Pengertian Strain Improvement Strain Improvement (Pemuliaan Galur) Mikroorganisme Produktif Marlia Singgih Wibowo
• Dalam bidang pertanian, perkebunan : pengembalian sifat asli tanaman • Dalam bidang mikrobiologi : usaha peningkatan produktivitas atau perubahan sifat suatu galur mikroorganisme
Tujuan Strain Improvement • • • •
Meningkatkan produktivitas Menghilangkan ko‐metabolit yang tidak diinginkan Memperbaiki penggunaan sumber karbon dan nitrogen Memperbaiki morfologi sel menjadi bentuk yang lebih baik dalam rangka memudahkan pemisahan mikroorganisme tsb dengan produknya
Proses umum • •
•
Induksi variasi genetik dalam populasi sel dari mikroorganisme yang dipilih Proses Fermentasi dalam skala lab dilakukan terhadap beberapa individu terpilih dalam populasi tersebut Melakukan analisis (assay) setelah proses fermentasi tersebut untuk mengidentifikasi galur yang dapat di mutasikan
Cara untuk meningkatkan produktivitas mikroorganisme industri
• • •
Optimasi kondisi lingkungan Optimasi nutrisi mikroorganisme Modifikasi genetik : Mutasi, rekombinasi, kloning gen
Optimasi nutrisi mikroorganisme • • • • •
Sumber karbon Sumber nitrogen Sumber mineral dan sumber nutrisi lain Penambahan prekursor Bantuan enzim
Optimasi kondisi lingkungan • Modifikasi parameter fisika (suhu, agitasi, dll) • Modifikasi parameter kimia (pH, kadar O2, dll) • Modifikasi parameter biologi (ko‐kultur, enzim, dll)
MUTAGENESIS • Mutagenesis adalah suatu usaha pemuliaan galur mikroorganisme dengan cara memberi perlakuan tertentu terhadap sel mikroorganisme sehingga terjadi perubahan dalam genotip maupun fenotipnya • Mutasi yang terjadi dapat terjadi secara random atau terarah
Prosedur mutagenesis • Mutasi : fisika, kimia atau kombinasi keduanya • Fusi protoplas • Rekombinasi • Kloning gen
Langkah dalam pelaksanaan mutasi fisik
Mutasi secara fisika Mutagen fisik : • Sinar X (x‐ray) Pertama kali tahun 1927 dilakukan terhadap lalat buah (fruit fly) Terjadi mutasi kromosomal • Sinar Ultra violet (250 – 270 nm) Tahun 1938 ditemukan bahwa DNA mengabsorpsi uv pada 260 nm Terjadi point mutation Terjadi dimerisasi timin‐timin Photo‐repair : kembali ke sifat semula akibat sinar • Radioisotop
Mutasi kimia Mutagen kimia :
• • •
• •
Biakan murni galur induk disuspensikan dalam larutan medium Jumlah sel dalam medium dihitung dan konsentrasi sel diatur untuk proses mutasi Radiasi dilakukan dalam keadaan terbuka dengan jarak tertentu selama jangka waktu tertentu pula dalam ruang gelap yang steril. Biakan selanjutnya dibiakkan dalam medium pertumbuhan dan diinkubasi selama beberapa hari Amati pertumbuhan sel dan koloni yang hidup diseleksi
• Senyawa analog basa : senyawa yang mirip
basa purin atau pirimidin, sehingga terjadi transisi , misalnya: 5‐bromouracil : mengganti C (cytosine) dengan T (thymin) 2‐aminopurin : mengganti A (adenine) dengan G (guanine)
• Senyawa Deaminasi dan pengalkil (alkylating agent) dapat menyebabkan transisi, misalnya : Nitrit (NaNO2) menyebabkan deaminasi A dan C sehingga pada proses replikasi pasangan AT diganti menjadi pasangan GC, atau sebaliknya. EMS (Etil metil Sulfonat), MNNG (Metil‐nitro‐ nitroso‐guanidine)
Contoh Mutasi Monascus purpureus menggunakan EMS
• Senyawa Interkalasi pewarna acridine (proflavin) menyisip (inserted) di antara pasangan basa, menyebabkan pergeseran (frame‐shift) sehingga pembacaan informasi genetik menjadi salah karena adanya sisipan tersebut
Mutan albino Monascus purpureus yang stabil setelah 5 generasi
FUSI PROTOPLAS
Metode Fusi Protoplas
• Fusi protoplas adalah suatu teknik umum untuk menginduksi rekombinasi genetik pada beberapa mikroba prokariot dan eukariot • Protoplas adalah : seluruh sel tanpa dinding sel • Fusi ini berguna untuk peningkatan produktivitas mikroba industri, misalnya pada prokariot genera Actinomycetes. Metode rekombinasi genetik ini relative mudah karena tidak memerlukan faga transduksi, faktor plasmid atau pengembangan kompetensi, namun memerlukan identifikasi prosedur utk membuat protoplas yang stabil. • Dalam Fusi protoplas perlu membuat sel‐sel hibrid yang sehat dari hasil fusi tersebut.
