Pemastian Mutu Produk Steril di Industri Farmasi Marlia Singgih Wibowo, PhD. School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung
PENDAHULUAN • USP General Chapters : berisi chapterchapter tentang berbagai metode analisis (Tests dan Assays) yang resmi (Official tests and assays) dan informasi penting yang berkaitan dengan metode-metode analisis terkait • Produk obat atau bahan baku, eksipien yang termasuk dalam cakupan Farmakope harus memenuhi persyaratan dalam farmakope • Chapter/ bab dengan nomor diatas 1000 merupakan informasi yang tidak memuat standard ataupun spesifikasi
Bahan/Produk Steril • Bahan baku obat, Bulk, (non-complex Active Drug Substances, Biotechnology-derived Drug Substances, dietary supplement Ingredients) • Produk Obat, Vaksin(non-complex active drug, biotechnology-derived drug products, Bloodblood products, Gene and Cell Therapy products, Dietary supplement products) • Compounding Sterile Preparations • Bahan eksipien obat • Alat (devices) , containers, • Alat kesehatan (medical divices)
Jenis analisis yang utama untuk produk steril (USP 30 Chart 10 page 25) • Endotoxin Limits : <85> Bacterial Endotoxins test • Sterility Tests : <71> Sterility tests dan <1208> Sterility testing-Validation of Isolator Systems • Aseptic processing : <1116> Microbiological Evaluation of Clean Rooms and Other Controlled Environments, <1208>, <1211> Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles
• Filtration : <1211> • Assembly : <1116>, <1207> Sterile product Packaging-Integrity Evaluation – – – –
BFS : <1116> FFS : <1116> SFS : <1116> Others : <1072> Desinfectans and Antiseptics, <1112> Application of Water Activity Determination to Non-sterile Pharmaceutical Products, <1116>, <1117> Microbiological Best Laboratory Practices – <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods
Preparasi sediaan steril di RS atau health centre lain • Mulai 1 Januari 2004 USP menetapkan bab <797>Pharmaceutical Compounding: Sterile Preparations • Di published pertama kali pada USP 27 dan NF 22 tahun 2004 sampai saat ini • Bab <797> berisi tentang prosedur, persyaratan dan penetapan standar2 yang dapat diterapkan pada seluruh aktivitas pembuatan produk steril
Penetapan tingkat risiko(Risk-level Determination) pada pembuatan produk steril
• Low-risk • Medium Risk • High Risk
Pemastian Mutu produk steril • Bahan baku, intermediate, produk akhir • Production process : teknik aseptik, sterilisasi akhir • Equipments • Quality Control • Environment : monitoring, validasi • Personnel : skill, training • Documentation : kelengkapan, arsip • Sales : monitoring, evaluasi
QA Program • • • • •
Monitoring Evaluating Correcting Improving Maintaining
Fokus pembahasan • Uji Sterilitas • Uji Endotoksin
UJI STERILITAS
Pembuatan produk farmasi steril
Tujuan uji sterilitas: Untuk menetapkan apakah bahan farmakope yang harus steril memenuhi syarat berkenaan dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masing-masing monografi
Suatu produk dikatakan STERIL • Bila memenuhi persyaratan dalam uji sterilitas • Kemungkinan hasil positif dapat terjadi karena teknik yang salah atau kontaminasi lingkungan pada waktu pengujian.
Mikroba yang Digunakan: (1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC No. 8482)
Ketentuan hasil: • Jika terdapat kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebut tidak memenuhi syarat. • Jika terdapat kegagalan menunjukkan adanya kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur dalam farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebut memenuhi syarat.
