kokrystal) nebo pevný roztok (jako smíšené krystaly). Kontaktní metoda, zvaná také metoda směsné taveniny Waltera McCrona (McCrone 1975), je jednoduchý a rychlý způsob zkoumání jakýchkoli tepelně indukovaných interakcí dvou sloučenin. Malé množství materiálu s nejvyšší teplotou tání je umístěno k jednomu okraji krycího sklíčka na podložním sklíčku a je zahřáto k tání. Tavenina se nechá roztéct pod krycí sklíčko přibližně do poloviny jeho plochy, poté je ochlazena a rekrystalizuje. Druhá látka (s nižší teplotou tání) je umístěna ke druhému okraji krycího sklíčka a celý preparát je znovu zahřát tak, že jen druhá látka roztaje, rozteče se pod krycí sklíčko a dostane se do kontaktu s první, rekrystalizovanou látkou. Při udržení preparátu při stálé teplotě po dobu několika sekund dojde k promíchání obou látek v úzké zóně předtím, než jsou ochlazeny a zcela rekrystalizují. Zóna, v níž došlo k promísení obou látek, je poté pozorována mezi zkříženými polarizátory při zahřívání preparátu na vyhřívaném stolku. Po roztavení zóny promísení látek může být pozorován jeden z mnoha jevů, které jsou dobře zdokumentovány, takže interakce může být důvěryhodně vysvětlena (McCrone 1957; KuhnertBrandstätter 1971). Za zmínku stojí, že teploty, při nichž eutektika, molekulární sloučeniny a ostatní fáze tají, mohou být využity pro sestrojení diagramů tání znázorňujících závislost teploty tání na složení (jako jsou ty na Obrázku 9.17 a 9.18).



Pokud testované látky neinteragují, vzniká při kontaktní metodě eutektikum a při jeho tání je pozorován pruh kapaliny mezi dvěma pevnými sloučeninami, jehož nejvýraznějším projevem při pozorování mezi zkříženými polarizátory je tmavý pruh. Například na Obrázku 9.17 je znázorněno roztavené eutektikum phenacetinu a paracetamolu při 115°C. Molekulární sloučenina (kokrystal) je snadno pozorovatelná v zóně smísení obou látek jako třetí krystalická fáze mezi dvěma eutektiky, která se liší svými teplotami tání. Na Obrázku 9.18 je znázorněn pruh kokrystalů s teplotou tání 98°C, který vznikl v zóně smísení mezi dvěma eutektiky při opětovném zahřátí preparátu p-nitrofenolu a benzamidu. Obrázek 9.17 Eutektikum (bod tání 115°C) vzniklé v zóně smísení v preparátu phenacetinu (vlevo, bod tání 134,5°C) a paracetamolu (vpravo, bod tání 171°C) Obrázek 9.18 Kokrystal (bod tání 98°C) vzniklý v zóně smísení mezi dvěma roztavenými eutektiky (při 84°C a 91°C) v preparátu p-nitrofenolu (bod tání 113,5°C) a benzamidu (bod tání 128°C) Následkem pátrání mnoha vědců po kokrystalech, které by mohly zlepšit vlastnosti pevných forem farmaceutických látek, Koflerové kontaktní metoda byla znovu zavedena jako jednoduchý a rychlý způsob pro rychlé zkoumání dvojic látek (Davis a kol. 2004; Stahly 2007; Berry a kol. 2008). Kontaktní metoda byla rovněž použita pro důkaz izomorfie dvou lokálních anestetik, falicaine hydrochloridu a dyclonine hydrochloridu. Důkaz byl proveden pozorováním růstu smíšených krystalů, ve formě pevného roztoku, v zóně smísení (Schmidt 2005). Termomikroskopie byla úspěšně aplikována při charakterizaci enantiomerů pseudoefedrinu a efedrin hydrochloridu jako rychlý způsob zjištění, zda jde o jednotlivé enantiomery nebo dvojici enantiomerů (Crantz 2004). Čisté enantiomery sloučenin mají stejnou teplotu tání, a proto by při použití kontaktní metody měly být taveny společně při stejné teplotě a ne odděleně, jako by byly taveny odlišné sloučeniny (jak bylo popsáno výše). Když je rekrystalizovaný preparát znovu zahřát a přitom je pozorována zóna smísení, je pozorována jedna ze tří možných interakcí: vznik racemické sloučeniny (nebo racemátu), racemické směsi (konglomerátu) nebo pseudoracemátu (pevný roztok) (Jacques a kol. 1994). Jelikož je studován binární systém, může být sestrojen diagram závislosti teploty tání na složení a, jelikož čisté enantiomery tají při stejných teplotách, bude diagram Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 175


symetrický podle osy složení. Racemická směs tvoří třetí homogenní krystalickou fázi vzniklou interakcí mezi dvěma enantiomery. Zóna jejich smísení je velmi podobná zóně smísení dvou odlišných sloučenin, která je tvořena molekulární sloučeninou (viz Obrázek 9.18), ale eutektika po obou stranách racemické sloučeniny mají stejnou teplotu tání. Racemická sloučenina může mít teplotu tání vyšší, nižší nebo dokonce stejnou jako enantiomery. Racemická směs je naproti tomu fyzikální směs, v níž nedochází k žádným interakcím mezi dvěma enantiomery, a je pozorována jako jednotlivé eutektikum v zóně smísení, jehož bod tání bude vždy nižší než bod tání jednotlivých enantiomerů (podobně jako eutektikum na Obrázku 9.17). Třetí, nejméně často pozorovaná interakce se objevuje jako pevný roztok mezi dvěma enantiomery a může být pozorována v zóně smísení jako souvislé řady směsných krystalů, které tají v širokém intervalu teplot. Novou metodou opětovného ohřevu kontaktního preparátu za účelem pozorování zóny smísení je umístění elektricky vyhřívaného drátu přímo nad krycí sklíčko v pravém úhlu k zóně smísení (Jones 1968). Když je teplota drátu udržována na hodnotě, při níž složka s nejvyšším bodem tání právě roztává, vzniká lokalizovaný teplotní gradient na obou stranách drátu a zóna smísení (obsahující eutektikum a kokrystaly) je snadno studována s využitím polarizační mikroskopie. Jde o elegantní a velmi informativní techniku pro studium směsných tavenin, protože hranice mezi pevnou fází a taveninou je spíše než přímkou tvořena křivkami, které vizuálně znázorňují fázový diagram závislosti teploty tání na složení. Kromě studia kontaktních preparátů byl teplotní gradient vytvořený horkým drátem použit pro pozorování sekvencí tekutých krystalických fází, které mohou vzniknout v případě termotropních sloučenin (Hartshorne 1975). Přidání okénka, propustného pro infračervené záření, na vyhřívaný stolek umožní provádění sofistikovanějších mikroskopických experimentů. Kromě optické mikroskopie (pro pozorování viditelných změn) může být prováděna analýza s pomocí FT-IR mikroskopie a Ramanovy mikrospektroskopie pro detekci chemických změn potřebných pro charakterizaci solí, polymorfů a solvátů. FT-IR termomikroskopie byla například použita při studiu fázové přeměny bezvodého karbamazepinu (Rustichelli a kol. 2000) a dehydratace monohydrátu kofeinu při cca 46°C (Reffner 2003).



Optické mikroskopické studie za nestandardních podmínek jsou často prováděny při vyšších teplotách kvůli napodobení podmínek, jimž je materiál vystaven při zpracovávání ve velkých množstvích. Experimenty při nízkých teplotách jsou prováděny na chlazeném stolku, což může být vyhřívaný stolek s proudem studeného plynu. Kromě možnosti pozorovat polymorfní přeměny při nižších než běžných teplotách spočívá hlavní aplikace této metody ve studiu zmrazených roztoků pro optimalizaci experimentů s mrazovým sušením. Polarizační mikroskopie s chlazeným stolkem byla použita jako jedna z technik při studii zmražených roztoků, obsahujících 3% w/v mannitolu, což je pomocná látka používaná jako plnidlo v některých mrazově sušených produktech (Kett a kol. 2003). Tato studie ukázala, že při ochlazení roztoku na přibližně -45°C se mannitol oddělil od krystalického ledu ve formě charakteristických prismatických částic. Tyto částice, jež mohou být tvořeny neidentifikovanou krystalickou pevnou formou mannitolu, nebyly předtím popsány, protože jsou malé a ve zmražených vzorcích jich je příliš málo pro detekci nemikroskopickými metodami. Tento objev upozorňuje na nedostatky v současných znalostech o fázových separacích farmaceutických materiálů při zmražení. Při studiu desolvatace hydrátů je termomikroskopie rychlou a citlivou technikou, s níž lze určit interval teplot, v němž desolvatace probíhá (Kuhnert-Brandstätter 1971). Krystaly hydrátu nebo předpokládaného hydrátu jsou smíchány se silikonovým olejem a pozorovány při zahřívání; při uvolňování vody je možné pozorovat bubliny vodní páry. Pokud jsou krystaly solvatovány organickým rozpouštědlem mísitelným se silikonovým olejem, bubliny vodní páry nebudou pozorovány. Při zahřívání některých hydratovaných nebo solvatovaných krystalů na vzduchu a jejich pozorování s využitím rovinně polarizovaného světla je uvolnění rozpouštědla zjištěno pozorováním změny krystalů z čirých na zakalené za vzniku pseudomorfů. Příkladem jsou jehličkovité krystaly monohydrátu teofilinu (vypěstované z vodného roztoku), uvedené na Obrázku 9.19, které byly při 25°C čiré a po zahřívání na 50°C po dobu jedné hodiny se staly neprůhlednými. Bylo zjištěno, že monohydrát teofilinu rychle dehydratuje při zahřátí nad 35°C nebo při skladování při nízké relativní vlhkosti (Byrn a kol. 1999). Některé hydráty dehydratují rovněž při vystavení vakuu, a na Obrázku 9.20 jsou znázorněny krystaly monohydrátu teofilinu před a po uchovávání ve vysokém vakuu (přibližně 10-3 Pa; 7,5·10-6 Torr) při přibližně 22°C po dobu jedné hodiny. Je zajímavé pozorovat, Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 177


že krystaly zahřívané na vzduchu po dobu jedné hodiny jsou výrazně zakalenější než ty, které byly po dobu jedné hodiny vystaveny vysokému vakuu. Nabízí se možnost, že krystalová voda může být při zahřátí rychle uvolněna z objemu každého krystalu a možná mnohem pomaleji jen z povrchu při vystavení vakuu. Při prozkoumání s využitím skenovacího elektronového mikroskopu je na povrchu krystalů monohydrátu teofilinu skutečně viditelné množství jemných prasklin, tento jev je diskutován v sekci 9.8.3. Monokrystal se může při desolvataci přeměnit na polykrystal, získat mozaikovitou strukturu (jak je vidět na Obrázku 9.5) nebo se může stát tak neuspořádaným, že se krystalová struktura zhroutí a vznikají drobné krystalky, které mohou při pozorování mezi zkříženými polarizátory vypadat jako izotropní (možná amorfní). Obrázek 9.19 Krystaly monohydrátu teofilinu při 25°C (vlevo) a po zahřívání na 50°C po dobu jedné hodiny (vpravo) Obrázek 9.20 Krystaly monohydrátu teofilinu před (vlevo) a po (vpravo) dehydrataci pod vysokým vakuem Pokud je tento jev pozorován, měly by suché, desolvatované krystaly být vloženy do kapaliny s odpovídajícím indexem lomu pro redukci jejich kontrastu, aby mohly být při velkém zvětšení zkoumány i jemné detaily. U některých sloučenin je rozpouštědlo tak pevně vázáno v krystalové mřížce, že jeho odpaření nemusí být viditelné, dokud krystal nezačne tát. Desolvatační děje mohou být detegovány rovněž s využitím jiných technik, jako je termogravimetrická analýza a diferenční skenovací kalorimetrie.

5.7.2. Stupeň vlhkosti Vliv vodní páry nebo par organického rozpouštědla na stabilitu pevných farmaceutických látek může být zkoumán jako součást charakterizace pevné fáze s využitím mnoha analytických metod, jako je dynamická sorpce par, mikrokalorimetrie v perfuzní cele a prášková rentgenová difrakce při proměnlivé vlhkosti. Pro doplnění těchto technik byla vyvinuta vzorková komora s kontrolovanou vlhkostí (VGI 2000M ze Surface Measurement System Ltd., UK) pro použití ve spojení s optickým mikroskopem, která umožňuje přímo monitorovat chemické a strukturní změny jako funkce vlhkosti, Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 178


teploty (do 40°C) a času. Kromě optického mikroskopu může být komora s kontrolovanou vlhkostí uzpůsobena pro vibračně spektroskopické experimenty s využitím FT-IR mikroskopie a Ramanovy mikroskopie. Komora s kontrolovanou vlhkostí byla využita pro pozorování a monitorování krystalizace amorfního salbutamol sulfátu (Young a kol. 2003) a amorfní laktózy (Price a Young 2004) v přítomnosti vodní páry. Sorpce vody na stlačené filmy, obsahující částice griseofulvinu rozptýlené v polymerní matrici, při relativní vlhkosti v rozmezí od 0,5% do 90% byla studována s využitím FT-IR mikroskopie (Chan a Kazarian 2004). V jiné studii bylo pozorováno, že monokrystaly bezvodého teofilinu a karbamazepinu byly hydratovány při vysoké relativní vlhkosti, zatímco při přímém kontaktu s hygroskopickými pomocnými látkami (polyvinylpyrrolidon K12 a K90) se hydratace obou farmaceuticky aktivních látek změní s procesu v pevné fáze na proces probíhající za vzniku roztoku (Salameh a Taylor 2006). Komory s kontrolovanou vlhkostí nejenže zvyšují hodnotu znalostí o farmaceuticky aktivních látkách v pevném stavu, ale mají i velký potenciál pro výzkum a charakterizaci sloučenin, které tvoří lyotropní mezofáze (sekce 9.7.4). Tyto komory umožňují zkoumat uvedené soulčeniny při různých relativních vlhkostech, což je důležité při provádění výzkumu různých formulací.

5.7.3. Stolek pro mrazové sušení Pro optimalizaci procesu mrazového sušení (lyofilizace) pro malá množství materiálu může být použit mikroskopický stolek pro mrazové sušení (Thomas a Cannon 2004). Tento stolek je vybaven programem kontrolujícím zahřívání, chlazení a vakuum. Přímé pozorování vzorku při jeho mražení a mrazovém sušení umožňuje vizuálně určit teploty, při nichž se koláč hroutí nebo dochází k tání. Experimenty s mrazovým sušením s využitím zmražených vodných roztoků pomocné látky glycinu byly provedeny pro kontrolu krystalizace polymorfu během přípravy produktů pro injekční podání (Chongprasert a kol. 2001).