• Protoplas dibuat dengan cara membuang dinding sel menggunakan enzim lisis di dalam suatu larutan penstabil osmosis. • Dengan bantuan larutan PEG (polietilen glikol) konsentrasi tertentu sebagai senyawa fusogenik, fusi dapat dilakukan dan akan terbentuk suatu hibrid antara atau diploid. • Selama bentuk hibrid ini, genom (atau kromosom) dari kedua sel yang terfusi atau saling bercampur dan rekombinasi genetik akan terjadi.
Fusi Protoplas untuk mikroorganisme • Untuk prokariot Bacilli dan Streptomycetes rekombinasi terjadi pada frekuensi yang cukup tinggi karena kromosomnya berada bebas dalam sitoplasma • Untuk mikroba eukariot fusi protoplas harus diikuti dengan fusi inti untuk memperoleh rekombinasi yang sesungguhnya • Tahap penting dalam teknik fusi protoplas ini adalah tahap REGENERASI dari sel yang hidup dari hasil fusi tersebut. • Fusi protoplas dilakukan untuk spesies yang sama, untuk menghasilkan galur yang lebih produktif daripada galur induknya.
Langkah umum fusi protoplas • • • • • • • • • •
Penyiapan sel yang akan difusi Pencucian sel menggunakan larutan hipertonik untuk menghasilkan lingkungan yang stabil secara osmotik untuk protoplas Sel disentrifuga dan resuspensi dalam medium , lalu ditambahkan enzim lisozim dan diinkubasi pada 37 C selama min.15 menit. terbentuknya protoplas diamati dibawah mikroskop fase kontras. Sel dicuci dengan cairan medium , disentrifuga dan diresuspensi dalam medium segar. jumlah sel yang akan difusikan dihitung dgn hemositometer suspensi sel dari dua galur yang akan difusi dicampur dalam tabung sentrifuga Sel disentrifuga , lalu diresuspensi dengan medium segar PEG (BM 1000‐6000) ditambahkan dengan konsentrasi antara 40 – 65% Campuran tersebut digoyangkan perlahan lalu didiamkan pada suhu kamar selama lebih kurang 1 jam Pengenceran terbatas dilakukan untuk proses seleksi sel yang hidup,diinkubasi dan diamati sel hibrid yang terbentuk.
Rekayasa Genetik (Genetic Engineering)
Contoh Fusi protoplas : Aspergillus terreus
Galur induk 1
Galur induk 2
• Rekayasa genetik adalah salah satu cara pembuatan DNA baru, biasanya melalui rekombinasi DNA dari organisme yang berbeda dan meproduksi banyak kopi dari DNA rekombinan tersebut melalui proses yang disebut KLONING • Kloning adalah suatu proses dimana suatu urutan DNA tertentu disisipkan ke dalam suatu vektor (berupa plasmid atau kromosom faga) dan selanjutnya direplikasi sebanyak mungkin. Replikasi terjadi di dalam suatu inang (host) yang memungkinkan replikasi itu terjadi
Fusan (hasil fusi)
Prinsip mutasi dengan rekayasa genetik • Informasi genetik yang dituju, diisolasi dari organisme donor dan dipotong menjadi bagian tunggal menggunakan enzim restriksi • Potongan ini digabungkan di dalam suatu DNA pembawa (vektor) dan selanjutnya bersama vektor tersebut ditransfer ke dalam suatu sel inang (host) • Sel inang akan bereplikasi dan mensekresi metabolit yang sesuai dengan informasi genetik yang ditransfer sebelumnya.
