Příloha 2. Návod pro laboratorní úlohu VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN Technická 5, 166 28 Praha 6 tel./fax.: + 420 224 353 185;
[email protected]
Analýza karotenoidů v rajčatech technikou HPLC/DAD
ANALÝZA KAROTENOIDŮ V RAJČATECH TECHNIKOU HPLC/DAD 1. Vymezení oboru metody Cílem této úlohy je seznámit studenty s aplikací techniky HPLC-DAD při sledování hladin biologicky aktivních látek - karotenoidů v rajčatech. Metoda je vhodná také pro stanovení obsahu karotenoidů ve výrobcích z rajčat. Předmětem sledování jsou hlavní karotenoidy rajčat lykopen a β-karoten. Obsah lykopenu a β-karotenu je významným ukazatelem kvality a vyzrálosti rajčat. Vedoucí úlohy nejprve shrne základní informace o aplikačním potenciálu techniky HPLC-DAD a poté bude demonstrovat funkci instrumentu. Studenti pak pod dohledem pedagoga provedou vlastní analýzu. Rozsah úlohy určí vyučující. Diskutována bude interpretace získaných záznamů a odhad pracovních charakteristik postupu. Zjištěné hladiny karotenoidů budou diskutovány s údaji v literatuře. 2. Princip metody Lykopen a β-karoten jsou z rajčat a výrobků z rajčat extrahovány směsí ethanol (s přídavkem 0,2% BHT) : hexan. Spojené hexanové extrakty jsou po odpaření rozpuštěny ve směsi aceton : ethanol (s 0,2% BHT) a karoteniody stanoveny metodou HPLC v reverzní fázi s DAD detekcí vč viditelné oblasti. 3. Chemikálie a laboratorní pomůcky Chemikálie, spotřební materiál, standardy • • • • • • • • • •
Aceton, p. a. (Penta Chrudim, Česká Republika) Acetonitril, Chromasolv (Sigma – Aldrich, Německo) Butylhydroxytoluen (Sigma – Aldrich, Německo) Ethanol, p. a. (Merk, Německo) Hexan, LiChrosolv (Merk, Německo) Methanol, LiChrosolv (Merk, Německo) Síran sodný, p. a. (Penta Chrudim, Česká Republika) Tetrahydrofuran, p. a. (Merk, Německo) Mikrofiltry Rotilalo Spritrenfilter PTFE 5µm, (Carl Roth GmbH, Německo) Běžné laboratorní sklo
Analytické standardy : - β-karoten (Sigma – Aldrich, Německo) - lykopen (Rotichrom, Německo) Příprava zásobních roztoků standardů 4-5 mg β-karotenu bylo rozpuštěno v 25 ml směsi aceton:ethanol (s 0,2% BHT) 4:6 (v/v). Tento zásobní roztok byl pak podle potřeby dále ředěn. Vzhledem k nestabilitě karotenu je nutno před každým stanovením připravovat vždy nový standard a chránit jej před světlem.
4-5 mg lykopenu bylo rozpuštěno v 10 ml směsi aceton:ethanol (s 0,2% BHT) 4:6 (v/v). Vzhledem k nestabilitě lykopenu je nutno před každým stanovením připravovat vždy nový standard a chránit jej před světlem. Přístroje a zařízení • Laboratorní homogenizátor 38BL40, Dynamics Corporation of America • Ultrazvuková lázeň • Topné hnízdo, LTHS 100, Brněnská Drutěva v.d. • Rotační vakuová odparka Büchi Rotavapor R-114 s vodní lázní B-480, (Švýcarsko) • Automatická SPE: Aspec XL, Gilson, Francie • Kapalinový chromatograf HP 1200 (Hewlett-Packard, USA) s DAD a FLD detektorem • Vakuová pumpa Vacc-Space 20 (Chromservis, Slovensko) • Váhy - Analytické váhy GR-202-EC (e = 1 mg, d = 0,01/0,1 mg) (AND, Japonsko) - Elektronické předváhy HF 1200G (e = 0,1 g, d = 0,01g) (AND, Japonsko) • Rotační vakuová odparka (BÜCHI Laboraltechnik AG, Švýcarsko) • Třepačka HS 250 basic – IKA Labortechnik (IKA Werk, Německo) • Halogenový analyzátor HG-63 (Mettler-Toledo, Švýcarsko) • Sušárna ULE 500 (Memmert, Německo) • Ultrazvuková lázeň - Bandelin Sonorex Super RK 510 (Bandelin, Německo) • Zařízení na úpravu destilované vody, Milli - Q RG (Millipore, Francie) •
Analytická kolona a předkolona pro kapalinovou chromatografii: LiChroCART (125×4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm); Guard columm LiChroCART (4×4 mm), LiChrospher 100; Merck, Německo
