Charakterizace, fyzikální a chemické, thiolových sloučenin Karel BASTL Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, 613 00 Brno, Czech Republic Seminární práce
1
Obsah Thiolové sloučeniny .............................................................................................. 3 Úvod ....................................................................................................................................................................... 3
Biologický význam thiolů ....................................................................................... 4 Fyzikální charakterizace ........................................................................................ 5 NMR spektroskopie ......................................................................................................................................... 5 IR spektroskopie ............................................................................................................................................... 5 Hmotnostní spektrometrie ........................................................................................................................... 6
Chemická charakterizace ....................................................................................... 8 Elektrochemické metody ............................................................................................................................... 8 Voltametrie a polarografie.............................................................................................................................. 8 Chromatografické metody ......................................................................................................................... 10
2
Thiolové sloučeniny TS Úvod Jako thiolové jsou označovány sloučeniny analogické alkoholům, když kyslík nahradíme sírou. Rozdílné vlastnosti mezi oběma skupinami lze vysvětlit rozdílným rozsahem možné oxidace obou klíčových prvků. Kyslík může nabývat oxidačního čísla –I nebo –II, zatímco síra jakéhokoliv od –II do +VI.
Příprava thiolů Nejvíce se používá SN2 reakce z thiomočoviny.
Liší se od alkoholů tím, že rozdíl elektronegativit mezi sírou a vodíkem není tak velký jako v případě kyslíku a vodíku v alkoholech. TS jsou daleko silnějšími kyselinami. pKa(ROS)=10 versus pKa(ROH)=16-19 Zároveň valenční elektrony síry jsou vzdálenější od jádra a tím jsou také thioly většími nukleofily. Síra jako element třetí řady periodické tabulky má pět volných d orbitalů, které mohou vytvářet rozmanité p-d vazby, podobné vazbě. Vzhledem k tomu , že vazba S-S je silnější než vazba O-O a zároveň vazba S-H slabší než O-H (přibližně o 25kcal/mol), podléhají thioly již mírné oxidaci ve vodném prostředí a vytváří disulfidy. Thioly se často dobře vážou, koordinačně kovalentní vazbou, ke kovům, především k takzvaným soft bazickým kovům, jako je Zn, Cd, Pd, Co. TS mají nižší bod varu než alkoholy, díky slabším vodíkovým vazbám.
3
Biologický význam thiolů Vlivem fyzikálních či chemických dějů dochází během nekompletní redukce molekulárního kyslíku na vodu, ke vzniku reaktivních kyslíkových radikálů, jakými jsou superoxidové radikály, peroxidy vodíku nebo hydroxylové radikály. Působením těchto vysoce reaktivních složek je buňka vystavena oxidativnímu stresu, který může vést k jejímu poškození, mutacím DNA a konečně i k jejímu usmrcení. Před těmito vlivy je nutné, aby se buňka chránila. Takovouto protektivní roli mají krom jiných antioxidantů i sulfhydrylové skupiny. Obecně lze říci, že thioly, proteiny s -SH skupinou, a neproteinové -SH skupiny (hlavně GSH) soutěží ve všech biologických prostředích v regulaci oxidantů. GSSG +PSH -> GSSP +GSH. Thiolové skupiny se mohou vzájemně oxidovat, resp. redukovat tak jak k tomu dochází například v endoplazmatickém retikulu při přenosu elektronu z molekulárního kyslíku, a následné oxidaci Ero1 (oxidáza endoplazmatického retikula).Tato oxidáza přenáší disulfidovou vazbu na PDI (protein disulfid izomeráza) a ta na substrátový protein. K tomu je nutný ještě kofaktor FAD. Výsledkem je úprava konformace substrátového proteinu vytvořením disulfidového můstku. TS mají enormní význam v biologických procesech především jako součást oxido redukčních dějů. Důležitá je vzájemná přeměna páru thiol-disulfid, stejně jako disulfidická vazba, která spojuje a stabilizuje terciální a kvartetní prostorové konformace bílkovin. (Harvey Lodish 2007) V eukaryotických buňkách může být disulfidická vazba vytvářena pouze v hrubém endoplazmatickém retikulu za přítomnosti vhodného oxidantu. Pro účinné vytvoření disulfidické vazby je nutný enzym protein disulfid isomerase PDI. Disulfidická vazba v aktivním místě PDI je přesouvána oxidačně redukčními reakcemi na další proteiny. Mezi významné biologické sloučeniny patří gluthathion, thioredoxin či metallothioneiny. Významná aminokyselina cystein, jež je součástí mnoha bílkovin je nejčastějším nositelem -SH skupiny v biologických systémech.