Syarat untuk vektor • • •
Memiliki Selectable markers (penanda selektif) Memiliki Restriction sites (situs restriksi) Berat molekul serendah mungkin
Plasmid
Faga (bakteriofaga)
• Plasmid adalah suatu molekul DNA sirkular (BM 106 – 2 x 108) dari bakteri, yang membawa 1‐3% genom sel dan mengkode suatu sifat genetik penting yang tidak dikode secara normal oleh kromosom bakteri tersebut • Sifat yang banyak digunakan : resistensi antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa aromatik, dll.
• suatu sub‐kelompok virus yang menginfeksi bakteri dengan cara menyisipkan asam nukleat nya ke dalam bakteri host nya. • Faga terkecil hanya mengandung 3 gen pengkode ss RNA • T4, suatu faga bakteri yang mengandung lebih kurang 60 gen pengkode ds genom DNA faga tersebut
Cosmid
Prinsip kloning gen menggunakan plasmid E.coli pBR 322
• Cosmid adalah partikel sintetik yang dapat bereplikasi sendiri • Berasal dari plasmid yang mengandung fragmen lambda‐DNA (DNA‐λ) yang mengkode urutan cos site (situs pengenalan) untuk sistem λ yang akan membentuk struktur sirkular. • DNA λ faga ini bereplikasi melalui suatu mekanisme khusus yaitu rolling circle yang yang selanjutnya membentuk struktur concatemer (berulang secara linear) setelah disisipkan DNA asing. • Bentuk linear ini merupakan substrat untuk reaksi packaging secara in‐vitro membentuk partikel. Selanjutnya partikel tersebut digunakan untuk menginfeksi sel inang, dan bentuk linear cosmid akan membentuk sirkular kembali pada sisi cos site
Plasmid yang mengandung gen resistensi thp ampisilin dan tetrasiklin dipotong pada sisi tetrasiklin dengan enzim restriksi DNA asing di sisipkan pada plasmid dengan enzim ligase Plasmid yang telah mengandung DNA asing tsb ditransfer ke dalam sel bakteri
Pembiakan
Seleksi sel yang hanya mengandung gen resistensi ampisilin dan DNA asing
Jenis Mutan • • • • •
• Mutan aukosotrof adalah mutan yang tidak dapat
Mutan Aukosotrof (Auxotrophic mutan) Mutan Resisten (Resistant) Mutan yang sensitif terhadap temperatur Mutan Konstitutif katabolik Mutan Konstitutif anabolik
Rancangan tahap skrining untuk proses mutasi di Industri Tahap 1
2
Proses
Jumlah
a.Mutasi biakan induk b.Pembiakan pada agar c.Seleksi koloni d.Fermentasi e.Seleksi galur terbaik
a.8 dosis berbeda
a.Pengujian kembali galur terseleksi (5 replikasi) b.Seleksi galur terbaik
a.40 x 5 = 200 galur
Skrining berikutnya dilakukan utk setiap galur
c.25 dari setiap dosis d.200 galur e.40 galur
b.8 galur utk metabolit primer, 40 galur utk metabolit sekunder
mensintesis suatu molekul organik yang sebenarnya sangat diperlukan untuk salah satu jalur biosintesis metabolit nya. Misalnya : nitrat, antibiotik
• Mutan resisten adalah mutan dari organisme yang sebelumnya sensitif terhadap suatu senyawa
• Mutan yang sensitif terhadap temperatur adalah mutan dari oraganisme yang semula tidak sensitif terhadap temperatur
• Mutan yang memiliki enzim konstitutif katabolik : antiinduksi, limiting factor, dll. • Mutan yang memiliki enzim konstitutif anabolik : antimetabolit
