MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
RECETOX VÝZKUMNÉ CENTRUM PRO CHEMII ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGII
METODY IZOLACE A CHARAKTERIZACE HUMINOVÝCH LÁTEK
Kristýna Vlachová
Diplomová práce
Vedoucí: RNDr. Michal Bittner, Ph.D. Brno, Česká republika, 2009
Děkuji Michalu Bittnerovi za pomoc při řešení této diplomové práce, za cenné rady, za lekce českého jazyka a za otestování HA na buňkách. Dále děkuji Monice Novotné a Ondrovi Mikešovi za velkou trpělivost s TOCem. Také díky Slunkovi za pomoc při vzorkování a klid na práci. Velký dík rodičům za všechno.
}2}
Seznam zkratek: AhR – arylhydrokarbonový receptor, aryl-hydrocarbon receptor CE – kapilární elektroforéza, capilary electrophoresis DBP – vedlejší produkty dezinfekce, disinfection by-products DEAE celulóza – dietylaminoetyl celulóza, diethylaminoethyl cellulose DOC - rozpuštěný organický uhlík, dissolved organic carbon DOM - rozpuštěná organická hmota, dissolved organic matter E4/E6 – poměr absorbancí při 465 nm a 665 nm, absorbance ratio at 465/665 nm ED – elektrodialýza, electrodialysis EPR – elektronová paramagnetická resonanace, electron paramagnetri resonance FA - fulvokyseliny, fulvic acids FTIR spektrometrie - spektrometrie v infračerveném záření s Fouriervou transformací, Fourier transformation infrared spectrometry HA – huminové kyseliny, humic substances HM – huminová hmota, humic matter HS - huminové látky, humic substances IHSS - mezinárodní asociace pro huminové látky, International Humic Substances Society IR spektrometrie – spektrometrie v infračerveném záření, infrared spectrometry k’ - sloupcový distribuční koeficient, column distribution factor kDa – kilodalton, kilodalton LLE – kapalinová extrakce, liquid liquid extraction MeOH – metanol, methanol meq – miliekvivalent, milliequivalent mg C/l – miligram uhlíku na litr, milligram of carbon per liter mS/cm – miliSiemens na centimetr, milliSiemens per centimeter MS – hmotnostní spektrometrie, mass spectrometry NMR – nukleární magnetická rezonance, nuclear magnetic resonance NOM - přírodní organická hmota, natural organic matter PAHs – polycyklické aromatické uhlovodíky, polycyclic aromatic hydrocarbons PCBs – polychlorované bifenyly, polychlorinated biphenyls PET – polyetylen tereftalát, polyethylene terephthalate PVP - poly(vinylpyrrolidon), poly(vinylpyrrolidone) SRFA – fulvokyselina ze Suwannee River, Suwannee River fulvic acid SUVA – specifická absorbance v ultrafialovém záření, specific UV absorbance THMFP - potenciál vzniku trihalometanů, trihalomethane formation potential TOC – celkový organický uhlík, total organic carbon UV spektrometrie – spektrometrie v ultrafialovém záření, ultraviolet spectrometry Vis spektrometrie – spektrometrie ve viditelném záření, visible spektrometry
}3}
Obsah Abstrakt ......................................................................................................................................6 Abstract ......................................................................................................................................6 I Teoretická část 1Úvod – cíle diplomové práce....................................................................................................7 1.1 Co jsou huminové látky....................................................................................................7 1.1.1 HS ve vodě.................................................................................................................8 2Vzorkování................................................................................................................................9 2.1 Úprava vzorků.................................................................................................................10 3Metody izolace HS..................................................................................................................13 3.1 Sorpční techniky ............................................................................................................14 3.1.1 XAD ........................................................................................................................14 3.1.2 Alternativní sorbenty ...............................................................................................16 3.2 Membránové techniky.....................................................................................................17 3.2.1 Reverzní osmóza .....................................................................................................18 3.2.2 Nanofiltrace a ultrafiltrace.......................................................................................20 3.3 Výtěžnost metod.............................................................................................................20 4Metody charakterizace............................................................................................................25 4.1 Elementární analýza........................................................................................................26 4.2 Spektrometrie v ultrafialovém a viditelném záření.........................................................27 II Praktická část 1Úvod........................................................................................................................................29 2Materiál a metody...................................................................................................................29 2.1 Použité chemikálie a standardy HS.................................................................................29 2.2 Systém reverzní osmózy................................................................................................30 2.2.1 Použití systému RO..................................................................................................31 2.3 Aparatura pro sorpci na DAX–8 pryskyřici...................................................................33 2.3.1 Příprava a použití DAX kolony...............................................................................34 2.4 Další přístroje a zařízení.................................................................................................37 3Optimalizace izolace HS ........................................................................................................37
}4}
3.1 Optimalizace systému RO...............................................................................................37 3.1.1 Objem přístroje........................................................................................................37 3.1.2 Zjišťování účinnosti RO pro koncentrování HS.....................................................38 3.1.3 Odstraňování iontů...................................................................................................41 3.2 Optimalizace sorpce na DAX-8......................................................................................42 3.3 Optimalizace celého procesu izolace HS........................................................................45 3.3.1 Zakoncentrování roztoku pomocí RO......................................................................46 3.3.2 Sorpce na DAX-8.....................................................................................................46 3.3.3 Výpočty podle měření spektrofotometrií:................................................................47 3.3.4 Zjišťování opakovatelnosti postupu.........................................................................49 4Reálné vzorky.........................................................................................................................51 4.1 Plán..................................................................................................................................51 4.2 Vzorkování......................................................................................................................51 4.2.1 Lokality...................................................................................................................51 4.3 Postup izolace.................................................................................................................53 4.3.1 Filtrace.....................................................................................................................53 4.3.2 Reverzní osmóza......................................................................................................53 4.3.3 DAX-8 procedura.....................................................................................................54 4.4 Měření.............................................................................................................................55 4.5 Výpočty a výsledky.........................................................................................................56 4.5.1 Obecné vzorce..........................................................................................................56 4.5.2 Vzorek z Březiny.....................................................................................................56 4.5.3 Vzorek z Louček......................................................................................................58 4.5.4 Vzorek ze Svratky....................................................................................................60 5Testování toxicity dioxinového typu.......................................................................................61 6Závěr.......................................................................................................................................63 Reference .................................................................................................................................64
}5}
Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá především metodami izolace huminových látek (HS) z povrchových vod. Teoretická část práce poskytuje rešerši metod izolace HS z povrchových vod a stručnou rešerši metod charakterizace HS s důrazem na metody použité v praktické části práce. Praktická část práce popisuje zavádění metody izolace HS z povrchových vod pomocí reverzní osmózy a následné sorpce na DAX-8 pryskyřici. Tato metoda byla optimalizována a vyzkoušena na vzorcích povrchových vod z různých prostředí. I přes drobné potíže, které mohou být v budoucnu odstraněny, hodnotím metodu jako velmi vhodnou pro izolaci HS z různých typů povrchových vod. Práce se okrajově zabývá charakterizací získaných huminových kyselin jak na obsah organického uhlíku, tak na obsah dioxinově aktivních látek. Tyto nebyly prokázány pomocí citlivého in vitro biotestu založeném na buněčné linii H4IIE-luc, proto původně plánovaná chemická analýza nebyla provedena. Klíčová slova:
izolace huminových látek, huminové kyseliny, fulvokyseliny, reverzní osmóza, DAX-8 pryskyřice, toxicita dioxinového typu
Abstract Focal point of this diploma thesis is isolation of humic substances (HS) from surface waters. Theoretical part of thesis provides recherche of methods of isolation of HS from surface waters and brief recherche of methods of characterisation of HS with accent on methods used in practical part of work. Practical part of diploma thesis describes implementation of isolation metod based on reverse osmosis and subsequent sorption on DAX-8 resin. This method was optimized and proved on samples of surface waters from various environments. Despite of small difficulties which can be eliminated in future, I evaluate the metod as suitable for isolation of HS from various surface waters. Work partialy concerns with characterization of recovered humic acids for content of organic carbon and content of dioxin-like compounds. In vitro biotest based on cell line H4IIE-luc have not revealed any content of dioxin-like compounds, so previously planned chemical analysis was redundant. Key words: isolation of humic substances, humic acids, fulvic acids, reverse osmosis, DAX-8 resin, dioxin-like toxicity
}6}
I Teoretická část 1 Úvod – cíle diplomové práce V diplomové práci se zabývám problematikou izolace huminových látek (HS) z vod. Diplomovou prací jsem sledovala tyto cíle: o Vypracovat rešerši metod izolace HS z vod o Vypracovat rešerši základních metod charakterizace HS se zaměřením na metody používané v praktické části práce o Zavést metodu izolace HS z vody na pracovišti RECETOX o Izolované vzorky HS charakterizovat na obsah uhlíku a přítomnost možných polutatnů typu PCBs a PAHs.
1.1 Co jsou huminové látky Každý živý organizmus do prostředí uvolňuje mnoho organických látek, ať už za svého života, tak i po smrti rozkladem svých tkání. Tyto látky následně podléhají chemickému i biologickému rozkladu za tvorby humusu, temně zbarvené organické hmoty, ve kterém už nepoznáme původní strukturu. Humus rozdělujeme na dvě části (Steinberg, Kamara et al. 2006): •
•
Nehumifikovaná část, obsahující téměř všechny biochemické složky původního materiálu, které můžeme přesně chemicky určit (sacharidy, lipidy, proteiny, aminokyseliny, nukleové kyseliny,…). Tyto látky se mohou dále rozkládat a vstupovat tak do procesu humifikace, kvantitativně druhého nejdůležitějšího biogeochemického procesu na Zemi hned po fotosyntéze. Humifikovaná část, nízkomolekulární až vysokomolekulární koloidní hmota nazývaná huminový materiál (humic matter), nebo také HS. Tato frakce představuje významnější část humusu, protože je jeho chemicky nejaktivnější částí. Podle rozpustnosti dělíme půdní HS tradičně na fulvokyseliny (FA), huminové kyseliny (HA) a nerozpustný humin. Akvatické HS, jako významná frakce rozpuštěné organické hmoty (DOM), se dělí jen na FA a HA. Obecně můžeme HS definovat jako kyselou, amorfní, žlutě, hnědě až černě zbarvenou směs různých více či méně degradovaných molekul.
Výzkum HS začal jejich popsáním v roce 1786. Německý chemik Achard zavedl první metody izolace a klasifikační schémata. Pro temně zbarvený organický materiál v půdě zavedl termín „Huminstoffe“ – huminové látky, jehož původ nacházíme v latinském slovu „humus“, což znamená půda nebo země. Další významný krok k poznání HS učinil roku 1839 slavný švédský chemik Berzelius, když izoloval půdní HS jako frakce rozpustné v bazických i
}7}
alkalických rozpouštědlech a ve vodě. Také započal výzkum vodních HS, které izoloval z pramene v Portě ve Švédsku. Přínosem jeho práce bylo také zjištění, že HS tvoří směs podobných, ale ne identických molekul. V Berzeliově práci pokračoval jeho žák Mulder, který roku 1840 izoloval další frakce HS (Steinberg, Kamara et al. 2006). O revizi klasifikace HS se na počátku dvacátého století zasloužil Oden. Jeho dělení na FA, HA a humus je platné dodnes. Oden popsal koloidní povahu HS, objevil jejich význam v transportu látek ve vodním ekosystému a označil je jako hlavní faktor určující zbarvení vody. Jeho výzkum odstartoval vývoj mnoha teorií o vzniku HS (Steinberg, Kamara et al. 2006).
1.1.1
HS ve vodě
Obecně lze říct, že HS nalézáme ve všech typech vod: v pramenech, potocích, řekách, jezerech, mořích a oceánech, ve spodní vodě i ve vodě srážkové. HS se ve vodách vyskytují v několika podobách: pevné, koloidní a rozpuštěné, jak ukazuje Obrázek 1. Významné je i zastoupení HS ve vodních sedimentech. Ve vodě samotné jsou HS součástí takzvaného rozpuštěného organického uhlíku (DOC), neboli rozpuštěné organické hmoty (DOM). Nadřazeným termínem je NOM (NOM), který zahrnuje veškeré organické látky v prostředí kromě živých organizmů. Sladké přírodní vody obsahují 0,5 – 50 mg/l C jako DOC, z čehož až 80% jsou HS. Nejvyšší koncentrace DOC, dosahující až 100 mg/l, se vyskytují v půdní pórové vodě (Zsolnay 1996), ale také ve slaných jezerech kanadských prérií (Waiser and Robarts 2000). Původ HS ve vodě můžeme zjednodušeně rozdělit na (Steinberg, Kamara et al. 2006): •
•
Allochtonní – „z vnějšku dodané“, mají původ v půdní humifikaci a do vody se dostaly sekundárně. Nalézáme je nejvíce v tekoucích vodách, zátokách a na pobřežích. Nemusí mít stejnou strukturu jako původní HS, protože většinou prodělávají další změny během transportu do jiného prostředí (degradace, fotochemické reakce, kondenzace, aj.). Autochtonní – vznikají přímo ve vodě, významné jsou ve velkých jezerech a v oceánech, kde je dostatek planktonu a řas jako zdrojového materiálu pro humifikaci.
}8}
Obrázek 1 Podoba HS ve vodním prostředí (School of Chemical Science and Engineering, 2008)
2 Vzorkování Vzorkování HS v různých prostředích je komplexní procedura zahrnující vzorkovací aparaturu (vzorkovací nádoby a pomůcky), lokalizaci vzorkování, udržování vzorku v čerstvém stavu a jeho dopravu. Dále musíme vzít v úvahu separaci vzorku (centrifugací či filtrací) a různá terénní měření a pozorování (Leenheer 2009). NOM bychom měli považovat za labilní a reaktivní, jak ukazuje Schéma 1. NOM také může být snadno kontaminována syntetickými chemikáliemi použitými při vzorkování, avšak vzhledem k jejímu nadbytku oproti „stopovým kontaminantům“ může být většinou vzorkována bez použití speciálně čistých procedur (Leenheer 2009). Nádoby pro přepravu a skladování preferujeme skleněné nebo polyethylenové. Použití nerezových nádob není vhodné, protože během skladování v chladu dochází k problému adsorpce taninů ze vzorků DOM (Leenheer 2009). Skleněné nádoby mají výhodu v tom, že díky průhlednosti se snadno kalibrují na určený objem vody, ale jsou křehké, tedy nevhodné k zasílání vzorků. Hranaté polyetylénové nádoby jsou vhodnější, protože mohou být snadno sbaleny a lépe vydrží přepravu, během které je vhodné vzorky chladit. Uvolňování změkčovadel z polyetylénových nádob nebylo zaznamenáno a adsorpce polární DOM na polyetylén není problém (Leenheer 2009). Pozorování a měření specifické vodivosti, pH, barvy, zápachu a turbidity by mělo být prováděno během vzorkování. Existuje lineární vztah mezi specifickou vodivostí vody za hodnoty pH blízko neutrality a obsahem solí ve vodě, jak udává vzorec (Fireman and Reeve 1948): meq soli na litr = 12,5 SC kde meq = miliekvivalent SC = specifická vodivost, mS/cm.
}9}
Hodnocení obsahu solí je vyžadováno pro separace DOM zahrnující iontově výměnné pryskyřice. Pozorování intenzity a odstínu barvy je kvalitativní měření vypovídající o koncentraci a původu DOM. Také zápach může naznačovat původ DOM, např. sulfan indikuje anaerobní podmínky. Měřením turbidity můžeme určit koncentraci suspendovaného sedimentu, která je užitečná pro zvolení metod separace sedimentů (Leenheer 2009).
Schéma 1: Deriváty NOM v půdě, sedimentu a vodě; = rezervoáry NOM; = = plynné produkty; = procesy; = propojení rezervoárů NOM; = reaktanty; vektory reaktantů a produktů; = vstupy NOM do rezervoárů, hυ = elektromagnetické záření (Leenheer 2009)
} 10 }
2.1 Úprava vzorků DOM je operačně rozlišená od sedimentové a koloidní NOM typem procedury pro oddělení částic. Tyto procedury mohou zahrnovat gravitační usazování, centrifugaci, filtraci, ultrafiltraci a dialýzu. Mohou být prováděny přímo během vzorkování nebo poté v laboratoři. Často je použita kombinace terénních a laboratorních separačních metod, podle cílů práce (Leenheer 2009). Nejčastějším prvním krokem při zpracování vzorku je téměř vždy filtrace, i když byly provedeny i charakterizace neupravených vzorků, a to dokonce podzemních vod s velmi nízkými koncentracemi DOC (méně než 1 mg.l-1). Použitá metoda, trojrozměrná excitačně emisní spektroskopie, je vhodná a užitečná pro měření koncentrací a pro charakterizaci HS v podzemních vodách (Nagao and Iwatsuki 2007). Pro některé charakterizační metody postačuje pouze filtrovaný vzorek vody s dostatečnou koncentrací NOM. Absorbance a fluorescence v ultrafialovém a viditelném záření, kapalinová chromatografie i acidita mohou být studovány v roztocích s koncentrací 10 mg C/l (Maurice, Pullin et al. 2002). Také vysokotlaká gelová permeační chromatografie se dá použít pro filtrovaný a dále nezpracovaný vzorek vody, avšak výsledky pro koncentrace NOM menší než 3-5 mg TOC/l nejsou vždy spolehlivé (Meier, Namjesnik-Dejanovic et al. 1999). To znamená, že tato metoda nemůže být použita pro vzorky vody s nízkým obsahem DOC bez předchozího zakoncentrování. Filtruje se většinou membránovým či stříbrným filtrem s velikostí pórů 0,45 μm nebo 0,2 μm (např. 0,2μm polykarbonátový filtr číslo 611101, Nuclepore). Pokud vzorek obsahuje mnoho nerozpuštěného materiálu, je dobré předřadit hrubší filtr (např. 5 μm) pro prevenci ucpávání jemného filtru. Důvodem těchto procedur je odstranění nerozpuštěných částí, protože HS jsou definovány jako rozpuštěné. Velikost filtru není zvolena náhodně, ale odpovídá funkční definici DOM, kterou graficky znázorňuje Obrázek 2 (Steinberg, Kamara et al. 2006). Pokud použijeme filtr s velikostí pórů 1 μm, což je horní limit velikosti koloidních částic, získáme filtrát obsahující jak DOM, tak koloidní NOM, která může být později oddělena od DOM v laboratoři pomocí dialýzy (Croue, Korshin et al. 2000). Filtry ze skleněných vláken jsou preferovanější oproti membránovým, které mají problém s ucpáváním, adsorpcí DOM a nebo kontaminací. Balstonský hloubkový skleněný 1μm filtr s 30μm předfiltrem je často používán pro vzorkování DOM, pokud nepotřebujeme získat sedimentovou NOM (Leenheer 2009). Obrázek 3 znázorňuje vzorkovací a filtrační aparaturu pro terénní použití. Čerpadlo je poháněno 12V autobaterií. Pumpuje vodu přímo ze vzorkovaného místa skrz dva skleněné filtry do zásobní nádoby. Toto uspořádání bylo inspirací pro zvažování využití systému reverzní osmózy ke vzorkování a současnému zakoncentrovávání vzorku přímo na lokalitě (vik kapitola 2.2.1 Použití systému RO v praktické části).