OH O
SH NH2
Figure 1.Cystein
4
Gluthathion (L-g-glutamyl-L-cysteinyl-glycine-GSH), je významný tripeptid složený z aminokyselin glycinu, kyseliny glutamové a cysteinu. Funguje v buňce jako antioxidant, detoxifikuje xenobiotika stejně jako těžké kovy. (Ondrej Zitka1) Při zvýšené stresové zátěži se zvyšuje koncentrace oxidovaného GSSG na úkor GSH. Další významnou sloučeninou je homocystein často spojovaný s kardiovaskulárními onemocněními nebo N-acetylcysteine, prekurzor GSH a agens používaná na léčbu bronchitidy. Mezi nejvýznamnější antioxidanty u savců patří významný thiol thioredoxin, udržovaný v redoxní formě pomocí thioredoxin reduktázy, dále rodina proteinů glutathion peroxidáz, které při své aktivitě využívají selen. Dalším důležitým antioxidantem je superoxid dismutáza, katalyzující přeměnu jednoho z nejnebezpečnějších oxidantů, superoxidu O2- na kyslík a peroxid vodíku. Superoxid totiž díky svému tripletovému stavu může reagovat, bud´s jinými radikály, včetně sebe sama, nebo s ionty kovů. Jsou známy tři typy SOD, lišící se typem kovu ve své struktuře.
Fyzikální charakterizace Pro zjištění chemického složení a vlastností thiolů jsou ideální spektroskopické metody.
NMR spektroskopie NMR spektroskopie využívá faktu, že některé izotopy s nenulovým celkovým nukleárním spinovým číslem, mohou být statisticky více orientovány ve směru silného magnetického pole (v jednotkách T). Po následném přesně definovaném radiofrekvenčním pulzu, můžeme těmito spinovými momenty pohybovat a měřit relaxační časy návratu spinů do rovnovážného stavu. TS mají specifické absorpční spektra a široký NMR signál. Můžeme použít jak H tak C signál. Vzhledem k nižší elektronegativitě síry je vodíkový signál, stejně jako signál na sousedním uhlíku méně odstíněn než v případě alkoholů a kyslíkového atomu. To se projevuje NMR signálem ve vyšším magnetickém poli. Příkladem použití NMR spektroskopie při určování 3D struktury je v (Pountney D.L.) K prostorovému rozlišení a přiřazení byla použita metoda HSQC po označení izotopem 15N. Pro přiřazení atomů podle vzdálenosti mezi nimi pomáhá nukleární Overhauserův efekt (NOE), který měří spin spinovou interakci mezi atomy, ne vzdálenými více než 3 angstrémy.
IR spektroskopie Ideálním nástrojem pro zjišt‘ování typu vazeb je IR spektroskopie, která umožňuje měřit rozdílné vibrační energie vazeb mezi atomy popřípadě celých funkčních skupin navázaných na atom v proteinovém řetězci. Za infračervenou oblast považujeme spektrum o vlnových délkách v rozmezí (2500-16000) nm. Je to energie, která 5
nemůže vyrazit elektron z orbitalu, ale je dostatečně velká na rozkmitání vazeb v molekulách. A tak největší frekvenci mají vazby vodíku a menší těžších atomů.
Funkční skupina
Charakteristická absorpce [1/cm]
S-H thiols
2550-2600
S-OR esters
700-900
S-S disulfide
500-540
C=S thiocarbonyl
1050-1200
S=O sulfoxide sulfone sulfonic acid sulfonyl chloride sulfate
1030-1060 1325± 25 & 1140± 20 1345 1365± 5 & 1180± 10 1350-1450
Zdroj: http://www2.chemistry.msu.edu/
Hmotnostní spektrometrie Využívá různé hybnosti částic se stejným nábojem, daného poměrem hmotnost/náboj m/Z. Nejdříve se musí převést studovaný komplex do plynné fáze a v elektromagnetickém poli za pomoci kvadropólových elektrod urychlit. Jen sloučeniny se specifickým poměrem m/Z dopadnou na určitá místa na obrazovce. Její novější podobou je elektrospray ionizovaná hmotnostní spektrometrie ESI-MS, která umožňuje lepší specifikaci jednotlivých fragmentů díky ionizaci menších částic. Využívá jevu takzvané coulombické exploze. Po několika fragmentacích na menší a menší kapky dojde k tomu, že povrchové napětí je překonáno coulombickým odpuzováním a kapička exploduje. Thioly se svojí snadnější ionizovatelností se jeví jako ideální molekulou k použítí ESI-MS.