5.7.4. Výzkum tekutých krystalů s využitím optické mikroskopie za nestandardních podmínek Tekuté krystaly (nebo mezofáze) se svými vlastnostmi nacházejí mezi pravými krystaly a izotropními kapalinami (jako jsou roztoky nebo taveniny) a jako krystalické materiály mohou rovněž vykazovat polymorfismus. Pokud farmaceutická látka tvoří kapalné krystalické fáze, může mít žádané vlastnosti jako je lepší rozpustnost, které mohou být využity při přípravě nových přípravků. Polarizační mikroskopie je technikou první volby pro detekci mezofází a mikroskopista by měl být schopen rozpoznat ty znaky, které je odlišují od krystalických pevných látek. Mikroskopická pozorování mezofází jsou značně zlepšena při studium vzorků na vyhřívaném stolku nebo v komoře s kontrolovanou vlhkostí. Počet farmaceutických látek, u nichž byla zjištěna schopnost tvořit kapalné krystaly, narůstá (Stevenson a kol. 2005; Bunjes a Rades 2005). Nicméně existuje mnohem více látek, ať už ve vývoji nebo jako produkty na trhu, u nichž ještě nebyly vlastnosti kapalných krystalů pozorovány. Z tohoto důvodu by měla být při charakterizaci farmaceutické látky (známé jako mesogen) jako součást screeningu při výběru pevné formy zkoumána schopnost tvořit jednu nebo více mezofází. Sloučenina tvoří kapalné krystalické fáze při přidání rozpouštědla nebo změně teploty, nebo při kombinaci obojího. Lyotropní mezofáze jsou dvousložkové systémy, které vznikají při rozpuštění amfifilní látky v rozpouštědle (obvykle vodě) při určité teplotě a koncentracích rozpouštědel. Termotropní mezofáze jsou jednosložkové systémy vznikající při zahřívání pevné látky nebo při ochlazení její izotropní taveniny. Anizotropní sloučeniny jsou ty, které vykazují jak lyotropní, tak termotropní chování. Lyotropní, termotropní a amfotropní mezofáze byly zjištěny u mnoha farmaceutických materiálů (Stevenson a kol. 2005). Mikroskopická charakterizace kapalných krystalů by měla zahrnovat pozorování s využitím vyhřívaného stolku pro změření teplot a vlhkostí, při nichž nastávají fázové přeměny. Různé mezofáze, jako nematická, cholesterická nebo lamelární, mají odlišné a charakteristické optické struktury, které je odlišují od pravých krystalických pevných látek. Tyto textury mohou vzniknout okamžitě nebo za několik minut či hodin (jak se molekuly navzájem organizují) a jsou snadno pozorovatelné a rozpoznatelné při pozorování mezi zkříženými polarizátory (Hartshorne 1974). Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 180


Obrázek 9.21 Lyotropní lamelární mezofáze lecitinu (vlevo) a termotropní cholesterická mezofáze cholesterol acetátu při 98°C (vpravo) při pozorování mezi zkříženými polarizátory Často mají interferenční barvy nižšího řádu (které jsou často šedé, bílé nebo žluté), což naznačuje, že nejsou příliš krystalické. Pro ilustraci jsou na Obrázku 9.21 uvedeny dobře vyvinuté textury vodné lyotropní lamelární mezofáze lecitinu a termotropní cholesterickou mezofázi cholesterol acetátu. Dobře vyvinuté textury kapalných krystalů často vypadají, jakoby byly pevné a vysoce krystalické. Pro zjištění, zda je vzorek opravdu tvořen kapalnými krystaly, je tedy zapotřebí mírně zatlačit na krycí sklíčko a sledovat, zda dochází k pohybu preparátu a narušení textury. Prvním znamením, že by sloučenina mohla být mezogen, je to, že se chová „zvláštním“ nebo nepředvídatelným způsobem, jako je například vázání nestechiometrického množství krystalové vody detekovaného během sorpce par a termogravimetrických experimentů. Při vysokých vlhkostech se také může stát lepkavým, a poté se po vysušení změnit na pevný, vysoce neuspořádaný, jemně zrnitý polykrystalický materiál bez dobře vyvinutých krystalů. Pokud sloučenina tvoří lyotropní nebo termotropní mezofáze, je to jev, který není pouze analytickou kuriozitou, ale může to být cesta k interpretaci dosud nevysvětlené vlastnosti pevné fáze, které ovlivňují například stabilitu, hygroskopicitu a rozpustnost. Přínosem zjištění přítomnosti kapalných krystalů ve farmaceutických sloučeninách a porozumění jejím důsledkům zahrnuje lepší kontrolu při výrobě farmaceuticky aktivních látek, optimalizaci mletí a možnost vývoje nových přípravků. Je známo mnoho lyotropních komerčně vyráběných léků, jako je nafcillin a leuprolid, ale málo termotropních léků, jako je itraconazol a cyklosporin (Stevenson a kol. 2005). Termotropní materiály jsou snadno studovány při různých teplotách na vyhřívaném stolku. Nicméně pokud jsou s pomocí mikroskopie s vyhřívaným stolkem charakterizovány lyotropní materiály, je potřebná opatrnost z důvodu možných ztrát rozpouštědla, které mohou způsobit fázovou přeměnu. Tomu lze zabránit zkoumáním malého množství lyotropního vzorku v kontrolované atmosféře s využitím komory s kontrolovanou vlhkostí (viz 9.7.2). Sloučenina tvořící lyotropní mezofázi může být vyvinuta jako gelový přípravek nebo použita jako „samozvlhčující se“ dávkovací forma, pokud má vlastnosti surfaktantu. Mletí lyotropní farmaceuticky



aktivní látky může být nutné provádět za velmi nízké vlhkosti, aby nedošlo ke zvlhnutí látky, která se tím stává lepivou (i natolik, že ucpe mlýn). Další procesy využívající vodu, jako je vlhká granulace nebo potahování tablet filmem na vodní bázi, by neměly být používány, pokud farmaceuticky aktivní látka tvoří lyotropní mezofázi. V případě termotropních sloučenin může být během mletí nutná pečlivá kontrola teploty, aby bylo zabráněno vzniku lepkavých viskózních kapalných krystalů při zahřátí látky, jelikož to může způsobit zvětšení částic jejich srůstáním. Kromě toho, pokud rozemletý materiál chladne z termotropního stavu nebo schne z lyotropního stavu, může nekontrolovaně krystalizovat a vznikne vysoce neuspořádaný produkt, nebo dokonce složitá směs polymorfů. Přestože jsou ve srovnání s lyotropními sloučeninami vzácné, mají léky s termotropními vlastnostmi komerční výhody, a když jsou objevovány nové kapalné krystalické formy, jsou využity jako nové produkty. Například, když je hydratovaná krystalická forma kalcium fenoprofenu zahřáta na 125°C, stává se termotropní a tato nová forma má vyšší rozpustnost (Patterson a kol. 2002). Rovněž bylo zjištěno, že cyklosporin se při sprejovém sušení při výrobě vdechnutelných částic stává termotropním, což zvyšuje jeho chemickou stabilitu ve srovnání s plně krystalickou solvatovanou formou (Lechuga-Ballesteros a kol. 2003).

5.8. Skenovací elektronová mikroskopie Skenovací elektronový mikroskop (SEM) umožňuje zobrazení vzorku s mnohem větším

zvětšením a rozlišením, než jakého je možno dosáhnout světelným mikroskopem. Obrázky získané SEM zobrazují detail na povrchu vzorku (nebo těsně pod ním), proto jsou analogy k obrázkům získaným pomocí světelné mikroskopie a zároveň jsou komplementární k obrázkům z transmisní elektronové spektroskopie. Tři hlavní výhody SEM oproti světelným mikroskopům: (1) větší zvětšení okolo 250000x (světelné mikroskopy jsou schopny dosáhnout rozlišení až 1000x), (2) vysoká hloubka ostrosti (mnohem vyšší než jaké je možné dosáhnout světelným mikroskopem), (3) prostorové rozlišení lepší než 3 nm (ve srovnání s 200 Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 182


nm, které umožňují světelné mikroskopy). Širší pohled na využití skenovací elektronové mikroskopie je podán v knize Goldsteina et al. (Goldstein et al. 1993 a 2003). První komerční SEM, Stereoscan Mk.1 (vyrobený ve Velké Británii společností Cambridge Instrument Company) na trhu dostupný od roku 1965 měl prostorové rozlišení okolo 50 nm (Breton 1999). Od té doby se SEM vyvinul z přístroje vyžadující značné odborné technické, operační a udržovací, až po vysoce všestranný, počítačem řízený přístroj, přítomný v mnoha akademických i průmyslových laboratořích, zabývajících se výzkumem materiálů. Díky tomuto vývoji jsou SEM jednodušší a staly se hlavním nástrojem k určení a analýze povrchů širokého spektra materiálů. Ačkoli jsou SEM přístupné širokému spektru uživatelů, s různou úrovní automatizace, interpretace obrázků ze SEM stále vyžaduje vysokou úroveň dovedností a zkušeností. Nikdy by se nemělo předpokládat, že jenom protože mají vědci k dispozici počítač, jsou okamžitě schopni ovládat SEM, zaznamenávat vysoce kvalitní obrázky a rozumět tomu, co na nich vidí. V současnosti je možné dosáhnout prostorového rozlišení až 1 nm využitím zdroje elektronů s emisí pole (kapitola 9.8.1). K dosažení tohoto ultra-vysokého rozlišení musí být vzorek vystaven paprsku dosahujícího napětí až okolo 15 kV. Avšak paprsek o takto vysokém napětí může způsobit poškození vzorku a obzvláště u většiny vzorků organického původu může paprsek penetrovat několik mikrometrů dovnitř vzorku, čímž dochází k překrytí a ztrátě obrázku díky rozptylu a absorpce emitovaných elektronů. K tomu, abychom dostali obraz povrchu vzorku, SEM musí pracovat s nižším napětím (5 kV a nižším), a proto dosahujeme pouze omezeného rozlišení. Praktické zkušenosti dokazují, že většina farmaceutických vzorků studovaných pomocí SEM jsou analyzovatelné s rozlišením 10000x nebo nižším, takže rozlišení nehraje až takovou roli. Skenovací elektronové mikroskopy vytváří spoustu signálu, které poskytují cennou informaci o většině typů vzorků, dokonce při nižším rozlišení, než při kterém pracují optické světelné mikroskopy. Avšak při analýze neznámých vzorků je vhodné kombinovat SEM s optickou mikroskopií, které poskytují komplementární informace umožňující lepšímu porozumění vzorku. Na obrázku 9.22 jsou zobrazeny krystaly acetanilidu pod skenovacím elektronovým i optickým mikroskopem a, i přesto, že jsou oba získány se stejným rozlišením, poskytují odlišné informace o vzorku. Obrázek ze SEM



ukazuje detail povrchu (jako jsou růstové kroky), zatímco krystaly pod světelným mikroskopem jsou transparentní a jsou vidět kapalné inkluze, které mají refrakční index o hodně vyšší než silikonový olej (R.I. = 1,403), ve kterých jsou umístěny. Dalším typem elektronového mikroskopu používaného ke studiu materiálů je transmisní elektronový mikroskop (TEM), který umožňuje získat obrázky tvaru a vnitřního uspořádání elektronů v průhledných vzorcích. TEM je nejčastěji využíván ke studiu biologických vzorků a anorganických materiálů (jako jsou kovy, polovodiče a minerály). Vzorky, studované pomocí TEM, musí být ultratenké (méně než 100 nm), zatímco vzorky pro SEM jsou obvyklé tlustší (většinou více než okolo 10 µm), aby bylo možno sledovat detail povrchu vzorku. V důsledku toho, TEM není vždy vhodným nástrojem k analýze většiny vzorků, určených k charakterizaci solid-state vlastností farmaceutických materiálů nebo vývoji of most formulations. Pro některé vzorky, jako například disperse liposomů, které jsou používány jako nové systémy doručování léčiv, je vhodné použít TEM, protože SEM postrádá zdroj rozlišení a schopnost zobrazit detail méně kontrastních vzorků (Bhareao a Raje Harshal 2003). Skenovací elektronová mikroskopie je široce používaná v rutinní analýze ve farmaceutickém průmyslu, využívá se ke stanovení farmaceuticky aktivních látek (API), excipients, prášků, balicích materiálů a kontaminací cizího původu. SEM hraje obzvláště důležitou roli ve vývoji a optimalizaci výrobních procesů většiny lékových forem v pevném stavu, např. tablet, práškové směsi pro orální suspenze, čípky, aerosoly k inhalaci, atd. (Schmidt 2002). Jelikož technologický vývoj dovoluje kombinovat různé, ale komplementární analytické techniky do jednoho instrumentu, možnosti studia solid-state vlastností materiálů jsou rozšířeny. Až do konce osmdesátých let 20. Století bylo možno analyzovat vzorky SEM pouze za vysokého vakua. To omezovalo použití SEM pouze na vzorky, které byly suché a elektricky vodivé (jako jsou kovy) nebo takové, které bylo možno nanést na kovy ve formě tenkého filmu. Jeden z největších a nejdůležitějších úspěchů vývoje SEM, které nastaly v posledních dvou desetiletí, bylo představení SEM pracujících pod částečným vakuem, či dokonce pod kontrolovanou zemskou atmosférou, takže i nevodivé, damp, … vzorky mohou být jednoduše analyzovány. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 184


5.8.1. Princip řádkovací elektronové mikroskopie (SEM) V běžné SEM jsou získávány obrázky vzorků jako topografické features, které jsou pozorované jako povrchové zdrsnění, cracks a krystalové soustavy. Přidáním speciálních detektorů, které jsou citlivé na některou z chemických vlastností vzorků, může být SEM transformován ze zobrazovací metody k významnému analytickému nástroji. Na obr. 9.23 je zobrazen schématický diagram s hlavními komponenty SEM pro analytické účely. Elektronový paprsek je emitován ze zdroje, tzv. katody, která se nachází v elektronové pistoli umístěné v hlavě elektronově-optické kolony. K tomu, aby byl udržován stabilní zdroj elektronů a nedocházelo ke kolizím elektronů s molekulami plynů, je elektronová pistole a kolona umístěna pod vysokým vakuem. Elektrony jsou urychleny kolonou směrem dolů díky vysokému napětí, které je většinou nastavené v rozsahu od 100 do 30000 V.

Obr. 9.23: Schématický diagram skenovacího elektronového mikroskopu a jeho hlavní součásti – elektronová kolona a detektor signálu analytu.