} 11 }
Obrázek 2 Grafická definice DOM včetně malých organických molekul a tří frakcí HS (AAaminokyseliny, CH- uhlovodíky, FA- mastné kyseliny) (Steinberg, Kamara et al. 2006)
Obrázek 3 Přenosné zařízení pro filtraci a vzorkování vody (Leenheer 2009)
} 12 }
3 Metody izolace HS Zkoumání HS různými metodami většinou vyžaduje jejich extrakci z matrice vzorku. Hlavním důvodem je, že HS tvoří jen asi třetinu až polovinu DOM, a tak je třeba zbavit se ostatních látek, které mohou interferovat při následujících analýzách. Jelikož HS obsahují velké množství různých chemických struktur, neexistuje jediná analytická metoda pro jejich izolaci a frakcionaci. V chemii humusu platí všeobecný princip, že bez ohledu na druh vzorku (rozpuštěné či pevné) veškerá klasifikace a definice HS je založena na proceduře použité pro jejich izolaci. Neexistuje ideální systém, který by uspokojil všechny vědce (Peuravuori, Monteiro et al. 2005). Termíny „frakcionace“ a „izolace“ jsou často zaměňovány, ale je mezi nimi značný rozdíl. Frakcionace se vztahuje k chemickým nebo fyzikální procesům, které rozdělují součásti přírodních vzorků do homogennějších skupin podle chemických či fyzikálních vlastnost, jako jsou acidita, anionty, kationty, polarita, molekulární velikost aj. Frakcionace NOM je většinou doprovázená dalšími analytickými metodami umožňujícími izolaci NOM od anorganických součástí vzorku a od sloučenin použitých při frakcionaci. Například hydrofilní aniontové součásti NOM frakcionované pomocí aniontově výměnných pryskyřic musí být posléze odděleny od anorganických iontů, jako jsou sulfáty, aby byly „izolovány“ ze vzorku. Frakcionační procedury jsou součástí izolačních, ale izolační procedury přesahují frakcionaci, takže v popisné terminologii je frakcionace kladena nad izolaci (Leenheer 2009). Produkty izolace NOM nebo jejích součástí jsou většinou pevné nebo tekuté směsi. Izolační procedura může někdy zahrnovat přeměnu tekutých produktů (např. těkavé mastné kyseliny, roztok disociovaných HA) na pevné látky (např. sodné soli mastných kyselin, sodné humáty) (Leenheer 2009). Zjednodušeně lze izolaci rozdělit na zakoncentrování vzorku a na frakcionaci a izolaci HS. Některé metody nám poslouží k oběma účelům zároveň. Při výběr metody musíme mít na zřeteli, které charakterizační metody budeme používat a také jaký je cíl naší práce. Dále musíme myslet na možné změny a nechtěnou frakcionaci vzorku. Mezi nejpoužívanější metody izolace NOM či HS patří: Ø Vymražování (lyofilizace) Ø Chemické srážení Ø Extrakce rozpouštědlem Ø Reverzní osmóza Ø Ultrafiltrace Ø Adsorpce na pevné povrchy Posledně jmenovaná technika v podobě extrakce na pevnou fázi v kolonách s neiontovou pevnou náplní je dnes nejčastěji využívaným způsobem, který se stal standardem, proto se jím budu zabývat šířeji. Je to také procedura používaná Mezinárodní asociací pro huminové látky (IHSS – International humic substances society), i když sama tato organizace doufá, že budou nalézány nové a vhodnější metody, které umožní posun ve studiu HS. Nejspíše proto byla v roce 1990 zavedena také izolace pomocí RO pro získání celistvější
} 13 }
NOM. Lyofilizace je další relativně šetrná metoda, která umožňuje přeměnit zakoncnetrované roztoky HS na pevné látky a proto tvoří často koncovku celého postupu izolace.
3.1 Sorpční techniky 3.1.1 XAD Sorpce na XAD-8 pryskyřice byla první zavedenou metodou, kterou také v roce 1981 přijala IHSS pro vytvoření sbírky referenčních vzorků HA a FA z povrchových vod. Jejich referenční FA ze Suwannee River (SRFA) byla charakterizována širokým spektrem metod a díky tomu slouží pro porovnávání XAD izolátů. XAD procedura je dnes nejpoužívanější metoda, díky které pouze neizolujeme NOM, ale získáme také jednotlivé frakce HM. XAD-8 akrylo-esterová pryskyřice je výborný sorbent pro HS při nízkém pH, proto musíme vzorek nejdříve okyselit na pH 2 pomocí koncentrované HCl. Poté vzorek pumpujeme skrz sloupec. Podle definice tvoří HS část zachycená na sorbentu. Hydrofilní součásti nepatří k HS a jsou odděleny (Steinberg, Kamara et al. 2006). Proces, který probíhá na sorbentu, zjednodušeně znázorňuje Obrázek 4. Poté jsou HS ze sloupce vymyty pomocí 0,1 M NaOH. Eluát je okyselen a může být dále zakoncentrováván stejným procesem až na 500 mg DOC na litr. Dalším krokem bývá rozdělení FA a HA, které spočívá v okyselení až na pH 1. HA se vysrážejí, FA zůstávají rozpuštěny. Obě frakce jsou poté zbaveny NaCl, které se děje promýváním deionizovanou vodou. Koncentráty jsou poté rozpuštěny v minimu NaOH (Thurman and Malcolm 1981). Posledním krokem je převedení získaných sodných humátů a fulvátů na jejich volné formy. Toho docílíme použitím silné kationtově výměnné pryskyřice (typ AgMP-50) v hydrogenované podobě. Hydrogenované HS následně vymrazíme a uskladníme k dalšímu použití (Thurman and Malcolm 1981). Celý proces bývá často modifikován pro získávání dalších frakcí NOM. Detailní a běžně používaný protokol pro získání HS, hydrofilních bází, silně hydrofobních a hydrofilních kyselin a hydrofilních neutrálních látek znázorňuje Schéma 2 (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004). Výhody XAD procedury: Ø kvantitativní metoda (použití uhlíkové analýzy) Ø nepotřebuje organická rozpouštědla Ø izolace přímo z vody Ø jednoduché a rychlé zpracování velkých kvant vody Ø oddělení HS od anorganických látek ve vodě (obsah popela ve výsledném produktu menší 1 %)
Nevýhody: Ø možná kontaminace organickými látkami z adsorbentu, které lze předejít důkladným přečištěním pryskyřice Ø vystavení HS extrémním pH
} 14 }
Schéma 2 Izolace HS a dalších organických uhlíkatých složek NOM. Pouze hydrofobní část je považována za HS. HiA – hydrofilní kyseliny; HiB – hydrofilní báze; HiN – hydrofilní neutrální látky; HoA – hydrofobní kyseliny; HoN – hydrofobní neutrální látky (Leenheer 1981)
} 15 }
Obrázek 4 Vliv pH na ionizaci a rozpustnost organických kyselin a bazí (Steinberg, Kamara et al. 2006)
3.1.2 Alternativní sorbenty Testováním a porovnáváním nových sorbentů se v nedávné době zabývali Peuravuori et al. (2005). Jako hlavní důvod udávají, že výroba spolehlivé XAD-8 pryskyřice (Amberlite ) byla před několika lety zastavena. Jako možnou náhradu navrhuje Farnworth (1995) DAX-8 pryskyřici (Supelite ). Přestože proces výroby těchto dvou sorbentů je mírně odlišný, jejich technické parametry (např. velikost pórů či povrchu) se liší jen velmi málo. Několik prací (Peuravuori, Lehtonen et al. 2002; Chow 2006) potvrzuje, že pomocí obou sorbentů lze izolovat téměř identické HS, i když DAX-8 produkuje HS s mírně vyšším obsahem alifatických struktur. ®
TM
Peuravuori et. al (2005) navrhují zavést více fyzikální definici HS, která nebude založená pouze na myšlených hydrofobně-hydrofilních interakcích za určité acidity, ale spíše na reálnějších a význačnějších vlastnostech. Nejpříznačnější vlastností různých HS je velké zastoupení kyselých funkčních skupin (hlavně karboxylových), které je řadí k polyelektrolytům. Díky tomu můžeme prakticky veškeré HS izolovat z vody jedním krokem pomocí jistých aniontově výměnných pryskyřic. Nejpopulárnějším materiálem pro tyto účely je DEAE celulóza (typ [25249-54-1], Sigma, Německo), která je slabým aniontově výměnným sorbentem s aminovými skupinami třetího řádu vázanými k hydrofilní matrix [OC2H4N(C2H5)2]. Velkou výhodou je možnost izolovat téměř jakékoliv HS ze vzorku bez úpravy pH, protože optimální výtěžnost pro organické
} 16 }
kyseliny, která je značně vysoká (80%-100% DOM), nastává mezi pH 4 a 6 (Peuravuori, Monteiro et al. 2005). Huminové roztoky získané izolační procedurou s DEAE celulózou jsou podobné kombinaci specifických roztoků (takzvané hydrofobní kyseliny a neutrální látky a hydrofilní kyseliny) získaných rozšířenou vícestupňovou XAD procedurou. Tu znázorňuje Schéma 2. Nevýhodou je nesnadné vymývání sorbovaného HM z pryskyřice (Peuravuori, Monteiro et al. 2005). Ve spojení s membránou (selektivní pro molekulární velikost 1000 kDa) může být dietylaminoetyl (DEAE) celulóza použita pro konstrukci pasivního vzorkovače DOM. Podle nukleární magnetické rezonance (NMR) pasivní vzorkovač izoluje DOM téměř nerozeznatelně od klasické DEAE procedury. Vzorkovač je efektivní pro různé typy vod (velké jezero, rychle tekoucí vody, bažiny). Velká množství DOM mohou být snadno a rychle izolována, vzorkovače mají jednoduchou konstrukci, nepotřebují tlakové filtrování a umožňují časově a prostorově rozsáhlé experimenty, které by byly nemyslitelné s konvenčními metodami. Například můžeme pravidelně monitorovat DOM na mnoha lokalitách či umístit vzorkovače do různých hloubek v jezeře. Mezi další výhody patří levný provoz (cena DOM oproti konvenčním metodám je až 25krát nižší) a jednoduché použití umožňující umístění do nesnadno dostupných míst (Lam and Simpson 2006). Další typickou charakteristikou HS je jejich relativně vysoký obsah fenolických funkčních skupin a hojnost aromatických C=C struktur. Tyto vlastnosti umožňují použít poly(vinylpyrrolidone) (PVP) (typ [25249-54-1], Sigma, Německo) pro frakcionaci DOM za kyselých podmínek (pH ~ 2) na HS a další organické zbytky (převážně uhlovodíky, proteiny, aminokyseliny a kyselina uronová). Přestože PVP pryskyřice ve své nerozpustné podobě byla používána v mnoha různých výzkumech, včetně počátků zkoumání HM, její použití v chemii humusu je méně známé. To ovšem nedokazuje nevhodnost PVP pro izolaci a frakcionaci HM (Peuravuori, Monteiro et al. 2005). PVP procedura je stejná jako v případě neiontových sorbentů, včetně okyselení vzorku na pH 2. Na rozdíl od hydrofobně hydrofilních interakcí v případě XAD procedury však tvoří PVP silné vazby s fenolickými, hydroxylovými a karboxylovými skupinami DOM (Ciavatta, Govi et al. 1990). Samotný proces spočívá v pročištění PVP pryskyřice (destilovanou vodou, zředěným NaOH, 10% HCl, destilovanou vodou do odstranění Cl-, acetonem a nakonec destilovanou vodou) a jejím následném rozpuštění v 0,01 M HCl (pH 2). Připravenou PVP pryskyřici umístíme do skleněné láhve, přidáme vzorek okyselený na pH 2 a směs mícháme 16 hodin (dávkový postup). Poté suspenzi filtrujeme, promyjeme destilovanou vodou a poté vymýváme zadržený HM pomocí 0,1 M NaOH. Provedeme kationtovou výměnu a vzorek lyofilizujeme (Peuravuori, Monteiro et al. 2005).
3.2 Membránové techniky Reverzní osmóza, nanofiltrace a ultrafiltrace jsou dobře použitelné membránové techniky vhodné také pro izolaci HM (Burba and Van den Bergh 2002). Obecné schéma metod znázorňuje Obrázek 5. Získané frakce jsou definovány na základě filtrační procedury, materiálu a pórovitosti membrány a molekulární velikosti DOC vzorku. Zanášení membrán jakožto
} 17 }
dynamický proces silně ovlivňuje propustnost membrán pro různé látky a jejich velikostní frakce (Liikanen, Kiuru et al. 2005; Kimura, Yamamura et al. 2006; Park, Kwon et al. 2006; Qin, Cao et al. 2006).
Obrázek 5 Blokové schéma izolace NOM membránovými technikami (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004)
3.2.1 Reverzní osmóza Kromě adsorpce na pevné povrchy začala po roce 1990 IHSS používat také reverzní osmózu (RO). Tato metoda umožňuje získávat referenční materiál v podobě koncentrované NOM, která neobsahuje pouze HS (hydrofobní frakci), ale také hydrofilní kyseliny a ostatní rozpustný organický materiál původně přítomný ve vzorku. Koncentrovaná frakce může obsahovat více než 90 % původního DOC. Před samotnou membránovou filtrací je vhodné odstranit co nejvíce kationtů pomocí kationtově výměnné pryskyřice. I přesto výsledný produkt často obsahuje velké množství anorganických iontů, které mohou ztěžovat další zkoumání (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004). Tyto skutečnosti naznačují velkou výhodnost RO pro tmavě zbarvené toky s vysokým obsahem DOC a s nízkými koncentracemi anorganických rozpuštěných látek (Serkiz and Perdue 1990). Některé práce ukazují možnost použít RO také pro extrakci DOC z povrchových vod různých typů a také z podzemních vod s nízkými koncentracemi DOC (Sun, Perdue et al. 1995).
} 18 }
Některé kroky mají více variant, podle záměru studie a konkrétní situace (typ vody, využité charakterizační metody). Velmi diskutovaný je typ katexu použitý k odstranění polyvalentních kationtů ze vzorku před jeho aplikací na membránu. Kationty totiž mohou způsobovat srážení nerozpustných solí (např. CaCO3) na membráně (Gjessing, Alberts et al. 1998) nebo ztráty DOM způsobené srážením kationt-DOM agregátů na membráně (Clair, Kramer et al. 1991). Používá se H+ nebo Na+ forma kationtově výměnné pryskyřice. Sun et al. (1995) použili H+ formu Dowex 50 katexu. Výsledkem bylo odstranění HCO3̵ v podobě CO2 (g) a koncentrát s nízkými hodnotami pH (pH 2-4). Výsledky některých dalších studií (Fang and Chian 1975; Fang and Chian 1976) i jejich vlastní simulace ukazují, že při nízkých pH dochází ke ztrátám nízkomolekulárních organických kyselin (např. kyseliny octové). Na základě těchto výsledků použili pro některé vzorky Na+ formu katexu. Výsledky neukázaly variabilitu ve výtěžcích při různých pH vzorků a při použití různých katexů, což předběžně vysvětlují tím, že nízkomolekulární organické kyseliny nebyly významnou součástí DOM ve studovaných vodách (Sun, Perdue et al. 1995). Další nevýhodou H+ katexu je možné srážení HA frakce DOM na membráně. Tento jev byl pozorován při nízkém pH v kombinaci s velmi vysokými koncentracemi DOC (Sun, Perdue et al. 1995). Na druhou stranu použití H+ katexu umožňuje nejen odstranění HCO3-, ale také některých anorganických kyselin. Výsledkem je, že iontová síla roztoků nestoupá tak rychle jako koncentrace DOC. Za stálého tlaku odtok permeátu klesá se stoupající iontovou silou, takže použití H+ katexu umožňuje rychlejší zpracování vzorku (Sun, Perdue et al. 1995). Bez ohledu na typ použitého katexu jsou anorganické soli a rozpuštěný oxid křemičitý koncentrovány v procesu RO. H+ saturovaný katex můžeme použít pro odstranění hlavních i vedlejších kationtů z koncentrovaného vzorku (včetně Na+, pokud byl použit jako výměnný kation před koncentrováním). Pro odstranění anorganických aniontů a rozpuštěného oxidu křemičitého z koncentrovaných vzorků DOM dříve neexistovala uspokojivá procedura (Sun, Perdue et al. 1995). Jednou z možností je použití Dowex AG-II A8 pryskyřice pro odstranění silných kyselin z koncentrovaných vzorků. Rozpuštěné křemičitany mohou být také odstraněny touto pryskyřicí, pokud jsou nejdříve převedeny na silnou kyselinu H2SiF6 přidáním HF. Tato metoda odstraní přes 90 % Si(OH) 4 a SO42-. Nevýhodou je, že tato pryskyřice také odstraňuje silnější organické kyseliny z DOM a tím způsobuje nechtěnou frakcionaci původní DOM a změnu jejích acido-bazických vlastností (Sun, Perdue et al. 1995). Jako úspěšnější metoda pro odstraňování anorganických rozpuštěných látek se jeví elektrodialýza (ED). Stejně jako RO, ED je relativně šetrná metoda, která umožňuje odsolení roztoků NOM bez jejich vystavování extrémně vysokým či nízkým pH. Výsledným produktem spojení RO a ED je odsolený koncentrovaný roztok, ze kterého můžeme lyofilizací získat pevnou NOM s nízkým obsahem popela. Za optimálních podmínek mohou být jak sulfáty, tak křemičitany ve velké míře odstraněny z koncentrátu říční vody se ztrátami průměrně pouze 3 % TOC (Koprivnjak, Perdue et al. 2006).
