UJI EFEKTIVITAS PENGAWET ANTIMIKROBA Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB
DEFINISI Pengawet Antimikroba: Zat yang ditambahkan pada sediaan obat untuk melindungi sediaan terhadap kontaminasi mikroba Pengawet digunakan terutama pada wadah dosis ganda untuk menghambat pertumbuhan mikroba yang dapat masuk secara tidak sengaja selama atau setelah proses produksi
• Zat antimikroba tidak boleh digunakan semata-mata untuk menurunkan jumlah mikroba viabel sebagai pengganti cara produksi yang tidak baik • Ada keadaan yang memerlukan penggunaan pengawet untuk menekan perkembangbiakan mikroba
Setiap zat antimikroba dapat bersifat pengawet, meskipun demikian semua zat antimikroba adalah zat yang beracun Untuk melindungi konsumen secara maksimum pada penggunaan harus diusahakan agar pada kemasan akhir kadar pengawet yang masih efektif lebih rendah dari kadar yang dapat menimbulkan keracunan pada manusia
Contoh pengawet
Faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Pengawet pH Keberadaan fasa non akuatik pada sediaan Adsorpsi solid dalam suspensi Adsorpsi pada kemasan plastik
Tujuan uji efektivitas pengawet Menunjukkan efektivitas pengawet antimikroba yang ditambahkan pada sediaan dosis ganda dengan dasar atau bahan pembawa air yang dicantumkan pada etiket. Contoh: produk parenteral, tetes telinga, hidung, dan mata
Syarat pengujian Pengujian dan Persyaratan hanya berlaku pada produk di dalam wadah asli, belum dibuka, dan didistribusikan pada produsen
MIKROBA UJI Candida albicans : mikroorganisme fungi golongan ragi (yeast) Hidup sebagai mikroorganisme comensal dalam tubuh manusia Candida albicans ATCC No. 10231
Dapat bersifat oportunistik menyebabkan infeksi oral dan infeksi vagina pada manusia
MIKROBA UJI Aspergillus niger adalah fungi berfilamen Bila sejumlah spora terhirup masuk ke paru-paru, dapat menyebabkan penyakit paruparu aspergillosis Penyebab otomycosis Aspergillus niger ATCC No. 16404
MIKROBA UJI Bakteri yang hidup dalam usus mamalia bakteri aerob dan facultative anaerobic, non-spore-forming, Gram-negative, rod-shaped. Fermentasi laktose dan menghasilkan gas dalam waktu 48 jam pada 35 °C (95 °F) Escherichia coli ATCC No 8739
Penyebab infeksi saluran kemih, dan diare
MIKROBA UJI Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri Gram-negative, aerob, rodshaped dan bergerak unipolar
P. aeruginosa biasanya menginfeksi saluran pernapasan, saluran kemih, luka bakar, dan luka lainnya Pseudomonas aeruginosa ATCC No 9027
MIKROBA UJI S. aureus adalah bakteri gram-positif merupakan bakteri yang berwarna kuning keemasan
Merupakan bakteri commensal pada kulit manusia, di dalam hidung, usus dan urin (kira-kira 25% dari populasi) Staphylococcus aureus ATCC No 6538
Menyebabkan penyakit kulit (Staphylococcal scalded skin syndrome )
Media yang digunakan Soybean-Casein Digest Agar Medium (SCDA) dengan komposisi sbb :
Digesti pankreatik kasein P 15 g Digesti papain tepung kedele P 5 g Natrium klorida P 5g Agar P 15 g Air ad 1000 ml pH setelah sterilisasi ~ 7,3
Pembuatan inokula Sebelum pengujian, inokulasi permukaan media agar bervolume sesuai dengan biakan persediaan segar mikroba yang digunakan Inkubasi (bakteri : 30-35ºC 18-24 jam, Candida: 20-25ºC 48 jam, Aspergillus: 2025ºC 1 minggu)
Panen mikroba Candida dan bakteri Larutan NaCl steril 0,9% cuci permukaan pertumbuhan Hasil cucian dimasukkan ke wadah yang sesuai
Encerkan dengan NaCl steril 0,9% sampai angka mikroba ~100 juta/mL
Aspergillus niger NaCl 0,9% steril yang mengandung polisorbat 80 P 0,05%
ALTERNATIF Mikroba ditumbuhkan pada media cair yang sesuai Panen sel dengan sentrifugasi
Pelet dicuci dan disuspensikan kembali dengan larutan NaCl 0,9% steril hingga mencapai angka mikroba dan spora yang dikehendaki
TURBIDIMETRI OD pd 420 nm
Suspensi Bakteri : Keruh pada jumlah lebih dari 107 /mL
Suspensi Ragi dan kapang : Keruh pada jumlah 10-100 kali lebih rendah dari bakteri
Cfu/ml x 10 8
Metode Lempeng 1mL (~30-300 koloni)
Pipet ke dalam 2 cawan petri steril
Tambahkan 15-20 mL media SCDA bersuhu ~45 oC, campurkan
Inkubasi 48-72 jam, amati pertumbuhan koloni
Tetapkan CFU (Jumlah Satuan Pembentuk Koloni)/mL dari setiap suspensi, gunakan untuk menentukan banyaknya inokula yang akan digunakan pada pengujian Jika suspensi yang telah dibakukan tidak segera digunakan, suspensi dipantau secara berkala dengan metode lempeng angka mikroba aerob total untuk menetapkan penurunan viabilitas Untuk memantau angka lempeng sediaan uji yang telah diinokulasi gunakan media agar yang sama seperti media biakan awal Jika tersedia inaktivator pengawet yang khas tambahkan sejumlah yang sesuai ke dalam lempeng agar
PROSEDUR UJI EFEKTIVITAS
Inokulasi dengan salah satu mikroba uji (0,1 mL/20 mL sediaan)
Jumlah mikroba 105 -106 /mL
Tetapkan jumlah mikroba viabel dalam setiap suspensi inokula, Hitung angka awal /mL sediaan dengan metode lempeng
Inkubasi pada 20-25 ºC
Amati pada hari 7,14, 21, 28 Catat tiap perubahan dan tetapkan jumlah mikroba viabel dengan metode lempeng
Hitung perubahan jumlah tiap mikroba dalam % selama pengujian
PENAFSIRAN HASIL Suatu pengawet dinyatakan efektif apabila: Jumlah bakteri viabel pada hari ke 14 berkurang hingga tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal Jumlah kapang dan khamir viabel pada hari ke 14 berkurang hingga tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal Jumlah tiap mikroba uji selama hari tersisa dari 28 hari pengujian adalah tetap atau kurang dari bilangan yang disebut di atas
KRITERIA EFIKASI ZAT PENGAWET
Keterbatasan Metode Uji
Masalah Praktis
Prosedur Alternative
Future Development
KASUS KHUSUS Thimerosal dalam Vaksin : kasus Autisme FDA pada tanggal 1 Juli 1999 merekomendasikan untuk mulai menurunkan atau menghilangkan thimerosal dari vaksin Vaksin yang mengandung thimerosal : Engerix (vaksin hepatitis B), HibTITER (vaksin konjugat Haemophilus influenzae tipe b)
