Pemanfaatan miroorganisme dalam pengembangan obat Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi ITB
Tokoh mikrobiologi dunia
Louis Pasteur
Alexander Flemming
Penyakit Infeksi Disebabkan oleh Mikroba patogen • Bakteri • Fungi • Algae • Parasit
Mikroba pada Gigi Streptococcus sobrinus Streptococcus mutans
Karies pada gigi
Perlu Antibiotik untuk mengobati nya ??
SUBCUTANEOUS MYCOSES
BLASTOMYCOSIS
PARACOCCIDIOIDOMYCOSIS
Antibotik : sulfamethoxypyridazine and sulfadimethoxine
HISTOPLASMOSIS - DARLING'S DISEASE
Antifungi yang digunakan : Amphotericin B, Ketokenazol
Antibiotik • Antibiotik didefinisikan sebagai suatu senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri. • Sampai hari ini ketergantungan kita terhadap antibiotik tidak dapat dipungkiri. Di tahun 1998, di United States, dilaporkan sekitar 80 juta resep (prescriptions) antibiotik diterbitkan untuk keperluan penyembuhan penyakit infeksi pada manusia , dan hal itu equivalen dengan sekitar 12.500 ton antibiotik dalam 1 tahun .
Secara umum cara kerja antibiotik merupakan salah satu dari 5 cara berikut : • Inhibisi sintesis asam nukleat (mis. Rifampicin; Chloroquine) • Inhibisi sintesis protein (mis. Tetracyclines; Chloramphenicol) • Aksi pada membran sel (mis. Polyenes; Polymyxin) • Interferensi dgn sistem enzyme (mis. Sulphamethoxazole) • Aksi pada dinding sel (mis. Penicillin; Vancomycin)
Mekanisme kerja antibiotik pada bakteri
Penemuan baru dan perkembangan antibiotik • In 1928, Alexander Fleming menemukan penisilin antibiotik pertama yang dihasilkan oleh suatu jamur (mould) Penicillium notatum yang tumbuh di atas cawan yagng berisi bakteri Staphylococcus yang sedang tumbuh. • Selanjutnya walaupun telah diencerkan 800 kali kultur jamur tersebut tetap dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Struktur dasar Penisilin
Alexander Flemming, 1928
Biosintesis penisilin dan sefalosporin L-α-aminoadipic acid
L-cysteine
L-valine
δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein
δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein-D-valine
Siklisasi 2 tahap
3 prekursor asam amino: L-valine, L-cystein, Lα-aminoadipat
Isopenicilin N C.Acremoneum, Streptomyces sp. Penicilin N Deacetoxycephalosporin C Deacetylcephalosporin C
Cephalosporin C
Penicillium chrysogenum Penicilin G
Perkembangan penemuan antibiotik • Di tahun 1939, Ernst Chain dan Howard Florey mengembangkan cara mengisolasi penisilin dan menggunakan nya pada Perang Dunia II. • Beberapa strategi telah dilakukan untuk menemukan senyawa antibiotik baru. Kandidat yang Potential sebagai natural antibiotics ditemukan dengan cara screening terhadap spesies bakteri dan fungi yang memiliki aktivitas antimikroba. • Semi-sintetik antibiotik dibuat dengan cara memodifikasi natural antibiotics • Obat Sintetik dirancang dengan mempelajari mekanisme virulensi bakteri patogen
Pembentukan eritromisin
• Oleh karena penggunaan antibiotik semakin luas, prevalensi resistensi antibiotik oleh bakteri sangat meningkat • Hasil evaluasi di Atlanta USA, 25% dari kasus pneumonia oleh bakteri terbukti resisten terhadap pensilin, sementara 25% lainnya sudah resisten terhadap lebih dari satu antibiotik. • Kasus retensi mikroba patogen menaikkan dosis nya atau mengganti dengan antibiotik baru
