Strain Improvement of Microorganisms Marlia Singgih Wibowo
Definition of Strain Improvement • In the field of agriculture : recovery of plant’s characters • In the fileld of microbiology : improve the microbe’s productivities or characteristics
Purposes of Strain Improvement • • • •
Increase productivities To change unused co-metabolites To improve the use of carbon and nitrogen sources To improve morphology of cells to be a better cells in order to separate the cells and its products
General Process • • •
Induction of genetic variation in some cell population of chosen microorganism Fermentation Process in lab scale for some cells Analysis (assay) to check the productivity of mutated strain
How to optimize miicrobe’s productivity? • • •
Optimize environmental condition Optimize nutrition of microorganism Genetic Modification : Mutation, recombination, gene cloning
Optimize environmental condition • Modification of physical parameter (temperature, agitation, etc) • Modification of chemical parameter (pH, O2 conc, etc) • Modification of biological parameter (co-culture, enzym, etc)
Optimize nutrition of microorganism • • • • •
Carbon source Nitrogen source Mineral source and other sources Precursor Enzyme
Screening in Industry Stage 1
2
Process a.Mutation of wild type b.Culture on agar c.Selection of colonies d.Fermentation e.Selection of good strain
Amount a.8 different doses c.25 of each dose d.200 strains e.40 strains
a.Re test of selected strain (5 a.40 x 5 = 200 strains replication) b.Selection of best strain b.8 strain for primary metabolites, 40 strains for 2nd metabolites Next screening
MUTAGENESIS • Mutagenesis is a process of mutation in strain improvement of microorganism. A treatment to microorganism will cause an improvement in their genotipic and fenotipic performances • Mutation can be random or direct
Procedure of mutagenesis • Mutation by : physical, chemical or combination of physical and chemical method • Protoplast Fusion • Recombination • Gene Cloning
Physical Mutation • X-ray Chromosomal mutation • UV Radiation (250 – 270 nm) DNA absorps uv pada 260 nm Point mutation Dimerization of thymine Photo-repair : gain improvement of some abilities • Radioisotop
Stages in Physical mutation • • • • •
Wild-type of microbes is suspended in medium Counting number of cells in medium and concentration of cells is determined for mutation process Radiation is conducted in dark area with certain distance for certain duration. Exposed colonies are inoculated in growth medium for several days Check the growth and select some colonies for further process
Chemical Mutation • Base analog : substance that similar to purine or
pirimidine, so transition will occured , example : 5-bromouracyl : substitute C (cytosine) with T (thymin) 2-aminopurine : substitute A (adenine) with G (guanine) • De amine and alkylating agent : transition, example: Nitrite (NaNO2) can cause de-amined A and C so replication of AT will change to GC, or viceversa EMS (Etil metil Sulfonat), MNNG (Metil-nitro-nitrosoguanidine)
• Intercalation Dye acridine (proflavine) inserted between base pair, will cause a frame-shift and will misread its genetic information
Mutation of Monascus purpureus using EMS
Albino mutant of Monascus purpureus stable after 5 generation
PROTOPLAST FUSION • Protoplast fusion is a general technic to induce genetic recombination in some prokariot and eukariotic microorganisms • Protoplast : whole cell without cell wall
• Fusion has some benefits to improve productivity of industrial microorganisms, e.g. Actinomycetes. • The Method is easy, no transduction phage needed, plasmid or competention development, the only things is how to get the stable protoplast • In protoplast fusion will produce hybrid cells
Method of Protoplast Fusion • Protoplast is prepared by removing the cell wall using lytic enzyme in a osmotic solution. • With the help of PEG (polyetilenglicol) at certain conc. (fusogenic agent), the fusion can be done and hybrid cells will produced (diploid) • During this stage , genome (or chromosom) from both cells will be fused and mixed . The genetic recombination will occured
Protoplast Fusion for microorganism • For prokariot Bacilli and Streptomycetes , recombination will occur in a very high frequency because its chromosomes is free in the cytoplasm • For eukariot microorganism, protoplast fusion should be followed by fusion of nucleus to obtain the real recombination • The important step in protoplast fusion is REGENERATION of the cells after fusion • Protoplast fusion mostly done for the same species to obtain the best strain with high productivity
Exampe of Protoplast Fusion : Aspergillus terreus
Strain 1
Strain 2
Fusant after fusion
Genetic Engineering
Genetic Engineering • Rekayasa genetik adalah salah satu cara pembuatan DNA baru, biasanya melalui rekombinasi DNA dari organisme yang berbeda dan meproduksi banyak kopi dari DNA rekombinan tersebut melalui proses yang disebut KLONING • Kloning adalah suatu proses dimana suatu urutan DNA tertentu disisipkan ke dalam suatu vektor (berupa plasmid atau kromosom faga) dan selanjutnya direplikasi sebanyak mungkin. Replikasi terjadi di dalam suatu inang (host) yang memungkinkan replikasi itu terjadi
Prinsip mutasi dengan rekayasa genetik • Informasi genetik yang dituju, diisolasi dari organisme donor dan dipotong menjadi bagian tunggal menggunakan enzim restriksi • Potongan ini digabungkan di dalam suatu DNA pembawa (vektor) dan selanjutnya bersama vektor tersebut ditransfer ke dalam suatu sel inang (host) • Sel inang akan bereplikasi dan mensekresi metabolit yang sesuai dengan informasi genetik yang ditransfer sebelumnya.
