Teknologi Fermentasi Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy Insitut Teknologi Bandung
Pendahuluan • Istilah Fermentasi • asal kata : “fervere” berarti mendidih • Penggunaan dalam bidang mikrobiologi
Proses umum fermentasi Raw Material
Sel mikroba
Sterilisasi
Penyiapan inokulum Fermentasi
By product
Pemisahan Penghancuran sel Isolasi & purifikasi Formulasi
Pengolahan limbah
Parameter yang menentukan • • • • • • •
Mikroorganisme Substrat Produk Kondisi fermentasi Bioreaktor Tahap Isolasi dan purifikasi Pengolahan limbah
Mikroorganisme •Fisiologi •Morfologi •Pertumbuhan •Karakteristik pertumbuhan •Kebutuhan lingkungan •Pola produksi metabolit •Stabilitas genetik
Substrat • • • • • •
Komposisi Sifat fisika dan kimia Proses sterilisasi Konversi Rancangan formulasi media Limbah post-fermentation process
Produk • • • • •
Intrasel, ekstrasel Proses panen Perhitungan hasil Sensitivitas terhadap degradasi By-product
Kondisi fermentasi •Lingkungan fisik •Lingkungan kimia •DO2, pCO2 •Mass transfer •Kadar nutrisi •Karakteristik mixing •Aerasi dan agitasi
Bioreaktor • • • •
Jenis bioreaktor Komponen instrumen Cara Sterilisasi Parameter proses
Tahap Isolasi dan purifikasi Proses aseptik Pemisahan, fraksinasi, isolasi Purifikasi
Pengolahan limbah • Jenis limbah • Proses pengolahan • Parameter keamanan lingkungan
Jenis Fermentasi • Fermentasi padat (Solid Substrate Fermentation) • Fermentasi cair /bawah permukaan (Submerged Fermentation)
Metabolisme • Katabolisme : proses degradasi nutrien menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil. Proses katabolisme menghasilkan ATP, proton motive force, menurunkan tenaga dan pengambilan nutrisi serta pembentukan rangka karbon dalam jalur metabolisme inti • Jalur degradasi ini bisa pendek (misalnya pembentukan asetat) atau bisa pula panjang (misalnya pembentukan asam benzoat)
• Amphibolisme : proses pembentukan intermediate (senyawa antara) • Terjadi pembentukan building blocks (senyawa pembangun), misalnya asam amino, purin, pirimidin, gula-gula fosfat, asam organik, dan metabolit lain
• Anabolisme : biosintesis polimer dari monomer (asam amino, nukleotida dan lipid) dari rangka karbon utama melalui pemanfaatan ATP dan NADPH • Pertumbuhan sel dengan menggabungkan struktur makromolekul melalui proses polimerisasi monomer-monomer yang dihasilkan dari proses biosintesis, melibatkan berbagai nukleotida fosfat • Polimer sel a.l. protein, asam nukleat, dinding sel, makanan cadangan, dll.