Media yang digunakan : Media yang digunakan mempunyai sifat merangsang pertumbuhan bagi mikroba yaitu: • Fluid Thioglycolate Medium (FTM) dan / atau Alternative Thioglycolate Medium (ATM) • Soybean-Casein Digest Medium (SCDM)
Cairan Pengencer dan pembilas : Cairan A Cairan D = Cairan A + 1mL polisorbat 80/L Cairan K
Cairan A • 1 gram jaringan hewan yg telah diuraikan oleh enzim pepsin, dilarutkan dlm air smp 1 liter, saring atau sentrifuga, pH diatur 7,1 • Jika akan digunakan untuk uji sediaan yang mengandung senyawa gol.penisilin/sefalosporin (beta laktam), maka media tsb harus ditambahkan enzim penisilinase utk proses inaktivasi
Cairan D • Adalah 1 L Cairan A + 1 mL Tween 80 • Digunakan bila sediaan mengandung lesitin, atau minyak • Atau utk uji peralatan steril dengan menggunakan penyaring membran
Cairan K • Cairan yang mengandung Jaringan hewan yg telah diuraikan oleh enzim lambung (peptic digest), beef extract, dan Tween 80 • Semua cairan pembilas harus disterilkan dengan otoklaf
Penambahan penisilinase • Untuk sediaan mengandung pengawet antimikroba golongan penisilin • Tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menggunakan sediaan penisilinase yang sebelumnya telah diuji daya penginaktif penisilin atau sefalosporin atau tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menambahkannya ke dalam tabung FTM dan sejumlah antibiotik dalam spesimen uji 1. Inokulasi media dengan 1 ml pengenceran (1 : 1000) biakan 18 jam-24 jam Staphylococcus aureus (ATCC 29737) dalam FTM. 2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 30o – 35o
Uji Fertilitas • Tujuan? • Untuk memastikan bahwa media yang digunakan dapat menumbuhkan mikroba uji sampai waktu 7 hari • Dilakukan sebelum uji sterilitas thp sampel
Uji Fertilitas Inkubasi Media
Mikroba Uji Suhu (oC)
Fluid Tioglikolat Medium
Tioglikolat alternative Soybean – casein digest
Kondisi
(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)
30 – 35
(2) Candida albicans (ATCC10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC8482)
30 – 35
(1) Bacteroides vulgatus (ATCC8482)
30 – 35
Anaerobik
(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)
20 – 25
Aerobik
(2) Candida albicans (ATCC No. 10321)
20 – 25
Aerobik
30 – 35
METODE UJI STERILITAS • INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI • TEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN
Hal yang perlu dilakukan sebelum Prosedur Inokulasi langsung: Uji Aktivitas Bakteriostatik dan Fungistatik Jika pertumbuhan mikroba uji dalam campuran media bahan secara visual sebanding dengan pertumbuhan dalam tabung kontrol, gunakan jumlah bahan dan media seperti yang tertera pada Tabel jumlah untuk bahan cair dalam pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi Penetapan perbandingan bahan dan media yang tidak merugikan pertumbuhan mikroba uji
Jumlah untuk bahan cair
Volume minimum tiap media
Isi wadah (mL)
Kurang dari 10
Volume minimum diambil dari wadah untuk tiap media
1mL, atau seluruh isi jika kurang dari 1mL
Digunakan untuk inokulasi langsung ke volume yang diambil dari tiap wadah (mL)
Digunakan untuk membrane atau setengah bagian membrane yang mewakili volume total dari jumlah wadah yang sesuai (mL)
Jumlah wadah per media
15
100
20 (40 jika volume tiap wadah tidak cukup untuk kedua media)
10 sampai kurang dari 50
5mL
40
100
20
50 sampai kurang dari 100
10mL
80
100
20
50 sampai kurang dari 100 dimaksudkan untuk pemberian intravena
Seluruh isi
-
100
20
100 sampai 500
Seluruh isi
-
100
10
500mL
-
100
10
Di atas 500
Ketentuan Penambahan atau pengurangan dalam menentukan perbandingan bahan dan media • Jika sejumlah tertentu bahan dalam 250mL media masih mempunyai daya bakteriostatik atau fungistatik, kurangi jumlah bahan hingga diperoleh jumlah maksimum yang tidak menghambat pertumbuhan uji dalam 250mL media. • Untuk cairan dan suspensi yang jumlahnya kurang dari 1mL, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan dan mencegah hambatan pertumbuhan. • Untuk bahan padat yang tidak segera larut atau dapat terdispersi, jika jumlahnya kurang dari 50mg, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan untuk mencegah hambatan pertumbuhan.
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat • Zat padat • Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnya • Alat kesehatan steril • Alat suntik kosong atau terisi steril
Prinsip pengujian: Inkubasi minimal 14 hari dengan pengamatan pada hari ke 3,4,atau 5, hari ke 7 atau 8, dan pada hari terakhir pengujian. Bahan uji
Bahan uji + media
Catatan: Perlakuan awal berbeda untuk masing-masing produk farmasi dan kesehatan.
