Cara Pengawetan dan Penyimpanan Biakan Fungi Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung
Outline • • • •
Prinsip Umum Teknik Pengawetan (Preservation) Keuntungan dan Kerugian Pemilihan Metode
Prinsip Umum Tujuan utama memelihara biakan suatu fungus adalah untuk menjaga galur fungus tersebut di dalam suatu media tanpa terjadi nya perubahan morfologi, fisiologi, atau genetik
Prinsip Umum • Organisme dapat berasal dari berbagai sumber • Contoh : Penicillium digitatum
Prinsip Umum • Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat dengan mengurangi kecepatan metabolisme atau bahkan dapat menunda metabolisme mikroorganisme • Pengawetan yang baik bila digunakan biakan yang sehat dan kondisi pertumbuhan yang optimum • Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dan kondisi yang berbeda-beda • Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas tertentu sebagai syarat pertumbuhannya
Prinsip Umum • Umumnya Mikroorganisme tumbuh baik dalam media yang dibuat mendekati kondisi lingkungan tempat asalnya • Contoh : tanah, bagian tanaman atau komponen air, dll.
Pertumbuhan Mikroorganisme • Media pertumbuhan dapat bervariasi. Misalnya Raper & Thom (1949) menggunakan Czapek's Agar, Steep Agar and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan Penicillia dan Aspergilli • Pitt (1980) menganjurkan penggunaan recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA) dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia • Standarisasi of formula media penting dilakukan • Media akan mempengaruhi morfologi dan warna koloni, karena kandungan media akan mempengaruhi pembentukan senyawa tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari mikroorganisme
Pertumbuhan Pengaruh Media terhadap morfologi koloni
Kontaminasi pada kultur fungi • Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh Tyroglyphus or Tarsonemus • Di alam banyak terdapat pada tanah, dan hampir semua bahan organik • Terbawa ke laboratorium dari bahan tanaman, produk yang sudah kadaluarsa, pada sepatu, serangga atau biakan mikroorganisme lain. • Cepat berkembang biak dalam keadaan lembab dan suhu ruang • Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat di simpan
Pencegahan Kontaminasi • • • •
Melakukan pekerjaan sesuai prosedur Menjaga kebersihan dan kesehatan diri Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur
Metode pencegahan kontaminasi Hygiene • Bersihkan seluruh permukaan dan hindari biakan dari udara luar dan debu • Cuci peralatan dengan desinfektan yang sesuai. Fumigation • Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harus dilakukan oleh yang berwenang Mechanical and chemical barriers • Universal bottles, kapas lemak, tube bersumbat
Metode pencegahan kontaminasi • Tempat penyimpanan yang aman • Lemari pendingin 4-8°C • Lemari penyimpanan “deep freeze” (< 20°C) • Menutup kultur dengan minyak mineral • Simpan dengan silica gel • Freeze-dry • Simpan di ultra-low temperatures case
Pengawetan dan Penyimpanan • Continuous culture Pada media padat atau cair Refrigeration Di bawah lapisan minyak mineral Di dalam air • Pengeringan • Freeze drying • Cryopreservation
Pengawetan dan Penyimpanan • Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan sebagai seed stock • Simpan satu biakan sebagai cadangan • Setelah pengawetan, viability, purity, dan identitas harus di cek ulang dan dibandingkan dengan data aslinya atau referensi • Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan biokimia harus diuji • Semua pengamatan harus dicatat dan disimpan untuk referensi di masa yad.
Metode Pengawetan mikroorganisme Penumbuhan pada agar miring • Metode yang paling mudah dan murah • Disimpan di dalam lemari pendingin dapat membantu mengurangi frekuensi sub-kultur
Metode pengawetan mikroorganisme Kerugian metode sub-kultur pd agar • Kemungkinan terjadi variasi genetik akibat pemindahan berulang, hilangnya sifat patogenitas atau karakteristik fisiologi dan morfologi lainnya • Kemungkinan kontaminasi besar • Memerlukan pengawasan yang ketat supaya biakan tidak tertukar atau terkontaminasi
Pengawetan dan Penyimpanan Keuntungan metode sub-kultur pada agar : • Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu cukup lama dibawah pengawasan ahlinya. • Metodenya cukup murah dan tidak memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah koleksi yang sedikit, metode ini cukup menguntungkan • Penumbuhan mudah karena tidak perlu waktu adaptasi yang lama. • Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau 2 – 4 bulan
Di bawah minyak mineral
Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen
Pengawetan dengan Minyak mineral • Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell & Weston (1947) • Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10 mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinal paraffin dengan specific gravity 0.830-0.890). • Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada 121°C selama 15 menit • Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengan cara mengambil sejumlah koloni dengan jarum biakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin. • Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah kadangkala memberikan hasil yang lebih baik sehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudah melalui slope
Pengawetan dalam Minyak mineral Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral : • Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara • Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval • Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi yang tidak nyaman dapat mengarah pada mutasi
Pengawetan dalam Minyak mineral Keuntungan : • Peralatan murah dan pengerjaan mudah • Beberapa mikroorganisme hanya dapat disimpan di dalam minyak mineral • Namun penyimpanan di bawah minyak mineral disarankan untuk laboratorium yang memiliki keterbatasan sumbar daya dan fasilitas
Penyimpanan dalam air Potongan agar atau suspensi spora dapat disimpan dalam air
Penyimpanan dalam air Cara : 1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari ujung pertumbuhan koloni jamur 2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril di dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu disimpan pada suhu 20-25°C. 3. Peremajaan dilakukan dengan mengambil potongan agar tsb, tempatkan terbalik pada medium pertumbuhan yang sesuai
Penyimpanan dalam air • Jangka waktu penyimpanan dapat mencapai 2-3 tahun , misalnya untuk spesies of Phytophthora dan Pythium tanpa adanya perubahan fisik (Onions & Smith, 1984).