Tahap Utama Metabolisme Asam amino, asam nukleat, dll
KH, Lemak, Protein NTP
ADP ATP Katabo lisme
NADP NADPH
Biosin tesis
CO2 Kerangka karbon
NDP
Tumbuh
Protein, lipid, struktur sel
Regulasi metabolisme • Seluruh kegiatan metabolisme berlangsung sangat cepat dan harus bekerja di dalam sel • Mikroorganisme memiliki potensi genetik untuk memproduksi lebih dari 1000 enzim • Enzim ini harus dibentuk dalam jumlah yang tepat dan dalam sistem yang terkoordinasi dengan baik agar sel bekerja secara efisien • Mikroorganisme dapat dengan cepat mengantisipasi perubahan lingkungan sehingga dapat dengan segera memperbaiki sistem metabolismenya • Regulasi untuk sistem yang demikian terjadi pada level sintesis enzim atau pada level kerja enzim
Faktor yang mempengaruhi regulasi metabolisme • Jenis dan jumlah enzim • Jenis dan jumlah substrat • Adanya induktor, aktivator, represor dan inhibitor • Faktor lingkungan • Faktor genetik
Pemanfaatan mikroorganisme • • • • • •
Biomassa Enzim Metabolit primer Metabolit sekunder Biotransformasi Bioinformatik
Beberapa contoh metabolit sekunder mikroba dan manfaatnya • Antibiotik : penisilin (Penicillium chrysogenum), sefalosporin (Cephalosporium acremonium), • Imunosupresan : silosporin (Trichoderma polysoprum) • Bidang pertanian : growth promoter Zearalonone (Gibberella zeae) • Enzim : amilase (Aspergillus niger), lipase (Pseudomonas aeruginosa) • Pigmen : ankaflavin (Monascus purpureus)
Pertumbuhan sel mikroba • Pertumbuhan sel : bertambahnya jumlah sel atau massa sel • Growth (pertumbuhan) merupakan hal yang penting dalam fungsi mikroba • Bakteri membelah diri dalam waktu 20-90 menit • Ragi : 90-120 menit • Kapang : 4-8 jam
Syarat mikroba tumbuh • • • • •
Ada sel hidup Ada sumber energi Ada nutrisi dan faktor pertumbuhan Tidak ada inhibitor atau toksin Kondisi fisiko-kimia yang mendukung
Kurva pertumbuhan mikroorganisme (sistem batch) c Biomasa
d
(X)
e µ x = dX/dt µ =laju pertumbuhan
b
X=konsentrasi sel t=waktu a Waktu (t) Ket : a: fase lag ; b: fase log ; c:fase stasioner ; d:fase kriptik ; e:fase kematian
Sistem kultur untuk pertumbuhan dan produksi menggunakan mikroorganisme • Sistem batch (kultur curah) • Sistem fed-batch (kultur curah umpan) • Sistem continuous (kultur sinambung)
Batch
Fed-batch
Continuous
Medium pertumbuhan • Substrat organik dan non-organik • Kebutuhan hidup tergantung pada proses metabolisme, kebutuhan akan oksigen, suhu, dll • Menentukan jenis mikroba : – Mikroba aerob, an-aerob, obligat, fakultatif – Mikroba psikrofil, termofil – dll
Kebutuhan mikroorganisme • Untuk tumbuh, mikroorganisme memerlukan nutrisi • Medium untuk pertumbuhan mikroorganisme dapat berupa bahan alam (sifatnya kompleks) atau bahan kimia (sifatnya terukur)
Elemen dalam sel mikroorganisme Elemen C O
% brt.krng 50 20
N
14
H P S K
8 3 1 1
Na
1
Ca Mg Cl
0,5 0,5 0,5
Fungsi fisiologis komponen sel organik komponen sel organik, Akseptor e- pd respirasi utk protein, as.nukleat, Ko-enzim komponen sel organik Fosfolipid, as.nukleat as.amino, protein kation dan kofaktor pd reaksi enzimatis kation dan membran transpor kation dan kofaktor kation dan kofaktor anion
Komposisi rata-rata sel mikroba Mikroba % C
%N
% Protein
% KH
%Lipid %As. %Abu Nukleat
Bakteri
48
12
55
9
7
23
6
Ragi
48
57
40
38
8
8
6
Kapang
48
56
32
49
8
5
6
Komponen Medium untuk mikroorganisme •
•
Karbon : sebagai sumber energi dan komponen utama biomasa Sumber karbon dapat berasal dari : Polisakarida atau monosakarida, contoh : Karbohidrat, glukosa, molase, amilum, malt extract, dll. Nitrogen : sebagai sumber pembentukan komponen utama sel Sumber nitrogen dapat berasal dari : garam ammonium, urea, asam amino, sumber kompleks seperti CSL (Corn Steep Liquor), Yeast Extract, Pepton, dll.