Je dostupných několik typů katod (Goldstein et al. 2003). Nejlevnějším a nejvíce používaným zdrojem elektronů je žhavené wolframové vlákno. Tento termický emisní zdroj je žhaven přímo procházejícím vysokým proudem a jeho typická životnost je okolo 100 h, ale ne jako bright (má např. nízký elektronový výtěžek) jako ostatní elektronové zdroje. Jako více brighter elektronový zdroj může být jmenován krystal hexaboridu lanthanu (LaB6), který je žhaven nepřímo. LaB6 zdroje mají životnost okolo 1000 h a musí pracovat pod mnohem vyšším vakuem než wolframové vlákno. Moderní, ultra-vysoko rozlišené SEM pracují se zdrojem studeného nebo horkého emisního pole (FE), které zaručují intensivní jas paprsku o nízkém průměru, který je takto generován. Zdroje s emisí pole mají typickou životnost několik tisíc hodin. Ze dvou jmenovaných zdrojů, je horký zdroj



(Schottky) častěji používaný, protože má mnohem stabilnější paprsek. Výhody používání FE-SEM v porovnání s ostatními SEM spočívají v dosažení většího rozlišení obrázků při nižším urychlovacím napětí, zvětšení poměru signálu k šumu (dávající více kvalitní obrázky s nízkou hladinou šumu) a zvýšení hloubky ostrosti (ve srovnání s ne-FE-SEM). Vzhledem k použití nízkého napětí také dochází k nižšímu poškození vzorku paprskem a díky tomu, že svazek elektronů penetruje méně dovnitř vzorku, je povrch zobrazen ve větším detailu. Skleněné čočky v kondenzoru a objektivech světelného mikroskopu slouží k refrakci a fokusaci světla k osvětlení a vytvoření obrazu vzorku. V SEM čočkami kondenzoru a objektivu jsou elektromagnety s programovatelnými zdroji, které neslouží k vytvoření obrazu, ale k fokusaci elektronového paprsku na vzorek a k osvětlení jeho povrchu. Elektronový paprsek je vychýlen tak, aby prošel skenovacími cívkami (umístěnými obvykle v čočkách objektivu) a tím došlo k vytvoření skenu (rastru, řádku) povrchu vzorku. Rastrovací generátor synchronizuje vychýlení elektronového paprsku s řádkováním v zobrazovacím okně. Jas obrazu zobrazený na monitoru je nastavován pomocí intenzity emitovaných elektronů z daného řádku povrchu vzorku. Skenovací elektronový paprsek, fokusován pomocí čoček v objektivu, vstupuje do vzorkovací komory a je směrován přímo na vzorek. V závislosti na použitém typu SEM, vzorkovací komora může být pod vysokým vakuem nebo pod parciálním tlakem plynu (kapitola 9.8.4). Jakmile primární elektronový paprsek dopadá na vzorek, elektrony a rentgenové záření je emitováno a detekováno řadou detektorů umístěných pár milimetrů od sebe. Samotný vzorek může být posouván ve směru X, Y a Z, otáčen a nakláněn pomocí manuálních nebo řízených polohovacích stolků. Různého zvětšení je dosaženo změnou skenované oblasti vzorku vzhledem k fixní velikosti zobrazujícího okna, čím menší skenovaná oblast vzorku, tím větší bude zvětšení. Skenovací elektronový paprsek není vždy využit k získání informace o daném vzorku, může být využit v elementární rentgenové mikroanalýze (kapitola 9.9) jednotlivých částic, např. skenovací paprsek může být zastaven na určitém stacionárním bodě, který směřuje na vybraný bod na vzorku. Ačkoli jsou moderní SEM docela jednoduché k obsluze, kvalita obrazu zobrazeného na monitoru závisí nakonec na znalostech SEM operátora. K získání vysoce kvalitních a plnohodnotných obrázků je Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 186


zapotřebí vybrat a nastavit několik mechanických a elektrických parametrů (jako je pracovní vzdálenost vzorku, jeho naklonění, urychlující napětí paprsku, korekce astigmatismu, šířka paprsku, centrování apertury). Se zvyšujícím se urychlovacím napětím se elektronový paprsek stává více nabitým a dostane se do nižších vrstev vzorku, čímž dojde k horšímu zobrazení povrchu. Snížením průměru paprsku (snížení „spot size“) se zlepší prostorové rozlišení, aby se odhalily i jemnější detaily na povrchu vzorku, což jde ale na úkor kvality signálu, protože poklesne proud paprsku (v řádu 1 až 2 nanoampérsekund), je emitováno méně elektronů ze vzorku a obraz je více zašumělý. Tomuto problému lze často předejít pomalejším skenováním vzorku a použití digitální redukce šumu. Stejně jako v optické mikroskopii, tvary a velikosti krystalu mohou být určeny také pomocí SEM. Pokud je měřítko zobrazeno pod obrazem, může být využito k měření lineární vzdálenosti na vzorku. Kontrolní software SEM zahrnuje základní analýzu obrazu dovolující určení vzdáleností, ploch a úhlů na vzorku.

5.8.2. Příprava vzorku pro řádkovací elektronovou mikroskopii Před vlastní přípravou vzorku je potřeba zvážit účel analýzy vzorku pomocí SEM, protože takto můžeme ovlivnit způsob, jakým se bude vzorek připravovat. SEM operátoři pracující v různých průmyslových odvětvích mají specifické typy vzorků, se kterými pracují a byly pro ně vyvinuty originální způsoby přípravy těchto vzorků (DeNee 1987). Většina vzorků, se kterými se setkáváme při charakterizaci tuhé fáze farmaceutik, jsou prášky, jednotlivé částice, pevné lékové formy (tablety a kuličky) nebo balicí materiál (jako sklo, plasty a kov). Je životně důležité omezit manipulaci se vzorkem na minimum a tím zabránit vstupu artefaktů a porušení povrchu. Jenom lehký dotek povrchu vzorku může způsobit fyzické poškození při velkém zvětšení. Naštěstí příprava materiálu pro SEM analýzu je velmi jednoduchá a zpravidla nezabere déle než pár minut. Pracovníci se zkušenostmi v elektronové mikroskopii jsou zběhlí v navrhování specifických způsobů přípravy různých druhů vzorků, z nichž některé mohou být opravdovou výzvou, tak, aby zajistili, že vzorek bude stabilní ve vysokém vakuu a i poté, co na něj bude mířit elektronový paprsek.



Prášky, jednotlivé částice, tablety, lyofilizované koláče, kapsule a kuličky jsou připevněny do držáků vzorků, tzv. terčíky, pomocí různých metod. Rychle schnoucí lepidlo, stříbrný nátěr vedoucí elektrický proud nebo uhlíkový nátěr jsou vhodné k udržení objektů velikosti až několik milimetrů, zatímco jemné prášky a malé objekty mohou být dispergovány do oboustranné adhesivní pásky, lepkavých podložek nebo etiket, nebo může být použitá tenká skvrna teplem tavitelného plastu. Velké vzorky mohou být také zmenšeny tak, aby seděly na terčících, a jádra tablet mohou být rozlomeny a řádně přitisknuty na terčík (Goldstein et al. 1992). S částicemi o velikosti 1 µm může být manipulováno pomocí ostré jehly z wolframového drátu a mohou být automatizovány pro SEM nebo EDX analýzu, ale k tomu jsou vyžadovány znalosti, trpělivost a zcela nehybná ruka (Brown a Teetsov 1980). Naštěstí většina vzorků ke stanovení pevné fáze farmaceutických preparátů jsou hrubé nebo jemné prášky, které vyžadují méně náročné postupy přípravy. Prášky mohou být jednoduše sypané nebo nalité na terčíky jako přilnavá tenká vrstva, přebytek prášku je jednoduše odstraněn pryč nebo lehce odfouknut mírným proudem stlačeného plynu (US Pharmacopeia 2009b). Velmi rychlý, jednoduchý a efektivní způsob rutinně používaný autorem je vložit adhezivní vložku na terčík a lehce ji ponořit do prášku, tak aby tenká vrstva prášku ulpěla na vložce a přebytečný prášek odfouknout pryč (je potřeba zabránit vstupu vzdušného prachu). Za všech okolností je třeba zabránit vzájemné kontaminaci vzorků, obzvláště prášků. Jednotlivé částice přenesené z jiného vzorku (které by byly jinak nezaznamenatelné nebo vůbec nedetekovatelné pomocí analýzy v roztoku) se stanou součástí vzorku a vědecký úsudek může pak být proveden na základě kontaminantu a ne analytu! Z tohoto důvodu není praktické používat například kartáčky k nanášení práškových částic na terčík, protože by musely být buďto plně dekontaminovány nebo vyhozeny po každém použití. Chceme-li stanovit vzorky nevedoucí elektrický proud za vysokého vakua pomocí SEM (např. API, pomocné látky, lékové formy a většinu primárních balicích materiálů), je potřeba je pokovit tenkou vrstvou kovu (většinou méně než 20 nm, Goldstein et al. 1992). Různé kovy, jako např. zlato nebo platina, mohou být použity k pokovování technikou naprašování (tyto techniky a jejich aplikace jsou popsány v Lee 1995). Bez pokovování by vzorek poskytoval pouze čistě negativní náboj, který je skenován s elektronovým paprskem, což může způsobit vychýlení dopadajícího elektronového Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 188


paprsku a zapříčinit tak ozáření vzorku, které pokud je přerušeno, tak způsobuje blesky a jasné pruhy na obrazu. Kromě prevence vytvoření náboje, pokovování také zvyšuje výtěžek sekundárních elektronů emitovaných z povrchu vzorku, což dává světlejší obrázek při nižším napětí elektrického paprsku a pomáhá zlepšit tepelnou stabilitu odváděním tepla ze vzorku, zatímco je vzorek bombardován proudem elektronů. Pokovení vzorku většinou není viditelné při zvětšení pod 15000x. Při vyšších zvětšeních se stává viditelným, obzvláště při použití vysoce rozlišeného FE-SEM, jemně zrnitá textura na povrchu může zakrývat prvky, které hledáme, nebo může být zaměněna za skutečnou strukturu vzorku. Platina poskytuje mnohem jemnější zrnitost pokovení než zlato a proto se používá ve vysoce rozlišené FE-SEM. Je-li vyžadováno zvětšení větší než 15000x, je možno použít i jemně zrnité kovové povlaky, jestliže jsou vzorky podchlazeny pod teplotu prostředí během naprašování (Goldstein 1992). V podstatě chlazení vzorku během naprašování může také ochránit před tepelným rozkladem vzorky s nižším bodem tavení. Abychom předešli potenciálním problémům a vyhnuli se artefaktům spojeným s pokovováním vzorků, materiály nevedoucí elektrický proud mohou být analyzovány bez nutnosti pokovení pomocí tzv. environmentální SEM nebo SEM s variabilním tlakem (kapitola 9.8.4). Rovněž pokud je vzorek analyzován pomocí FE-SEM pod vysokým vakuem za urychlovacího napětí nižšího než 10 kV, není potřeba ho pokovovat, protože energie sekundárních elektronů vyražených ze vzorku je vyrovnávána energií vstupujícího paprsku, což eliminuje vytvoření náboje (Lee 1995). Má-li být vzorek analyzován pomocí elementární rentgenové mikroanalýzy, je vhodnější, pokud není pokoven, protože daný kov interferovat a v rentgenovém spektru se objeví navíc čáry kovu použitého k pokovení. Je možné vytvoření tenké vrstvy uhlíku, avšak moderní většina moderních prvkových analýz je schopna detegovat i lehké prvky (od boru dolů), a tudíž i tenká vrstva uhlíku může interferovat. Avšak znovu environmentální SEM nebo SEM s variabilním tlakem dovoluje nepokovené vzorky sledovat a analyzovat v jejich přirozeném stavu.



5.8.3. Interakce elektronového paprsku se vzorkem Při bombardování vzorku elektronovým paprskem dochází k pronikání paprsku pod povrch vzorku až do hloubky několika mikrometrů a je rozptýlen do objemu zvaného interakční objem. Skutečná hloubka, do které paprsek proniká je dána urychlovacím napětím paprsku (paprsek o vyšší energii proniká hlouběji než paprsek o nižší energii) a průměrnou atomovým číslem prvků obsažených ve vzorku (paprsek proniká hlouběji vzorkem obsahujícím lehčí prvky než těžší). Na obrázku 9.24 jsou zobrazen různé druhy záření, které jsou emitovány vzorkem při interakci s elektronovým svazkem: sekundární elektrony, zpětně rozptýlené elektrony, Augerovy elektrony, rentgenové záření a světlo (Chandler 1980). Ze jmenovaných záření budou detailněji diskutovány především emitované sekundární a zpětně rozptýlené elektrony a rentgenové záření, protože jsou každodenně využívány ke stanovení vlastností pevné fáze farmaceutických preparátů. Další ze jmenovaných záření jsou méně významné pro analýzu farmaceutických vzorků s výjimkou speciálních případů. Signál, který poskytuje vzorek během bombardování elektronovým paprskem, nese jedinečnou a doplňující topografickou a chemickou informaci, která může být zachycena pouze vhodným detektorem pro SEM. Takže spíše než „odpadní“ a rentgenové záření, jsou součástí SEM řady detektorů, schopny zachytit požadované záření. Některé SEM jsou schopny zachytit více různorodých signálů a tím získat další dodatečné informace o vzorku. Přenos energie z elektronového paprsku na vzorek, při jeho zpomalení dopadem na vzorek, může způsobit lokální degradaci nebo dokonce roztavení některých organických materiálů. Paprsek, který vyvolal degradaci, může být pozorován na obrázcích jako bublající (tento fenomén je často pozorován u monohydrátu laktózy při větším zvětšení). Pokovení nevodivých materiálů vodivými vrstvami kovů (kapitola 9.8.2) může pomoci rozptýlit teplo a redukovat poškození vzorku paprskem.