} 19 }
Rozpuštěné křemičitany mohou způsobovat problémy se zanášením membrány jejich vysrážením. Tím se snižuje tvorba permeátu, ale zadržení DOM membránou RO zůstává nezměněno. V současnosti neexistuje řešení tohoto problému. V komerčním využití RO je zanášení křemičitany hlavním problémem, který je řešen odstraňováním SiO2 z vody pomocí akrylové nebo styrenové pryskyřice (série Amberlite IRA). Tato pryskyřice téměř jistě odstraňuje také DOM, takže tento přístup je nevhodný pro koncentrování DOM pomocí RO. Prozatím se jako jediná možnost jeví proplachování přístroje RO pomocí roztoku NaOH kdykoliv se tvorba permeátu příliš sníží (Sun, Perdue et al. 1995).
Nevýhody:
Výhody koncentrování pomocí RO (Sun, Perdue et al. 1995) : Ø možnost použití v terénu Ø rychlé zpracování velkých kvant vody (150 – 180 l/hod ) Ø získání téměř nezměněné DOM (90% výtěžnost bez frakcionace a bez použití chemikálií)
Ø nezískáváme čistě HS, ale celkovou NOM Ø často velký obsah anorganických iontů (nutné odsolování)
3.2.2 Nanofiltrace a ultrafiltrace Nanofiltrace má velké použití pro odstraňování NOM při úpravách pitné vody. Hlavním důvodem je odstranění prekurzorů vedlejších dezinfekčních produktů (DBP, nebo také potenciál vzniku trihalometanů - THMFP) (de la Rubia, Rodriguez et al. 2008). Ne všechny části DOM se podílejí stejnou měrou na vzniku DBP, a proto jsou používány různé frakcionační techniky k identifikování hlavních prekurzorů DBP v DOM, včetně XAD, RO a ultrafiltrace (Chow, Gao et al. 2005). Metoda membránové ultrafiltrace s tangenčním tokem (TFUF) umožňuje koncentrovat DOM podle molekulární velikosti. Přestože mírnému zanášení membrány nelze předejít, velké objemy vody mohou být snadno zpracovány pro získání gramových množství DOM koncentrátů s různými molekulárními velikostmi, které poté mohou být lyofilizovány (Peuravuori, Monteiro et al. 2005). TFUF metoda je efektivní nástroj pro izolaci DOM podle velikosti, ale základní velikost zadržených molekul může být ovlivněna přítomností kovů a jedinečným uspořádáním DOM (Everett, Chin et al. 1999). TFUF metoda může také předcházet XAD izolaci a tak rozdělit původní vzorek na několik velikostních frakcí (AbbtBraun, Lankes et al. 2004).
3.3 Výtěžnost metod Data z různých studií ukazují, že výtěžek izolované frakce HM závisí na původu vzorku. Velký rozdíl vykazují vzorky reprezentující různě humifikovaný materiál. Z hnědé vody s vyšším stupněm humifikace je možno izolovat relativně velké množství HS na rozdíl od vedlejšího výtoku z čistírny odpadních vod, který reprezentuje počáteční stádium humifikace. Většina organické hmoty v takových odpadních vodách se nachází v podobě
} 20 }
hydrofilní nehuminové frakce. XAD metoda je vhodná k izolaci vodních HS s relativně velkým obsahem dvojitých vazeb ve struktuře, které nacházíme ve více humifikovaných HS odvozených z vyšších rostlin. Izolací pomocí XAD metody nebo ultrafiltrace (s pórovitostí membrány 4000 g/mol) můžeme získat frakci představující 50 až 60 % původního obsahu DOC ve vzorku. Ze vzorku odvozeného z odpadních vod je výtěžek izolované frakce mnohem nižší (do 20 % DOC). Důvodem je, že takovéto vody mají většinu organické hmoty v málo humifikované a nízkomolekulární podobě (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004). Porovnání výtěžnosti XAD metody a RO pro různé druhy vzorků ukazuje Obrázek 6.
Obrázek 6 Porovnání hmotnostní bilance (v % DOC) pro různé frakce získané XAD-8 procedurou (FA: fulvo kyseliny, HA: huminové kyseliny, NHS: nehuminové látky) a ultrafiltrací (K: koncentrát, P: permeát, membrána s pórovitostí 4000 g/mol). Použité zkratky: HO: hnědá voda z jezera Hohloh, ABV: výtok z čistírny odpadních vod, čísla: označení vzorkování (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004).
Rozsáhlé porovnání nejen výtěžností různých metod izolace provedli Peuravuori et al. (2005). Schéma 3 znázorňuje různé analytické procedury použité v této studii. Část filtrovaného původního vzorku vody (5l SSS-water) byla přímo koncentrována pomocí rotační evaporace na 1 l a poté dialyzována proti destilované vodě a nakonec vymražena (ve schématu označena jako frakce A[Orig.Wat.]). Tato frakce byla považována za orientační pro porovnávání.
} 21 }
V případě chromatografických izolačních metod (DAX-8 a DEAE) byly izolovány i frakce jiné než HS. Organické látky nevymyté z DAX-8 pryskyřice pomocí báze (takzvané hydrofobní neutrální látky) byly eluovány metanolem a označeny jako frakce C [MeOH]. Hydrofobní frakce vymyté z DAX-8 pryskyřice (frakce B[HM] získaná z 10 l původní vody) a DEAE celulózy (frakce D[HM] získaná z 44,9 l původní vody) nebyly v této studii vystaveny silně kyselým podmínkám za účelem jejích rozdělení na FA a HA, prošly pouze kationtovou výměnou a poté byly vymraženy. Frakce získané z PVP procedury jsou ve schématu označeny následovně: frakce E[HM] (zadržená HM vymytá pomocí 0,1 M NaOH), frakce F[XAD] a frakce G[IRA] (část nezachycená pomocí PVP, posléze ošetřená dávkovou metodou s XAD-8/2 pryskyřicí a poté s IRA-67 aniontově výměnným sorbentem). Všechny tři frakce také prošly kationtovou výměnou a byly vymraženy. Ultrafiltrace byla provedena pomocí systému membránové ultrafiltrace s tangenčním tokem (4 GPM Pellicon Cassete System od Millipore) s membránou 1 kDa. Dialyzovaný koncentrát H[HM] byl vymražen. Pro charakterizaci zbylého organického materiálu s molekulovou hmotností ≤1 kDa byl filtrát okyselen (pomocí HCl na pH 2) a ošetřen slabě zásaditým aniontově výměnným sorbentem (IRA-67) a následně kationtovou výměnou (frakce I[IRA]). Organický materiál zachycený na kationtově výměnném sorbentu byl vymyt pomocí NaOH, neutralizován (pomocí HCl na pH 7) a vytvořená sůl (NaCl) byla odstraněna dialýzou (frakce J[Dow]). Také frakce I[IRA] a J[Dow] byly vymraženy. Schéma 3 sumarizuje účinnost zkoumaných izolačních metod (procenta originální DOM) pro rozdělování organických roztoků na specifické frakce. DAX-8 procedura se ukázala stejně účinná, jako již bylo publikováno (Peuravuori, Ingman et al. 2001; Peuravuori, Lehtonen et al. 2002). Kvantitativně významné hydrofilní organické látky nezachycené na DAX-8 pryskyřici bývají někdy rozděleny pomocí slabě bazických aniontově výměnných sorbentů nebo vhodnými neiontovými pevnými sorbenty na takzvanou transfilní frakci [tvoří jí hydrofilní kyseliny, 14 – 25% DOC (Peuravuori, Koivikko et al. 2002)] a hydrofilní neutrální frakci. Bylo dokázáno, že DAX-8 pryskyřice je schopná zachytit až o 20% víc hydrofilních součástí DOM než dříve používaná XAD-8 pryskyřice (Peuravuori, Lehtonen et al. 2002). Přesto se zdá, že při výrobě DAX-8 pryskyřice nastávají jisté problémy, takže DAX-8 izolace nemůže být považována za spolehlivou. To je mezi jinými argument pro testování dalších izolačních technik. Schéma 3 ukazuje vysokou schopnost DEAE celulózy zadržovat HM (zhruba o 17% víc než DAX-8 procedura), což je ve shodě s předchozími studiemi (Peuravuori, Ingman et al. 2001; Peuravuori, Koivikko et al. 2002). Jak již bylo zmíněno, makromolekulární organické látky získané DEAE procedurou se jak kvantitativně tak kvalitativně velmi blíží průměrné kombinaci čtyř různých frakcí získaných ve vícestupňové DAX/XAD proceduře (hydrofobní FA a HA, hydrofobní neutrální látky získané pomocí MeOH a hydrofilní kyseliny – transfilní frakce). Z hlediska strukturní chemie je to velká výhoda. Z praktického hlediska je třeba poznamenat, že vymývání sorbované HM z DEAE celulózy je o něco složitější než z DAX-8 pryskyřice a jejích homologů.
} 22 }
Schopnost PVP pryskyřice zadržovat HM z okyselených roztoků byla vysoká i při použití jednoduché dávkové metody. To odpovídá již publikovaným výsledkům (Chen, LeBoef et al. 2003). Obsah nezadržených organických látek (19-23%) se pohyboval v podobných hodnotách jako v případě DEAE procedury. Tyto látky byly z velké části izolovatelné pomocí XAD-8/2 pryskyřice (F[XAD]). Frakce velmi efektivně získaná pomocí IRA-67 (G[IRA]) odpovídá transfilní frakci při XAD proceduře. Schéma 3 ukazuje, že koncentrát vzniklý použitím membrány s pórovitostí 1 kDa obsahoval 97% organických roztoků původní DOM (frakce H[HM]). Menší molekuly (např. organické kyseliny) byly úspěšně izolovány pomocí IRA-67 pryskyřice (bylo získáno asi 91% zbývajících organických látek). Kationtově výměnná pryskyřice zadržela zhruba 21% různorodých organických látek (frakce J[Dow], aminy, aminokyseliny, peptidy, etc.) a zbytek byl tvořen různými druhy makromolekulární HM (frakce I[IRA]).
} 23 }
Schéma 3 Analytické procedury pro rozdělení DOM na různé typy frakcí HS (Peuravuori, Monteiro et al. 2005). Vysvětlení zkratek viz text od druhého odstavce kapitoly 3.3 Výtěžnost metod.
} 24 }
4 Metody charakterizace Přestože poprvé byly HS popsány již v roce 1786 Chemikem Achardem, dodnes neznáme jejich přesnou strukturu. Důvod je jednoduchý, makromolekuly HS mají velmi komplexní a složitou strukturu. I když prvkové složení HS je dobře známé, informace o struktuře a funkčnosti jsou stále nedostatečné. Pro zlepšení této situace navrhují Abbt-Braun et al. (2004) použít co nejvíce metod pro získání informací o struktuře stejných vzorků HS z různých pohledů. Byla publikována četná review a detailní studie o metodách a přístupech charakterizace HS (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004, Leenheer, 2009 #99, Gjessing, 1998 #27). Z toho důvodu zde uvedu pouze přehled nejběžnějších metod používaných v poslední době, které shrnuje Tabulka 1 (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004), a podrobněji se budu zabývat jen metodami alespoň zčásti využitými v praktické části diplomové práce. Tabulka 1: Běžné metody charakterizace HS (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004) Metody: Chemické, fyzikální Elementární analýza Derivatizace (metylace, silylace) Acido-bazická titrace Pyrolýza (teplotní degradace)
Spektroskopické
Získané informace: Prvkové složení (C, H, N, O, S) Funkční skupiny (-OR, –OOR) Protonační kapacita Degradační produkty (monomery) v kombinaci s GC/MS, LC/MS nebo MS Oxidativní, reduktivní degradace /MS, LC/MS nebo MS Mikroskopie Velikost, tvar Viskozimetrie Velikost, tvar UV/VIS Určení UV/Vis-absorbujících skupin (A 245 nm, A 436 nm); E4/ E6 IR, FTIR Kvalitativní určení funkčních skupin Fluorescence Kvalitativní určení funkčních skupin NMR (1H,13C) Kvalitativní určení funkčních skupin: aromatických, alifatických a karboxylových 1 13 NMR (2-D, H, C) Kvalitativní/kvantitativní určení monomerických jednotek NMR (15N) Kvalitativní určení strukturních prvků Raman Kvalitativní určení funkčních skupin EPR Kvantitativní určení organických radikálů a paramagnetických tranzitních kovů MS Určení organických molekul, v kombinaci s jinou metodou (degradace, pyrolýza, hydrolýza)
} 25 }
Chromatografické CE; gelová chromatografie Molekulární velikost, váha Některé modelové reakce v kombinaci s předešlými metodami Fluorescenční quenching Interakce s organickými mikropolutanty (pesticidy) a kovy Chemická/enzymatická Určení aminokyselin, hydrolýza krátkořetězcových kyselin a monosacharidů Biologická degradace Biologické využití Adsorpční chování Adsorpce na pevnou fázi (např. aktivní uhlí, minerální fáze)
4.1 Elementární analýza Prvkové složení představuje nejzákladnější charakteristiku organických sloučenin a může být určeno s dobrou přesností (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004). Hlavní prvky běžně zastoupené v NOM jsou uhlík, vodík, kyslík a dusík. Vedlejší prvky jsou halogeny, síra a fosfor. Typická data pro prvkové složení vodních HS ukazuje Tabulka 2. Jako doplnění elementární analýzy je nezbyté určit obsah vody a popela pro dosažení přesných výsledků obsahu jednotlivých prvků. Většina NOM je hygroskopická, což znamená, že velmi rychle přijímá vodu po vymražení. Hydráty solí, které mohly být spoluizolovány s hydrofilními frakcemi DOM také obsahují mnoho vody, která nadhodnocuje obsah vodíku a kyslíku. Proto je nezbytné tyto hydráty odstranit před provedením elementární analýzy. Bylo zjištěno, že oddělené měření obsahu vody sloužící pro korekci obsahu kyslíku a vodíku je vhodnější než sušení vymražováním s přímým stanovením obsahu vodíku a kyslíku, protože některé vzorky NOM rychle znovu přijímají vlhkost okamžitě po vymražení (Leenheer 2009). Je důležité, aby vzorek měl nízký obsah popela, hlavně pro zjišťování obsahu kyslíku. Kyslík v NOM je často určován jako rozdíl mezi 100 % mínus součet obsahů ostatních hlavních prvků určených pomocí C, H a N analyzátorů. Problémy způsobené tímto rozdílovým určením jsou (Leenheer 2009): o Případné chyby v určení obsahů uhlíku, vodíku a dusíku jsou sečteny při výpočtu obsahu kyslíku o Výpočet nebere v úvahu vedlejší prvky o Popel může obsahovat prvky již určené (např. v karbonátech, sulfátech a oxidech) Přímé určení obsahu kyslíku ve vzorcích s nízkým obsahem popela minimalizuje chybu (Leenheer 2009). Protože DOM obsahuje asi 50 % uhlíku, DOC je běžně používaný parametr pro zjišťování výtěžků DOM (Sun, Perdue et al. 1995).
} 26 }
Obsah uhlíku může být stanoven pomocí coulometrického analyzátoru. Ten měří obsah DOC pomocí vysokoteplotního spalování, které převede organický uhlík na CO2 v kyslíkaté atmosféře s teplotou okolo 700 °C. Uvolněný CO2 je titrován. Anorganický uhlík musí být odstraněn před analýzou obsahu DOC. Vzorek je ošetřen H2SO4 až na pH 2 a potom probubláván pomocí N2 po dobu 15 minut. Obsah DOC ve vzorku je vypočítán jako rozdíl mezi změřenou hodnotou vzorku a blankem (Sun, Perdue et al. 1995). Některé analyzátory provádějí tento krok automaticky a měří i obsah anorganického uhlíku. Různé poměry prvků NOM jsou používány v analyticko-chemických a biochemických aplikacích. Například poměr C:N je používán pro rozlišení původu sedimentového materiálu ve vyšších rostlinách (C:N>20) od původu v autochtonním fytoplanktonu a bakteriích (C:N<10). Také byl použit pro charakterizaci zdrojového materiálu POM v hlavních světových řekách. Polární frakce NOM většinou mají nižší poměr C:N než nepolární frakce (Leenheer 2009). Dvourozměrné (H/C a O/C) a trojrozměrné (H/C ,O/C a N/C) grafy jsou používány k typizování různých NOM. Původně sloužily k typizování uhlí (Van Krevelen 1993). Tabulka 2 Prvkové složení (C, H, O, N, S, popel) FA izolovaných XAD procedurou a koncentrátů získaných ultrafiltrací Použité zkratky: HO: hnědá voda z jezera Hohloh, ABV: výtok z čistírny odpadních vod, čísla: označení vzorkování (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004).