Syarat untuk vektor • • •
Memiliki Selectable markers (penanda selektif) Memiliki Restriction sites (situs restriksi) Berat molekul serendah mungkin
Plasmid • Plasmid adalah suatu molekul DNA sirkular (BM 106 – 2 x 108) dari bakteri, yang membawa 1-3% genom sel dan mengkode suatu sifat genetik penting yang tidak dikode secara normal oleh kromosom bakteri tersebut • Sifat yang banyak digunakan : resistensi antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa aromatik, dll.
Faga (bakteriofaga) • suatu sub-kelompok virus yang menginfeksi bakteri dengan cara menyisipkan asam nukleat nya ke dalam bakteri host nya. • Faga terkecil hanya mengandung 3 gen pengkode ss RNA • T4, suatu faga bakteri yang mengandung lebih kurang 60 gen pengkode ds genom DNA faga tersebut
Cosmid • Cosmid adalah partikel sintetik yang dapat bereplikasi sendiri • Berasal dari plasmid yang mengandung fragmen lambda-DNA (DNA-λ) yang mengkode urutan cos site (situs pengenalan) untuk sistem λ yang akan membentuk struktur sirkular. • DNA λ faga ini bereplikasi melalui suatu mekanisme khusus yaitu rolling circle yang yang selanjutnya membentuk struktur concatemer (berulang secara linear) setelah disisipkan DNA asing. • Bentuk linear ini merupakan substrat untuk reaksi packaging secara in-vitro membentuk partikel. Selanjutnya partikel tersebut digunakan untuk menginfeksi sel inang, dan bentuk linear cosmid akan membentuk sirkular kembali pada sisi cos site
Prinsip kloning gen menggunakan plasmid E.coli pBR 322 Plasmid yang mengandung gen resistensi thp ampisilin dan tetrasiklin dipotong pada sisi tetrasiklin dengan enzim restriksi DNA asing di sisipkan pada plasmid dengan enzim ligase Plasmid yang telah mengandung DNA asing tsb ditransfer ke dalam sel bakteri
Pembiakan
Seleksi sel yang hanya mengandung gen resistensi ampisilin dan DNA asing
Jenis Mutan • • • • •
Mutan Aukosotrof (Auxotrophic mutan) Mutan Resisten (Resistant) Mutan yang sensitif terhadap temperatur Mutan Konstitutif katabolik Mutan Konstitutif anabolik
• Mutan aukosotrof adalah mutan yang tidak dapat mensintesis suatu molekul organik yang sebenarnya sangat diperlukan untuk salah satu jalur biosintesis metabolit nya. Misalnya : nitrat, antibiotik
• Mutan resisten adalah mutan dari organisme yang sebelumnya sensitif terhadap suatu senyawa
• Mutan yang sensitif terhadap temperatur
adalah mutan dari oraganisme yang semula tidak sensitif terhadap temperatur
• Mutan yang memiliki enzim konstitutif katabolik : antiinduksi, limiting factor, dll. • Mutan yang memiliki enzim konstitutif anabolik : antimetabolit