6
Figure 2 ESI-MS
Výpočetní metody Vzhledem k tomu, že je často k dispozici struktura thiolů získaná z rentgenové krystalografie či NMR spektroskopie , nabízí se možnost namodelovat některé procesy in silico. Pro tento účel můžeme vybrat některý z přístupů pro molekulové modelování. Metodicky lze tyto přístupy rozdělit na kvantově mechanické, dále ty které používají molekulárně mechanických principů a nakonec těch vycházejících z Newtonových rovnic v molekulární dynamice. Můžeme použít kvantově mechanický výpočet ab initio nebo výpočet s určitým prvkem empiriky. Kvantově mechanický výpočet vychází z řešení Schrődingerovi rovnice s použitím několika přiblížení, protože tuto rovnici jinak nelze pro větší systém vyřešit. Primárním z těchto přiblížení je Born Openheimerovo přiblížení, které dovolí separovat pohyb „lehkých“ elektronů od poměrně relativně pomalého pohybu „ těžkých“ atomových jader. Popis interakcí je obsažen v Hamiltonově operátoru pro energii systému. Jemu potom odpovídají vlnové funkce charakterizující stav systému. Popis systému pomocí vlnových funkcí spočívá především v navržení vhodných bazí, popisujících jednotlivé atomové orbitaly, z nichž poté metodou LCAO zkonstruujeme molekulové orbitaly odpovídající popisu celé molekuly. Výběr setu základních vlnových funkcí ovlivní nejen jeho přesnost, ale také náročnost výpočtu. Musíme si uvědomit, že pro problém více těles neexistuje žádné přesné řešení. Využíváme varičního principu, který říká, že energie systému odpovídající určitému odhadu vlnové funkce bude vždy vyšší než u správné vlnové funkce. Vzhledem k snadné polarizovatelnosti a větší difuzivity orbitalů sulfhydrylových skupin je dobré využít minimálně báze vlnových funkcí se započtením tohoto vlivu jako je například 6-31+G*.
7
Chemická charakterizace Elektrochemické metody TS jsou díky rozsahu svého oxido redukčního porenciálu dobrým cílem pro studium pomocí elektrochemie. Známá je například Brdičkova reakce využívající kobaltitých a kobaltnatých komplexů k zjišt´ování koncentrací thioly-obsahujících proteinů, nebo Heyrovského katalytický pík H navržený ke stanovování koncentrací proteinů. Elektrochemické metody jsou využívány především pro svoji vysokou rychlost a relativní instrumentální nenáročnost. Horší je to už s jejich citlivostí, a selektivností při stanovení především organických látek v komplexním biologickém systému. Podstatou elektrochemických metod je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci. Objektem zkoumání je elektrochemický článek – soustava, v níž je analyzovaný roztok (elektrolyt) v kontaktu s elektrodami. Elektrody zprostředkovávají spojení elektrolytu s měřícím přístrojem, který sleduje některé z elektrických veličin (např. proud I, potenciál E, vodivost G, elektrický náboj Q, kapacitu C, aj.).(Jiří Barek 2005) Voltametrie a polarografie Voltametrie a její podskupina polarografie jsou elektrochemické metody založené na sledování závislosti intenzity proudu na velikosti proměnlivého napětí vkládaného mezi pracovní (polarizovatelnou) a referentní (nepolarizovatelnou). Vzhledem k rušivým jevům, jež plynuly z dvoulelektrodového zapojení (např. proudového zatížení referentní elektrody) se v dnešní době používá kromě pracovní a referentní i elektroda pomocná, pak mluvíme o tříelektrodové zapojení (Obr. 2). Jako pracovní elektrody se nejčastěji používají pevné SDME – pastová uhlíková elektroda, elektroda ze skelného uhlíku a elektroda z pyrolytického uhlíku nebo kovové, zlatá, stříbrná, platinová apod. Polarografie se vyznačuje tím, že používá rtut´ovou kapku jako pracovní elektrodu DME. Potenciál pracovní elektrody je kontrolovaný vůči elektrodě referenční, jež se vyznačuje konstantním potenciálem. Vlastní referentní elektroda je od měřeného roztoku oddělena solným můstkem. Nejčastěji se používá referentní elektroda argentchloridová (Ag/AgC l/3M KCl). Pomocná elektroda je převážně z ušlechtilého kovu (Au, Ag, Pt) z důvodu vysokého přepětí vodíku, což umožňuje pracovat při nižších potenciálech. Pro půchodu proudu zkoumaným vzorkem je nutná přítomnost elektroaktivní látky, tzv. depolarizátoru, jinak roztokem proud neprochází. Přítomnost depolarizátoru se