Resistensi Bakteri • Kasus resistensi yang meluas, memaksa para peneliti untuk mencari dan mengembangkan antibiotik baru agar memperoleh obat yang efektif dalam mengobati penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakateri patogen. • Modifikasi antibiotik yang telah ada termasuk salah satu usaha meningkatkan kinerja antibiotik
Terjadinya resistensi • Diperoleh melalui mutasi spontan • Vertical gene transfer • Lateral or horizontal gene transfer (transduksi, transformasi atau konjugasi) • Inaktivasi enzim terhadap antibiotik
The first rule of antibiotics is try not to use them, and the second rule is try not to use too many of them —Paul L. Marino, The ICU Book
Mekanisme resistensi pada bakteri
• Bakteri menjadi drug-resistant melalui berbagai cara , salah satunya adalah dengan memproduksi enzim yang dapat meng”inaktif”kan molekul antibiotik yang ada sehingga tidak lagi efektif membunuh bakteri Kasus MRSA (Methicilin-Resistant Staphylococcus aureus)
Supergerm
Proses multiresistensi antibiotik
Beberapa contoh kasus resistensi
Penggunaan antibiotik dalam makanan ternak merupakan salah satu penyebab resistensi bakteri terhada antibiotik . Beberapa bakteri yang ada dalam makanan (Foodborne), seperti Salmonella, E. coli dan Campylobacter adalah bakteri yang bersimbiosis dengan hewan ternak sapi dan ayam.
Salah satu penggunaan yang salah : antibiotik untuk mengatasi penyakit yg disebabkan virus
Usaha memerangi resistensi bakteri • Para peneliti mempelajari bentuk molekul dari enzim yang dihasilkan oleh drug-resistant bacteria, kemudian mencoba untuk mendesain "fighter molecules" yang secara tepat dapat men”deaktif”kan enzim tersebut, sehingga bakteri akan sensitif kembali terhadap antibiotik yang sama. • Mencari sumber antibiotik baru
The discovery of antibiotics • Untuk memerangi terjadinya kejadian resistensi bakteri, industri farmasi harus selalu mengembangkan penelitian bersama perguruan tinggi dan lembaga penelitian dalam menemukan antibiotik baru demi mempertahankan efektivitas pengobatan penyakit infeksi dengan antibiotik
Top 25 Biotechnol Company (2011) • • • • • • • • • • • •
Abbott Laboratories Amgen, Inc. AstraZeneca Pharmaceuticals Bayer HealthCare Pharmaceuticals Biogen Idec Inc. Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Bristol-Myers Squibb Company Chiron Corporation Eli Lilly and Company Forest Laboratories. Genentech, Inc. Genzyme Corporation
• • • • • • • • • • • • •
Gilead Science, Inc. GlaxoSmithKline LLC Johnson & Johnson Merck / Schering-Plough Pharmaceuticals MGI Pharma, Inc./ Eisai Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mylan Pharmaceuticals Corporation Novaris Pharmaceuticals Corporation Pfizer Roche Diagnostics Corporation Sanofi-Aventis Takeda Pharmaceuticals North America, Inc. Teva Pharmaceutical Industries Ltd.
• Kebutuhan antibiotik sejak 1940 sampai sekarang (Sumber : Timeline of Antibiotics)
Berbagai cara penemuan obat baru
Obat baru untuk TB Setelah Percobaan klinik tahap I dilanjutkan kepada tahap II dan III, persetujuan dari Badan pengawasan Makanan dan Obat (FDA) diberikan kepada Antibiotik bagi TB itu kini diberi nama diarylquinolones. Diarylquinolone TMC207 merupakan preparat baru yang mempunyai potensi sebagai antituberculosis. Mekanisme antituberculosis dari diarylquinolone TMC207 ini adalah dengan cara menghambat sintetaseATP dari kuman Mycobaterium.