Bahan uji merupakan larutan yang pada produk farmasi dan kesehatan kecuali yang berbentuk cairan digunakan untuk membilas atau mendispersi produk tersebut.
Perlakuan awal untuk berbagai sediaan 1. 2. 3.
Cairan Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media. Campur cairan dengan media tanpa aerasi berlebihan. Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat
1. 2.
Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah, dan diperlakukan tiap kelompok sebagai berikut: Secara aseptik pindahkan 100mg dari tiap wadah dari 10 wadah ke dalam labu berisi 100mL pembawa air steril yang dapat mendispersi homogen bahan uji dalam seluruh campuran cairan. Campur 10mL alikot dari campuran cairan yang diperoleh dengan 80mL tiap media.
Zat padat
Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang sudah dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) tidak kurang dari 300mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari 300mg. Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40mL FTM dan SCDM.
Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnya
Dari setiap kemasan, ambil secara aseptik 2 bagian atau lebih masing-masing 100 sampai 500mg dari bagian paling dalam. Secara aseptik pindahkan bagian bahan uji ini ke dalam sejumlah tertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi.
Alat kesehatan steril
Untuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkan keseluruhan ke dalam tidak lebih dari 1000mL media, uji alat utuh menggunakan media yang sesuai.
Untuk alat yang mempunyai pipa/saluran berlubang 1. seperti alat transfusi atau infus atau yang ukurannya menyebabkan pencelupan tidak dapat dilakukan dan hanya saluran cairannya yang harus steril, Bilas lumen masing-masing dengan sejumlah FTM dan SCDM hingga diperoleh kembali tidak kurang dari 15mL setiap media. 2. Inkubasi dengan tidak kurang dari 100mL masing-masing media.
Prosedur untuk: Alat suntik kosong atau terisi steril • Uji dilakukan sama seperti uji untuk produk steril dalam ampul atau vial. • Cara inokulasi langsung dapat dilakukan jika penetapan bakteriostatik dan fungistatik telah menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan dalam kondisi pengujian.
UJI STERILITAS DENGAN TEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN
Kegunaan uji sterilitas dengan teknik penyaringan membran • Berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut yang bersifat bakteriostatik atau fungistatik, untuk memisahkan mikroba kontaminan dari penghambat pertumbuhan. • Berguna untuk bahan seperti minyak, salep atau krem yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer bukan bakteriostatik atau bukan fungistatik. • Berguna untuk uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan.
Prosedur awal: • Buat perbandingan yang sama menggunakan sejumlah tertentu bahan uji dan cairan pengencer dan pembilas yang sesuai. • Bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan pengencer dan pembilas.
Pertumbuhan mikroba uji dari membran yang digunakan untuk menyaring bahan diikuti cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi secara visual sebanding dengan pertumbuhan dari membran yang hanya digunakan untuk menyaring cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi.
UJI MENGGUNAKAN PENYARINGAN MEMBRAN Untuk: • Cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air • Cairan yang tidak bercampur dengan pembawa air (kurang dari 100mL per wadah) • Zat padat yang dapat disaring • Salep dan minyak yang larut dalam Isopropil Miristat • Zat padat yang tak dapat disaring • Alat kesehatan Peralatan: porositas 0,45µm, diameter ±47mm, kecepatan penyaringan 55mL-75mL/mnt pada tekanan 70cmHg.
Penafsiran Hasil Uji Sterilitas • Tahap I Amati adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan / atau pertumbuhan pada permukaan pada isi semua wadah dalam interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi. Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhi syarat. • Tahap II Jumlah spesimen yang diuji minimal 2 kali jumlah tahap I. Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat. Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji tidak memenuhi syarat.
UJI ENDOTOKSIN
Pendahuluan Produk farmasi parenteral
Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah. Salah satu tahap : Sterilisasi Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN
Bagaimana produk parenteral dapat terkontaminasi endotoksin? • Pada proses sterilisasi produk parenteral (menggunakan panas), bakteri gram negatif yang mungkin ada dalam produk, akan mati dan lisis terjadi, endotoksin akan terlepas dan tetap tinggal di dalam produk • Sifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)
Endotoksin dan Pirogen • Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif • Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena • Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin • Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida (LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun membran luar bakteri gram negatif.