Figure 3 (Baumaister) Schéma zapojení tříelektrodového systému; (Baumaister) Schéma elektrolytické nádobky. Legenda: W – pracovní elektroda, R – referentní elektroda, A – pomocná elektroda, M - míchadlo, N2 – přívod inertního plynu. Převzato a 8 upraveno z (Markušová 2000)
projeví při určitém potenciálu, při kterém dochází k oxidaci nebo redukci depolarizátoru, popřípadě změnou kapacity na elektrodové dvouvrstvě, a to změnou protékajícího proudu. Platí, že elektrodové děje (oxidace anebo redukce) způsobují změny jen ve velmi těsné blízkosti povrchu polarizovatelné elektrody o malém povrchu. Samotný elektrodový proces zahrnuje děje spojené s transportem elektroaktivní látky (analytu) k elektrodě, vlastním elektrodovým dějem a vylučováním produktu na elektrodě, případně jeho transportem od elektrody.Transport elektroaktivní látky k povrchu elektrody je zprostředkován především difuzí podle Fickových zákonů v závislosti na změně koncentrace látky a elektrickou migrací nabitých částic vlivem elektrického pole. Cílem elektrochemické detekce je zjištění koncentrace elektroaktivní látky. Snažíme se tedy potlačit vliv elektrické migrace například naředěním nosným elektrolytem. Převážnou část náboje pak přenášejí ionty nosného elektrolytu a migrace elektroaktivní látky je zanedbatelně malá. Současně je tím významně snížen i elektrický odpor roztoku, vytvoří se konstantní iontová atmosféra . V případě některých vzorků je nezbytné před samotným měřením odstranit z nosného elektrolytu veškerý kyslík, neboť jeho vylučování na povrchu elektrody může znemožnit detekci ostatních elektroaktivních látek přítomných v roztoku, protože se sám zúčastňuje elektrodové reakce. Odstranění kyslíku se provádí probubláváním roztoku inertním plynem (např. dusík, argon). Dosáhne-li potenciál polarizovatelné (pracovní) elektrody hodnoty rozkladného potenciálu elektroaktivní látky (vzhledem k potenciálu elektrody referentní), začne se tato látka vylučovat na povrchu elektrody a její koncentrace v blízkosti elektrody poklesne. Vylučovat se přitom může jen ta látka, která se nachází v těsné blízkosti od povrchu elektrody a tam se dostane difúzí (migrace je eliminována přítomností nosného elektrolytu). Proto je procházející proud označován jako difúzní. Zvyšuje-li se dále vložené napětí, narůstá vylučování elektroaktivní látky až do doby, dokud sa nevyloučí všechny částice elektroaktivní látky, která je v blízkosti elektrody. Tím klesne koncentrace elektroaktivní látky u povrchu elektrody na nulovou hodnotu. Zvyšování napětí již neurychluje její vylučování. Proud dosáhl hodnoty limitního difúzního proudu. Jeho velikost je určena rychlostí difúze elektroaktivní látky k povrchu elektrody, a je přímo úměrná její koncentraci. Elektroda se polarizovala koncentrační polarizací.(Markušová 2000) Proudová odezva při polarizaci elektrody (i aplikaci napěťového pulzu na elektrodu) je komplikována existencí kapacitního proudu ic, který je potřebný k vytvoření elektrické dvouvrstvy na rozhraní elektroda – roztok a nabití elektrody na požadovaný potenciál. Tento typ proudu závisí na vkládaném napětí, na velikosti elektrody a na povaze základního elektrolytu, nesouvisí tedy s přeměnou elektroaktivní látky. U DME dochází k neustálému obnovování povrchu, a proto se musí každá kapka nabít na daný potenciál, a tak vzniká kapacitní proud. IC je funkcí vloženého potenciálu, velikosti měnícího se povrchu kapky a povahy základního elektrolytu., klesá exponenciálně s časem.48 Tento proud snižuje citlivost měření, neboť zkresluje hodnotu limitního difúzního proudu Difuzní proud (Maha Saad) má faradaický charakter a je rozhodující pro stanovení koncentrace depolarizátoru. Jeho velikost je dána velikostí náboje vyměňovaného mezi polarizovanou elektrodou a roztokem za jednotku času. V případě sférických elektrod je velikost tohoto proudu Cottrellovou rovnicí (Markušová 2000):