Pegagan bahan alam untuk mengobati TB • Centella asiatica
Tahapan pencarian antibiotik baru • Skrining awal kandidat antibiotik (in-vitro, in-silico) • Uji mutagenitas (uji Ames) • Uji toksisitas (LD50) • Uji aktivitas antimikroba (MIC,MBC) (CLSI method) • Uji potensi antibiotik (Kirby Bauer method)
Peneliti Norwegian meneliti new antibiotik baru dari bakteri yang ada di laut sekitar perairan Norwegia. The Norwegian University of Science and Technology (NTNU) dan Pusat Penelitian SINTEF telah melakukan bioprospecting selama 5-6 tahun untuk mencari seenyawa-senyawa penting yang dihasilkan oleh bakteri laut (marine bacteria). Bakteri-bakteri tersebut dievaluasi fisiologi dan genetik nya, dilakukan screening modern dan dicoba produksinya di laboratorium fermentasi
Metabolit sekunder untuk pertahanan diri atau kompetisi dengan mikroba lain
Seleksi mikroorganisme • Mikroorganisme yang digunakan dalam proses fermentasi biasanya bukan yang wild type. Umumnya telah dilakukan modifikasi atau mutasi secara genetik untuk menghasilkan galur mikroba yang unggul • Strain improvement (pemuliaan galur) dilakukan secara fisik, kimia maupun rekayasa genetik • Mutasi fisik misalnya dengan penyinaran ultraviolet , x-rays • Mutasi kimia dengan senyawa kimia tertentu, • Mutasi biologi dengan cara gene amplification,dimana beberapa salinan gen pengkode enzim yang terlibat dalam produksi antibiotik yang dituju dapat diinsersikan ke dalam suatu plasmid, lalu di insersi kan ke dalam sel host untuk produksi.
Menguji aktivitas antimikroba
Perubahan morfologi pada Streptomyces.sp saat diinduksi oleh senyawa atau molekul tertentu
Uji sensitivitas mikroba terhadap beberapa antibiotik
Menggali potensi mikroorganisme dalam penemuan obat baru • • • • •
Perbaikan prosedur Culturing Extremophiles Endophytes Mikroba laut Biosintesis Kombinatorial
Perbaikan Prosedur Culturing • Perkembangan terbaru tentang teknik pengambilan biakan dari alam (terutama dari laut dan tanah) (seawater and soil) • Gel-encapsulated single cells (gel micro-droplets = GMDs) • Proses ini mencegah terjadinya “over growth” oleh mikroba yang cepat tumbuh, dan dapat menstimulasi pertumbuhan mikroba yang termasuk slow-growing microbes • Mikroba yang sulit di biak kan secara in-vitro
Acuan dalam mengeksplor tanah untuk menggali potensi mikroba nya serta guideline untuk proses produksi
Extremophiles • Mikroba yang hidup dalam habitat yang ekstrem, misalnya yang bersifat asidofil (acidic sulfurous hotsprings) atau alkalofil (danau yang bersifat alkali) • Mikroba termofil dan hipertermofil • Mikroba yang hidup dalam air yang mengandung metal atau lingkungan dengan polusi tinggi
Endophytes • Mikroba yang berasosiasi dengan tumbuhan • Dapat bersifat simbiosis atau patogenik • Banyak ditemukan senyawa bioaktif baru, contoh: • kakadumycin dari endofit Streptomycete pada tanaman Grevillea pteridifolia, • Endofit Aspergillus nidulans anti-cancer agent
Mikroba laut • Sedimen laut dalam merupakan sumber yang potensial karena terdapat bakteri Actinomycete yang unik , misalnya Salinospora yang menghasilkan senyawa Salinosporamide A suatu inhibitor proteasome yang sangat poten • Endo-symbiosis antara fungi dan bakteri : Rhizopus dan Burkholderia menghasilkan senyawa Rhizoxin , semula dikembangkan sebagai pest-control, lalu menjadi anticancer drug
Biosintesis Kombinatorial • Penggalian informasi tentang peran dan fungsi PKS (Polyketide Synthase Enzymes) dan gen nya pada beberapa bakteri • Peran dan fungsi NRP (Non-Ribosomal peptide synthetase) • Kombinasi informasi ini dapat diarahkan kepada sintesis senyawa baru melalui proses rekayasa genetik • Contoh : sintesis Epothilone dari myxobacterium Sorangium cellulosum
Bagaimana produksi antibiotik /obat baru setelah ditemukan kandidat nya? Pengembangan skala lab Pengembangan skala pilot Pengembangan skala industri
• Antibiotik diproduksi dalam skala industri melalui proses fermentasi atau total sintesis kimia atau kombinasi kedua nya • Proses Fermentasi dengan menggunakan inokulum mikroba minimum dalam large containers (100,000–150,000 liters or more), dengan pengaturan oksigen dialirkan ke dalam medium cair, pengaturan suhu dan pH.