Struktur LPS • Contoh : LPS dari Salmonella terdiri dari bagian Lipid A yang hidrofob yang terikat pada suatu daerah inti yang mengandung molekul KDO (2-keto-3-deoksioktonat)
Struktur LPS Salmonella Mannose-Abequose Rantai samping
Rhamnose Galactose
n
Glucose-N-acetylglucosamine Galactose
Glucose-Galactose Inti polisakarida
Heptulose Heptulose-P-P-Ethanolamine KDO KDO-KDO-P-Ethanolamine P-GlcN-GlcN-P Lipid A
Efek endotoksin bagi tubuh • • • •
demam aktivasi sistem sitokin rusaknya sel-sel endotelial permeabilitas pembuluh darah berubah sehingga menyebabkan turunnya tekanan darah • dll.
Perkembangan regulasi tentang uji pirogen • Bacterial endotoxin test (BET) merupakan salah satu uji yang penting terhadap produk parenteral dan alat kesehatan • 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode kelinci (Rabbit test) • Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942 sampai 40 tahun kemudian • 1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus amoebocyte lysate (LAL) test
LAL-test • The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri. • LAL diperoleh dari ekstrak cair amebosit Horseshoes crab (Limulus polyphemus atau Tachypleus tridentatus) • Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri)
Mengapa LAL test? • Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk, untuk menghindari penggunaan hewan/binatang dalam percobaan • Metode lebih akurat
Limulus amebocyte lysate • Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus atau Tachypleus tridentatus • Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah. • Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.
• Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.
Reaksi pembentukan gel (clot) spontan antara endotoksin (LPS) bakteri dan protein dalam amebosit.
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Horseshoe crab
African Wolf Spider
•
Pembentukan gel padat pada titik akhir reaksi sebagai hasil reaksi antara LAL dan endotoksin.
•
Reagen LAL + larutan uji dalam tabung reaksi dengan volume yang sama.
•
Inkubasi 37°C±2°C selama 60 menit±1 menit.
•
Reaksi (+) : gel stabil dan melekat pada dasar tabung bila dibalikkan 180º. Reaksi (-) : gel kental, terlepas dari dasar tabung bila dibalikkan 180º.
•
Alat Tabung reaksi, pipet ukur, pengocok vorteks, oven, inkubator.
Alat-alat gelas dibuat bebas pirogen : oven 200ºC selama 4 jam.
REAGEN LAL • ekstrak amebosit dalam kepiting landam kuda, Limulus polyphemus (Atlantic horseshoe crab)
REAGEN TAL • Tachypleus Amebocyte Lysate (TAL): ekstraksi Amebocyte Tachypleus tridentatus (Japanese horseshoe crab atau Chinese horseshoe crab)
Bahan : • Reagen TAL 0,125 EU/ml , • Control Standar Endotoksin (CSE) 10 EU/ml, • Reagent Water (RW), • Sampel : Aqua pro injeksi.
Tahapan Sebelum Uji LAL terhadap sampel • Uji konfirmasi kepekaan lisat • Optimasi kondisi percobaan • Verifikasi atau Validasi metode (*sesuai keperluan di Laboratorium uji) • Uji terhadap sampel
• Untuk mengecek kepekaan/sensitivitas reagen TAL, apakah sesuai dengan yang tercantum pada label. • Dibuat 4 seri pengenceran (2λ; λ; 0,5λ dan 0,25λ) dari CSE dalam 4 replikasi dan kontrol negatif (RW) • Persyaratan : Kadar rata-rata geometrik titik akhir harus ≥ 0,5λ dan ≤ 2,0λ .
Penyiapan Larutan CSE Penyiapan Kontrol Negatif (LRW) Penyiapan Kontrol Positif (CSE)
Penyiapan Sampel 1. 2.