* Rozsah pro FA izolované z vodního prostředí Obsah popela spočítán jako 100 % - (C + H + N + O + S)
4.2 Spektrometrie v ultrafialovém a viditelném záření Spektrometrie v ultrafialovém (UV) a viditelném (Vis) záření se provádí od 180 nm do 760 nm elektromagnetického spektra; 380 nm je předěl mezi UV a Vis spektrometrií. UV záření je absorbováno π-elektronovými přechody v jednoduchých chromoforech se systémem jedné nebo několika málo dvojných vazeb. Poměr absorbance UV záření při 254 nm (UV254) ke koncentraci DOC je často používán pro určení obsahu aromatického uhlíku v roztoku NOM (Leenheer 2009). Tento poměr je známý jako specifická UV absorbance NOM (SUVA). Absorbance Vis záření při 400 nm (neboli „barva“) koreluje s potenciálem vzniku trihalometanů (THMFP) při chlorování (Leenheer 2009). Bylo zjištěno, že SUVA také obecně
} 27 }
koreluje s THMFP, ale má své limitace. Např. nehuminový materiál, operačně definovaný jako hydrofilní frakce, který má nízké hodnoty SUVA, produkuje vyšší než predikované množství vedlejších produktů dezinfekce vody (Reckhow, Singer et al. 1990). Absorbce ve Vis záření je nejspíše výsledkem intramolekulárních interakcí mezi hydroxy-aromatickými donory a chinonovými akceptory vzniklými částečným rozkladem fenolů (Del Vecchio and Blough 2004). Sklon křivky absobčního spektra HS ve Vis oblasti můžeme měřit jako poměr absorbance při 465 nm a 665 nm (E4/E6 poměr). Tento poměr byl používán půdními vědci k charakterizaci HS, ale mnoho let existovaly různorodé interpretace jeho významu. Definitivní studie E4/E6 poměru provedli Chen et al. (1977), aby zjistili, že poměr lineárně a inverzně koreluje s molární hmotností určenou sníženou viskozitou. E4/E6 poměr je také ovlivněn hodnotou pH, koreluje s koncentrací volných radikálů, je nezávislý na koncentraci HA nebo FA a není ve vztahu ke koncentraci kondenzovaných aromatických kruhů. Zjištění této studie je ve shodě s pozdějším výzkumem Del Vecchia a Blougha (2004), kteří vysvětlují absorbci ve Vis záření jako výsledek intramolekulárního přenosu náboje. Výsledky měření absorbce UV a Vis záření ukazují vliv izolační procedury na frakcionaci podle hydrofilních a hydrofobních vlastností. Absorbce záření v UV a Vis pásmu je typická vlastnost HS. XAD-8 metodou preferenčně získáváme hydrofobní HS, které jsou zbarvené a UV absorbující. Nehuminová frakce vykazuje relativně nízké hodnoty specifické absorbance. V grafu je vynesena specifická absorbance světla ve Vis oblasti (A436/DOC) oproti specifické absorbanci v UV oblasti (A254/DOC). Jak je ukazuje Graf 27, HA vykazují nejvyšší hodnoty pro oba druhy specifické absorbance, zato nehuminová část nejnižší hodnoty a FA prostřední hodnoty. Tato data naznačují, že obsah dvojných vazeb je ve vztahu k hydrofobnímu charakteru. Koncentrát z RO vykazuje vyšší hodnoty specifické absorbance než původní vzorek, protože během membránových procesů jsou některé méně absorbující a méně zabarvené části odstraněny. To je způsobeno průchodem nízkomolekulárních látek skrz membránu (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004). Graf 27: Korelace specifických absorbčních koeficientů (A436/DOC) a (A254/DOC) pro různé frakce NOM při pH 11. (NHS – nehuminová frakce, K – koncentrát získaný ultrafiltrací, G – původní vzorek zkoncentrovaný evaporací při 40 °C, org – původní vzorek) (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004)
} 28 }
II Praktická část – zavedení postupu izolace HS 1 Úvod Úkolem praktické části práce bylo zavést metodu izolace HS z vod České republiky a získané HS charakterizovat (obsah organického uhlíku, toxicita dioxinového typu, obsah PCBs a PAHs). Po prostudování literatury se jako nejvhodnější pro tento účel jevila kombinace reverzní osmózy s následnou izolací pomocí DAX-8 sorbentu. Použití reverzní osmózy umožňuje zkoncentrovat získaný vzorek vody na malý objem. Následné využití sorpce na DAX-8 pryskyřici se přímo nabízí, jelikož ta je velmi vhodná pro vody s vyšší koncentrací HS.
2 Materiál a metody 2.1 Použité chemikálie a standardy HS Jako standard HS jsem používala HA-Fluka (číslo 53680) od firmy Fluka (Švýcarsko). Pro vlhčení sorbentu jsem použila Methanol – gradient grade (Riedel de Haën, Německo). Pevné HS jsem rozpouštěla v 0,05 M NaOH. Pro okyselení roztoků HS na požadovanou hodnotu pH jsem použila koncentrovanou HCl.
} 29 }
2.2 Systém reverzní osmózy Použila jsem přístroj od firmy DEMOS (Miroslav Baláš, Čebín 314) typ DEMOS 402, určený primárně pro výrobu demineralizované vody. Přístroj byl firmou upraven tak, aby vyhovoval laboratornímu použití. Bylo k němu připojeno čerpadlo umožňující nasávání vody a vytvoření dostatečného tlaku pro provoz přístroje. Do první komory byl umístěn hrubý filtr (70μm). Uhlíkový filtr ve druhé komoře, který původně slouží k odstraňování chlóru, byl nahrazen jemnějším filtrem (5μm). V poslední třetí komoře se nachází nejjemnější filtr (1μm). Přístroj využívá nízkotlaký membránový modul reverzní osmózy M-T 1812 A 50 od firmy Filmtec(). Všechny tyto části ukazuje Obrázek 7.
Obrázek 7 Přístroj RO, čísla udávají postup průchodu vzorku systémem 1 – přívodní hadice pro čerpání vzorku, 2- čerpadlo; 3,4,5 – komory s filtry (70, 5 a 1 mikrometrový filtr), 6 – modul s membránou, 7 – hadice odvádějící koncentrát, 8 – hadice odvádějící permeát, 9 – kovová deska sloužící k uchycení přístroje
} 30 }
Technické parametry přístroje DEMOS 402: Vstupní voda tlak maximální obsah rozpuštěných látek maximální specifická elektrická vodivost pH maximální teplota obsah aktivního chlóru připojení
250 - 750 kPa 500 mg/l 860 µS/cm 5 - 10 35°C 2 mg/l 3/4" - šroubení, 1/2" - hadice
specifická elektrická vodivost permeátu obsah těžkých kovů poměr koncentrátu : permeátu
cca 5 % vstupní vody 0,01 mg/l 5:1
Použité náplně – předúpravní filtry mechanický filtr "PURTREX" F-OX 70 mechanický filtr "PURTREX" F-OX 05 mechanický filtr "PURTREX" F-OX 01 Pozn.: poslední číslo udává velikost pórů v μm
062x254 mm 062x254 mm 062x254 mm
Membránový modul RO (výkon stanoven při tlaku 0,5 MPa a teplotě 25 °C) M-T 1812 A 50 max. 7,0l/hod
2.2.1 Použití systému RO Systém RO může být umístěn jak přímo v místě vzorkování, tak v laboratoři. Postup je v obou případech stejný (Gjessing, Alberts et al. 1998): 1. Vzorek je filtrován buď samostatně, nebo pumpován skrz filtr předřazený zásobníku vzorku. 2. Ze zásobníku voda pokračuje do komory kationtové výměny 3. Poté voda prochází membránou (pórovitost 150 Å, 15nm), kde je rozdělena na: § Permeát - téměř bez rozpuštěných látek (méně než 0,2 mg C/l; vodivost 0.17 mS/m), je odstraněn § Koncentrát - zadrženou část 4. Koncentrát, který obsahuje téměř všechny rozpuštěné látky, je navrácen do zásobníku vzorku 5. V zásobníku je udržován občasným doplněním vzorku přibližně původní objem
} 31 }
6. Po pravidelných intervalech je koncentrát přefiltrován a přemístěn do zásobních lahví. Poslední část koncentrovaného vzorku vypláchneme malým množstvím permeátu nebo čistou vodou 7. Koncentrovaný vzorek je dále zakoncentrován pomocí rotační odparky (max 30°C) a následně lyofilizován pro získání pevného NOM. Před těmito procedurami mohou nastat ještě další kroky z důvodů odstranění iontů. Příklad konkrétního postupu (Serkiz and Perdue 1990): 1. Voda byla pumpována přímo z řeky, skrz 0,45μm předřazený filtr a dále do zásobníku pomocí malé ponorné pumpy. 2. Druhé ponorné čerpadlo pumpovalo vzorek ze zásobníku přes komerční vodní filtr, jehož prázdný objem byl vyplněn Dowex-50 katexem (H+ forma). 3. Vzorek pokračoval do vysokotlaké pumpy, která zvedla tlak z 18-20 psi na 180250 psi. Natlakovaný vzorek procházel regulátorem tlaku. 4. Membrána použitá v této studii byla složená membrána (CrW30-4619-A, Filmtec Corp.), která se skládá z 0,2 μm tlusté aromatické polyamidové vrstvy na 35μm podpůrné polysulfonové vrstvě. 5. Permeát byl odstraněn a koncentrát byl recyklován do zásobníku vzorku a smíchán s další říční vodou 6. Díky unikátně nízkým koncentracím anorganických látek ve vzorkované řece (Suwannee River) bylo zapotřebí velmi málo dalších procedur pro získání produktu s nízkým obsahem popela. Koncentrovaný vzorek byl odsolen na H+ formě katexu a lyofilizován. Systém RO je většinou využíván pro zpracování velkých objemů vody přímo v terénu (Serkiz and Perdue 1990; Sun, Perdue et al. 1995; Gjessing, Alberts et al. 1998). Systém, který jsem použila, zatím nefunguje přímo v terénu, ale do budoucna by ho bylo možno uzpůsobit. Je potřeba pouze vyřešit napájení čerpadla a předřazení hrubšího filtru. Poté by mohlo vzorkování a zakoncentrovávání probíhat současně. Prozatím je možno systém využít poblíž lokality a do laboratoře už přepravovat pouze koncentrát. Uvážíme-li, že objem se zmenší na cca 5 litrů, je to velká úspora. Postup použití systému RO DEMOS 402: 1. Pokud byl přístroj rozložen, je třeba zkontrolovat jeho těsné složení, případně dotáhnou závity. 2. Hrubě přefiltrovanou vodu čerpáme hadicí do komor s filtry (70 μm, 5 μm a 1 μm) 3. Dále voda pokračuje do modulu RO, který obsahuje membránu 4. Na membráně je vzorek rozdělen na permeát a koncentrát a odchází dvěma hadicemi 5. Část permeátu uschováme pro pozdější vyplachování a zbytek odstraníme (možno použít jako destilovanou vodu) 6. Koncentrát navrátíme do zásobníku vody 7. Proces necháme probíhat tak dlouho, dokud v zásobníku vody nezbývá jen minimální množství zkoncentrovaného vzorku
} 32 }
Po každém použití je potřeba systém RO důkladně vyčistit. Část permeátu můžeme použít k vypláchnutí koncentrovaného vzorku ze systému RO. Důkladnější čištění provádíme vypláchnutím slabým roztokem detergentu a následně opláchneme čistou vodou. Po delším provozu se mohou na membráně nahromadit vrstvy HA, bakterií či vodního kamene. Eisenberg a Middlebrooks (1986) vytvořili seznam metod čištění a doporučení od různých výrobců. Před vysušením a uskladněním systému RO se doporučuje na závěr čištění použít bakteriální inhibitor (Sun, Perdue et al. 1995).
2.3 Aparatura pro sorpci na DAX–8 pryskyřici Aby mohl být vzorek sorbován, je potřeba předem připravit sypané kolony (vizPříprava a použití DAX ). Tyto umístíme do aparatury s vakuovým odsávacím zařízením Baker spe-12G (Baker, USA), které je napojeno na membránové vakuové čerpadlo (Schott, Německo). Jednotlivé součásti aparatury viz Obrázek 8.
Obrázek 8 Aparatura pro sorpci na DAX-8, 1 – zásobní lahve na vzorky, 2 – hadičky pro nasátí vzorku skrz zátky do kolon (na obrázku testování různých typů zátek), 3 – kolona se sorbentem, 4 – kohoutky pro regulaci průtoku, 5 – odsávací zařízení se stojánkem a ukazatelem tlaku, 6 – zásobní láhev na eluát, 7 – bezpečnostní láhev (ochrana čerpadla před nasátím kapalin), 8 – regulace nasávání, 9 - čerpadlo
} 33 }
2.3.1 Příprava a použití DAX kolony A. Obecný postup, který byl přiložen u dodaného sorbentu: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Vlhčení pryskyřice Plnění kolony sorbentem Zpětné promývání (backwashing) Plnění sloupce * Vymývání ze sloupce Obnova Výpočty
* Tento bod byl velmi obecný, aby vyhovoval použití pro různé druhy vzorků. Nahradila jsem ho proto konkrétním postupem pro použití sorbentu k zachycení HS.
1. Vlhčení pryskyřice Pryskyřice je dodávána ve vlhké formě, ale během dopravy a skladování může dojít k vyschnutí. Postup vlhčení: Ø přesuneme suchou pryskyřici do dostatečně velké kádinky Ø přidáme dostatečné množství metanolu: 2,5 – 5 cm nad pryskyřici (POZOR: použití organických rozpouštědel jako je metanol, etanol nebo isopropanol může způsobit bobtnání pryskyřice) Ø minutu jemně mícháme, tím zajistíme úplné promíchání Ø necháme ustát 15 minut Ø opatrně slijeme většinu metanolu a nahradíme ho destilovanou vodou Ø zamícháme, necháme ustát 5 – 10 minut
2. Plnění kolony sorbentem Vždy používáme plně hydratovaný materiál. Pokud je třeba, vlhčíme materiál dříve popsaným postupem a nedopustíme jeho vyschnutí během přípravy ani při užívání sloupce. Stálé čelo vody nebo rozpouštědla zhruba 2,5 cm nad pryskyřicí předejde vysychání a „tunelování“. Postup plnění: Ø Ø Ø Ø
do prázdné kolony dáme zhruba 2,5 cm deionizované vody pomalu naléváme suspenzi do kolony a nadbytečnou vodu odpouštíme spodem nedopustíme, aby hladina vody klesla pod úroveň pryskyřice kolonu plníme jen do poloviny, čímž zajistíme místo pro bobtnání v případě použití organických rozpouštědel
} 34 }
3. Zpětné promývání (backwashing) Tato procedura odstraní vzduchové bubliny, vytřídí částice materiálu (stratifikace podle velikosti, nejmenší částice nahoře) a odstraní nejjemnější částice. Pro přípravu nového lože se doporučuje 30 minut proplachování: Ø připojíme přívod vody na spodní konec kolony Ø pomalu zvyšujeme průtok deionizované vody směrem nahoru, dokud nejsou všechny částice suspendovány Ø proplachujeme Ø zastavíme proud vody a necháme pryskyřici usadit Ø nastavíme hladinu vody alespoň 2,5 cm nad povrch pryskyřice 4. Plnění sloupce Spočívá v procházení filtrovaného vzorku kolonou, přičemž dochází k adsorpci extrahovaných látek na pryskyřici. Jelikož adsorpce je rovnovážný proces, adsorbát není nikdy plně zachycen. Obvykle se nejefektivnější průtok pro plnění pryskyřice pohybuje v rozmezí 2 - 16 objemů lože za hodinu. Čím rychlejší průtok, tím větší ztráty. Většinou necháme plnění probíhat, dokud nestoupne obsah adsorbátu na výtoku ze sloupce na určitou předem danou koncentraci. V tomto bodě přistoupíme k vymývání vzorku z kolony 5. Vymývání z kolony (Thurman and Malcolm 1981) Zachycené organické kyseliny vymýváme z kolony v obráceném směru pomocí 0,1M NaOH při průtoku 1 - 5 objemů lože za hodinu. Celkem vymýváme 2 – 3 objemy. Pokud je třeba, celkový eluát okyselíme a pokračujeme dalším krokem zakoncentrování na menším DAX-8 sloupci. 6. Obnova kolony Po vymytí je kolona naplněna vymývacím roztokem. Před opakovaným použitím je potřeba tento roztok odstranit. Většinou postačuje propláchnutí 2 objemy lože deionizované vody při průtoku 1-2 objemy lože za hodinu. 7. Výpočty Sloupcový distribuční koeficient (k´) většiny vodních a půdních HS při pH 2 se pohybuje mezi 500 a 2000. HS jsou tedy kvantitativně adsorbovány, když použijeme k´ rovno 100. Velikost sloupce potom můžeme vypočítat podle vzorce (Thurman and Malcolm 1981): VEL = 2Vo(1+k´) § § §
VEL je objem aplikovaného vzorku s 50% zadržením, Vo je prázdný objem sloupce (= 60 % objemu lože) k´ je sloupcový distribuční koeficient
} 35 }
Poměr sorbentu : objemu vzoru se bude lišit podle obsahu DOC vstupního roztoku. Tabulka 3 ukazuje velikosti sloupců, potřebné pro získání všech hydrofobních kyselin v závislosti na obsahu DOC. Hodnoty byly zjištěny empiricky sorpcí HS. Jelikož izoterma adsorpce hydrofobních kyselin na DAX-8 pryskyřici má tvar L, kapacita sloupce klesá se stoupající koncentrací (Thurman and Malcolm 1981). Tabulka 3: Objem vzorku vs. koncentrace DOC vzorku Koncentrace DOC vzorku (mg/l) 5 25 50 100 200 500
Počet objemů lože vzorku prošlého sloupcem před začátkem „protékání“ HS 50 30 25 15 10 5
B. Praktická příprava kolon Obecně jsem dodržela předepsaný postup. V této části proto popíšu praktické aspekty výroby kolon. • Jako náplň jsem použila DAX-8 pryskyřici od výrobce Sigma-Aldrich (Německo) • Jako kolony jsem zvolila polypropylenové zkumavky o objemu 60 ml od výrobce Sigma-Aldrich (Německo). Spolu s nimi jsem objednala i polyetylénové frity (pórovitost 20 μm) a plastové těsnící zátky. Před plněním kolony sorbentem jsem na její dno pevně přitlačila fritu. Druhou fritu jsem zmenšila nůžkami a po naplnění kolony a provedení zpětného promytí jsem jí volně položila na hladinu čela. Tato frita slouží jako ochrana před zvířením sorbentu při přitékání vzorku či vymývacího činidla. Objem sorbentu jsem volila nejdříve podle tabulky v práci Thurmana a Malcolma (1980) a poté ho upravovala podle optimalizačních pokusů s ohledem na rozdílný proces vymývání. Použitá aparatura i typ kolon neumožňují vymývání v opačném směru, proto je vhodné použít spíše menší objem, aby vzorek při vymývání snadno prošel celým objemem sorbentu. Pro funkčnost aparatury je rozhodující těsnost celého systému. Aby byl vzorek nasát, bylo třeba do dodaných zátek zabudovat hadičky. Parafilm jako první volba se ukázal jako nedostatečné těsnění. Druhá metoda spočívala ve vyplnění prázdného prostoru zátky tmelem. Zjistila jsem, že je třeba volit tmel, který po vytvrzení nezmenšuje objem a je dostatečně přilnavý k hladkému povrchu plastových zátek. Toto splňuje nejlépe sklenářský tmel, který je zároveň průhledný, což usnadňuje aplikaci. Ale ani tento druhý systém se dlouhodobě neosvědčil, protože zátky jsou pružné a při jejich vytahování z kolon se tmel časem uvolní a těsnost se poruší. Jako nejvhodnější řešení se tedy jeví použití gumových zátek, se kterými se také snadno manipuluje. Jelikož jsem měla k dispozici již provrtané gumové zátky, použila
} 36 }
jsem k napojení hadiček plastový spojovač hadiček. Pokud máme k dispozici celé gumové zátky, bylo by vhodné použít k napojení hadiček dostatečně širokou jehlu.