Obrázek 9.24: Druhy záření emitovaného při interakci elektronového paprsku se vzorkem

Některé vzorky, jako například kvazipevné nebo vlhké materiály, mohou být chlazeny či dokonce mraženy pomocí studené fáze, aby bylo zabráněno rozkladu vzorku (Goldstein et al. 1992). FE-SEM Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 190


dovoluje analyzovat povrchy labilních vzorků použitím elektronového paprsku u velmi nízké energii (např. 500 V nebo méně), což může pomoci minimalizovat nebo dokonce eliminovat zničení vzorku. Pokud jsou pomocí SEM analyzovány hydratované nebo solvatované krystaly, je možno odstranit vodu nebo jiné rozpouštědlo pomocí vakua. Některé krystaly zůstanou po desolvataci bez evidentní změny, pokud je v nich voda nebo rozpouštědlo vázáno buďto velmi silně a nemůže být odstraněno, nebo je v nich volně vázáno a pak může snadno uniknout po strukturních kanálech. Pozůstatky desolvatace jsou obvykle pozorovatelné jako náhodně rozmístěné jemné trhlinky na povrchu krystalů bez definované struktury nebo jako nebo jako pravidelný vzor s kontrolovanou krystalovou strukturou. Např. na obr. 9.45 jsou zobrazeny jemné dehydratované trhliny na nakloněném konci roviny a některých protáhlých, prismatických rovinách jehlovitých krystalů monohydrátu theofylinu. Všimněte si, že minimálně jeden z viditelných prismatických rovin postrádá trhliny, což napovídá, že pod vysokým vakuem (vyšším než 8 x 10-6 Torr) ztrácí tyto krystaly vodu anisotropicky. Analyzujeme-li tyto vakuem dehydratované krystaly pomocí světelné mikroskopie, jsou-li průhledné, pak mohou být pouze částečně dehydratovány (obr. 9.20). Je vyloučeno, aby dehydratace nastávala za použití pouze středně vysokého vakua (okolo 0,06 Torr) během naprašování platinou. Krystaly monohydrátu theofylinu byly naprašovány pod vakuem a podrobeny čistícímu cyklu (bez naprašování). Tyto procesy nezpůsobily žádné zakalení krystalů, ke kterému dochází za vystavení vysokému vakuu v SEM mikroskopu. Proto použití středně vysokého vakua během naprašování pro krystaly se slabě vázanou vodou nebo jiným rozpouštědlem, může být vhodné k zamezení desolvatace.

5.8.3.1. Sekundární elektrony Neelastický rozptyl elektronů, který nastává po interakci vstupujícího svazku elektronů se vzorkem, způsobuje emisi sekundárních elektronů jako důsledek přenosu energie z paprsku na vzorek do jeho interakčního objemu. Sekundární elektrony mají nízké energie (obvykle méně než 50 eV) a jsou vyráženy z menší hloubky, obvykle méně než 50 nm pod povrchem vzorku. Většina SEM obsahuje Everhart-Thornley (E-T) elektronový detektor, který je citlivý k těmto nízkoenergetickým sekundárním elektronům. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 191


Obr. 9.25: Jemné trhliny na některých rovinách krystalu monohydridu theofylinu způsobené dehydratací za vysokého vakua

E-T detektor obsahuje scintilátor, který přeměňuje sekundární elektrony na světelné záblesky. Tyto záblesky procházejí světelnou trubicí do fotonásobiče, kde jsou přeměněny zpátky na elektrony, které jsou násobeny, a tím vzniká signál, který je registrován jako zesílený proud odpovídající počtu sekundárních elektronů emitovaných vzorkem. Aby bylo zajištěno, že veškeré nízkoenergetické elektrony emitované vzorkem vytváří obraz a žádné z nich se „neztrácejí“ ve vzorkové komoře, detektor sekundárních elektronů (běžně umístěný k jedné straně vzorku) obsahuje positivně nabitou drátěnou mřížku, ke které jsou přitahovány elektrony. Důsledkem toho, sekundární elektrony putují po zakřivených trajektoriích od místa na vzorku až k na stranu detektoru, který nemusí být v přímé linii se vzorkem. Obrazy vytvořené ze sekundárních elektronů bývají velmi kontrastní a vykazují skutečný detail povrchu, který koresponduje topografickým vlastnostem, jako jsou trhliny, jamky, hrby a různé druhy povrchového zdrsnění. Kromě sekundárních elektronů jsou E-T detektory také citlivé k vysoce energetickým zpětně rozptýleným elektronům, které jsou emitovány z těch oblastí vzorku, které jsou v přímé linii k detektoru. Pokud je přepětí na mřížce E-T detektoru negativní (což není možné pro některé druhy SEM), pak budou sekundární elektrony odráženy a obraz bude tvořen pouze vysokoenergetickými zpětně rozptýlenými elektrony. To, co dělá obraz tří dimenzionální (obr. 9.22 a 9.25) se světlem a stínem je kombinovaný obraz získaný ze sekundárních a zpětně odražených elektronů (které dávají světlo částicím, které jsou ve směru k elektronům).



5.8.3.2. Zpětně rozptýlené elektrony Pokud je primární elektronový paprsek ve vzorku vystaven elastickému rozptylu, jsou emitovány zpětně rozptýlené elektrony. Tyto zpětně rozptýlené elektrony mají větší energii než sekundární elektrony. Jejich energie se obvykle blíží energii vstupního elektronového paprsku (až k několika kV). Stejně jako sekundární elektrony, i zpětně rozptýlené elektrony poskytují obrazy ukazující povrchovou topografii vzorku. Na rozdíl od sekundárních elektronů, obrazy zpětně rozptýlených elektronů jsou nejvíce užitečné k ukázání změn chemického složení vzorků, neboť změny v průměrné hodnotě atomového čísla se projevují jako změny světlosti napříč obrazem vzorku. Ačkoli jsou E-T detektory citlivé k zpětně rozptýleným elektronům, běžně nejsou používány k jejich zobrazování, protože jsou umístěny na jedné straně vzorku a tudíž většina emitovaného signálu není zachycena. Za účelem zachytit zpětně rozptýlené elektrony, které jsou emitovány v širokém úhlovém rozsahu, detektor musí být umístěn blízko a přímo nad vzorek. Mnoho SEM je v současnosti vybaveno detektorem zpětně rozptýlených elektronů, který může být využit jako scintilátor a zároveň pevný křemíkový diodový detektor. Scintilační detektor funguje stejně jako v případě sekundárních elektronů – detekcí elektronů jako světelné záblesky (kap. 9.8.3.1), ale není zde žádná přepěťová mřížka, která by přitahovala elektrony. Pevný křemíkový diodový detektor je tvořen čtyřmi nebo pěti oddělenými diodami, které jsou sestaveny jako tenká prstencová deska, která je buďto fixně připevněna na konec objektivových čoček, nebo na pohyblivém rameni. Diody mohou být zapínány a vypínány v různých kombinacích, čímž můžeme vytvořit topografický, složený nebo kombinovaný obrázek. Pokud je detektor zpětně rozptýlených elektronů namontován nad vzorkem, typografický kontrast není tak dobrý, jako by byl s detektorem sekundárních elektronů umístěným na straně. Takže abychom dostali topografické obrazy, je vhodné scintilátor lehce vychýlit na jasnější stranu obrazu. K tomu, abychom dostali topografické obrazy pomocí křemíkového detektoru, jsou diody odděleně zapínány a vypínány a tím jsou elektrony snímány pouze z jedné strany prstence. Je dobré poznamenat, že jak scintilační tak křemíkový detektor zpětně rozptýlených elektronů je také velmi citlivý na viditelné záření, které je vzorkem emitováno jako důsledek katodoluminiscence (kap. 9.8.3.4). Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 193


Výběr detektoru zpětně rozptýlených elektronů závisí na tom, jakou informaci chceme získat. Scintilační detektory pracují dobře při nízkých napětích, avšak nejsou tak dobré jako diodové na zobrazování rozdílů v atomových číslech. Scintilační detektory rovněž vyžadují větší prostorovou kapacitu než diodové, což je předurčuje k práci s nízkými vzdálenostmi detektoru od vzorku potřebnými k vysoce rozlišenému zobrazování. Ideální varianta je mít v SEM oba druhy detektorů, čímž můžeme kombinovat výhodou obou a tím dosáhnout zobrazování širokého spektra typů vzorků. Výhoda použití detektoru zpětně rozptýlených elektronů oproti detektoru sekundárních elektronů spočívá v tom, že není ovlivněn elektrickým nábojem na povrchu vzorku (kap. 9.8.2). Takže jakmile není nevodivý materiál dostatečně pokoven a je zde riziko výboje, může být zobrazen za vysokého vakua použitím detektoru zpětně rozptýlených elektronů. Oproti sekundárním elektronům, které pochází z vrstev těsně pod povrchem vzorku, zpětně rozptýlené elektrony jsou emitovány z hlubších vrstev vzorku (hloubka roste se zvětšující se energií paprsku). Důsledkem toho, obrazy zpětně rozptýlených elektronů mají nižší prostorové rozlišení než obrazy sekundárních elektronů a zobrazují povrch v menším detailu. Výtěžek zpětně rozptýlených sekundárních elektronů roste se zvyšujícím se průměrným atomovým číslem vzorku. Proto, když stanovujeme API, směsi, pevné lékové formy a kontaminanty cizího původu, změny v relativním jasu obrazu mohou odpovídat změnám v prostorové distribuci lehkých a těžkých prvků. Materiály, obsahující těžší atomy nebo které mají vyšší průměrné atomové číslo, vypadají světlejší než ty, které obsahují lehčí atomy. Obr. 9.26 ukazuje, jak je zobrazování zpětně rozptýlených elektronů použito k získání topografického obrazu a rozdílů v chemickém složení ve směsi obsahující deskovité krystaly volné báze API, které mají v průměru nízké atomové číslo ve srovnání s jehlovitými krystaly její besylátovou solí. Obrazy chemické kompozice ve skutečnosti nic neříkají o prvkovém složení vzorku, ale ukazují, ve kterých oblastech vzorku se nachází prvky s vyšším atomovým číslem a ve kterých s nižším. Ke stanovení prvkového složení se používá elementární rentgenová mikroanalýza (kapitola 9.9). Zobrazování zpětně rozptýlených elektronů má také význam ve zkoumání upravovaných produktů, jak je ukázáno na studii distribuce v mikroměřítku a homogenity prvků s nízkým atomovým číslem Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 194


částic léčiva dispergovaného v matrici pektinátu vápenatého, který má vyšší atomové číslo (Sriamornsak a Thirawong 2003).

Obr. 9.26: Obrazy zpětně rozptýlených elektronů ukazující směs obsahující volnou bázi (destičky) a bensylátovou sůl (jehličky) připraveného API zobrazené v topografickým (vlevo) a kompozičním módě (vpravo)

5.8.3.3. Rentgenové záření v elektronové mikroskopii Interaguje-li elektronový paprsek s atomy vzorku neelasticky, dochází k emitování ionizujícího rentgenového záření. Pokud je atom bombardován elektronem o vysoké energii, je pravděpodobné, že bude vyražen elektron z vnitřní elektronové slupky. To způsobí volné místo v elektronové slupce a atom se stává dočasně ionizovaný. Elektron z vnější slupky o vyšší energii okamžitě přeskočí, aby zaplnil prázdné místo, a zároveň dojde k vyzáření energie odpovídající tomuto pohybu elektronu. Tato energie je emitována ve formě rentgenového fotonu. Energie a vlnová délka tohoto fotonu je charakteristická pro daný atom (Loretto 1984). Charakteristické rentgenové záření je významný vedlejší produkt interakce paprsku se vzorkem, protože může být využito k nedestruktivní prvkové analýze vzorku (toto téma je blíže diskutováno v kapitole 9.9).

5.8.3.4. Katodoluminiscence Je-li nějaká látka ozařována proudem elektronů, může lumineskovat a emitovat záření o vlnové délce v oblasti od blízkého ultrafialového, přes viditelné až k blízké infračervené oblasti. Tento emisní proces, tzv. katodoluminiscence, je většinou využívána v analýze anorganických materiálů (jako jsou minerály a polovodiče), avšak hodně organických sloučenin mohou také poskytovat charakteristická spektra, která mohou být analyzována za použití spektrometru zakomponovaného v SEM (De Mets et al. 1974). Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 195


5.8.3.5. Environmentální SEM a VP SEM (mód s proměnným tlakem - „variable pressure“ mód) Farmaceuticky aktivní krystaly a prášky jsou spíše elektricky nevodivého charakteru, a pokud je chceme analyzovat s paprskem vysoce energetických elektronů za vysokého vakua, elektrony nemůžou pronikat do země. Důsledkem toho, nevodivé vzorky vyžadují vytvoření negativního náboje, který často vede k horší kvalitě obrazu, jelikož se vstupní paprsek občas odrazí. Chceme-li se vyvarovat nabíjení, jsou vzorky většinou pokovovány velmi tenkou vrstvou kovu (kapitola 9.8.2) a tak mohou být vzorky zobrazovány a elektronové mikrografy zaznamenávány bez rušivých artefaktů. Vzorky, analyzované za vysokého vakua, musí být také suché, avšak fyzikální změny, jako zmenšení či dokonce roztříštění krystalů může nastat, odstraňujeme-li vodu nebo jiné rozpouštědlo za sníženého tlaku (kapitola 9.8.3). Proto byla vyvinuta metoda stanovení vzorku pomocí SEM v jejich přirozeném stavu bez jakéhokoli pokovování. První environmentální skenovací elektronový mikroskop (ESEM), kterým je možno analyzovat vlhké vzorky, je komerčně dostupný od roku 1988. Tato metoda je jednou z posledních novinek na poli skenovací elektronové mikroskopie (Danilatos 1991). Molekuly plynu jsou ve vzorkové komoře pozitivně ionizovány a takto jsou bombardovány elektronovým paprskem. Mrak iontů v okolí vzorku bude neutralizován negativním nábojem v procesu zvaném nábojová kompenzace (Stokes 2008). ESEM dovoluje stanovovat nevodivé vzorky, vlhké i suché, v jejich přirozeném stavu za použití širokého rozsahu parciálních tlaků v komoře s minimální přípravou vzorku a bez pokovování. Tato metoda vyžaduje zachování elektronově optické kolony a (obzvláště) komory s elektronovým dělem pod vysokým vakuem, za použití systému různých pump je vzorková komora udržována pod tlakem blízkým atmosférickému a je částečně naplněna plyny, včetně vzduchu a vodní páry (Danilatos 1991). To, že vzorková komora obsahuje plyn, znamená, že dochází k jakémusi postrannímu rozptylu elektronového paprsku, tzv. skirting, neboť dochází ke kolizím elektronového paprsku s molekulami plynu (Stokes 2008). Tomuto rozptylu by mělo být zamezeno ve vysoce rozlišených studiích, protože paprsek nemůže být zaostřen tak jemně, jako by tomu bylo za vysokého vakua, nicméně zkrácením Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 196