Penyimpanan dalam air • Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939, 1967) yang menyimpan fungi yang patogen thp manusia • Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya. • Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan penyimpanan dalam air bisa mencapai 10 years • Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogen a.l. Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota dan mitotic fungi selama 7 tahun. • Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales, Pyrenomycetes, Hymenomycetes, Gasteromycetes dan Hyphomycetes
Teknik pengeringan and freeze‐drying • Penghilangan air akan mengurangi laju metabolisme sel • Dapat dilakukan dengan pengeringan udara • Dapat pula dengan penambahan absorbant spt tanah, silica gel, atau desiccant lain. • Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan beku dengan cara sublimasi es
What happens to a cell when it freezes? -2OC
<10OC
-5OC SLOW COOL
RAPID COOL
VERY RAPID COOL
Response of cells to freezing. Slow cool: cells can maintaing osmostic equilibrium by water efflux; thus cells shrink and only extracellular ice forms. Rapid cool: cells cannot lose water rapidly enough to maintain osmotic equilibrium; thus cells shrink slightly and contain a few large ice crystals. Very rapid cool: cells contain a large number of small ice crystals.
Penyimpanan dalam Silica Gel
• Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun • C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungi lebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins (1962), semua galur terbukti stabil.
Penyimpanan dalam Silica Gel Cara : 1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dan sterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam). 2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal - 20°C). 3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang telah didinginkan. 4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica gel dan goyangkan agar tercampur homogen. 5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada 25°C sampai silica gel crystals mengering dan siap untuk dipisahkan. 6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadah kedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsi lembab.
Penyimpanan dalam Silica gel • Banyak fungi yang tahan lama dengan metode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962; Onions, 1977; Smith & Onions, 1983). • Spora yang berdinding tipis cenderung tidak dapat bertahan. • Keberhasilannya tergantung biakan yang sehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dari perbedaan biakan dari setiap isolat. • Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freezedrying tidak tersedia, walaupun ada bbrp fungi yang tidak dapat bertahan lama dgn cara ini.
Penyimpanan dalam Silica Gel
Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai
Penyimpanan dalam Silica Gel Kekurangan cara silica gel : • Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak sesuai untuk Pythium, Phytophthora dan beberapa Oomycota, juga beberapa fungi bermiselium yang memiliki spora yang kompleks. • Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup besar setelah beberapa kali peremajaan.
Penyimpanan dalam Silica Gel Keuntungan cara silica gel : • Murah dan sederhana • Menghasilkan biakan yang stabil untuk banyak sporulating fungi termasuk Basidiomycota. • Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari karena kondisi yang kering • Peremajaan inokulum dapat dilakukan dengan mengmbil beberapa butir dari satu botol, walaupun disarankan tetap memisahkan biakan stock dari biakan kerja.
Penyimpanan dalam tanah
• Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min) sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi spora dalam air steril • Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantung pada laju pertumbuhan fungi
Penyimpanan dalam tanah • Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971) • Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria, Aspergillus, Circinella dan Penicillium. • Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulan tetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan juga Pseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke & Fokkema, 1979). • Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolat Fusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F. acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971). • Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakan untuk Fusarium dibandingkan di dalam minyak karena adanya perubahan (variasi) terjadi dalam minyak.
Penyimpanan dalam tanah Keuntungan : • Biakan dapat bertahan sampai 10 tahun. • Peremajaan berulang dapat dilakukan dari sampel yang sama, walaupun sebaiknya stok harus ditempatkan terpisah. • Biaya murah dan alat sederhana
Penyimpanan dalam tanah Kerugian : • Kemungkinan terjadi variasi genetik • Beberapa fungi tidak dapat tahan di desikasi • Kemungkinan kontaminasi lebih besar
Oomycota • Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair dengan kecepatan pendinginan 10°C min-1, walaupun beberapa galur tidak dapat disimpan dengan cara ini. • Di bawah minyak mineral dapat disimpan sampai 6 bulan • Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40 tahun (laporan dari CABI-UK) • Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di transfer setiap 2 tahun
Zygomycota • Nitrogen cair sangat disarankan untuk penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus lainnya • Dapat pula dengan cara freeze-dried • Tidak semua genus tahan proses dehidrasi, terutama dengan silica gel, misalnya Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus, Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites. Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan Coemansia yang dapat di freeze dried.
Basidiomycota • Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi demikian hanya dapat disimpan dengan cara transfer regular pada agar dengan atau tanpa minyak, atau disimpan di nitrogen cair. • Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar ditumbuhkan kembali • Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang tumbuh di alam, dapat di freeze-dried
Fungi Deuteromycota • Fungi yang ber konidia reltif mudah di simpan • Freeze-drying adalah teknik yang paling tepat. • Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces dapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai 2 tahun pada agar miring pada -18°C.
Ragi • Ragi (single celled vegetative yeasts) dapat disimpan dengan cara freezedrying. • Kebanyakan spesies dapat tahan disimpan dalam silica gel namun sukar ditumbuhkan kembali • Liquid nitrogen adalah cara yang paling baik.
Rangkuman Method
Cost
Stability
Longevity
Cryopreservation High o below –130 C Freeze-drying High
Excellent
>10 000 years 4-40 years
Silica gel
Low
Water
Low
Soil
Low
Oil
Low
Growth 18-22 oC Low-Medium Growth 4-7 oC
Medium
Little change reported Little change reported Variation linked to storage time Variation common Change expected with time Change expected with time Change expected with time
5-20 years 2-7 years 5-20 years 1-50 years 2 weeks to 6 months 6-12 months