Komponen Medium untuk mikroorganisme •
•
Mineral : P, K, Na, Mg, S, Ca, dll P sebagai salah satu unsure penting dalam pembentukan asam nukleat (dalam bentuk Fosfat), S sebagai unsure pembentukan beberapa asam amino esensial, Mg sebagai kofaktor dalam proses fosforilasi. Unsur-unsur lain : trace elements misalnya : vitamin, EDTA, dll
Komponen Medium untuk mikroorganisme • •
Air : komponen utama terbesar dalam medium Oksigen : kebutuhan utama mikroba aerob sebagai aksptor electron pada proses respirasi, yang umumnya diperoleh dari komponen air (H2O)
Hubungan antara pertumbuhan sel, penggunaan substrat dan pembentukan produk (metabolit) • • • • • • •
Laju pertumbuhan Laju pertumbuhan vs konsentrasi nutrisi Koefisien hasil (yield coefficient) Nilai metabolit (metabolic quotient) Persamaan Monod Persamaan Michaelis-Menten Pembentukan produk (type I, II dan III)
PRODUKSI ASAM SITRAT SECARA FERMENTASI
Pendahuluan • Asam sitrat merupakan asam organik • Berguna dalam industri makanan, farmasi dan tambahan dalam makanan ternak • Dapat diproduksi secara kimiawi, atau secara fermentasi menggunakan mikroorganisme
Sejarah Asam sitrat • Sebelum tahun 1800 asam sitrat diperoleh dari tumbuhan (buah lemon) • 1893 : ditemukan diproduksi oleh jamur berfilamen (filamentous fungi) • 1923 : produksi pertama asam sitrat menggunakan mikroorganisme dengan cara fermentasi pada permukaan (surface culture) • 1930 : produksi menggunakan fermentor diperoleh sebanyak 5000 ton • 1979 : produksi menggunakan fermentor mencapai 220.000 ton dari 220 m3
Kegunaan asam sitrat • Industri makanan : flavouring agent, ekstrak jus buah, perasa permen, es krim,dll • Industri farmasi : dapar pH, pengawet dalam sediaan farmasi, perasa asam, dll • Industri kimia : antifoam agent, softener, campuran warna tekstil, campuran deterjen, dll
Mikroba penghasil asam sitrat • • • • • • • • • •
Merupakan metabolit primer Aspergillus niger Aspergillus wentii Penicillium luteum, P.citrinum Mucor piriformis Citromyces pfefferianus Candida lipolytica Trichoderma viridae Corynebacterium sp. dll
Biosintesis asam sitrat dalam mikroorganisme • Asam sitrat (2-hidroksipropana-1,2,3-asam karboksilat) adalah produk metabolisme primer dan dibentuk dalam siklus asam trikarboksilat (TCA cycle) • Sumber karbon utama adalah glukosa • Enzim dalam jalur EMP terlibat dalam penguraian glukosa menjadi piruvat • Ketika piruvat mengalami dekarboksilasi membentuk asetil koA, residu asetat masuk dalam siklus TCA
• Selama proses idiophase, enzim sitrat sintase meningkat 10 kali selama produksi asam sitrat, sedangkan enzim asonitase dan sitrat dehidrogenase berkurang • Glukosa juga mengalami katabolisme melalui jalur pentosa fosfat. Enzim untuk siklus ini terdapat pada A.niger
Diagram biosintesis asam sitrat PEP
Piruvat Asetil coA oksaloasetat Malat
Sitrat
Fumarat Suksinat
IsoSitrat
Fermentasi asam sitrat • Dapat dilakukan menggunakan 2 macam metode fermentasi : permukaan (surface process) dan bawah permukaan (submerged process) • Pada tahap tropofase, sebagian dari glukosa digunakan untuk membentuk miselium dan respirasi • Pada tahap idiofase, sisa glukosa diubah menjadi asam organik, termasuk asam sitrat • Produksi berkisar antara 40-69% dalam bentuk asam sitrat-1-hidrat (123 g per 100 g sukrosa) atau asam sitrat anhidrat (112 g per 100 g sukrosa)