dráhy paprsku (výběrem kratší pracovní vzdálenosti) je možno tento efekt minimalizovat. Je možno také optimalizovat tlak plynu a tím eliminovat nabíjení vzorku, čímž je možno minimalizovat rozšíření paprsku, a zlepšit tak kvalitu obrazu (Carlton 1999). Jeden z důvodu, proč mnoho vědců využívá ESEM je, že vzorky netřeba pokovovat před vlastním stanovením. Další SEM, kde se nemusí před stanovením pokovovat a má zároveň nižší náklady, je VPSEM (variable pressure SEM) (Mathieu 1996). Stejně jako ESEM i VP-SEM má oddělený systém vakua vzorkové komory a elektronové komory, takže kolona je udržována pod vysokým vakuem, zatímco řízené množství plynu (většinou vzduchu) je přiváděno do vzorkové komory. Rozdíl mezi ESEM a VPSEM je ten, že v ESEM, vzorky můžou po dobu stanovení zůstat vlhké, protože je zajištěna rovnováha mezi kapalnou vodou, kterou obsahuje vzorek, a vodní párou ve vzorkové komoře. Ve VP-SEM není možno naplnit vzorkovou komoru, takže vlhké vzorky velmi rychle uschnout za sníženého tlaku plynu. Pokud je důležité stanovit vlhké vzorky nebo zjistit efekt přidané vody do vzorku, pak by měla být požitá ESEM. Ačkoli obrazy nevodivých vzorků zobrazované ESEM nebo VP-SEM ukazují to, co chceme vidět, obrazy pokovených vzorků budou vždycky jasnější a s lepším rozlišením detailů povrchu, protože kovy mají vždycky lepší elektronová výtěžky než na uhlík bohaté vzorky a zároveň protože paprsek nemůže penetrovat příliš hluboko pod povrch vzorku. Není vždy nutné použít ESEM ke stanovení vlhkých vzorků. Poslední inovace přinesly WETSEM TM, která umožňuje stanovovat plně hydratované vzorky za vysokého vakua. Jedná se o kapsli s elektronově transparentním oknem, ve kterém jsou hydratované vzorky hermeticky uzavřeny a udržovány ve vlhkém prostředí, zatímco jsou analyzovány pomocí zpětně rozptýlených elektronů (Behar 2005). S nárůstem používaní ESEM ve farmaceutickém výzkumu, jsou objevovány nové aplikace této jedinečné metody. ESEM je označován jako nástroj nevyčíslitelné hodnoty k charakterizaci mechanismu uvolňování léčiv z biologicky rozložitelných polymerních matric a studiu širokého rozsahu přípravků a farmaceutických materiálů, jako jsou emulze, tablety, polysacharidy a krystaly solí (DÉmanuele a Gilpin 1996). Další příklady zahrnují např. stanovení prostorové distribuce hydratovaných částic nedokromilu sodného na laktózovém nosiči v inhalačních přípravcích (Clarke et



al. 1998) nebo schopnost sledovat dehydrataci a rehydrataci liposomů obsahujících rozpuštěné léčiva (Mohammed et al. 2004). ESEM je bezpochyby cenným nástrojem ke studiu vlhkých vzorků a její funkčnost je rozšířena i na stanovení zmražených vzorků, pokud je použit mrazící stolek. Toho se využívá jako způsoby podpory vývoje a optimalizace cyklů vysušování vzorků v laboratorním měřítku. Fyzikální stabilita lyofilizovaného koláče koreluje s mikrostrukturními změnami, které byly pozorovány, když zmražené roztoky manitolu a poly(laktid-co-glykolidu) sublimovaly pod vakuem v ESEM (Meredith et al. 1996). Ačkoli mohou být vlhké vzorky jednoduše stanoveny pomocí ESEM, tato metoda neposkytuje nutně náhled na to, co se děje uvnitř pevné lékové formy, když se rozpouští. K tomu, abychom získali tuto informaci, jsou k dispozici další techniky SEM; např. rozpouštění promethazin hydrochloridu z více částicových perliček může být monitorováno pomocí SEM za vysokého vakua použitím prvkové rentgenové mikroanalýzy k vytvoření mapy distribuce síry a chloridu v perličkách. Toho bylo dosaženo po přípravě vzorku vymražením, čímž se odstranily vlhké perličky z rozpouštěcí lázně v daných časových intervalech. Perličky byly mraženy v tekutém dusíku a následně rozlomeny, aby bylo odkryto jejich jádro, a udržovány zmražené během analýzy (Wilding et al. 1991).

5.8.4. Kvantitativní analýza SEM obrazů Obrazy ze SEM ukazují dostatečné množství informací o tvarech, velikostech a povrchových vlastnostech API, pomocných látek, pevných lékových forem i obalových materiálech. Vyhodnocení těchto obrazů většinou provádí zkušený operátor, který může volit parametry obrazu tak, aby zdůraznil specifické rysy povrchu vzorku a použít je ke srovnání obrazů z předchozích experimentů. Toho vyhodnocení je kvalitativní a subjektivní, ale je adekvátní k mnoha situacím. Pro analytické potřeby a kvantitativní srovnávání mezi různými vzorky, toto visuální hodnocení není dostatečné. Mnoho SEM má ve svém softwaru zakomponovány nástroje k určení např. vzdálenosti mezi jednotlivými vzory na obrazu nebo plochy vybraných objektů, jimiž jsou analyzovány vzorky. Kvantitativní analýza obrazu je možná po převedení do formátu vhodného k analýze obrazu (daný Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 198


softwarový balíček může a nemusí být součástí SEM). Schopnost přesně analyzovat obrazy umožňuje určit velikost částic a jejich 2D tvary (BéruBé et al. 2003; Feddah a Davies 2004; Tinke et al. 2005). Tato schopnost je vhodná pro mnoho aplikací a je často užívána k podpoře vývoje produktů. Kvalitnější rozlišovací výkon SEM umožňuje měřit velikosti částic, které by byly příliš malé pro světelnou mikroskopii (Jillavenkatesa et al. 2001). Jak jako ve světelné mikroskopii, příprava vzorku pro skenovací elektronovou mikroskopii je rozhodující pro zajištění dostatečné disperze částic. Při provádějí analýzy obrazu k získání velikosti a tvaru částic, může široká škála šedi mezi světlými a tmavými oblastmi v obrazech sekundárně rozptýlených elektronů způsobit problémy při vybírání prahu kontrastu rozlišujícího mezi částicemi, které nás zajímají a pozadím. Abychom předešli těmto problémům v analýze obrazu sekundárně rozptýlených obrazů, jež mají obvykle menší počet šedých odstínů a méně výrazné okrajové efekty, je možné dosáhnout lepších výsledků prahováním snímků. Během vývoje suchých práškových inhalačních přípravků bylo zjištěno, že mikroskopické povrchové zdrsnění částic laktózového nosiče má značný vliv na jemné frakce částic léčiva spojené s manipulací s přístrojem a doručováním léčiva do plic (Chan et al. 2003). Proto schopnost měřit povrchové zdrsnění u takto malých částic je výhodné k získání optimální výroby produktů, soudržnosti ve kvalitě pomocných látek a robustnosti výroby. Použití SEM k řešení těchto problému je evidentní, avšak donedávna bylo kvantitativní měření (nebo povrchová profilometrie) topografie povrchu časově i pracně velmi obtížné. Používaly se další mikroskopické techniky jako konfokální laserová skenovací mikroskopie a mikroskopie atomárním sil (Entwistle 1996). Použitím SEM k určení jemné struktury povrchu částic, např. laktózy, je potřeba dávat pozor při výběru kovu k pokovování (platina), aby byl povrch dostatečně jemný a nezakrývaly se rysy, které chceme vidět. Pokud je to nutné, je analyzovat nepokovené vzorky pomocí ESEM nebo VP-SEM. Je možno získat pomocí 3D obrazy zaznamenáním páru elektronmikrografů (jeden pro pravé oko a jeden pro levé) s obrazem vzorku umístěným pod eucentrickým úhlem mezi 5 až 10° vzhledem k ostatním obrazům. Tyto mikrografy představují stereo pár a dovolují vnímání hloubky na vzorku viděné jako stereoskopický pohled (binokulární pohlížení) pouhým okem nebo použitím softwaru k převedení obou obrazů do jednoduchého, dvojbarevného anaglyfu, který můžeme pozorovat



použitím červeno-zelených nebo červeno-modrých brýlí. Tyto obrazy poskytují mnoho informací a ukazují předtím neviditelné topografické rysy na vzorku. Ale jsou kvalitativní, protože skutečnou hloubku (z) je těžké nebo dokonce nemožné změřit. Naposledy vyvinutý 3D software k vytvoření rekonstrukce obrazu, nazvaný MeX® (Alicona Imaging GmbH, Rakousko) využívá principu stereo-fotogrammetrie k vytvoření povrchové profilometrie. Použití tohoto softwaru v SEM umožňuje využití nejen jako zobrazovacího nástroje, ale také jako mikrometrický nástroj (Scherer a Piffer 2003). Stereo pár zaznamenaný s přesně definovanou vzdáleností a úhlem měření, nebo trojce obrazu pro větší přesnost, je měřen SEM a importován do MeX®. 3D topografické rysy vzorku, jako je povrchové zdrsnění krystalů, struktura filmem potažených tablet nebo výška růstu kroků na povrchu krystalů, můžou být jednoduše vizualizovány a kvantifikovány, jak je zobrazeno na obr. 9.27.

5.9. Prvková rentgenová mikroanalýza Interaguje-li svazek vysoce energetických elektronů se vzorkem, je emitováno rentgenové záření, charakteristické pro daný prvek. SEM s detektorem a spektrometrem rentgenového záření je významným analytickým nástrojem, který umožňuje nedestruktivní analýzu vzorku.

Obr. 9.27: Elektronmikrograf zobrazující kroky růstu na povrchu API krystalu. 110 µm dlouhý topografický profil (A-B) ukazuje 6,7 µm vysoký krok mezi body (XX)

Jsou dostupné spektrometry, které detekují rentgenové záření a zároveň dispersní, schopné vytvořit rentgenové spektrum s emisními čarami, které korespondují s detekovanými prvky, v závislosti na vlnových délkách nebo energiích (Loretto 1984; Goldstein et al. 1992).



5.9.1. Detekce rentgenového záření Vlnově dispersní rentgenové mikroanalytické systémy (WDX) detekují při dané vlnové délce charakteristické rentgenové záření emitované prvky od lithia (Z = 3) výše. Detektor sekvenčně skenuje přes rozsah úhlů, čímž sbírá fotony rentgenového záření, emitované vzorkem, tak jak jsou rozptylovány z krystalu (Braggova difrakce) ve spektrometru, a počítá je. Pečlivým výběrem krystalu může být optimalizována difrakce vlnových délek rentgenového záření, a tím je dáno rozlišení emisních čar nacházejících se blízko sebe. S detekčním limitem okolo 0,01 hm. % (100 ppm), WDX je vhodnou metodou ke stanovení stopového množství většiny prvků ve vzorku. Vlnově dispersní rentgenová mikroanalýza je vhodná ke kvantitativní prvkové analýze, protože spektrometr může být nastaven kvantifikovat právě jeden prvek. Pokud je analyzován neznámý prvek ve vzorku, kvalitativní analýza může zabrat několik minut, protože spektrometr potřebuje skenovat přes široký rozsah úhlů, aby posbíral všechno emitované záření. Za účelem provést kvantitativní analýzu, musí být vzorky rovné a velmi dobře vyleštěné, aby bylo zajištěno, že geometrie mezi elektronovým paprskem, vzorkem a detektorem je přesně známa a je minimalizován mimo-prvkový efekt (Goldstein et al. 2003). S takovými vzorky se velmi zřídka setkáváme ve farmaceutickém průmyslu a ve vývoji léčiv (možná s výjimkou rovnoběžně stlačených prášků), důsledkem toho, WDX má velmi omezené aplikace a není rutinní technikou (oproti dalším průmyslově studovaným materiálům jako jsou kovy, horniny a polovodiče, které je možno jednoduše připravit rovné a hladké). Energiově dispersní rentgenové mikroanalytické (EDX) systémy na druhou stranu nemají žádné pohyblivé části a je možno jimi detekovat rentgenové záření prvků (teoreticky až po bor), emitované současně přes široký rozsah emisních energií. Rentgenové záření emitované vzorky je rozptylováno dle jejích energií (v elektronvoltech, eV) do oddělených kanálů a distribuce rentgenového záření je zobrazována jako píky v histogramu napříč vybraným energetickým rozsahem, např. od 0 do 20 keV. Energiově dispersní rentgenová analýza je bezpochyby rychlejší než WDX, kvalitativní spektrum může být zaznamenáno během pár vteřin. Nejlehčí detekovatelný prvek závisí na použitém detektoru, což bude diskutováno později. Ačkoli elementární data můžou být zaznamenány rychle, EDX nemá tak dobré rozlišení čar blízko sebe jako WDX, a proto je detekční limit EDX pouze okolo 0,1 hm. % (1000 ppm). Stejně jako v WDX, i v EDX je možná kvantitativní analýza, ale vyžaduje stejné podmínky na



rovné a hladké vzorky. Jelikož je EDX velmi rychlá technika, je častěji než WDX používána v kvalitativní nebo (v nejlepším případě) v semi-kvalitativní analýze a je častěji aplikovatelná pro prvkovou mikroanalýzu ve farmaceutickém průmyslu (Tanninen et al. 1990). Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza je vhodná pro rychlý a nedestruktivní screening prvků ve vzorcích, což pak může být využito pro vybrané vzorky k další přesnější analýza pomocí metod, jako je atomová absorpční (AA) spektroskopie nebo hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plasmatem (ICP-MS). Zbytek kapitoly proto bude zaměřen právě na EDX. EDX obsahuje čtyři části: detektor (umístěný pouze pár milimetrů od vzorku), vícekanálový analyzátor (spektrometr), počítač (který má zakomponovaný rentgenový pulsní procesor k rozlišení mezi různými rentgenovými zářeními a počítač rentgenových pulsů) a zobrazovací monitor. Většina EDX v současnosti používaných detektorů je složena z pevného, tzv. „lithium-drifted“ silikonového krystalu, který je chlazený pomocí tekutého dusíku nebo Peltierového článku. K ochraně krystalu v prostředí vzorkové komory slouží obvykle tenké fóliové (beryllium nebo polymer) okénko před krystalem, propouštěcí rentgenové záření (Goldstein et al. 2003). Prvky lehčí než sodík (Z = 11) emitují rentgenové záření o nízké energii, jež je pohlceno tenkým beryliovým okýnkem. Tudíž mnoho moderních detektorů mají ultratenké polymerové okénko, které umožňuje detekci lehčích prvků až po bor (Z = 5) nebo nemají okénko a jsou schopny detegovat i beryllium (Z = 4). Bezokénkové detektory mohou být používány pouze v ultračisté vzorkové komoře, která se nachází pod vysokým vakuem, kde olej, uhlík a vlhkost nemohou kondenzovat na studeném silikonovém krystalu. Bezokénkové detektory proto nejsou použitelné v kombinaci s ESEM a VP-SEM.

