Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologi pada Produk Farmasi dan Makanan Marlia Singgih Wibowo
Jenis Uji
Uji langsung Teknik kultur Metode Enumerasi Metode Alternatif Metode Cepat
Uji Langsung
Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) Metode pewarnaan DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)
Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) : morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan bentuk koloni Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) : bentuk dan motilitas mikroorganisme, bentuk dan warna hifa. Ada dua jenis mikroskop : optik dan fase kontras Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel disaring dengan filter, bakteri diwarnai dengan zat warna tertentu lalu dilihat di bawah mikroskop epifluoresens
DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)
Filter membran polikarbonat Zat warna senyawa fluorokromatis yang berfluoresensi setelah berikatan Acridine orange : Ikatan denan dsDNA : hijau Ikatan dengan ssRNA : oranye Ikatan dengan sel hidup : kuning Ikatan dengan sel mati : hijau terang
Teknik Kultur
Walaupun berbagai metode analisis cepat dan sensitif telah dikembangkan untuk identifikasi dan karakterisasi mikroba patogen, teknik pembiakan mikroba di dalam medium mikrobiologi masih diperlukan terutama untuk konfirmasi identitas. Media mikrobiologi yang sering digunakan umumnya adalah medium padat atau cair. Medium padat umumnya mengandung agar.
Kultur pada media agar
Tujuan Isolasi Tujuan Determinasi Tujuan Penyimpanan Tujuan Pertumbuhan Tujuan Produksi Tujuan Analisis
Metode Enumerasi
Plate Count : metode perhitungan mikroba yang ditumbuhkan di atas cawan petri MPN Count (Most probable Number) : metode perhitungan relatif berdasarkan fenomena kekeruhan Analisis Fisikokimia : metode perhitungan mikroba berdasarkan komponen sel atau metabolit yang dihasilkan
Metode Alternatif
Dye-reduction Test Electrical Methods ATP Determination
Dye-reduction Test
Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna (dye) Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem biologi yang aktif dan akan menghasilkan perubahan warna Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarna dan bentuk tereduksi tidak berwarna Contoh dye yang sering digunakan : metilen blue, resazurin, trifeniltetrazolium klorida
Electrical Methods
Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya akan menyebabkan perubahan komposisi medium dan oleh karenanya akan merubah sifat elektriknya. Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi, kapasitans, dan impedansi
Penetapan ATP
ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidup yang melakukan metabolisme Diukur melalui aktivitas enzim luciferase dan substrat luciferin menghasilkan pendaran cahaya (chemiluminesence)
Metode cepat
Metode Imunokimia Metode molekuler
Metode Imunokimia
Prinsip analisis : berdasarkan reaksi AntigenAntibodi Komponen sel atau metabolit sel mikroba bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan pereaksi (suatu Ab yang spesifik) menghasilkan kompleks Ag-Ab Kompleks Ag-Ab divisualisasi dengan berbagai cara yang dapat diukur (spektrofotometri, spektofluorometri, dll.)
Prinsip ELISA (Enzyme LinkedImmunosorbent Assay) Antigen Kompleks AgAb
Konjugat enzim pada Ag-Ab Substrat
Antibodi Reaksi enzimatik
Produk berwarna
Jenis Metode Imunokimia
EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay) RIA (Radio Immuno Assay) IFA (Immuno Fluoresence Assay) LIA (Luminescence Immuno Assay)
Metode Molekuler
Cara Hibridisasi Cara Amplifikasi
Teknik hibridisasi
Proses denaturasi dsDNA menjadi ssDNA menggunakan pemanasan Kombinasi ssDNA tersebut dengan suatu segmen ssDNA lain yang telah di beri probe (label) Hibrid DNA yang telah mengandung label dapat dideteksi dengan berbagai
Teknik Hibridisasi ssDNA dsDNA
denaturasi
ssDNA dgn probe
ssDNA
Hibrid DNA berlabel
Teknik amplifikasi
PCR (polymerase chain reaction) : reaksi polimerisasi berantai DNA target didenaturasi menggunakan panas Pelekatan primer (suatu oligonukleotida pendek) yang komplemen dengan salah satu ujung ssDNA Sintesis DNA yang diawali dari primer Proses pengulangan 20 – 50 x
3’ 5’
5’ 3’ Denaturasi pada 94 °C
3’
5’
5’
3’ Annealing primer pd 72°C
3’
5’
5’
3’
3’
5’ Polimerisasi pada 72 °C
5’
3’
3’
5’
dsDNA baru
5’
3’
dsDNA baru
Proses berulang
Denaturasi Annealing Polimerisasi
Proses setelah PCR
Setelah pengulangan 20 – 50 x diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat di deteksi Produk PCR dapat dideteksi dengan elektroforesis Pita-pita DNA dibandingkan dengan marker DNA
Elektroforesis DNA
DNA marker
Produk PCR
PCR Fingerprints of Replicates of an isolate of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of Preservation with Mr Primer
L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in water , 12-16 cryopreserved, 17 control
M. Ryan
Instrumen dan Bahan untuk analisis PCR
DNA Thermal cycler DNA target Primer DNA polimerase Nukleotida Larutan Mg 2+ Alat Elektroforesis
Biochemical Methods: Enzymes
An APIZYM strip Enzymes tested for include: acid/alkaline phophatase, trypsin, chymotrypsin, galactosidase, glucosidase, glucuronidase, proteases, fucosidase.
M. Ryan
Biochemical Methods: Metabolites
Thin Layer Chromatography of Secondary Metabolites (Example of Patulin production by Penicillium spp.)