2.4 Další přístroje a zařízení • • • • • • •
Dávkovací pipety s nastavitelným objemem 1000 µl a 100 µl (Eppendorf, USA) pH-metr model 526 s kombinovanou elektrodou SenTix 41 (WTW, Německo) Ultrazvuková lázeň Sonorex RK 106 (Bandelin, Německo) Filtrační papír – Filtrak 390 (Německo) Centrifuga – Jouan BR4i (Francie) Spektrofotometr - PowerWave (Bio-Tek Industries) Přístroj pro měření obsahu uhlíku - LiquiTOCII (Elementar Analysensysteme, Německo)
3 Optimalizace izolace HS Pro veškeré optimalizační pokusy jsem si připravovala roztoky standardních HA (HA Fluka). Jelikož tato HA obsahuje cca 20 % popela, volila jsem navážky o 20 % vyšší pro dosažení požadované koncentrace. Koncentrace roztoků HA jsem měřila jako absorbanci při 300 nm. Připravovala jsem si vždy čerstvou kalibrační ředící řadu a podle ní jsem vypočítávala koncentrace. Zvolila jsem takzvanou trojkovou ředící řadu, to znamení, že koncentrace HA byly: 1,4 mg/l; 4,1 mg/l; 12,3 mg/l; 37,0 mg/l; 111,1 mg/l; 333,3 mg/l; 1000 mg/l Nejdříve jsem potřebnou navážku HA rozpustila v 0,05M NaOH. Pro dokonalé rozpuštění jsem použila ultrazvukovou lázeň. Roztok jsem centrifugovala a odebrala tak, aby nerozpuštěný popel zůstal na dně. Získaný roztok jsem vyřeďovala do 0,05M NaOH. Později jsem zjistila, že roztok NaOH také slabě absorbuje, proto jsem dále vždy roztok HA vyřeďovala do destilované vody a tu jsem také používala jako blank.
3.1 Optimalizace systému RO 3.1.1 Objem přístroje Do prázdného přístroje jsem z kalibrované nádoby nasávala vodu. Jakmile začal vytékat koncentrát i permeát (o chvilku později) odečetla jsem použitý objem vody. Koncentrát začal vytékat po nasátí 2,75 l vody a permeát po nasátí 3 l vody. Takzvaný mrtvý objem přístroje tedy je cca 3 l.
} 37 }
3.1.2 Zjišťování účinnosti RO pro koncentrování HS Plán: § § § §
Zakoncentrovat 10 l roztoku HS o koncentraci 4 mg/l Zjistit jaký vliv na výtěžnost má vyplachování koncentrátu z přístroje pomocí permeátu Vypočítat výtěžek RO Vypočítat rychlost produkce permeátu
Postup: 1. čištění Před použitím jsem přístroj propláchla cca 10 l destilované vody. Permeát jsem zachycovala do čisté nádoby pro další použití a koncentrát jsem vylévala do odpadu. 2. příprava roztoku HS Navážila jsem si 48 mg HA Fluka do Eppendorfovy zkumavky. Přidala jsem 1,5 ml 0,05 M NaOH a pro dokonalé rozpuštění jsem zkumavku dala na 15 minut do ultrazvukové lázně. Pro odstranění popela jsem nádobku chvíli centrifugovala. Obsah jsem poté pipetou přenesla do nádoby s 10 l destilované vody tak, aby popel zůstal na dně Eppendorfovy zkumavky. Obsah nádoby jsem zamíchala. Odebrala jsem 1 ml pro pozdější měření spektrofotometrií. 3. Reverzní osmóza Hadici, která vede k čerpadlu i tu, která odvádí koncentrát, jsem umístila do nádoby s roztokem HA. Permeát jsem jímala zvlášť pro pozdější použití. Spustila jsem čerpadlo. V pětiminutových intervalech jsem měřila vodivost roztoku v nádobě a občas také vodivost koncentrátu přímo na výtoku (viz Tabulka 4). Občas jsem také měřila přímo vodivost koncentrátu i permeátu na výtoku z hadiček. Vodivost permeátu se pohybovala kolem 2,5 µS/cm, ale po delším provozu přístroje ještě mírně klesla, asi na 2,1 µS/cm. Když v nádobě zbývalo asi 0,5 l roztoku, vypnula jsem čerpadlo a permeát, který ještě vytékal, jsem jímala do kádinky. Jeho objem byl 300 ml a konečná vodivost 12,2 µS/cm . Objem zbytku v nádobě byl 625 ml a jeho vodivost byla 13,6 µS/cm. Celkem jsem tedy získala 925 ml zakoncentrovaného vzorku.
} 38 }
Tabulka 4: Nárůst vodivosti koncentrátu Čas (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 37
vodivost (µS/cm) roztoku v zásobní nádobě 5,0 5,2 5,7 6,2 6,7 7,7 9,0 11,3 13,6
vodivost (µS/cm) koncentrátu na výtoku z hadičky 6,2 7,4 9
4. Vyplachování Jelikož v přístroji zůstalo ještě hodně zakoncentrovaného roztoku, pokusila jsem se ho vypláchnout získaným permeátem. Do něj jsem umístila přívodní hadici. Na jímání koncentrátu jsem si připravila 2 menší kádinky. Dále jsem si připravila větší nádobu, automatickou pipetu (1ml), 10 Eppendorfových zkumavek, které jsem umístila do stojánku, očíslovala (1 – 10) a otevřela. Spustila jsem čerpadlo, do první kádinky jsem najímala cca 200 ml koncentrátu a přehodila hadici do druhé. Z první kádinky jsem odebrala 1 ml do Eppendorfovy zkumavky a obsah nalila do větší nádoby. Mezitím nateklo do druhé kádinky cca 200 ml, přehodila jsem hadici do první, odebrala vzorek a přilila do větší nádoby. Takto jsem pokračovala až k desátému vzorku. Získala jsem 2 litry koncentrátu (přilila jsem je k 925 ml koncentrátu z RO) a 10 vzorků pro spektrofotometrii. Po vypnutí čerpadla samovolně vyteklo ještě 200 ml koncentrátu do první kádinky (vodivost 9,9) a ještě 400 ml jsem najímala do druhé kádinky (vodivost 7,4). U těchto dvou koncentrátů jsem také odebrala vzorky pro měření na spektrofotometrii. 5. čištění Na závěr jsem přístroj propláchla větším množstvím destilované vody. Vytékající koncentrát jsem po cca půl litru jímala na střídačku do dvou kádinek, měřila vodivost a vylévala do odpadu tak dlouho, až vodivost klesla na 2,1 µS/cm a dále se neměnila. 6. měření Do desky na spektrofotometrii jsem napipetovala již dříve připravenou koncentrační řadu HA. Do každé jamky jsem dala 200 µl roztoku. Dále jsem napipetovala po 200 µl od každého připraveného vzorku. Data z měření absorbancí jsem exportovala do MS Excell a vyhodnotila.
} 39 }
Výpočty: 1. výtěžnost: V MS Excell jsem podle kalibrace vytvořila graf závislosti absorbance na koncentraci roztoku HS. Podle něj jsem vypočetla koncentrace všech měřených vzorků (viz Tabulka 5). Získané hodnoty jsem využila pro výpočet výtěžností podle vzorce (Sun, Perdue et al. 1995): V = (Vkonc*Ckonc + Vv*Cv)/ Vpoč*Cpoč § § §
Vkonc a Ckonc je objem a koncentrace koncentrátu Vv a Cv je objem a koncentrace koncentrátu získaného vyplachováním Vpoč a Cpoč je počáteční objem a koncentrace.
Tabulka 5: Koncentrace roztoků HS vypočítané podle jejich absorbance při 300 nm Vzorek
Objem (l)
Počáteční roztok HA Koncentrát bez vyplachování Koncentrát z vyplachování Koncentrát vyteklý po vyplachování Směs koncentrátů (koncentrát bez a z vyplachování)
10 0,925 2 0,6 2,925
Koncentrace vypočítané měření absorbance (mg/l) 5,82 15,34 15,04 8,39 14,58
podle
Výtěžnost bez vymývání byla 24,4 % (zisk 0,925 l) a po vymývání 76,1% (zisk 2,925 l). V případě jímání samovolně vyteklého koncentrátu se výtěžnost ještě zvýšila na 84,7 % (zisk 3,525 l). 2. výkon RO Zajímá nás, kolik permeátu/koncentrátu přístroj vytvoří za určitý čas. Výrobce udává 7 litrů permeátu za hodinu v případě napojení na kohoutek veřejného vodovodu. Jelikož používáme čerpadlo, dosahujeme vyššího tlaku a tudíž i rychlejší produkce permeátu. Produkce permeátu:koncentrátu je podle výrobce 1:5. Za 37 minut se objem původního roztoku zmenšil na 0,625 l. To znamená, že bylo vyprodukováno 9,375 l permeátu a přístrojem proteklo 56,25 l vody, předpokládáme-li, že poměr produkce permeátu: koncentrátu je 1:5. Výkon přístroje tedy je 15,2 l permeátu za hodinu. Závěr: Tento pokus ukázal, že přístroj funguje, i když výtěžek by měl být ještě o něco vyšší. Literatura udává výtěžky přes 80 i 90 % DOM. Nejspíše tedy dochází k zadržení HA
} 40 }
v přístroji. Ukázalo se, že výkon přístroje je při použití čerpadla více než dvojnásobný oproti běžně používanému přímému napojení na vodovodní baterii. Následně jsem provedla ještě několik podobných pokusů pro potvrzení výsledků. Postupně mírně poklesla produkce permeátu a výtěžky HS se snižovaly. To signalizovalo usazování HS, nebo pravděpodobněji HS-minerálních komplexů v přístroji. Rozhodla jsem se přístroj důkladně pročistit zředěným roztokem NaOH, jelikož ten rozpouští jak HS, tak některé minerály (např. křemičitany) a také se běžně pro čištění používá. Zvolila jsem koncentraci 0,025 M NaOH a použila jsem 20 l. Z přístroje vytékal tmavě zbarvený koncentrát. Barva postupně bledla. Dále jsem přístroj proplachovala destilovanou vodou, dokud se pH na výtocích nevrátilo do neutrálních hodnot (kontrolováno orientačně pH papírkem). Po této zkušenosti jsem se rozhodla zbylý koncentrát z přístroje vyplachovat 0,025 M roztokem NaOH. § § § § § § §
Optimalizovaný postup vyplachování: v momentě, kdy je vzorek zakoncentrován na mrtvý objem přístroje (zásobní nádoba je téměř prázdná) vypneme čerpadlo a tím zastavíme RO: samovolně vyteče část koncentrátu připravíme si 2 l 0,025 M NaOH (navážka 2g) a tímto roztokem začneme přístroj vyplachovat koncentrát zachytáváme do pětilitrové nádoby jakmile se do přístroje nasaje všechen roztok NaOH, přehodíme rychle hadici vedoucí k čerpadlu do destilované vody a dále vyplachujeme koncentrát jímáme, dokud je tmavě zbarvený (cca 5 litrů) poté přístroj propláchneme větším množstvím destilované vody nebo permeátu koncentrát skladujeme v chladu
3.1.3 Odstraňování iontů Jak již bylo popsáno v teoretické části, systém RO koncentruje také anorganické součásti vzorku. Předpokládala jsem, že tyto budou odstraněny v procesu sorpce na DAX-8 pryskyřici. Bohužel, výsledný produkt obsahuje již po senzorickém zhodnocení značné množství popela. Proto jsem se rozhodla vyzkoušet katex pro odstraňování hlavních kationtů již v procesu RO. Použití katexu by mělo také urychlit RO a odstranit problémy s usazováním DOM-minerálních komplexů v přístroji. Jelikož v přístroji DEMOS 402 používáme čerpadlo, bylo nutné zařadit katex až nakonec všech modulů. To ovšem není problém, ionty se jen začnou odstraňovat až po prvním průtoku membránou. Z časových důvodů jsem zatím neprovedla žádný pokus s RO systémem se zařazeným katexem.