4. Popis jednotlivých kroků experimentu Příprava vzorku V důsledku nízké stability analytů (zejména lykopenu) byly vzorky v průběhu manipulace chráněny pomocí aluminiové fólie a skladovány v mrazicím boxu. 5 g homogenizovaných rajčat (mražených) bylo extrahováno směsí ethanol (Merk, s přídavkem 0,2% BHT) : hexan (Merk) (40 : 30) s 15 g Na2SO4 na třepačce rychlostí 210 kyvů/min. po dobu 30 minut. Vzniklý homogenát byl přefiltrován přes fritu s filtračním papírem č. 390 a filtrační koláč promyt extrakčním činidlem. Poté byla provedena separace pomocí dělící nálevky. Byla odebrána hexanová vrstva a ethanolický podíl byl ještě jednou reextrahován 30 ml hexanu. Spojené hexanové extrakty byly odpařeny na vakuové rotační odparce (40 °C) a odfoukány pomocí N2 do sucha. Odparek byl skladován při -18 °C. P řed analýzou byl rozpuštěn v 5 ml směsi aceton : ethanol (s 0,2% BHT) 4 : 6. Byly použity tmavé vialky jako ochrana před UV zářením. HPLC-DAD analýza Parametry separace (HP 1200) • analytická kolona: MERCK, LiChroCART (125×4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) • analytická předkolona: MERCK, LiChroCART (4×4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) • teplota kolony: 35 °C • mobilní fáze: MeOH:THF (95 : 5 v/v) • průtok: 1 ml/min
•
nástřik: 20 µl
Nastavení DAD detektoru Karotenoidy byly detekovány pomocí DAD detektoru při vlnové délce 450 a 470 nm. Na obrázku (obr. 1) jsou znázorněny absorpční spektera sledovaných karotenoidů. Během jednotlivých analýz bylo snímáno celé UV/VIS spektrum (200-600 nm). DA D1, 20.874 (37.9 mA U, - ) of LY COP101.D
DA D1, 24.118 (226 mA U, - ) of LY COP102.D
mA U
mA U 225
35 200
30 175
25
150
125
20
100
15 75
10 50
5
25
0
0
250
300
350
400
450
500
550
nm
250
300
350
400
450
500
550
nm
Obrázek 1 Absorpční spektrum lykopenu a β -karotenu 5. Vyhodnocení naměřených dat Identifikace β-karotenu a lykopenu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčních časů vzorku s retenčními časy standardů. Kvantifikace analytů byla provedena přímým porovnáním ploch standardů s plochami příslušných analytů identifikovaných v analyzovaných vzorcích. Pro zjištění kalibrační závislosti a její linearity byly analyzovány roztoky standardu β-karotenu o koncentraci analytu 0,05; 0,2; 0,5; 2; 5; 10 µg/ml a standardu lykopenu o koncentraci analytu 0,2; 0,5; 2; 5; 20; 50; 200 µg/ml. Bylo zjištěno, že kalibrační křivka standardu β-karotenu je v celém sledovaném rozmezí lineární. Kalibrační křivka lykopenu je lineární v rozmezí koncentrací 2-200 µg/ml. 6. Stanovení pracovních charakteristik (výsledky validace) Opakovatelnost metody byla stanovena na rajčatech zakoupených v tržní síti, pro pět paralelních stanovení. Opakovatelnost metody stanovení lykopenu a β -karotenu vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka je 7,8 % pro lykopen 8,7 % pro β-karoten. Výtěžnost metody byla stanovena pouze pro β-karoten z důvodu velmi malého množství komerčně dodávaného standardu lykopenu. Výtěžnost metody stanovená ve třech opakováních na hladině přídavku β-karotenu 6 mg/kg je 103%. Mez detekce metody byla určena jako nejnižší množství stanovovaného analytu ve vzorku, které může být detekováno, tj. trojnásobek šumu. Byla stanovena mez detekce 0,2 mg/kg pro βkaroten a 0,1 mg/kg pro lykopen.
Příklad analýzy reálných vzorků Na obr. 2 je uveden chromatogram vzorků rajčat v různém stadiu zralosti.
VWD1 A, Wavelength=470 nm (LYCOPEN\50118061.D) VWD1 A, Wavelength=470 nm (LYCOPEN\50118062.D) mAU
80
lykopen
70
60
50
β-karoten
40
30
červené rajče 20
zelené rajče
10
0 6
8
10
12
14
16
min
Obrázek 2 Chromatogram srovnávající vzorky různého stupně zralosti: zralé červené rajče a nezralé zelené rajče