Medium untuk nutrisi • Sumber karbon : berbagai amilum dapat digunakan (kentang, hidrolisat amilum, sirup glukosa, sukrosa, molase, dll) • Penambahan trace elements (Cu, Mn, Mg, Fe, Zn, Mo) dalam skala ppm. Bila berlebih dapat berakibat toksik • Fe merupakan faktor penentu, jumlahnya tergantung pada sumber karbon yang digunakan. Contoh : bila digunakan sukrosa murni, jumlah optimal Fe adalah 2.0 ppm, sedangkan bila hidrolisat amilum yg digunakan, jumlah optimal Fe adalah 0,2 ppm
• Komponen medium lainnya : sumber nitrogen, fosfat, juga diperlukan • pH harus diatur < 3.0, untuk menekan pembentukan asam oksalat dan asam glukonat. Selain itu dapat mengurangi kemungkinan terkontaminasi
Proses produksi • Penyiapan suspensi spora A.niger pada 25 °C, inkubasi selama 10-14 hari • Inokulum dibuat dengan 15% gula (misalnya dari molase) • Ditambahkan ion sianida untuk menginduksi pembentukan miselium dalam bentuk pelet dengan ukuran 0,2-0,5 mm • Setelah 24 jam, pelet dapat digunakan untuk produksi dalam fermentor
Proses dengan metode permukaan (surface process) • Medium untuk metode ini dapat berupa substrat padat atau cair • Substrat padat : wheat bran, amilum ubi (sweet potato) • Setelah disterilisasi, substrat ditaburkan dalam loyang setebal 3-5 cm lalu diinkubasi pada 28 °C • Pertumbuhan dapat dipercepat dengan penambahan enzim amilase • Proses fermentasi berlangsung 5-8 hari
• Substrat cair lebih banyak digunakan karena efisien. Spora inokulum sebanyak 2 – 5 x 107 spora/m2 • Komposisi medium : (g/L) – – – – – –
Sukrosa 160 – 200 NH4NO3 1,6 – 3,2 CaH2PO4 0,3 – 1,0 MgSO4.7 H20 0,2 – 0,5 ZnSO4 0,01 – 0,02 Ca heksasianoferat 0,4 – 2,0
Kondisi fermentasi • Suhu inkubasi 30 – 40 °C • Ventilasi penting untuk pertukaran gas karena produksi asam sitrat akan berkurang bila CO2 di atmosfir meningkat > 10% • pH diatur supaya asam
Proses dengan metode bawah permukaan (submerged process) • 80% produksi asam sitrat di dunia menggunakan metode ini • Waktu fermentasi 8 hari • 3 parameter yang menentukan keberhasilan proses : kualitas fermentor, struktur miselium, pasokan oksigen
• Fermentor harus terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam, misalnya SS (Stainless Steel) • Bentuk miselium yang ideal adalah bentuk pelet dengan diameter kecil. Bila terjadi filamen dan tidak membentuk klamidospora, asam sitrat yang terbentuk menjadi sedikit • Rasio jumlah Cu dan Fe mempengaruhi bentuk miselium ini • Oksigen harus antara 20 – 25% jenuh, dengan laju aerasi 0,2 – 1 vvm • Tidak perlu dilakukan pengadukan karena viskositasnya tidak tinggi
Perolehan kembali (product recovery) • Jika asam oksalat terbentuk sebagai produk samping (side product), maka asam oksalat harus diendapkan dengan Ca agar membentuk endapan Ca-oksalat pada suasana asam. Asam sitrat akan tetap tertinggal dalam larutan sebagai mono-kalsium sitrat • Asam sitrat selanjutnya diendapkan pada pH 7,2 dengan suhu 70 – 90 C
• Pemurnian selanjutnya dengan asam sulfat, lalu diendapkan sebagai kalsium sulfat • Penambahan kabon aktif, atau ion exchange, dan kristalisasi sebagai asam sitrat atau asam sitrat monohidrat pada 36,5 C