} 41 }
Obrázek 9 Systém RO se zařazeným katexem. 1 – přívodní hadice pro čerpání vzorku, 2,3,4 – komory s filtry (70, 5 a 1 mikrometrový filtr), 5 – modul s membránou, 6 – hadice odvádějící koncentrát do komor s katexem, 7- hadice odvádějící permeát, 8 – komory s katexem, 9 – hadice odvádějící odsolený koncentrát
3.2 Optimalizace sorpce na DAX-8 V době těchto optimalizací byl na pracovišti RECETOX zakoupen analyzátor obsahu uhlíku. Tento vysokoteplotní TOC analyzátor s IR detektorem umožňuje přímé měření obsahu organického uhlíku jak v pevných tak ve vodných vzorcích. Proto jsem k měření absorbance přidala také měření pomocí tohoto přístroje. 1. Příprava kolony Podle výše popsaného postupu jsem si připravila kolonu s objemem lože cca 20 ml. Pokud si připravujeme kolony dopředu, skladujeme je poté v lednici uzavřené těsnící zátkou. Při vytahování zátky většinou dojde k nasátí vzduchu do spodní části sorbentu a tím
} 42 }
ke vzniku bublin. Proto je dobré provádět zpětné promývání až těsně před použitím kolony a poté ji rovnou uzavřít zátkou s hadičkou. 2. Plnění sloupce • • • • • • • •
stříkačku jsem přesunula do aparatury pokusný roztok HA (koncentrát získaný z optimalizace RO o objemu V = 900 ml a koncentraci c = 37,44 mg/l ) jsem pomocí koncentrované HCl okyselila na pH 2 hadičku jsem ponořila až na dno pokusného roztoku HA spustila jsem čerpadlo a nastavila průtok přibližně na rychlost 8 loží za hodinu tak, aby v aparatuře příliš nevzrůstal podtlak jelikož čelo vzorku pomalu klesalo kvůli neúplně těsnící zátce, jednou za čas jsem ho doplnila zvednutím láhve se vzorkem nad stříkačku a povolením zátky plnění se nepovedlo zastavit včas, proto veškerý vzorek protekl přes sorbent plnění trvalo 5 hodin a 36 minut, rychlost plnění tedy byla cca 8 loží za hodinu eluát byl mírně zabarven, proto jsem se rozhodla použít ho jako vzorek pro další plnění 3. Vymývání
• •
do stříkačky jsem postupně nalila cca 50 ml 0,1M NaOH a nechala ho samospádem pomalu protékat do připravené zkumavky rychlostí cca 3 objemy lože za hodinu získala jsem 50 ml temně zbarveného roztoku: § 2 ml jsem dala stranou na měření TOC § k 0,1 ml jsem přilila 0,9 ml destilované vody a změřila pomocí spektrofotometrie § zbylých 48 ml jsem dala stranou pro vysrážení a lyofilizaci 4. Obnova sorbentu
• •
sorbent jsem ještě propláchla asi 50 ml 0,1M NaOH a poté jsem vyjmula horní fritu a provedla zpětné vymývání 750 ml destilované vody pro opětovnou stratifikaci a pro odstranění bublinek sorbent zůstal mírně zabarven 5. Druhé plnění
• • •
prázdnou láhev od vzorku jsem vypláchla a vyměnila za láhev s eluátem (V = 925 ml, c = 11,42 mg/l) spustila jsem čerpadlo a nechala vzorek kapat na sorbent rychlostí cca 9 – 10 loží za hodinu plnění jsem zastavila, když v láhvi zbývalo minimum vzorku 6. Druhé vymývání
• •
čelo vzorku jsem odpustila těsně nad sorbent do stříkačky jsem postupně nalila 40 ml 0,1M NaOH a nechala ho pomalu samospádem protékat do připravené zkumavky
} 43 }
• •
sorbent jsem vypláchla dalšími 50 ml 0,1M NaOH, které jsem zachytila do další zkumavky získala jsem 40 ml tmavě zbarveného roztoku a 50 ml světle zbarveného roztoku § 2 ml tmavšího roztoku jsem dala stranou pro měření TOC § zbylých 38 ml jsem dala stranou pro vysrážení a lyofilizaci 7. Srážení HA a lyofilizace
• • • • • • • • • •
roztoky HA v 0,1M NaOH z obou vymývání jsem okyselila pomocí koncentrované HCl na pH přibližně 1,3 HA se začaly srážet v podobě tmavých vloček, roztok byl stále zabarven zkumavky s roztoky jsem centrifugovala 5 minut při 2000 otáčkách, většina vloček se usadila supernatant jsem slila do dalších dvou zkumavek pelet prvních dvou zkumavek jsem promyla destilovanou vodu všechny 4 zkumavky jsem centrifugovala 5 minut při 4000 otáčkách z promytých HA jsem slila supernatant a dala do mrazáku na -80 °C pelet z druhých dvou zkumavek jsem promyla stejným způsobem a dala také zmrazit všechny zkumavky jsem umístila do lyofilizátoru po vymražení jsem získaný prášek HS zvážila 8. Výsledky a výpočty
a) Výtěžek první sorpce DAX-8 podle výsledků spektrofotometrie Počáteční koncentrace: Počáteční objem: Konečná koncentrace: Konečný objem: Objem eluátu: Koncentrace eluátu: Výtěžek Ztráty do eluátu
37,66 mg/l 900 ml 300,53 mg/ml 50 ml 925 ml 11,42 mg/l X = (300,53 * 50 / 37,66 * 900) * 100 % = 44,3 % Z = (11,42 * 925 / 37,66 * 900) * 100 % = 31,2 %
24,5 % HA bylo zadrženo v sorbentu
b) Výtěžek první sorpce DAX-8 podle výsledků měření TOC Počáteční koncentrace: Počáteční objem: Konečná koncentrace: Konečný objem: Výtěžek
26,18 mg/l 900 ml 280,15 mg/l (5*56,03) 50 ml X = (280,15 * 50/26,18 * 900) * 100 % = 59,5 %
} 44 }
c) Výtěžek první sorpce na DAX-8 včetně srážení HA a lyofilizace: Počáteční koncentrace podle TOC: Počáteční koncentrace podle spektrofotometrie: Počáteční objem: Konečná hmotnost: Konečná koncentrace vypočtená z hmotnosti HA: Konečný objem: Výtěžek podle TOC Výtěžek podle spektrofotometrie
26,18 mg/l 37,66 mg/l 900 ml 28 mg 560 mg/l 50 ml
X = (560 * 50 / 26,18 * 900) * 100 % = 118,8 % X = (560 * 50 / 37,66 * 900) * 100 % = 82,6 %
d) Výtěžek druhé sorpce DAX-8 podle výsledků měření TOC Počáteční koncentrace: Počáteční objem: Konečná koncentrace: Konečný objem: Objem eluátu: Koncentrace eluátu: Výtěžek Ztráty do eluátu
11,42 mg/l 925 ml 230,19 mg/l 40 ml 925 ml 6,10 mg/l X = (230,19 * 40 / 11,42 * 925) * 100 % = 87,2 % Z = (6,1 * 925 / 11,42 * 925) *100 % = 53,4
Tyto výsledky ukazují, že část HA z předchozí sorpce se ještě mohla uvolnit. To naznačují i následující výsledky. e) Výtěžek druhé sorpce DAX-8 včetně srážení HA a lyofilizace Počáteční koncentrace: Počáteční objem: Konečná hmotnost: Konečná koncentrace vypočtená z hmotnosti HS: Konečný objem: Výtěžek podle TOC
11,42 mg/l 925 ml 23 mg 460 mg/l 40 ml
V = (460 * 40 / 11,42 * 925) * 100 % = 174,2 %
3.3 Optimalizace celého procesu izolace HS Plán: § Provést všechny kroky od namíchání pokusného roztoku po získání pevných HA § Zjistit celkovou účinnost izolace HA i účinnost dílčích kroků
} 45 }
Postup:
3.3.1 Zakoncentrování roztoku pomocí RO a) příprava pokusného roztoku § Připravila jsem si 9 ml zásobního roztoku HS o koncentraci 10 mg/ml. Navážila jsem si 108 mg HS, přidala 4 ml destilované vody a 5 ml 0,1 M NaOH a dala rozpustit do ultrazvukové lázně § Z tohoto roztoku jsem si připravila jak kalibrační řadu pro měření spektrofotometrií § Ze stejného zásobního roztoku jsem si také připravila 40 l pokusného roztoku o koncentraci 2 mg/l (do 40 l destilované vody jsem dala 8 ml zásobního roztoku). Z tohoto jsem si odebrala 15 ml na měření spektrofotometrií a TOC. b) samotná RO § Hadici, která čerpá roztok, i tu, která odvádí koncentrát, jsem dala do nádoby s pokusným roztokem § spustila jsem čerpadlo § permeát jsem jímala do jiné nádoby. § v momentě, kdy byla nádoba téměř prázdná, jsem vypnula čerpadlo a tím zastavila RO: samovolně vyteklo 900 ml koncentrátu § připravila jsem si 2 l 0,025 M NaOH (navážka 2g) a tímto roztokem jsem začala přístroj vyplachovat § koncentrát jsem zachytávala do další nádoby § jakmile se do přístroje nasál všechen roztok NaOH, dala jsem čerpací hadici do 1 l destilované vody a dále jsem vyplachovala § získala jsem 2 l tmavě zbarveného roztoku § poté jsem přístroj propláchla větším množstvím destilované vody § z obou roztoků jsem si dala 15 ml stranou pro měření
3.3.2 Sorpce na DAX-8 a) plnění stříkaček § koncentrát z RO i roztok získaný vyplachováním přístroje RO jsem okyselila pomocí koncentrované HCl na pH 2,3 – 2,4 § připravila jsem si aparaturu (viz Obrázek 8) a umístila do ní 3 stříkačky s již dříve připraveným sorbentem § na stříkačky jsem nasadila těsnící špunty s hadičkou § jednu hadičku jsem ponořila do lahve s koncentrátem z RO (900 ml) a druhé dvě do roztoku získaného vyplachováním přístroje RO (2000 ml, rozděleno do dvou litrových lahví) § spustila jsem čerpadlo a nastavila průtok roztoků sorbentem na cca 10 loží za hodinu § jakmile byl roztok z některé lahve vyčerpán a jeho čelo ve stříkačce kleslo asi 2 -3 cm nad sorbent, zavřela jsem kohoutkem odtok z této stříkačky § po vyprázdnění všech lahví jsem vypnula čerpadlo § získala jsem cca 2,8 l eluátu, ze kterého jsem si odebrala 15 ml pro měření § v láhvích zůstal tmavý povlak HS, který jsem vypláchla 5 ml 0,1 M NaOH, doplnila na 15 ml pomocí destilované vody a uschovala pro měření
} 46 }
b) vymývání § čelo jsem samospádem pomalu odpustila až těsně nad sorbent § do každé stříkačky jsem opatrně nalila asi 30 ml 0,1 M NaOH § dále jsem odpouštěla, dokud nezačal odkapávat tmavší roztok § odpuštěnou část jsem přilila k eluátu § 0,1 M NaOH jsem nechala samospádem protékat sorbentem rychlostí cca 3 lože za hodinu; průběžně jsem doplňovala 0,1 M NaOH do stříkaček § roztok vymytých HS jsem jímala do 50 ml zkumavek § získala jsem 3 x 50 ml tmavého roztoku, z každého jsem dala 2 ml stranou pro měření a každý doplnila destilovanou vodou na 15 ml § sorbenty jsem rychle propláchla destilovanou vodou (objemem cca 10 loží) c) srážení a lyofilizace § 3 získané tmavé roztoky (50 ml) jsem okyselila pomocí koncentrované HCl na pH 1,09 až 1,14 § centrifugovala jsem je 5 minut při 4000 otáčkách na rotoru S40 § supernatant jsem slila a pelet jsem propláchla 45 ml destilované vody § znovu jsem centrifugovala 5 minut při 4000 otáčkách na rotoru S40 § supernatant jsem slila a pelet dala zamrazit § zkumavky jsem otevřela a dala lyofilizovat
3.3.3 Výpočty podle měření spektrofotometrií: Obecné vzorce X = (Vkonc * Ckonc + Vflush * Cflush) / (Vraw * Craw) * 100 % Kde X = výtěžek Vkonc a Ckonc = objem a koncentrace koncentrátu Vflush a Cflush = objem a koncentrace roztoku získaného vyplachováním Vraw a Craw = objem a koncentrace původního roztoku ZELU = ztráty do eluátu ZLAH = ztráty vysrážením HA v zásobních lahvích 1. Výtěžek RO Ø na počátku jsem měla 40 l roztoku o koncentraci 2 mg/l. Ø získala jsem 900 ml koncentrátu o koncentraci 33,57 mg/l Ø dále jsem získala 2000 ml roztoku HA po výplachu 0,025 M NaOH o koncentraci 24,83 mg/l X = (900 * 33,57 + 2000 * 24,83) / (40000 * 2) * 100 % = 99,8 %
} 47 }
2. Výtěžky a ztráty sorpce koncentrátu RO na DAX-8 Ø na sorbent jsem dala koncentrát (V = 900ml, c = 33,57 mg/l) a roztok HS získaný vyplachováním přístroje RO pomocí 0,025 M NaOH (V = 2000 ml, c = 24,83 mg/l). Ø získala jsem 3 tmavě zbarvené roztoky (V900,V1000a,V1000b = 50 ml; c900 = 290,75 mg/l, c1000a = 239,5 mg/l a c1000b = 85,75 mg/l) Ø získala jsem 3 l eluátu o koncentraci 3,4 mg/l výtěžek sorpce koncentrátu X900 = (50 * 290,75) / (900 * 33,57) * 100 % = 44,8 % výtěžky sorpce roztoku získaného vyplachováním pomocí 0,025 M NaOH X1000a = (50 * 239,5) / (1000 * 24,83) * 100 % = 48,2 % X1000b = (50 * 85,75) / (1000 * 24,83) * 100 % = 17,3 % celkový výtěžek sorpce na DAX X900+1000a+1000b = (50 * 290,75 + 50 * 239,5 + 50 * 85,75) / (900 * 33,57 + 2000 * 24,83) * 100 % = 38,6 % ztráty HA způsobené protékáním do eluátu a vysrážením části HS v zásobních lahvích ZELU = (3000 * 3,4) / (900 * 33,57 + 2000 * 24,83) * 100 % = 12,8 % ZLAH = (10 * 140,02) / (900 * 33,57 + 2000 * 24,83) * 100 % = 1,8 % Z výpočtů vyplívá, že 46,8 % HA zůstalo sorbováno na DAX-8. 3. Výtěžek srážení a lyofilizace HA Ø srážela jsem tři roztoky HS získané vymýváním sorbentu DAX (V900,V1000a,V1000b = 50 ml; c900 = 290,75 mg/l, c1000a = 239,5 mg/l a c1000b = 85,75 mg/l). Ø získala jsem 7, 10 a 3,5 mg HS, celkem tedy 20,5 mg HS. X = 20,5 / (0,05 * 290,75 + 0,05 * 239,5 + 0,05 * 85,75) * 100 % = 71,1 % 4. Výtěžek celého postupu Pokusný roztok jsem připravila z 8 ml zásobního roztoku (c = 10 mg/l), to znamená, že jsem použila 80 mg HS. Získala jsem 20,5 mg HS. X = (20,5 / 80)*100% = 25,6 %
} 48 }
3.3.4 Zjišťování opakovatelnosti postupu Plán: § Provést všechny kroky (od namíchání pokusného roztoku po získání pevných HA) a zjistit jejich opakovatelnost. § Doladit postup - vyřešit problémy protékáním HA do eluátu § Zjistit celkovou výtěžnost i výtěžky dílčích kroků § Porovnat výsledky měření pomocí TOCII a spektrofotometrie proměřením stejné kalibrační řady Postup: Postupovala jsem stejně, jako v předcházejícím pokusu. Postup obsahoval dvě drobné změny. Zaprvé jsem se pokusila zvýšit výtěžek sorpce na DAX-8 zvětšením objemu sorbentu z cca 20 ml na 35 ml. Výsledkem sice bylo mírné snížení ztrát HA do eluátu, ale výtěžek HA se také mírně snížil. To bylo způsobeno nejspíše zhoršeným vymýváním HA ze sorbentu. Proto jsem se pro příště rozhodla ponechat objem na 20 – 25 ml sorbentu pro sorpci podobně koncentrovaných roztoků HA. Druhá modifikace postupu spočívá v centrifugaci vysrážených HA jen ve dvou zkumavkách. Objem třetí zkumavky s vysráženými HA jsem poté přilila k jednomu z peletů a znovu centrifugovala. Snižují se tak ztráty při přesypávání pevných HA do skladovacích nádobek. Výpočty: Vypočetla jsem stejné výtěžky a ztráty. Navíc jsem přidala výpočty podle výsledků měření TOC. Výsledky shrnuje . Po proměření stejné kalibrační řady na analyzátoru TOC jsem zjistila, že výsledky pro nižší koncentrace nejsou zdaleka spolehlivé, jak ukazuje Tabulka 6. Teprve od koncentrace 12,4 mg HA/l vychází smysluplné výsledky, které ukazují, že obsah organického uhlíku v HA je průměrně 53,2 %. Pro dvě nižší koncentrace kalibrační řady vychází obsah organického uhlíku nesmyslně, proto jsem je nezahrnula do výpočtu průměrné koncentrace TOC v HA. Z těchto důvodů jsem výsledky pro výtěžky TOC přepočítala. Hodnoty, které podle měření TOC vyšli nižší než 20 mg TOC/l, jsem nahradila hodnotami z měření spektrofotometrií upravenými na TOC. Opravená data dávají srovnatelnější výsledky.
} 49 }
Tabulka 6 Porovnání koncentrací HA s hodnotami TOC. *Hodnoty nezapočítané do průměru. Koncentrace podle analyzátoru Koncentrace podle navážky HA TOC (mg TOC/l) (mg HA/l) % obsahu TOC v HA 5,35 1,37 390,4* 5,37 4,12 130,3* 7,95 12,35 64,4 16,87 37,04 45,6 55,97 111,1 50,4 159,18 333,3 47,8 578,51 1000 57,9 Průměrný obsah TOC v HA 53,2
Tabulka 7 Porovnání výtěžků dvou pokusů Výtěžek HA
RO Sorpce na DAX Ztráty do eluátu Srážení a lyofilizace Celkový hmotnostní
První pokus (spektrofoto metrie) 99,8 % 38,6 %
Druhý pokus (spektrofoto metrie) 89,3 % 31,6 %
Druhý pokus (měření TOC) 22,84 % 15,71 %
Druhý pokus (měření TOC, opravené hodnoty) 73 % 25,5 %
12,8 %
8,9 %
14,91 %
8,9 %
71,1%
44,1 %
113,13 %
64,5 %
25,6 %
10,5 %
10,5%
10,5 %
} 50 }
4 Reálné vzorky Hlavním cílem této diplomové práce bylo zavést izolační proces pro získání HS z vody. V této kapitole bych se chtěla věnovat popisu prvních čtyř izolací HS z reálných vod.
4.1 Plán Ø Provést všechny kroky izolace HS ze čtyř reálných vzorků povrchové vody různého typu. Ø Zjistit celkovou účinnost relativně optimalizovaného postupu pro izolaci HA a FA i účinnost dílčích kroků izolace HS. Ø Získat dostatečné množství HA pro jejich následnou charakterizaci a další využití.
4.2 Vzorkování Všechny vzorky byly odebrány do dvou 50l nádob z polyetylénu. V případě nabírání vzorků z mělkých vod jsem se snažila odebírat vodu bez zvířených sedimentů, z čistého vodního sloupce. Po odebrání byly vzorky pokud možno skladovány v chladu a zpracovány do druhého den, jedinou výjimku nedopatřením tvořila říční voda (odebrána ze Svratky), která stála dva dny uzavřená v nádobách při laboratorní teplotě.
4.2.1 Lokality Další fotografie lokalit a vzorkování s popisky je možno shlédnout v příloze.
Obrázek 10 11.3.2009 jsem odebrala 100 l povrchové vody zachycené v prohlubni po kolech těžké lesní techniky v malém údolí nedaleko obce Březina. Voda velmi pomalu prosakovala a protékala prohlubní a vyúsťovala do potůčku. Na první pohled obsahovala HS (žluté zbarvení), nejspíše vyplavené z lesní půdy po jarním tání. Ze vzorku jsem si uschovala 330 ml pro pozdější měření a uschovala v lednici.
} 51 }
Obrázek 11 17. 4. 2009 jsem odebrala 100 litů vody z rybníka v katastru obce Popůvky. Odběr jsem prováděla u břehu z povrchové vrstvy vody.
Obrázek 12 19. 4. 2009 jsem odebrala 50 l povrchové vody z kaluží mokřadu v blízkosti obce Loučky (Vílanec). Dalších 50 l jsem odebrala z potůčku tekoucího v těsné blízkosti mokřadu. Z obou vzorků jsem si uschovala 330 ml pro pozdější měření a umístila v lednici. Pro další postup jsem oba vzorky sloučila.
} 52 }
Obrázek 13 21. 4. 2009 jsem do dvou 50l nádob odebrala 100 l říční vody ze Svratky v Brně – Bystrci, nedaleko od jejího výtoku z přehrady. Ze vzorku jsem si uschovala 330 ml pro pozdější měření a umístila v lednici.