5.9.2. Rentgenové emisní spektrum Počet emisních čar charakteristického EDX spektra jednoho prvku závisí na složitosti jeho elektronové struktury. Pro lehké prvky, jako je uhlík (Z = 6), který má pouze dva elektronové obaly, je dovolen pouze jeden elektronový přechod (kap. 9.8.3.3); a proto spektrum obsahuje pouze jednu emisní čáru. Těžší prvky, které mají více elektronových obalů, poskytují také složitější spektra bohatší Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 202


na emisní čáry. Např. měď (Z = 29) má 6 možných rentgenových emisních čar, zatímco velmi těžký atom, jako je olovo (Z = 82), může mít 13 emisních čar. Elektronový paprsek o urychlovacím napětí 20 kV má dostatečnou energii excitovat charakteristické rentgenové záření všech prvků od beryllia. S ohledem na to excitovat dostatečné rentgenové záření ze vzorku, obzvláště pro kvantitativní analýzu, je potřeba proud elektronového paprsku adjustovat výběrem vhodné velikosti bodu (kap. 9.8.1). Pokud je proud paprsku příliš velký, je produkováno příliš mnoho rentgenového záření a detekční systém může být přetížen. Přebytek signálu také může způsobit artefakty ve spektru, jako je spojení nebo zaniknutí některých čar a tím bude spektrum ještě složitější (Goldstein et al. 2003). Tyto artefakty mohou být zaměněny s reálnými čarami, ale obvykle je lze odlišit od skutečného spektra, protože jejich pozice jsou předvídatelné a identifikovatelné pomocí analytického softwaru. Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza je universální metodou a může být využita k analýze prvků přítomných ve velkém množství farmaceutických pevných materiálů, jako jsou API, pomocné látky, práškových směsí, pevných lékových forem, částic cizího původu a obalových materiálů. Nejlepší je analyzovat vzorky v jejich přirozeném, nepokoveném stavu, abychom eliminovali interferující píky, pocházející z pokovování. Např. EDX spektrum zaznamenané ve VP módu z binární směsi obsahující stálou laktózu (obsahující lehké prvky: C, H a O) a lék, obsahující lehké a těžké prvky (C, H, O, S a Br) je ukázáno na obr. 9.28. Spektrum obsahuje všechny čáry prvků detekovaných ve vzorku, které jsou zobrazeny jako graf energie rentgenového záření (v keV) versus intenzita čar (puls za sekundu). Všimněte si, že emisní čáry (okolo 1,49 keV, 11,91 keV a 13,3 keV) náleží bromu, protože je relativně těžší vzhledem k ostatním přítomným prvkům.

5.9.3. Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza jednotlivých částic a mapování prvků Energiově dispersní rentgenovou mikroanalýzou může být analyzována široká oblast vzorků a to skenováním pomocí elektronového paprsku nebo v jednotlivých bodech, jestliže je skenování vypnuto (tzv. spot mode). Obě metody mají své výhody, skenování umožňuje analýzu v roztoku,



zatímco „spot mode“ dovoluje přesné lokalizování prvků, které jsou určovány v heterogenních vzorcích v prostorovém rozlišení okolo 10 µm (ve VP módu není lepší než 20 µm). Díky pronikání elektronového paprsku, může být rentgenové záření excitováno z chemicky odlišného prostředí nebo oblastí pod povrchem vzorku, které nejsou viditelné v SEM obrazech, čímž může stoupnout riziko zavádějících interpretací rentgenových dat. Dávat bychom si měli pozor především při analýze malých částic obsahující lehké prvky (ty které jsou menší než 5 µm v průměru), neboť rozptýlený paprsek v interakčním objemu (kap. 9.8.3) přesahuje objem samotných částic a může být detekováno i rentgenové záření ze substrátu.

Obr. 9.28: EDX spektrum prášku obsahující binární směs laktózy a API s jeho charakteristickými čarami pro brom a síru emitované z API

Důkaz, že vzorek obsahuje pevnou fázi s různým prvkovým složením, může být získán, jestliže je napřed zobrazen obraz zpětně rozptýlených elektronů (kap. 9.8.3.2). Např. obraz zpětně rozptýlených elektronů pro binární směs prášku analyzovaného pomocí EDX (Obr. 9.28) je ukázán na obr. 9.29b, kde prostorová distribuce světlých částic léčiva (obsahujících síru a brom) je jasně viditelná. Metoda, která má být využita k mapování prostorové distribuce vybraných prvků ve vzorku, vyžaduje EDX systém, který bude kontrolovat vychýlení elektronového paprsku v SEM. To dovoluje EDX automaticky detekovat před vybrané prvky ve vzorku a zobrazit je v digitální bodové mapě (Goldstein et al. 2003). Je-li vybraný prvek skenován paprskem napříč vzorkem, body (např. pixely) v daném místě jsou přidány do mapy. Po několika záznamech, oblast, která má detekovatelné koncentrace prvků, je zobrazena jako oblast s body s vysokou koncentrací. Obr. 9.29b zobrazuje bodovou mapu distribuce bromu napříč obrazem ukázaným na obr. 9.29a. Všimněte si, že rentgenové záření emitované některými částicemi léčiv nebyly dříve detekovány nebo pouze jejich část. Je tomu tak proto, že detektor rentgenového záření, oproti BSE detektoru, není přímo nad vzorkem, ale je umístěný na jedné straně (níže napravo) a je nakloněný pod úhlem 45° ke vzorku. Důsledkem toho je z povrchu částic emitováno pouze to rentgenové záření, které je v přímé linii s detektorem, a to je zaznamenáno (protože rentgenové záření se pohybuje přímočaře). To znamená, že rentgenové záření Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 204


emitované chemicky různými částicemi v prášcích a dalších vzorcích s drsným povrchem není dostatečně detekovatelné. Mapování rentgenového záření má proto omezené aplikace, obzvláště pro prvkovou charakterizaci práškových vzorků, jako jsou práškové přípravky, protože rentgenové záření nebude detekované ze všech částic. Naštěstí detekce rentgenového záření může být zlepšena naklánění vzorku směrem k detektoru (jako tomu bylo dáno pro vzorek na obr. 9.29). Kvalitativní a kvantitativní EDX analýzy mohou být prováděny pod lehkým vakuem v ESEM nebo VP-SEM módu. Jelikož dochází k rozšíření paprsku (kap. 9.8.4), nelze zaměřit malý bod, a tak je EDX analýza limitována na větší objekty s minimálně 20 µm v průměru (Carlton 1999).

Obr. 9.29: Binární směs čisté laktózy s API (obsahující S a Br) zobrazena pomocí zobrazování zpětně rozptýlených elektronů (a) ukazující tmavé částice laktózy a světlé API a (b) rentgenová distribuční mapa pro brom.

5.10.

Mikroskopie atomárních sil

Cílem této kapitoly je poskytnout základní informace k další metodě, mikroskopii atomárních sil, používané ve farmaceutickém průmyslu, což dokládá nedávná diskuze o použití tohoto relativně nového přístupu k analýze povrchu materiálů. Tato diskuze o principech a technikách této metody není vyčerpávající, ale je zaměřena na nejčastěji používané přístupy (jak zobrazovací, tak i charakterizace), které nalezneme ve farmaceutické literatuře. Je diskutována příprava vzorku a nastavení přístroje, avšak důraz je kladen na přehled existujících farmaceutických aplikací, s cílem ukázat jejich potenciál. Jsou také zdůrazněny rozvíjející se metody. Mikroskopie atomárních sil je ve skutečnosti pouze jedna z široké skupiny mikroskopií, tzv. mikroskopií se skenovací sondou (SPM). Každý člen této skupiny byl vyvinut k zobrazování různých fyzikálních a chemických vlastností povrchů, využívající miniaturní sondy různých tvarů a popisu. Zlom v SPM přišel se skenovacím tunelovacím mikroskopem (STM) a jeho schopností rozšířit rozlišovací limit vlnových délek, základní fyzikální omezení kladené na světlo a na rozlišení založeném na Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 205


elektronové mikroskopii. Tento bod byl ilustrován na dnes již známém 7 x 7 křemíkovém povrchu, ukazující opakující se vzor jednotlivých atomů (Binning et al. 1983). Jako uznání významu pokroku poskytnutého v STM, byla udělena Nobelova cena Rohrerovi a Binningovi v roce 1986 a Ernestovi Ruska v roce 1931 za jeho práci na vývoji skenovací elektronové mikroskopii. Mikroskopie atomových sil byla vyvinuta jako rozšíření STM, jelikož zobrazování pomocí STM je omezeno pouze na vodivé vzorky (Binning 1986). ATM nepracuje na principu tunelovacího proudu mezi vodivou sondou a povrchem jako je tomu v STM, ale je zde ostrá sonda, která je upevněna na jemné pružině tak, aby byla v kontaktu s povrchem vzorku a její pohyb po „hrbolatém“ povrchu je zaznamenáván. Těsně po objevu ATM bylo získáno atomové rozlišení nevodivých vzorků (Albrecht a Quate 1987). Klíčová vlastnost AFM je schopnost zobrazovat v různých prostředích, zahrnující okolní prostředí, kontrolní plyny a kapaliny. To umožňuje zobrazování vzorku s jeho minimální přípravou a v prostředí, ve kterém je vzorek využíván (např. za speciální vlhkosti nebo teploty). AFM se stala obzvláště populární ve vědeckých laboratořích nejrůznějších odvětví, jakmile přišla na trh v roce 1988. Mělo by být poznamenáno, že v současnosti existuje značné množství technik STM, které jsou vyvinuty tak, aby zaznamenávaly fyzikálně-chemické vlastnosti různých povrchů. Což zahrnuje optické systémy schopné lokální spektroskopické analýzy (Kirstein 1999), mikroskopy schopné studovat magnetické (Michinobu 2003) a elektrostatické vlastnosti povrchů (Fujihira 1999) a zkoumat chování vzorků při různých teplotách. Posledně jmenovaná, tzv. skenovací termální mikroskopie (SThM), je obzvláště oceňovaná v analýze farmaceutik (Sanders 2000; Hussain 2004) díky relativní jednoduchosti dat z této metody, které mohou být dále srovnávány se standardními kalorimetrickými daty, s přidaným prostorovým odlišením, které nám poskytne STM. V posledních letech bylo rozlišení této metody zlepšeno dokonce až k okolo 50 nm díky nástupu nanotermálních sond (Dai et al. 2009). Popis těchto speciálních technik STM je nad rámec této kapitoly a proto je čtenář odkázán na příslušnou literaturu (Poggi 2004; Loos 2005).



5.10.1.

Princip jednotlivých technik mikroskopie atomárních sil

5.10.1.1. Zobrazování Mikroskop atomárních sil obsahuje sondu s ostrým hrotem připevněnou na ultra-lehké a flexibilní konzole, která se hýbe s ohledem na povrch vzorku pomocí piezoelektrického skeneru schopného 3D pohybu s rozlišením v angströmech (Obr. 9.30). Obraz získaný pomocí takového skeneru může být převeden do rastrovacího skenu hrotu relativně k vzoreku v xy rovině, zatímco hrot je v kontaktu (nebo blízkosti) se studovaným povrchem. Přesněji řečeno, získaná data nejsou přímým obrazem povrchu, ale ukazují, jak hrot AFM sondy interaguje s povrchem. Pokud je tato interakce konstantní (k tomu dochází, pokud je vzorek homogenní), pak jsou AFM data přímým obrazem povrchu vzorku. Bohužel heterogenita vzorku může zapříčinit vliv na data, která nemůžou být spojeny jednoduše přímo s topografií. Tento zdánlivý problém je ve skutečnosti skvělou příležitostí, neboť řízením povahy a úrovně hrotu a tím interakcí, můžeme sledovat nejen topografii, ale i složení a interakce v nanoměřítku.

Obr. 9.30: Schématický diagram hlavních komponent mikroskopu atomárních sil

Tudíž jak je hýbe AFM hrot napříč povrchem, je monitorován rozsah interakcí hrot – povrch, který odráží škálu fyzikálních vlastností. Např. v kontaktním módu AFM, je zaznamenávána odchylka konzoly pomocí laserového paprsku odrážejícího se ze zadní části pomocné konzoly. Obvod zpětné vazby je pak využit k nastavení z-pozice skeneru, tak aby byla zachována konstantní výchylka a tím i interakce hrot – povrch. Různé typy konstrukce instrumentu přispívají k vysokému rozlišení zobrazování v AFM. Ostré hroty v nanoměřítku poskytují dobrou citlivost povrchové topografie. Nízká tuhost pružiny konzoly spolu s optickou detekční metodou umožňuje sledovat slabé síly (10-11 N), čímž AFM snadno a jednoduše dovoluje studovat síly mezi farmaceutickými materiály.



Ačkoli kontaktní mód, jak byl již dříve diskutovaný, má vysoké prostorové rozlišení, má také své omezení. Nejvýznamnější z nich je fakt, že během zobrazování jsou na vzorek aplikovány značné postranní síly, tak jak je hrot postupně posouván napříč povrchem. To může vyústit ve dva potencionální problémy. Ten první je spojen se skenovacím hrotem, který může být poškrábán při zobrazování tvrdého materiálů a tím ztupěn, čímž se sníží jeho rozlišovací schopnost. K druhé možnosti může dojít během zobrazování měkčích materiálů, jako třeba polymerů, některých pomocných látek nebo biologických materiálů, které mohou být důsledkem postranních sil poškozeny. Další část se zabývá alternativní zobrazovací strategií, tzv. poklepovým módem. V tomto módu jsou postranní síly redukovány tím, že hrot osciluje v jeho rezonanční frekvenci (nebo frekvenci blízké rezonanční, 70 – 350 kHz v závislosti na typu vzorku) (Zhong et al. 1993). Intermitentní charakter interakce vzorku a hrotu snižuje díky oscilacím postranní síly, které působí jak na hrot, tak i na vzorek. Poklepový mód pracuje jako zobrazování amplitudy (nebo fáze) oscilace hrotu v jeho rezonanční frekvenci (měření výchylky hrotu). Ztráta kinetické energie zapříčiněná volnou vibrací konzoly přibližující se k povrchu vede ke vzniku intermitentního kontaktu s povrchem (Brandsch et al. 1997). Tato energetická ztráta může způsobit změnu (obvykle pokles) v oscilační amplitudě v monitorovací frekvenci. Zpětná vazba má udržovat konstantní oscilační amplitudu během skenování a nutné úpravy se používají k vytvoření topografického obrazu v poklepovém režimu. Rovněž může být zaznamenávána amplituda oscilace hrotu a fázový posun mezi excitační frekvenci a odpovědí hrotu. Výsledné fázové obrazy jsou užitečným nástrojem v mapování heterogenních povrchů. Ačkoli je často získán kontrastní obraz, je interpretace fázových posunů obtížná a závislá na výše zmíněných parametrech poklepového režimu. Kontrast ve výsledných obrazech může být přisuzován faktorům jako elasticita a disipace energie (Brandsch et al. 1997), hydrofobicita (Chen et al. 1998a) a adheze (Finot a McDermott 1997). Tato data jsou omezena, avšak poskytují informaci kvalitativního charakteru, která může sloužit k posouzení lokálních vlastností vzorku. Poslední verze oscilačních režimů AFM jako je režim pulsních sil (Gigler et al. 2007) a HarmoniXTM (Mullin et al. 2009) mohou poskytnout podobné odlišení složek v heterogenních