9
kde n je počet elektronů účastnících se elektrodové reakce, F Faradayova konstanta, D difúzní koeficient, A plocha elektrody, c koncentrace depolarizátoru, t doba pulzu, r poloměr elektrody. 2.5.6.2 Diferenční pulzní polarografie Nevýhody měnícího se povrchu kapky se částečně zbavíme při diferenční pulzní polarografii (DPP) a voltametrii (DPV). Při těchto metodách jsou aplikovány napěťové pulsy o délce tp s konstantní amplitudou ( Δ E). Napěťový pulz je aplikován ke konci doby života kapky. Registruje se rozdíl proudů (Δi = ib – ia), které jsou měřeny před vložením napěťového pulsu (časový interval ta) a těsně před koncem tohoto pulsu (časový interval tb). U diferenční pulzní polarografie/voltametrie má závislost proudu na napětí tvar píku. Při DME je doba kapky seřízená na určitý čas kratší než přirozená doba kapky. Délka doby kapky se užívá obvykle 2 až 3 s, přičemž pulz je vložen na kapku ve stejnou dobu jejího trvání. Je důležité použít co nejkratší dobu k měření, aby byla získána co největší proudová odezva, ale současně dostatečně dlouhou dobu, aby byl kapacitní proud nízký (klesá rychleji než faradický). Doba pulsu se využívá řádově desítky ms. Velikost amplitudy se v praxi obvykle používá 10 až 100 mV. 48 V případě DPV kapka neodkapává a celé měření probíhá na jedné visící rtuťové kapkové pracovní elektrodě (HMDE).
Chromatografické metody HPLC je nejčastěji používaná metoda pro zjištění koncentrace thiolových sloučenin. Lze využít výhodně dobré vaznosti sulfhydrylové skupiny k těžkým kovům například k zlatu a sestavit kolonu tak, aby vychytávala thiolové sloučeniny na zlatých částicích. Po navázání thiolů na pevnou fázi dojde k její modifikaci a vymití mobilní fáze následuje detekce. Chromatografie pak může být spojena s UV, fluorescenční či elektrochemickou detekcí. Pro ochránění SH skupiny před oxidací lze použit derivatizační sloučeniny, jež mohou zároveň dávat fluorescenční signál jako například g 9-Acetoxy-2-(4-(2,5dihydro-2,5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl)phenyl)-3-oxo-3H-naphtho[2,1-b]pyran (ThioGloE3). (Nuran Ercal 2001) Často se používý v tandemu metoda HPLC a ESI-MS.
Reference: Baumaister, W. (2005). "A voyage to the inner space of cells." Protein science 14.
10
Edina Rosta, M. H., Zhen T.Chu,Arieh Warshel (2008). "„Acceleratig QM/MM Free Energy Calculations: Representing the Surroundings by an IUdates Mean Vharge Distribution.“." The Journal of PhysicalChemistr 112(18). Harvey Lodish, A. B., Chris A.Kaiser, Monty Kriegr (2007). Molecular cell biology. New York, W.H.Freeman and Company. Jiří Barek, F. O., Karel Štulík (2005). Elektroanalytická chemie, Univerzita Karlova. Maha Saad, O. B. G., Tamata Minko (2008). "Co-delivery of si RNA and an anticancer drug for treatment of multidrug resistant cancer." Nanomedicine: 761-776. Markušová, K. (2000). Elektrochemické metódy. Košice, Univerzita Pavla Jozefa Šafárika Nuran Ercal, P. Y., Nukhet Aykin (2001). "Determination of biological thiols by high perfomance chromatography following derivatization by ThioGlo malimide reagents." Journal of Chromatography 753: 287-292. Ondrej Zitka1, Dalibor Huska1, Sona Krizkova1, Zuzana Horakova3, Vojtech Adam1, Hana Binkova3, Libuse Trnkova4, Ales Horna5, Miroslava Beklova6, Rene Kizek1* "An investigation of glutathione platinum (II) interactions by means of the floe injection analysis using glassy carbon electrode." Pountney D.L., F. S. M., Faller P., Birchler N.E., Hunziker P.,Vašák M. " Isolation, primary structures and metal binding properties of neuronal growth inhibitory factor from bovine and equine brain FEBS." FEBS Lett. 345: 192-197.
11