4.3 Postup izolace Všechny vzorky jsem zpracovávala obdobným postupem
4.3.1 Filtrace § Všechny vzorky jsem nejprve přefiltrovala přes hustou tkaninu § Jemnější filtrace probíhá v systému RO (viz 2.2 Systém reverzní osmózy v praktické části)
4.3.2 Reverzní osmóza § § § § § § § §
Hadici, která vede k čerpadlu, i tu, která odvádí koncentrát, jsem dala do nádoby se vzorkem spustila jsem čerpadlo permeát jsem jímala do jiné nádoby do zásobní nádoby se vzorkem jsem postupně přilévala z druhé nádoby v momentě, kdy v nádobě zbývalo co nejméně vzorku, jsem vypnula čerpadlo a tím zastavila RO; samovolně vyteklo malé množství koncentrátu připravila jsem si 2 l 0,025M NaOH (navážka 2 g) a tímto roztokem jsem začala přístroj vyplachovat jakmile se do přístroje nasál všechen roztok NaOH, zastavila jsem čerpadlo čerpací hadici jsem přesunula do nádoby s 2,5 l permeátu a dále jsem vyplachovala
} 53 }
§ § §
získala jsem celkem 5,3 l tmavě zbarveného koncentrátu (jen v případě koncentrování vody z rybníka jsem vymývání zastavila již po zisku 3,5 l koncentrovaného vzorku, jelikož dále vytékal velmi světlý koncentrát) poté jsem přístroj propláchla větším množstvím permeátu ze získaného koncentrátu jsem si dala 15 ml stranou pro měření TOC a uschovala v lednici
Pokud nenásledoval hned další krok izolace, jako v případě vzorků z mokřadu v Loučkách a ze Svratky, uschovala jsem koncentráty přes noc v lednici v 5l PET láhvi. V koncentrátu z mokřadu se vytvořila světlá sraženina, kterou jsem odstranila zfiltrováním přes papírový filtr. Z koncentrátu z rybníka se také vysrážely nějaké minerály, ale v podobě povlaku na vnitřním povrchu lahve. Koncentrát jsem opatrně slila a bílý povlak zůstal v láhvi.
4.3.3 DAX-8 procedura a) Přípravné kroky Koncentráty z RO jsem okyselila pomocí koncentrované HCl na pH 2,15 – 2,2. Jelikož v přírodních vzorcích se zkoncentrovaly i minerální látky, např. uhličitany, po přidání HCl roztok z Březiny intenzivně šuměl. Proto jsem musela přidávat kyselinu pomalu a vznikající bubliny řádně vytřepat. Koncentrát z rybníka šuměl méně, a ostatní dva již jen mírně, nejspíš díky odstranění části minerálů po skladování v lednici. Připravila jsem si kolony (viz 2.3.1 Příprava a použití DAX kolony). Pro všechny vzorky 6 kusů, jen koncentrát z rybníka jsem kvůli jeho nižšímu objemu i světlejšímu zabarvení sorbovala jen na 4 kolony. Zvolila jsem objem sorbentu 25-30 ml na jednu kolonu. Další postup již byl shodný pro všechny vzorky. b) Sorpce na DAX-8 § připravila jsem si aparaturu a umístila do ní kolony § na stříkačky jsem nasadila těsnící špunty s hadičkou. Hadičky jsem ponořila do lahví s okyseleným koncentrátem z RO § spustila jsem čerpadlo a nastavila průtok roztoků sorbenty na cca 10 loží za hodinu § jakmile byl roztok z některé lahve vyčerpán a jeho čelo ve stříkačce kleslo asi 2 -3 cm nad sorbent, zavřela jsem kohoutkem odtok z této stříkačky § po vyprázdnění všech lahví jsem vypnula čerpadlo § zapsala jsem si objem získaného eluátu § debrala jsem si 15 ml eluátu pro měření TOC a umístila v lednici c) Vymývání § § § §
všechny hadičky jsem přehodila do nádoby s 0,1 M NaOH čelo jsem opatrně odpustila až těsně nad sorbent dále jsem odpouštěla, dokud nezačal odkapávat tmavší roztok (u každé stříkačky individuálně) odpuštěnou část jsem přilila k eluátu
} 54 }
§ § § § §
pod stříkačky jsem umístila 6 (respektive 4) 50ml zkumavky 0,1 M NaOH jsem nechala protékat sorbentem rychlostí cca 3 lože za hodinu roztok vymytých HS jsem jímala do připravených 50ml zkumavek získala jsem 6 x (respektive 4x) 50 ml tmavého roztoku sorbenty jsem promyla 0,1 M NaOH a větším množstvím destilované vody d) Srážení a lyofilizace
§ § § § § § § § § §
6 (respektive 4) získaných tmavých roztoků (50 ml) jsem slila a okyselila pomocí koncentrované HCl na pH 1,14 do každé ze dvou zvážených zkumavek jsem nalila 50 ml roztoku se sraženými HS a centrifugovala 5 minut při 4000 otáčkách na rotoru S40 supernatant jsem slila a uschovala a k peletu jsem dala dalších 50 ml roztoku znovu jsem centrifugovala 5 minut při 4000 otáčkách na rotoru S40 supernatant jsem přilila k předchozímu a postup ještě jednou opakovala se zbytkem roztoku (kromě vzorku z rybníka) supernatant jsem opět slila a uschovala do každé zkumavky jsem přidala 50 ml destilované vody a důkladně protřepala centrifugovala jsem 5 minut při 4000 otáčkách na rotoru S40 světlejší supernatant jsem slila a uschovala zvlášť pelet jsem zamrazila a dala lyofilizovat
4.4 Měření Získané pevné HA jsem zvážila. Ze vzorku z rybníka jsem nezískala žádné HA, všechny HS zůstaly rozpuštěny v supernatantu z centrifugace. Z 1 mg získaných suchých HA jsem si připravila kalibrační ředící řadu o objemu 1 ml (1,4 až 1000 mg/l). Navážku jsem rozpustila v 0,5 ml M NaOH a dala rozpustit do ultrazvukové lázně a poté doplnila na 1 ml. Podle této kalibrační řady jsem vypočítávala koncentrace všech roztoků HS po měření spektrofotometií. Připravila jsem si také tři roztoky získaných HA pro měření TOC o koncentraci 129,03 mg/l a objemu 15,5 ml. Navážku 2 mg jsem rozpustila v 0,5 ml 0,05 M NaOH v ultrazvukové lázni. Roztok jsem doplnila destilovanou vodou na 15,5 ml. Roztoky jsem změřila pro zjištění obsahu TOC v získaných HA. Na spektrofotometru i analyzátoru TOC jsem dále změřila: • Všechny uschované původní vzorky • Koncentráty z RO • Koncentráty po sorpci DAX-8 • Eluáty ze sorpce na DAX-8 • Supernatanty po centrifugaci vysrážených HS a po promytí peletu
} 55 }
4.5 Výpočty a výsledky 4.5.1 Obecné vzorce X = (Vkonc * Ckonc + Vflush * Cflush) / (Vraw * Craw) * 100 % Kde X = výtěžek Vkonc a Ckonc = objem a koncentrace koncentrátu Vflush a Cflush = objem a koncentrace roztoku získaného vyplachováním Vraw a Craw = objem a koncentrace původního roztoku XHS = XHA + XFA Kde XHS = výtěžek HS XHA = výtěžek HA XFA = výtěžek FA ZELU = ztráty do eluátu ZPEL = ztráty při promývání peletu
4.5.2 Vzorek z Březiny
A. Výpočty podle měření koncentrací HS spektrofotometrií 1. Výtěžek HS po zakoncentrování pomocí RO Ø Na počátku jsem měla 100 l roztoku o koncentraci HS 18,25 mg/l. Ø Získala jsem 5,3 l koncentrátu o koncentraci HA 301,35 mg/l. X = (5,3 * 302,2) / (100 * 18,25) * 100 % = 87,76 %
Ø Ø Ø Ø
2. Výtěžky a ztráty HS po sorpci koncentrátu RO na DAX-8 a po rozdělení HS na HA a FA Na sorbent jsem dala koncentrát RO V = 5300 ml, c = 301,35 mg/l Získala jsem 2,625 l eluátu o koncentraci 44,31 mg/l a 2,625 l eluátu o koncentraci 92,06 mg/l Po srážení, centrifugaci a vymražení peletu jsem získala 79,7 mg HS a 300 ml supernatantu (= roztoku FA) o koncentraci 612,34 mg/l Po promytí peletu jsem získala dva supernatanty V1,2 = 50 ml; c1 = 237,69 mg/l a c2 = 208,25 mg/l.
XHA = 82 / (5,3 * 301,35) * 100% = 5,1 % XFA = (0,3 * 612,34 / 5,3 * 301,35) * 100 % = 11,5 % XHS = XHA + XFA XHS = [(82 + 0,3 * 612,34) / (5,3 * 301,35)] * 100 %= 16,6 %
} 56 }
Ztráty HS do eluátu a po promývání peletu ZELU = [(2,625 * 44,31) + (2,625 * 92,06)] / (5,3 * 301,35) * 100% = 22,4% ZPEL = [(0,05 * 237,69) + (0,05 * 208,25)] / (5,3 * 301,35) * 100% = 1,4 % Z DOM v koncentrátu RO jsem získala 5,1 % jako pevné HA, 11,5 % jako roztok FA. 22,4 % odešlo do eluátu a další 1,4 % tvořily ztráty při promývání HA. Z toho plyne, že 59,5 % DOM z koncentrátu zůstlo zachyceno na sorbentu.
3. Výtěžek HS celého postupu Ø Původní vzorek 100 l měl koncentraci 18,25 mg/l, to znamená, že obsahoval 1825 mg HS. Ø Získala jsem 82 mg pevných HA a 300 ml roztoku FA o koncentraci 612,34 mg/l, což odpovídá 183,7 mg FA XHA = (82 / 1825) * 100 % = 4,5% XFA = (0,3 * 612,34 / 1825) * 100 % = 10,1 % XHS = [(82 / 1825)] [(0,3 * 612,34 / 1825)] * 100 %= 14,6 % Z původní DOM jsem získala 14,6 % HS. Získané HS obsahují 30,9 % HA a 69,1 % FA.
B. Výpočty podle měření koncentrací TOC Po změření roztoku připraveného ze získaných pevných HA jsem zjistila, že HA obsahují 49,5 % TOC.
1. Výtěžek TOC po zakoncentrování pomocí RO Ø Na počátku jsme měli 100 l roztoku o koncentraci 39,1 mg TOC/l. Ø Získala jsem 5,3 l koncentrátu o koncentraci 405,30 mg TOC/l. X = (5,3 * 405,30) / (100 * 39,1) * 100 % = 54,9 % 2. Výtěžek TOC po sorpci na DAX a srážení + lyofilizace Ø Na sorbent jsem dala koncentrát RO V = 5300 ml, c = 405,30 mg/l Ø Získala jsem 2,625 l eluátu o koncentraci 130,72 mg/l a 2,625 l eluátu o koncentraci 181,69 mg/l. Ø Po vysrážení, centrifugaci a vymražení jsem získala 82 mg pevných HA a 300 ml roztoku FA (= supernatantu) o koncentraci 2556,85 mg TOC/l. Ø Po promytí peletu jsem získala dva supernatanty V1,2 = 50 ml o průměrné koncentraci = 693,017 mg/l XHA = 82 / (5,3 * 405,30) * 100 % = 3,1 % XFA = (0,3 * 2556,85 / 5,3 * 405,30) * 100 % = 35,7 % XHS = XHA + XFA
} 57 }
XHS = [82 / (5,3 * 405,30)] + [(0,3 * 2556,85 / 5,3 * 405,30)] * 100 %= 39,5 % ztráty DOC do eluátu a po promývání peletu ZELU = [(2,625 * 130,72) + (2,625 * 181,69)] / (5,3 * 405,30) * 100 % = 38,2 % ZPEL = (0,1 * 693,017) / (5,3 * 405,3) * 100 % = 3,2 % Z DOC v koncentrátu RO jsem získala 3,8 % jako pevné HA, 35,7 % uhlíku jako roztok FA. 38,2 % uhlíku odešlo do eluátu a další 3,2 % uhlíku tvořily ztráty při promývání HA. Z toho plyne, že 19,1 % DOM z koncentrátu zůstalo zachyceno na sorbentu.
3. Výtěžek celého postupu Ø Původní vzorek 100 l měl koncentraci 39,1 mg TOC/l, to znamená, že obsahoval 3910 mg TOC. Ø Získala jsem 82 mg HS a 300 ml roztoku FA o koncentraci 2556,85 mg/l Ø Z měření TOC získaných HA jsem zjistila, že obsahují 49,5 % TOC. XHA= (82 * 0.495 / 100 * 39,1) * 100% = 1,04 % XFA = (0,3 * 2556,85 / 3910) * 100 % = 19,6 % XHS = [(82 * 0,495) / 3910] + [(0,3 * 2256,85) / 3910] * 100 %= 20,7 % Z 3910 mg DOC v původním vzorku jsem získala 20,7 % uhlíku v podobě HS. HA tvoří 5,0 % získaných HS a FA zbylých 95,0 %.
4.5.3 Vzorek z Louček
A. Výpočty podle měření koncentrací HS spektrofotometrií 1. Výtěžek HS po zakoncentrování pomocí RO Ø Na počátku jsme měli 50 l roztoku o koncentraci 37,77 mg/l a 50 l roztoku o koncentraci 12,49 mg/ml Ø Získala jsem 5,3 l koncentrátu o koncentraci 211,91 mg/l. X = (5,3 * 211,91) / [ (50 * 37,77) + (50 * 12,49) ] * 100 % = 44,7 % Z původní DOM zůstalo v přístroji RO zachyceno 55,31 %. To naznačuje již velký problém. Adsorpce DOM a DOM-minerálních komplexů se zřejmě časem zrychluje, nejspíše proto, že se tyto agregáty snadněji tvoří samy na sobě, než na původních površích v přístroji RO. Po tomto pokusu bylo provedeno čištění filtrů pomocí ultrazvukové lázně. 2. Výtěžky a ztráty HS po sorpci koncentrátu RO na DAX-8 Ø Na sorbent jsem dala koncentrát RO V = 5300 ml, c = 211,91 mg/l Ø Získala jsem 300 ml roztoku o koncentraci 602,06 mg/l a 5,25 l eluátu o koncentraci 41,91 mg/l X = (0,3 * 602,06) / (5,3 * 211,91) * 100 % = 16,1 %
} 58 }
ztráty DOM do eluátu ZELU = (5,25 * 41,91) / (5,3 * 211,91) * 100% = 19,6 % Po vymytí HS z kolony jsem získala 16,1 % z původní DOM; 19,6 % z původního DOC odešlo do eluátu, to znamená, že 64,33 % zůstalo nevymyto či navázáno na sorbent. 3. Ø Ø Ø
Výtěžek rozdělení roztoku HS na pevné HA a roztok FA Srážela jsem 300 ml roztoku o koncentraci 602,06 mg/l Po vysrážení a lyofilizaci peletu jsem získala 37 mg HA Po vysrážení a centrifugaci jsem získala 300 ml supernatantu (= roztoku FA) o koncentraci 597,2 mg/l
XHA = (37 / 0,3 * 602,06) * 100 % = 20,5 % XFA = (0,3 * 597,2) / (0,3 * 602,06) * 100% = 99,2 % XHS = XHA + XFA XHS = [(37 + 0,3 * 597,2) / (0,3 * 1493,67)] * 100 % = 119,68 % Z těchto výsledků plyne, že měření koncentrací HS spektrometrií není vždy spolehlivé. 4. Výtěžek celého postupu Ø Původní vzorek 50 l o koncentraci 37,77 mg/l a 50 l roztoku o koncentraci 12,49 mg/ ml obsahoval 2513 mg HS Ø Získala jsem 37 mg HA a 300 ml roztoku FA o koncentraci 597,2 mg/l XHA = (37 / 2513) * 100% = 1,5 % XFA = (0,3 * 597,2 / 2513) * 100 % = 7,1 % XHS = (37 / 2513) + (0,3 * 597,2 / 2513) * 100 % = 8,6 % Z původní DOM jsem získala 8,60 % jako HS. HS tvoří 17,1 % HA a 82,9 % FA.
B. Výpočty podle měření TOC Z měření TOC získaných HA jsem zjistila, že obsahují 51,4 % TOC. V průběhu měření došlo k poruše analyzátoru obsahu uhlíku, jejíž odstranění si vyžádá několik týdnů. Přístroj se již několikrát ukázal jako velmi nespolehlivý a poruchový. Proto další výsledky nejsou kompletní. 1. Výtěžek TOC po zakoncentrování pomocí RO Ø Na počátku jsme měli 50 l roztoku o koncentraci 53,83 mg TOC/l a 50 l roztoku o koncentraci 17,38 TOC mg/ml Ø Získala jsem 5,3 l koncentrátu o koncentraci 177,11 mg TOC/l. X = (5,3 * 177,11) / [ (50 * 53,83) + (50 * 17,38) ] * 100 % = 26,4 % Z původní DOM zůstalo v přístroji RO zachyceno 73,64 %.