površích, ale poskytující kvantitativní informaci o vlastnostech jako je elasticita, adheze nebo houževnatost. Zobrazování kapalin, jež mají vztah k farmaceutické analýze, je možné pokud to dovoluje dynamický charakter, jako je rozpouštění a zvětšování objemu. Zobrazování pod kapalinou může být provedeno v kontaktním i poklepovém módu, jak bylo popsáno výše. Nicméně postranní síly vyskytující se v kontaktním módu mohou často způsobit zničení vzorků, jelikož vzorky bývají často jemnější po ponoření do kapaliny. Poklepový mód může snížit postranní síly, avšak běžné implementace poklepového módu pro kapaliny většinou dosahují efektu tzv. „lesu píků“. K tomuto nárůstu signálů dochází, protože v kapalinách je více akusticky excitovaných rezonančních píků, kvůli dodatečnému tlumení. Nedostatek jedinečných rezonančních signálů vede ke ztrátě kvality obrazu a snížení stability. Nabízejí se zde dva možné přístupy. První přístup spočívá v magnetickém ovládání magneticky pokovené konzoly, čímž se vytváří efektivní energetický přenos a redukuje se počet rezonančních píků (Han a Lindsay 1998). Alternativní přístup spočívá v aplikaci Q-kontroly (Rodriguez a Garcia 2003), kde faktor kvality rezonance hrotu je elektronicky modifikován, aby také zlepšoval výkon v kapalinách. Tzv. měření silových vzdáleností dovoluje detailně studovat interakce mezi hrotem (často s přiloženou definovanou chemickou vlastností nebo částicí) a vzorkem. Silová měření jsou zaznamenávána měřením výchylky konzoly, když je hrot a vzorek napřed spojen a pak zase odpojen od sebe. Rozsah výchylky konzoly (x) může být ve vztahu s působící silou podle Hookova zákona, upravený o konstantu tuhosti pružiny konzoly k: F = -kx Data jsou zaznamenávána z různých míst na povrchu, obvykle v bodech, které byly zaznamenány na předchozím obraze (např. fázový obraz může být využit k lokalizaci různých složek na heterogenním povrchu). Existují také různé křivky silových vzdáleností založené na experimentu v poklepovém módu. V tomto případě je zaznamenávána amplituda a fáze oscilujícího hrotu jako separovaná funkce, která roste v pořadí křivek amplituda-fáze-vzdálenost (a-p-d). Tyto křivky mohou také obsahovat informaci Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 209


o interakčních silách mezi sondou a substrátem. Navíc fázová křivka může pomoci lokalizovat přitažlivé a odpudivé interakční módy, které mohou vést ke zvýšení stability fázových obrazů (Chen et al. 1998a). Mapování vlastností povrchu je umožněno díky rozšíření měření lokalizovaných silových vzdáleností nebo měření amplituda-fáze-vzdálenost na záznam řady takových datových bodů napříč oblastí na povrchu. Např. v případě měření silových vzdáleností je každý pixel složen z křivky silové vzdálenosti, a ta obsahuje všechny detaily interakcí mezi sondou a povrchem v určitém místě. Zobrazování sil v prostoru dovoluje prostorové mapování různých interakcí hrot-vzorek napříč oblastí povrchu, což je užitečné k posouzení heterogenity vzorku (Radmacher et al. 1994). Z datového setu mohou být také extrahována topografická data a tak heterogenní rysy mohou být vztaženy k výškovým rozdílům vzorků. Takové řady křivek silových vzdáleností mohou být dávkově zpracovány a získány tak mapy odvozených vlastností, včetně tvrdosti a adheze (Baselt a Baldeschwieler 1994; Schonherr et al. 2000).

5.10.1.2. Příprava vzorku Tak jak tomu bývá u všech analytických metod, výběr vhodné metody přípravy vzorku k AFM často určuje úspěch či neúspěch. Nutným požadavkem k získání vzorku vhodného k AFM analýze je zajištění dobré adhezivity částí komponent k přiloženému skeneru tak, aby skener a vzorek působil jako rigidní celek. Pokud je použita adhezivní páska k upevnění vzorku, musíme upevnění provést tak, aby se vzorek nemohl pohybovat a nemohlo tak dojít k topografickému zkřivení. Rovněž je třeba zajistit, aby fixní prostředky nebo lepidla nebyly z těkavých složek, které by mohly kontaminovat povrch vzorku. Obzvláště prášky je velmi těžké uchytit, jelikož jsou většinou velmi přilnavé a je těžké je dispergovat. Jako dostatečně efektivní metody uchycení se jeví zalití částic do měkkého kovu jako je indium nebo pokrývání tenkými vrstvami lepidla a následné posypání práškem (Baldwin et al. 1996). Výběr zobrazovacího módu může také ovlivnit stabilitu prášku během zobrazování, obzvláště kontaktní módu může způsobit odtržení lehce přichycených částic díky postranním silám (Mechler et al. 2001). Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 210


5.10.2.

Aplikace AFM ve farmaceutické analýze

5.10.2.1. Morfologická analýza Mikroskopie atomárních sil je asi nejznámější pro její schopnost produkovat vysoce rozlišení 3D obrazy povrchové morfologie s rozlišením, které je nemožné pro konvenční mikroskopii. Takovéto obrazy umožňuje vytvořit během minut ze vzorku, který prošel minimální přípravou. Avšak vzorek nesmí být příliš zdrsněný, protože by bylo velmi obtížné pro AFM sondu vést dráhu po jeho povrchu. Je také důležité zdůraznit, že pod AFM může být najednou zobrazováno pouze malé množství vzorku (typický obraz nepřekračuje velikost 5 – 20 mikronů), a proto chceme-li vytvořit reprezentativní obraz vzorku, může to nějaký čas trvat. Povrchová struktura má vliv na to, jakým způsobem materiál interaguje a to naopak ovlivní farmaceutickou produkci. Příkladem může být vliv různých inženýrských postupů výroby částic na vlastnosti prášků. Je dobře známo, že konvekční metody zmenšování velikosti částic jako mikronizace může značně zvýšit zdrsnění takto zpracovaných částic, což vede k těžce zpracovatelným až příliš kohezivním práškům. Jako vhodná alternativa se jeví použití sofistikovanějších metod zmenšení velikosti částic jako je kapalinou zesílená disperze pomocí superkritických kapalin (SEDS), která umožnuje získat lepší kontrolu nad vlastnostmi povrchu. Metoda AFM poskytuje kvantitativní srovnání těchto různých metod zpracování. Na obr. 9.31 je srovnání AFM povrchového zdrsnění krystalů paracetamolu, jejichž velikost byla zmenšena pomocí mikronizace a SEDS metody. Pro oba příklady jsou zobrazeny různé částice v zobrazené v poklepovém módu a byla stanovena průměrná hodnota drsnosti. Na 3D data sety byly aplikovány různé algoritmy výpočtu hodnot drsnosti. V tomto případě je uvedena střední kvadratická hodnota drsnosti, která byla vypočtena z odchylek každého bodu obrazu ze střední roviny procházející prostředním bodem obrazu. Abychom byli schopni srovnání mezi různými vzorky, měření drsnosti musí být vždy aplikováno na stejnou oblast vybranou tak, aby zahrnovala požadované rysy. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 211


Obr. 9.31 také ukazuje typický topografický obraz materiálu po zpracování metodou SEDS. Je možno vidět, že povrch částic je rovný až na úroveň vlastních krystalových stop. Měření drsnosti závisí na vlhkosti, proto by měla být uvedena, aby umožnila interpretovat adhezní chování částic (Berard et al. 2002). Zmenšování velikosti částic až na sub-mikronové částice se jeví jako velmi efektivní přístup k zlepšení biologické dostupnosti ve vodě hůře rozpustných léčiv. To ovšem znamená výzvu v charakterizaci takovýchto částic. AFM byla použita k potvrzení rozsahu zmenšení částic pomocí „nanomletí“ (Shi et al. 2003). Distribuce velikostí získaná z AFM obrazu poskytuje výbornou korelaci k hodnotám získaným pomocí metod rozptylu světla. Rozsah velikostí částic okolo 100 nm byl určen jak pro již zmenšené částice, tak i pro částice stanovované během procesu zmenšování. Mezi další přístupy kvantifikace AFM obrazů patří určování fraktální dimenze, metoda, která byla použita pro mnoho farmaceutických materiálů (Li a Park 1998). Byla také více použita k získání unikátního náhledu na vznik a růst krystalů (Ward 2001).

Obr. 9.31: Nahoře: Srovnání AFM povrchové drsnosti paracetamolových krystalů, jejichž velikost byla zmenšována pomocí mikronizace a SEDS metody. Dole: Graf odchylek povrchových zdrsnění se škálou pro tyto dva materiály.

Vysoce rozlišené AFM rovněž umožňuje zobrazování krystalových forem nanočástic léčiv z kapalinové disperze a pevných lékových forem, které prošly ultramikrotromií k určení jejich velikostí, tvaru a distribuce (Shi et al. 2003). Nanočástice každé lékové formy byly navzájem podobné se středním průměrem 95 nm a průměrným poměrem 1.3. Distribuce velikostí částic stanovená pomocí AFM souhlasí s daty naměřenými pomocí skenovací elektronové mikroskopie s emisním polem, statického rozptylu světla a měření kalnosti pomocí RTG. Jelikož pomocí AFM je možno analyzovat kapaliny a následné dynamické procesy na povrchu v nanoměřítku, byla tato metoda aplikována k charakterizaci dynamických procesů jako rozpouštění, uvolnění léčiva z matrice nebo potahování tenkou vrstvou (Ward 2001). Bylo to znázorněno na srovnání rozpouštěcích rychlostí dvou různých rovin Aspirinu ve vodných roztocích (Danesh et al.



2001). Před začátkem experimentu bylo známo, že (100) a (001) roviny mají různé rozpouštěcí kinetiky, avšak původ tohoto jevu nebyl znám. AFM měření byla konstruována tak, že povrch jednotlivých krystalů Aspirinu byl nastaven na požadovanou rovinu. Aby byla demonstrována schopnost rychle měřit data, rychlost skenování byla navýšena na 40 Hz. Podmínky byly nastaveny tak, aby zahrnovaly rozpouštěcí rychlost, jejíž dynamika mohla být pozorována při těchto skenovacích rychlostech AFM během přidání 0,05 M HCl do čistého vodného média. Na obr. 9.32 je zobrazena série obrazů zaznamenaných po sobě pro (001) rovinu. Aby bylo ukázáno, že nedošlo k žádnému vlivu skeneru, pozice neměnných artefaktů je označena na obrazu. V tomto případě je vidět, že rozpouštění pokračuje po ustupujících krocích hran, jak je ukázáno na vybrané hraně označené šipkou. Naproti tomu sekvenční řada obrazů pro (100) rovinu ukazuje jiný rozpouštěcí mechanismus, viz obr. 9.33. Zde můžeme pozorovat klesající krystalové řady podle toho, jak se rozpouští aktivní složka. Podrobná analýza sekvenčních obrazů umožnila stanovení průměrné rychlosti krokového pohybu hrany a pokles krystalových teras (17 nm.s-1 a 2,93 nm.s-1).

Obr. 9.32: Série AFM sekvenčních obrazů zaznamenaných pro rozpouštění (001) roviny krystalu Aspirinu.

Obr. 9.33: Sekvence AFM obrazů zaznamenaných pro rozpouštění (100) krystalové roviny Aspirinu.

Navíc na základě určení rychlostí a znalosti objemu rozpouštědla může být stanovena vnitřní rozpouštěcí rychlost pro každou rovinu. Bylo ukázáno, že vnitřní rychlost rozpouštění pro (100) rovinu je přibližně šestkrát rychlejší než pro (001) rovinu. Mikroskopie atomárních sil také upozorňuje na výskyt některých faktorů, které mohou vést k různým rozpouštěcím rychlostem. Srovnáním drsnosti obou rovin na základě určení pomocí AFM bylo zjištěno, že (100) rovina má vyšší drsnost, což také odpovídá většímu povrchu k rozpouštění. AFM experimenty, ve kterých byly použity chemicky modifikované sondy, byly využity k získání



relativní smáčivosti dvou rovin (Danesh et al. 2000b). V tomto experimentu byly zaznamenány křivky „amplitudy-fáze-vzdálenosti“ s využitím sond modifikovaných pomocí methylových (hydrofobní) a karboxylových (hydrofilní) samoskladných vrstev (z angl. Self-assembled monolayers, SAM), viz obr. 9.34. Srovnáním a-p-d křivek bylo možné určit relativní afinity hydrofobních a hydrofilních vrstev ke každé krystalové rovině. Uvědomíme-li si, že stupeň interakce mezi sondou a substrátem, indikován jako dolina na křivce fáze-vzdálenost, dokazuje, že (001) rovina vykazuje nejlepší afinitu k hydrofobní sondě a ukazuje na přítomnost hydrofobní povrchové chemie. Naproti tomu (100) rovina vykazuje nejvýraznější interakce s hydrofilní sondou, což naznačuje na přítomnost hydrofilních funkčních skupin. Tyto závěry zároveň korespondují s rozpouštěcími daty, které dokazují, že více smáčitelná rovina se rozpouští rychleji. Podobný přístup byl aplikován na jiný model krystalů ve farmacii a ukázal, že AFM je schopno stanovit specifické vlastnosti rovin (Muster a Prestidge 2002).

Obr. 9.34: Křivka „amplituda-fáze-vzdálenost“ měřená pomocí AFM sondy modifikované s methylovými (hydrofobními) a karboxylovými (hydrofilními) skupinami samoskladných vrstev (SAM)

Schopnost vizualizovat krystalizační procesy pomocí AFM v nanoměřítku je využívána v mnoha dalších oborech, včetně krystalového růstu proteinů (Yip et al. 1998; Ching-Erh et al. 1996). V tomto případě rozlišení molekul dovoluje studium modifikací krystalových struktur nebo zabalování krystalů. Ve studiu materiálů, jako je sádrovec nebo koordinační polymery, byl umožněn unikátní pohled na růst a struktury krystalových modifikací v různých pufrovaných prostředích. Tyto výhody se dostávají do vedení a poslední využití v analýze farmaceutik zahrnuje vizualizace procesů „habit modification“, obzvláště efekt oktanové kyseliny na růst kyseliny adipové (Keel et al. 2004). In situ zobrazování odhalilo vznik etch-pit (leptání-jámy) během rozpouštění a rychlý růst při větším přesycení. Jasné změny byly pozorovány v krokové morfologii a růstovém módu po přídavku oktanové kyseliny až do bodu, kdy krystal přestane růst.