• Oleh karena antibiotik adalah metabolit sekunder, jumlah nya harus dikontrol dengan baik untuk mendapatkan hasil yang optimal. Setelah proses produksi selesai, antibiotik yang terbentuk harus diekstraksi, isolasi, dan dimurnikan. • Berbagai cara pemurnian telah dikembangkan antara lain melalui cara kromatografi penukar ion, adsorpsi, atau pengendapan kimiawi . • Cara sintesis kimia melibatkan reaksi berantai yang menggunakan pelarut organik, katalis dan proses kimia lainnya.
Tahapan dalam proses fermentasi • • • • •
Formulasi medium untuk mikroorganisme Sterlisasi medium dan persiapan lainnya Produksi yang aktif dan inokulasi kultur murni Ekstraksi produk dan pemurnian Penanganan produk limbah (effluent)
Proses fermentasi secara umum : contoh Sacharomyces cereviseae
Sistem kultur untuk pertumbuhan dan produksi menggunakan mikroorganisme • Sistem batch (kultur curah) • Sistem fed-batch (kultur curah umpan) • Sistem continuous (kultur sinambung)
Batch
Fed-batch
Continuous
Fermentor
Kontrol pada proses fermentasi contoh : produksi Sefalosforin
Modifikasi sruktur antibiotik kuinolon MODIFIKASI
EFEK
Satu atom Fluor di posisi C-6
Meningkatkan aktivitas inhibisi DNA girase
Atom Fluor kedua pada posisi C-8
Meningkatkan absorpsi , memperpanjang waktu eliminasi, memingkatkan fototoksisitas
Gugus Piperazin pada posisi C-7
Meningkatkan aktivitas terhadap bakteri Gram negatif Staphylococci dan Pseudomonas
Alkilasi cincin C-7
Memperbaiki aktivitas terhadap bakteri Gram positif
Gugus metil pada atom N di cincin C-7 piperazin
Meningkatkan eliminasi dan memperbaiki bioavalibilitas
Uji bakteriostatik dan bakterisida
KLT untuk identifikasi kandungan metabolit sekunder dari biakan mikroba
Proses PCR dilanjutkan dengan Elektroforesis 1 2 3 4 5 NOTE : 1. DNA marker λ/HindIII/EcoRI 2. DNA plasmid pSTA14 (isolated) 3. DNA plasmid pSTA14 (PCR product/ positive control) 4. DNA transformants (PCR product with plasmid) 5. DNA mutant (PCR product / negative control)
546,15 bp
811 bp
Conclusion : gene niaD in pSTA14 plasmid proved existed in transformant cells
KONDISI DI INDONESIA • Bidang usaha kefarmasian nasional masih didominasi oleh perdagangan (trading), dan masih sangat lemah dibidang manufakturing • Perusahaan farmasi lokal, yang sampai saat ini berjumlah 344 masih terkonsentrasi pada pengembangan formula, yang bahan baku obatnya 95% masih diimpor • Untuk pasar antibiotik, amoksisilin masih merupakan kebutuhan tertinggi Sumber :
Fakta dan Data • Kebutuhan tahun 2007: Amoksisilin 892,7 ton; Ampisilin: 79,8 ton; Sefalosporin dan derivatnya 260 ton (Data Deputi I Badan POM) • Baru satu industri di Indonesia yang memproduksi amoksisilin dengan bahan baku diimpor dari China (6-APA dan Dane Salt) • Perlunya kemandirian nasional dalam pemenuhan kebutuhan amoksisilin Sumber :