} 59 }
4.5.4 Vzorek ze Svratky
A. Výpočty podle měření koncentrací HS spektrofotometrií 1. Výtěžek HS po zakoncentrování pomocí RO Ø Na počátku jsem měla 100 l vzorku o koncentraci 11,07 mg/l . Ø Získala jsem 5,3 l koncentrátu o koncentraci 277,37 mg/l. X = (5,3 * 277,37) / (100 * 11,07) * 100 % = 132,8% Před RO jsem čistila filtry pomocí ultrazvukové lázně. HS se z filtrů uvolnili jen částečně, a to hlavně z povrchových vrstev filtru. V procesu koncentrace nebo vymývání pomocí roztoku NaOH se proto mohly z filtrů vymýt i usazeniny z hlubších vrstev filtrů uvolněné ultrazvukem. 2. Výtěžky a ztráty DOC při sorpci koncentrátu z RO na DAX–8 Ø Na sorbent jsem dala koncentrát RO V = 5300 ml, c = 277,37 mg/l Ø Získala jsem 300 ml roztoku o koncentraci 1493,67 mg/l a 5,25 l eluátu o koncentraci 70,70 mg/l X = (0,3 * 1493,67) / (5,3 * 277,37) * 100% = 30,5 % ztráty DOM do eluátu ZELU = (5,25 * 70,70) / (5,3 * 277,37) * 100% = 25,3 % Po vymytí HS z kolony jsem získala 30,5 % z původní DOM; 25,3 % z původní DOM odešlo do eluátu, to znamená, že 44,3 % zůstalo nevymyto či navázáno na sorbent. 3. Výtěžek rozdělení roztoku HS na pevné HA a roztok FA Ø Srážela jsem 300 ml roztoku o koncentraci 1493,67 mg/l. Ø Po vysrážení a lyofilizaci peletu jsem získala 16,9 mg HA a 300 ml supernatantu (= roztoku FA) o koncentraci 1366,26 mg/l. Ø Po promytí peletu jsem získala 100 ml roztoku o koncentraci 67 mg/l XHA = (16,9 / 0,3 * 1493,67) * 100 % = 3,8 % XFA = (0,3 * 1366,26 / 0,3 * 1493,67) * 100 % = 91,5 % XHS = XHA + XFA XHS = [(16,9 + 0,3 * 1366,26) / (0,3 * 1493,67)] = 95,2 % ztráty při promývání peletu ZPEL = (0,1 * 67) / (0,3 * 1493,67) * 100% = 1,5 % 4. Výtěžek celého postupu Ø Na počátku jsem měla 100 l vzorku o koncentraci 11,07 mg/l. Ø Získala jsem 16,9 mg HA a 300 ml roztoku FA o koncentraci 1366,26 mg/l. XHA = (16,9 /1107) * 100% = 1,5 % XFA = (0,3 * 1366,26 / 1107) * 100 % = 37,0 % HHS = (16,9 /1107) + (0,3 * 1366,26 / 1107) * 100 % = 38,6 %
} 60 }
Z původní DOM jsem získala 38,6 % jako HS, z toho 4 % jako HA a 38,6 % jako FA.
B. Výpočty podle měření TOC Z měření TOC získaných HA jsem zjistila, že obsahují 41,0 % TOC. Další data nejsou kvůli poruše analyzátoru uhlíku k dispozici.
Tabulka 8 Porovnání výtěžků HS a TOC ze tří vzorků reálných vod Výtěžek
RO Sorpce na DAX Ztráty do eluátu Srážení a lyofilizace Celkový o Z toho HA
Březina (spektrofot ometrie) 87,8 % 16,6 %* 22,4 % 16,6 %* 14,6 % 30,9 %
Svratka (TOC)
26,4 % ** ** **
Svratka (spektrofoto metrie) 132,8 % 30,5 % 25,3 % 95,2 %
** **
38,6 % 4%
** **
Loučky (TOC)
54,9 % 39,5 %* 38,2 % 39,5 %*
Loučky (spektrofoto metrie) 44,7 % 16,1 % 19,6 % 119,67 %
20,7 % 5%
8,6 % 17,1 %
Březina (TOC)
69,1 % 95 % 82,9 % o Z toho FA * pro tento vzorek sledován výtěžek obou kroků zároveň ** data chybí kvůli poruše analyzátoru obsahu uhlíku
** ** ** **
96 %
5 Testování toxicity dioxinového typu Jedním z cílů diplomové práce bylo otestovat získané HA na obsah dioxinově aktivních látek. Proto jsem provedla kapalinovou extrakci (LLE) dvou roztoků získaných HA (z Březiny a z Louček) a původní roztoky HA i roztoky po extrakci jsem předala vedoucímu diplomové práce k provedení in vitro biotestu založeném na buněčné linii H4IIE-luc. Po 24h expozici testovaným vzorkům HA byla stanovena luciferázová aktivita, která přímo odpovídá míře aktivace arylhydrokarbonového receptoru (AhR) vzorkem, tedy množství AhR-aktivních látek ve vzorku. Postup LLE: • izolovaný vzorek HA byl rozpuštěn v 0,05M NaOH v koncentraci 15 mg/ml v konečném objemu 0,5 ml • LLE byla provedena 3 x 2 ml roztoku dichlormethanu v hexanu v poměru 1:3 Cílem LLE byla extrakce nepolárních organických látek, které jsou známými induktory AhR a významnými, především antropogenními kontaminanty ŽP (např. PCBs a PAHs). Pokud by původní vzorek HA vykazoval významnou AhR-zprostředkovanou aktivitu,
} 61 }
pak bychom u vodné HA frakce po LLE očekávali snížení této aktivity, které by odpovídalo vyextrahování nepolárních dioxinově aktivních látek do organické frakce (roztok dichlormethanu v hexanu v poměru 1:3). Vzhledem ke skutečnosti, že žádná významná aktivita nebyla v původním vzorku HA zjištěna (viz Graf 27), pak by neměla být zjištěna ani žádná aktivita v testované vodné frakci HA po LLE, což bylo potvrzeno. Výsledkem měření je zjištění, že ve vzorcích HA izolovaných z vod u Březiny a Louček nebyla zjištěna statisticky významná AhR-zprostředkovaná aktivita, a to ani ve velmi vysokých koncentracích HA (nejvyšší testovaná koncentrace HA byla 150 mg/l). Vzhledem k těmto skutečnostem nebylo nutné provádět původně plánované chemické stanovení dioxinově aktivních látek ve vzorcích HA. Toto chemické stanovení by v případě zjištění významné AhR-zprostředkované aktivity vzorků HA v biotestu bylo provedeno v organické frakci získané LLE.
AhR-zprostředkovaná aktivita TCDD a vzorků HA ze ŽP 120
100
80
60
40
20
HA-BR [mg/l]
HA-BR - vodná frakce po LLE [mg/l]
Koncentrace
} 62 }
HA-LO [mg/l]
150
75
25
8
150
75
25
8
150
75
25
8
150
75
TCDD [pM]
25
EtOH
8
100
0 EtOH
Luciferázová aktivita (% TCDDmax indukce)
Graf 28 AhR-zprostředkovaná aktivita dvou vzorků HA izolovaných ze životního prostředí a příslušných vodných frakcí po LLE. Luciferázová aktivita vzorku odpovídá míře aktivace AhR testovanou látkou. EtOH - negativní kontrola; TCDD - pozitivní kontrola, koncentrace indukující maximální aktivaci AhR; HA-BR - vzorek HA v roztoku 0,05M NaOH, izolovaný z vody u Březiny, HA-LO - vzorek HA v roztoku 0,05M NaOH, izolovaný z vody u Louček; vodná frakce po LLE - frakce HA v roztoku 0,05M NaOH, ze které byly vyextrahovány nepolární organické látky (např. PCBs a PAHs) metodou kapalinové extrakce (LLE). Zobrazené hodnoty představují průměr a SD stanovení v triplikátu.
HA-LO - vodná frakce po LLE [mg/l]
6 Závěr Dosažené výsledky potvrzují možnost použití popsaných metod pro izolaci HS z povrchových vod. Na druhou stranu také ukazují, že všechny kroky nedosahují výtěžků popsaných v literatuře. V následující diskuzi se pokusím navrhnout možné důvody. Velká variabilita výtěžků RO (26,4 % – 132,8 %) byla nejspíše způsobena zanášením přístroje vysrážením HS-minerálních komplexů. Pro zvýšení výtěžků navrhuji použití katexu, které by mělo tuto situaci výrazně zlepšit a odstranit alespoň některé problémy spojené se zakoncentrováváním anorganických součástí vzorků. Také doporučuji pravidelné čištění přístroje pomocí zředěného roztoku NaOH a čištění filtrů pomocí ultrazvuku. Promyšlené, ale zatím nezrealizované, použití RO v terénu, umožní efektivně vzorkovat a zkoncentrovat také vody s nižším obsahem DOM, pro získání rozumných množství HS. Také odpadne doprava velkých kvant vzorků do laboratoře. Některé výsledky sorpcí koncentrátů z RO na DAX-8 pryskyřici ukazují nedostatečné vymývání zachycených HS. Vzorky jsem vymývala cca dvěma objemy lože 0,1 M NaOH. Literatura udává, že 95 % zachycených HS je vymyta 1-3 objemy lože (Thurman and Malcolm 1981). Podle vizuálního sledování barvy se většina HS vymývá již prvním objemem lože, poté už se vymývají jen velmi světlé roztoky HS. Výtěžky by se mohly zvýšit jejich jímáním. Dalším možným důvodem špatného vymývání může být jeho nevhodný směr. Proto by bylo vhodné upravit kolony pro umožnění vymývání v opačném směru. Odchod DOM do eluátu v rozmezí 19,6 – 38,2 % odpovídá prostudované literatuře. Do eluátu odchází nehuminové součásti DOM. Při srážení HA z roztoku získaného z DAX-8 pryskyřice dosahujeme na první pohled malých výtěžků, ale musíme si uvědomit, že HA tvoří menší součást HS. Literatura udává 3 % HA pro HS z málo humifikovanou DOM a 19 % HA pro HS s více humifikovanou DOM (Abbt-Braun, Lankes et al. 2004). Tento trend je možno vidět i na vybraných vzorcích, kdy nejvyšší zastoupení HA má vzorek z Březiny, který nejspíše obsahoval HS vyplavené z půdy. Nejnižší zastoupení HA mají HS z říční vody ze Svratky. I přes popsané drobné problémy doporučuji použití tohoto postupu pro izolaci HS z vody.
} 63 }
Reference: School of Chemical Science and Engineering (2008). Properties of Humic Substances in Inland Waters. URL: http://www.kth.se/che/divisions/inorg/research/1.19942?l=en_UK Abbt-Braun, G., U. Lankes, et al. (2004). "Structural characterization of aquatic humic substances - The need for a multiple method approach." Aquatic Sciences 66(2): 151170. Burba, P. and J. Van den Bergh (2002). "On-site classification of humic-rich hydrocolloids and their metal species by means of online multistage ultrafiltration." Environmental Science & Technology 36(19): 4114-4120. Ciavatta, C., M. Govi, et al. (1990). "Characterization of Humified Compounds by Extraction and Fractionation on Solid Polyvinylpyrrolidone." Journal of Chromatography 509(1): 141-146. Clair, T. A., J. R. Kramer, et al. (1991). "Concentration of Aquatic Dissolved Organic-Matter by Reverse-Osmosis." Water Research 25(9): 1033-1037. Croue, J. P., G. V. Korshin, et al. (2000). Comprehensive isolation of natural organic matter for spectral characterization and reactivity testing. Characterization of Natural Organic Matter in Drinking Water, American Water Works Association: 342. de la Rubia, A., M. Rodriguez, et al. (2008). "Removal of natural organic matter and THM formation potential by ultra- and nanofiltration of surface water." Water Research 42(3): 714-722. Del Vecchio, R. and N. V. Blough (2004). "On the origin of the optical properties of humic substances." Environmental Science & Technology 38(14): 3885-3891. Eisenberg, T. N. and Middlebrooks E.J (1986). Reverse osmosis treatment of drinking water. Boston, Butterworths. Everett, C. R., Y. P. Chin, et al. (1999). "High-pressure size exclusion chromatography analysis of dissolved organic matter isolated by tangential-flow ultrafiltration." Limnology and Oceanography 44(5): 1316-1322. Fang, H. H. P. and E. S. K. Chian (1975). "Criterion of Ion Separation by Reverse-Osmosis." Journal of Applied Polymer Science 19(10): 2889-2895. Fang, H. H. P. and E. S. K. Chian (1976). "Reverse-Osmosis Separation of Polar Organic Compounds in Aqueous-Solution." Environmental Science & Technology 10(4): 364369. Farnworth, J. J. (1995). Comparisons of the sorption from solution of a humic acid by Supelite DAX-8 and by XAD-8 resins. IHSS Newsletter. 8. Fireman, M. and R. C. Reeve (1948). "Some Characteristics of Saline and Alkali Soils in Gem County, Idaho." Soil Science Society of America Proceedings 13: 494-498. Gjessing, E. T., J. J. Alberts, et al. (1998). "Multi-method characterisation of natural organic matter isolated from water: Characterisation of reverse osmosis isolates from water of two semi-identical dystrophic lakes basins in Norway." Water Research 32(10): 31083124. Chen, J., E. J. LeBoef, et al. (2003). "Fluorescence spectroscopic studies of natural organic matter fractions." Chemosphere 50(5): 639-647. Chen, Y., N. Senesi, et al. (1977). "Information Provided on Humic Substances by E4-E6 Ratios." Soil Science Society of America Journal 41(2): 352-358.
} 64 }
Chow, A. T. (2006). "Comparison of DAX-8 and XAD-8 resins for isolating disinfection byproduct precursors." Journal of Water Supply Research and Technology-Aqua 55(1): 45-55. Chow, A. T., S. Gao, et al. (2005). "Physical and chemical fractionation of dissolved organic matter and trihalomethane precursors: A review." Journal of Water Supply Research and Technology-Aqua 54(8): 475-507. Kimura, K., H. Yamamura, et al. (2006). "Irreversible fouling in MF/UF membranes caused by natural organic matters (NOMs) isolated from different origins." Separation Science and Technology 41(7): 1331-1344. Koprivnjak, J. F., E. M. Perdue, et al. (2006). "Coupling reverse osmosis with electrodialysis to isolate natural organic matter from fresh waters." Water Research 40(18): 33853392. Lam, B. and A. J. Simpson (2006). "Passive sampler for dissolved organic matter in freshwater environments." Analytical Chemistry 78(24): 8194-8199. Leenheer, J. A. (1981). "Comprehensive Approach to Preparative Isolation and Fractionation of Dissolved Organic-Carbon from Natural-Waters and Wastewaters." Environmental Science & Technology 15(5): 578-587. Leenheer, J. A. (2009). "Systematic Approaches to Comprehensive Analyses of Natural Organic Matter." Annals of Environmental Science Vol 3: 1-130. Liikanen, R., H. Kiuru, et al. (2005). "Nanofiltration flux, fouling and retention in filtering dilute model waters." Desalination 175(1): 97-109. Maurice, P. A., M. J. Pullin, et al. (2002). "A comparison of surface water natural organic matter in raw filtered water samples, XAD, and reverse osmosis isolates." Water Research 36(9): 2357-2371. Meier, M., K. Namjesnik-Dejanovic, et al. (1999). "Fractionation of aquatic natural organic matter upon sorption to goethite and kaolinite." Chemical Geology 157(3-4): 275-284. Nagao, S. and T. Iwatsuki (2007). "Convenient characterization of humic substances in deep groundwaters by three-dimensional excitation emission matrix spectroscopy." Bunseki Kagaku 56(3): 143-150. Park, N., B. Kwon, et al. (2006). "Characterizations of the colloidal and microbial organic matters with respect to membrane foulants." Journal of Membrane Science 275(1-2): 29-36. Peuravuori, J., P. Ingman, et al. (2001). "Comparisons of sorption of aquatic humic matter by DAX-8 and XAD-8 resins from solid-state C-13 NMR spectroscopy's point of view." Talanta 55(4): 733-742. Peuravuori, J., R. Koivikko, et al. (2002). "Characterization. differentiation and classification of aquatic humic matter separated with different sorbents: synchronous scanning fluorescence spectroscopy." Water Research 36(18): 4552-4562. Peuravuori, J., T. Lehtonen, et al. (2002). "Sorption of aquatic humic matter by DAX-8 and XAD-8 resins - Comparative study using pyrolysis gas chromatography." Analytica Chimica Acta 471(2): 219-226. Peuravuori, J., V. Lepane, et al. (2004). "Comparative study for separation of aquatic humic substances by capillary zone electrophoresis using uncoated, polymer coated and gelfilled capillaries." Journal of Chromatography A 1023(1): 129-142. Peuravuori, J., A. Monteiro, et al. (2005). "Comparative study for separation of aquatic humic-type organic constituents by DAX-8, PVP and DEAE sorbing solids and
} 65 }
tangential ultrafiltration: elemental composition, size-exclusion chromatography, UVvis and FT-IR." Talanta 65(2): 408-422. Peuravuori, J., N. Paaso, et al. (1999). "Characterization of lake-aquatic humic matter isolated with two different sorbing solid techniques: pyrolysis electron impact mass spectrometry." Analytica Chimica Acta 391(3): 331-344. Qin, J. J., Y. M. Cao, et al. (2006). "Preparation of poly(ether sulfone) hollow fiber UF membrane for removal of NOM." Journal of Applied Polymer Science 99(1): 430-435. Reckhow, D. A., P. C. Singer, et al. (1990). "Chlorination of Humic Materials - by-Product Formation and Chemical Interpretations." Environmental Science & Technology 24(11): 1655-1664. Serkiz, S. M. and E. M. Perdue (1990). "Isolation of Dissolved Organic-Matter from the Suwannee River Using Reverse-Osmosis." Water Research 24(7): 911-916. Steinberg, C. E. W., S. Kamara, et al. (2006). "Dissolved humic substances - ecological driving forces from the individual to the ecosystem level?" Freshwater Biology 51(7): 1189-1210. Sun, L., E. M. Perdue, et al. (1995). "Using Reverse-Osmosis to Obtain Organic-Matter from Surface and Ground Waters." Water Research 29(6): 1471-1477. Thurman, E. M. and R. L. Malcolm (1981). "Preparative Isolation of Aquatic Humic Substances." Environmental Science & Technology 15(4): 463-466. Van Krevelen, D. W. (1993). Coal: Typology - Physics - Chemistry - Constitution, Elsevier Science. Waiser, M. J. and R. D. Robarts (2000). "Changes in composition and reactivity of allochthonous DOM in a prairie saline lake." Limnology and Oceanography 45(4): 763-774. Zsolnay, A. (1996). Dissolved humus in soil waters. Humic Substances in Terrestrial Ecosystems. A. Piccolo. Amsterdam: 171 - 224.
} 66 }