Schopnost fázového zobrazování pomocí AFM prostorově rozlišit povrchové vlastnosti v nanoměřítku byla dokázána, aby byla umožněna polymorfní diskriminace. V případě léčiva Cimetidin, jež existuje ve dvou polymorfních formách (A a B), bylo ukázáno, že fázové obrazy mohou detekovat přítomnost obou forem, viz obr. 9.35 (Danesh et al. 2000b). Podobným způsobem, jaký byl popsán výše, a-p-d křivky dosahují charakteristických tvarů pro každou z forem, což umožňuje jejich jednoznačnou identifikaci. Výhody fázového zobrazování byly rovněž využity k identifikaci složek biodegradabilních směsí, založených na faktorech jako je relativní hydrofobicita (Chen et al. 1998b) nebo mechanických vlastnostech stanovených jako lokální stupeň krystalinity (Magonov a Reneker 1997).

Obr. 9.35: AFM fázové zobrazení rozlišující mezi dvěma polymorfními formami Cimetidinu (velikost obrázku 2µm x 2µm).

Obr. 9.35: Fázová separace styren:izobutylenových bloků kopolymerů ve stentu, uvolňujícím léčivo – TaxusTM, a fázová separace léčivem plněné polymerové vrstvy a povrchová morfologie po uvolnění léčiva.

Tyto studia vedly následně k aplikaci AFM a umožnili navržené mechanismy, narušení polymerních směsí (Shakesheff et al. 1995a), uvolnění léčiv z polymerních matric (Shakesheff et al. 1995b), kontrolované uvolnění pilulek (Ringqvist et al. 2003) a polymerních mezostruktur stentů (Ranade et al. 2004) a nanoenkapsulace (Oliva et al. 2003). Jako příklad nám může posloužit obr. 9.36 (Ranade et al.), který zobrazuje nejen fázovou separaci styren:isobutylenových bloků kopolymerů v TaxusTM, ale rovněž fázovou separaci léčivem plněnou polymerovou vrstvu a povrchovou morfologii po uvolnění léčiva. Schopnost mikroskopů atomárních sil vizualizovat a zkoumat povrchy v nanoměřítku byla také v poslední době využita k řešení klíčového problému v charakterizaci pevné fáze farmaceutik –



detekci nízkých množství amorfního materiálu. Je evidentní, že malé množství amorfní fáze přítomné v přípravcích, které jsou označovány jako krystalové formy, může fungovat jako „hot spot“ k transformaci fyzikální formy. Např. amorfní materiál je schopen poskytnou základ k polymorfním konverzím a v některých případech k chemické degradaci. Povrchové amorfní fáze jsou obvykle mimořádně nestabilní vůči vlivům prostředí. Např. poslední studium ukázalo, že AFM má potenciál stát se mapovacím nástrojem povrchových amorfních domén (Ward et al. 2005). V této studii modelový systém povrchových amorfních domén Sorbitolu byl vytvořen lokalizovaným ohřátím pomocí SThM sondy. Tím došlo k vytvoření chladem vytvořených domén mikronových velikostí. Následně byla tato modifikovaná oblast a okolní krystalové fáze charakterizovány pomocí poklepového módu, obr. 9.37. Mimo modifikovanou oblast byla morfologie pozorovaná jako regulérní krystalová struktura s hranicemi, které byly zdůrazněny pomocí fázových obrazů.

Obr. 9.37: AFM obrazy původního (nahoře) a chladem modifikovaného amorfního (dole) sorbitolu (vlevo topografický a vpravo fázový obraz).

Obrazy s vyšším rozlišením ukázaly jemnou strukturu skládající se z rovnoběžných pruhů. Tato vlastnost se vyskytuje díky lamelám, pravidelným latím z krystalického materiálu, obklopeným méně uspořádanými oblastmi. Vysoce uspořádané lamely jsou lehce hustší a tužší než okolní, umožňující detekovatelný fázový posun. Naproti tomu modifikované domény Sorbitolu vypadají jemnější bez pravidelných morfologických struktur. V tomto případě odpovídající fázové obrazy ukazují malé kruhovité oblastí světlejšího kontrastu. Tyto oblasti mohou odpovídat malým, více uspořádaným oblastem, které jsou pozůstatkem původních krystalových struktur nebo důkazem malých rekrystalizovaných oblastí.



5.10.2.2. Analýza lokálních interakcí mezi sondou a vzorkem Zobrazování založené na přístupu zobrazeném na obr. 9.37 spočívá v kvalitativní interpretaci obrazových vlastností; nicméně AFM je schopno i kvantitativního rozlišení krystalové a amorfní fáze díky analýze kontaktních oblastí křivek síla-vzdálenost, viz obr. 9.38. Je zřejmé, že amorfní fáze ukazuje větší odsazení při daném zatížení, znamenající, že je jemnější než pravidelně balená krystalická fáze. Aplikací Herzova deformačního modelu na zvolenou sekci odsazené křivky je možné kvantifikovat Youngův model pružnosti (Davies et al. 2005) a tak získat numerickou identifikaci dvou fází. Navíc rozdíl ve ztuhlosti a tvaru křivky síly-vzdálenosti v kontaktní oblasti rovněž rozlišuje dvě fáze. Zatímco krystalizační křivky ukazují přiblížení a odstoupení dat, které se překrývají, křivky zaznamenané pro amorfní fázi mají posun mezi přiblížením a odstoupením. To ukazuje na hysterezi plněnými a neplněnými materiály a viskoelastické deformační reakce ve srovnání s elastickou krystalizační formou. Zářezová metoda v nanoměřítku popsaná výše otevírá další možnosti aplikací. Hlavní výhoda testování materiálu pomocí AFM spočívá v tom, že potřebujeme pouze malé množství vzorku k analýze. To by mohlo umožnit analýzu v raných fázích vývoje, předpovídat a vytvořit opatření pro budoucí přípravky. Například spolu s detekcí amorfního materiálu je známá schopnost formulovat materiál pomocí přímé komprese v závislosti na jeho deformačních vlastnostech, platí, že plastické chování je upřednostňováno k elastickému.

Obr. 9.38: Analýza kontaktních oblastí křivek síla-vzdálenost vzorku Sorbitolu zobrazených na obr. 9.37.

Jak bylo ukázáno výše, AFM je schopno rozlišit mezi těmito dvěma deformačními módy a tak teoreticky umožnit včasnou indikaci uvolnění přípravku ve fázi selekce pevné fáze. Povrchová smáčitelnost je další vlastnost, která může být zkoumána pomocí měření silových vzdáleností. Jelikož je AFM sonda vtahována od vlhkého povrchu, výsledné kapilární síly uchytí AFM hrot na povrchu. Tato síla může být měřena a následně korelována k tloušťce vrstvy vodního filmu (Dey 2000) a efektu



topografie v nanoměřítku na smočeném povrchu (Hooton 2004). V souvisejícím přístupu, kde bylo využito „frictional measuremets“ (tření) mezi AFM sondou a povrchem bylo rovněž možno měřit čas potřebný k vytvoření takovýchto kapilárních mostů (Szoszkiewicz 2005). Obzvláště užitečným rozšířením AFM měření silových vzdáleností ve farmaceutické analýze bylo přidávání jednotlivých částic farmaceuticky aktivních prášků do AFM hrotu a následné použití tohoto materiálu k modifikaci dalších příslušných vzorků (Roberts 2005). Do doby než se stala tato metoda přístupnou, přímé hodnocení interakcí částice-částice a částice-zařízení spoléhalo na dávno zavedené metody, které pracují s velkým počtem částic, jako je centrifugace (Larsen 1958; Podczeck 1997). Zatímco může být získán náhled na potenciální soudržnost a přilnavost vyrobených přípravků, získaná data odhalují pouze málo z povahy a vzájemných ovlivňování některých základních sil (např. van der Waalsovy, elektrostatické nebo kapilární síly). Přístup k těmto informacím by mohl přinést nejen odhad složení, ale také by pomohl určit základy požadované modifikace částic a její optimalizace. Je důležité podotknout, že jednotlivé částice „přilepené“ na AFM konzolu mohou být použity na sérii srovnávacích měření zkoušející různé substráty. Navíc, jestliže zároveň zobrazujeme, může být využita schopnost AFM pracovat v různých prostředích, jako je například prostředí s kontrolovanou vlhkostí nebo v kapalinách. Mnoho skupin využilo tento potenciál, obzvláště v oblastech terapií založených na inhalaci, kde znalost interakcí mezi částicemi léčiva a pomocné látky a komponent zařízení je kritická k výrobě úspěšného produktu. Z širšího pohledu experimentální strategie sledované do dnešního dne lze rozdělit do dvou skupin: (1) hodnocení interakcí mezi vybranými materiály nebo (2) pokus o kvantitativní stanovení vlastností jako je adheze nebo povrchová energie z pohledu nejen hodnocení, ale i srovnání dat z dalších AFM experimentů a také z výsledků dalších technik. V jedné z nejstarších publikací Louey et al. (2001) byla využita metoda měření stahovacích sil mezi modelem sondy z koloidního oxidu křemičitého a laktosových částic použitelných jako nosiče v inhalačních přípravcích na bázi suchých prášků (DPI). Sindel a Zimmermann (2001) aplikovali AFM jak kvalitativně, tak i kvantitativně ke studiu sil interakcí mezi laktosovými substráty. Tento výzkum odhalil vliv morfologie kontaktních drsností a povrchového zdrsnění a přímou souvislost těchto charakteristik k adhezním silám. AFM byla také využita k hodnocení silových interakcí Salbutamolu s materiály určenými jako Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 218


inhalační nosiče v následujícím pořadí: sklo > laktóza > Salbutamol > polytetrafluoroethylen (PTFE). Bylo zaznamenáno, že PTFE TRIBO-nabíjení nastalo po opakovaném kontaktu (Eve et al. 2002). Vliv relativní vlhkosti byl předmětem mnoha studií. Young et al. (2004) ukázali, že soudržnost léčiv se zvyšuje za zvýšené vlhkosti pro některé materiály, zatímco pro jiné klesá, pravděpodobně důsledkem atraktivních elektrostatických interakcí dlouhého dosahu. Bylo ukázáno, že různorodost morfologie kontaktních částic stejných materiálů je také příčinou podobného chování za zvyšující se vlhkosti (Hooton et al. 2004). Za pomocí AFM efektu vytvořit amorfní složku na povrchu částic léčiva Zanamiviru bylo ukázáno, že roste jeho afinita k povrchu laktosových nosičů (Berard et al. 2002). Schopnost zaznamenat data v kapalinách byla také využita ke kvantifikaci a hodnocení interakcí na modelu pohonné hmoty představující tlakem dávkovaný inhalátor (pMDI) (Hooton et al. 2003; Young et al. 2003a; Ashayer et al. 2004; James et al. 2009). Alternativní měření k měření interakcí mezi dvěma komponentami je zpochybnění sondy o známém složení k určitému povrchu a tak určit jeho povrchovou energii (Zhang et al. 2005). Tímto způsobem mohou být získány hodnoty povrchové energie jednotlivých částic s možným prověřováním, jak bylo popsáno dříve pro nano-odsazovací metodu. Obecně je možné vidět, že AFM poskytuje velmi flexibilní platformu, přizpůsobitelnou k širokému spektru experimentálních geometrií. Poslední příklady určování interakcí mezi AFM sondou pokovenou železem a několika léčivy k simulaci interakcí lisovaných tablet (Wang et al. 2003), silových interakcí bublin v průmyslovém zpracování hornin (Nguyen et al. 2003) a určení třecích sil (Ecke et al. 2001) – na rozdíl od adheze – jsou možnými příklady. Nevýhoda měření dat jednotlivých částic a z opravdu malých procent povrchů těchto částic je že, někdy je těžké vytvořit návaznost těchto dat na chování v roztocích. Vlastnosti roztoků, jako je tok prášků, nutně zahrnují řadu vzájemně souvisejících faktorů a proto jednotlivé měření vlastností na malých množstvích vzorků nemůže představovat jednoduchý model. Nicméně zde byl vytvořen pokrok, např. v oblasti predikcí toků prášků z AFM interakčních měření (Jones 2003; Weth et al. 2001). Podobně se Perkins et al. (2009) zabýval lokalizovanými silovými měřeními k určení distribuce povrchové energie a hodnot modulů pružnosti na třech polymorfních formách Karbamazepinu za použití těchto hodnot k predikci jejich chování během mikronizace. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 219


Využití AFM adhezních měření se sondami modifikovanými specifickými skupinami umožnilo další pohled do povahy studovaných interakcí. Od té doby, kdy Danesh et al. Ukázal hodnotu tohoto přístupu ve farmaceutické analýze prostřednictvím identifikace specifických krystalových rovin Aspirinu (Danesh et al. 2000b), množství autorů rozšířilo aplikace modifikovaných sond do různých odvětví. Např. Sheng et al. Naposledy použili AFM adhezní měření k určení efektu bílkovin z moči na různé krystalizační roviny krystalů monohydrátu oxalátu vápenatého (související s ledvinovými kameny) pomocí karboxylátem a amidiniem modifikovaných AFM sond (Sheng et al. 2005). Souhrnně tyto měření měly demonstrovat, že adheze funkčních skupin a vazba rozpustných aditiv, včetně makromolekul z moči, je v přírodě vysoce specifická na krystalové povrchy a naznačuje cestu k lepšímu pochopení onemocnění s ledvinovými kameny a navrhuje lepší vývoj terapeutik.

5.10.3.

Vyhlídky do budoucnosti

Závěrem bychom rádi podotkli, že AFM měření v krátkém časovém období přinesly řadu nových náhledů na farmaceutickou analýzu přes jedinečnou schopnost mapovat topografii a další povrchové vlastnosti s nesrovnatelným rozlišením a k tomu s časovým rozlišením, které umožňuje sledovat procesy jako rozpouštění, uvolnění léčiv nebo růst krystalů. Stále více dalších využití AFM k měření interakcí mezi složkami prokazují význam AFM, obzvláště v odvětví vývoje inhalačních zařízení. Zatímco zde jen krátce zmíněná možnost různých AFM modifikací a s nimi spojené vyrobené skenovací sondy k simultánnímu měření topografie a dalších fyzikálně-chemických vlastností, jako je nabíjecí a termální chování, ukazuje, že je očekáváno, že mnoho těchto technik nové generace se stane běžně používanými. Očekáváme, že se objeví schopnost analyzovat velmi malé množství materiálu pomocí AFM, který by mohlo být více použitelné v prověřovacích aplikacích a screeningu. Umíme si představit, že techniky schopné přinést informace o rozpouštění, tvrdost, přilnavosti, soudržnosti a povrchové energii jednotlivých částic se budou setkávat se současnou potřebou získat detailní charakterizaci API pokud možno v časných fázích vývoje. Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů. 1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1 2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7 220

Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody

Recommend Documents