Produksi Sepuluh Antibiotik Terbesar (2007)
NO
JENIS ANTIBIOTIK
JUMLAH PRODUKSI (Kg)
Sumber :
PRESENTASE (%)
1
Amoxicillin
892,713.21
72.54
2
Cefadroxil
224,775.96
18.26
3
Ampicillin
79,763.39
6.48
4
Cefotaxime
13,148.97
1.07
5
Ceftriaxone
13,039.53
1.06
6
Cefixime
3,234.18
0.26
7
Cefuroxim
1,623.03
0.13
8
Cefotiam
1,319.63
0.11
9
Ceftazidime
682.55
0.06
10
Cefradin
371.61
0.03
Biosintesis penisilin dan turunannya (Ferreira et al., 2000)
Sumber :
Topik Penelitian dengan Mahasiswa S3 di Sekolah Farmasi ITB • Fermentasi antibiotik Sefalosporin dan Pemuliaan galur Cephalosporium acremonium dengan cara mutasi sinar uv • Produksi antikolesterol (Lovastatin) dari Aspergillus terreus dan Monascus purpureus dengan cara fermentasi • Pemuliaan galur Aspergillus terreus melalui fusi protoplast, copy gen produksi. • Studi Transformasi genetik Monascus purpureus. • Studi protein spesifik dari Mycobacterium tuberculosis untuk mencari kandidat vaksin baru untuk penyakit TBC • Fermentasi dan modifikasi pigmen karotenoid dari jamur oncom Neurospora sp. untuk pewarna obat, makanan dan kosmetika • Produksi Plantaricin dari Lactobacillus plantarum sebagai anti Candida albicans
Contoh Topik Penelitian Mahasiswa S1 dan S2 di Sekolah Farmasi ITB dalam rangka pencarian senyawa antimikroba Antibacterial Activity of Cinnamomum cassia L. Barks and Salvadora persica L. Heartwood Extracts Against Dental Caries Bacteria Marlia Singgih, Irda Fidrianny, Khaliesah Aimi Kamal Ariffin
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF INDONESIAN TEA LEAVES (Camellia sinensis L.) AGAINST Streptococcus mutans ISOLATED FROM DENTAL CARIES PATIENTS Marlia Singgih Wibowo, Irda Fidrianny, Novrita Lestia Utami
AKTIVITAS ANTIMIKROBA REMPAH – REMPAH TERHADAP BAKTERI PATOGEN PADA MAKANAN KERANG LAUT Marlia Singgih, Amanda Bernadine FORMULASI SAMPO ANTI KETOMBE YANG MENGANDUNG TEA TREE OIL DAN PENGUJIAN AKTIVITAS SEDIAAN TERHADAP MALASSEZIA FURFUR Jessie S.Pamudji, Marlia Singgih, Angelia
Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, 000 – 000 DOI10.1002/mnfr.200700282 Research Article
Identification and quantification of methylglyoxal as the dominant antibacterial constituent of Manuka (Leptospermum scoparium) honeys from New Zealand Elvira Mavric, Silvia Wittmann, Gerold Barth, and Thomas Henle Institute of Food Chemistry, Technische Universitt Dresden, Dresden, Germany Institute of Microbiology, Technische Universitt Dresden, Dresden, Germany