Sampel Sampel Tercemar
Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE)
Penambahan Reagen LAL
Inkubasi 37ºC±1ºC, 60 menit±2 menit
1,0 ml RW
0,2ml
1,8 ml RW
8λ= 1 EU/ml
(10/0,125 x λ = 80 λ)
0,1ml
0,5ml
1,0ml
CSE 10 EU/ml
0,1ml
0,2ml
1,0 ml RW
4λ= 0,5EU/ml
1,5 ml RW
1,4 ml RW
1,5 ml RW
3,1 ml RW
2λ = 0,25 EU/ml
λ= 0,125 EU/ml
0,5 λ = 0,0625 EU/ml
0,25 λ = 0,03125 EU/ml
Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA=MVD)
PMA =
Batas kadar endotoksin Kepekaan (λ) 0,25 EU/ml 0,125 EU/ml =2
Jadi, sampel ini hanya dapat diencerkan maksimal 1: 2
• Optimasi kondisi dilakukan dengan melakukan variasikan suhu dan atau waktu inkubasi.
Parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode Parameter Performa Analitik
Kualitatif (ID)
Perhitungan Kembali Kategori I
Perhitungan Kembali Kategori III Kuantitatif
Batas Tes
Perhitunga n Kembali Kategori III
Akurasi
tidak
ya
ya
*
*
Presisi
Tidak
ya
ya
tidak
ya
Spesifisitas
ya
ya
ya
ya
*
Batas Deteksi
ya
tidak
tidak
ya
*
BatasiKuantit asu
Tidak
tidak
ya
tidak
*
Linearitas
tidak
ya
ya
tidak
*
Rentang
Tidak
Ya
ya
tidak
*
ya
ya
ya
ya
ya
Ketangguhan
*
mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik
Contoh
LAL Reagent • • • • •
Sensitivitas : 0,125 EU/ml Lot No. : Y4661L Exp. Date : 09 – 2011 Kemasan : Vial @ 5,2 ml CSE Potency : 500 NG/Vial (2,5 ml) • Lot No. : EM 84632 • Exp. Date : 03 -2012 • Kemasan : Vial @ 2,5 ml
Hasil Uji Konfirmasi Kepekaan (λ) Repli kasi
K (-) RW
CSE 2λ
λ
0,5λ
0,25λ
E (EU/ml)
Log E
1
-
+
+
+
-
0,0625
-1,204
2
-
+
+
-
-
0,125
-0,903
3
-
+
+
-
-
0,125
-0,903
4
-
+
+
-
-
0,125
-0,903
Jumlah
-3, 913
Perhitungan Rata- Rata Geometrik kadar Titik Akhir
Σe f
GM = antilog Σe/f = jumlah logaritma kadar titik akhir dari seri pengenceran yang digunakan = jumlah replikasi GM = antilog -3,913/4 = 0,105 EU/ml
Persyaratan : Kadar rata-rata geometrik titik akhir harus ≥ 0,5λ dan ≤ 2,0λ . (≥ 0,0625EU/ml dan ≤ 0,25EU/ml)
Kesimpulan : Memenuhi syarat
Hasil Pengujian dengan LAL Re K (-) pli RW kas i
Kontrol Positif 2λ
λ
0,5λ
0,25 λ
Kontrol Sediaan Positif
Sampel Neat
1:2
1:4
1:8
1:16
Pengujian 1 1
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
2
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
Pengujian 2 1
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
2
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
Pengujian 3 1
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
2
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
Hasil Pengujian dengan TAL Rep li kasi
K (-) RW
λ
0,5λ
0,25λ
Kontrol Sediaan Positif
Kontrol Positif 2λ
Sampel Neat
1:2
1:4
1:8
Pengujian 1
1
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
2
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
Pengujian 2
1
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
2
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
Pengujian 3
1
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
2
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
Pengujian 4
1
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
2
-
+
-
-
-
+
+
+
-
-
Pengujian dengan Toksinometer
Alat
• Teknik Kinetik-Turbidimetri • Endotoxin mengaktifkan enzim pada LAL menghasilkan gelatinasi coagulin dalam LAL, sehingga meningkatkan turbiditas sampel • Perubahan transitans selama kurun waktu tertentu diukur (kinetik) utk mengukur waktu gelatinasi dari awal smp akhir reaksi. • Gelation time (waktu gelatinasi) secara langsung berhubungan dengan jumlah endotoksin dalam sampel
Hasil Pengujian Kurva Baku Run Time (Menit) Pengenceran
Tg
Mean Tg
¼λ
48,2 47,4
47,80
½λ
43,2 43,4
43,30
λ
35,0 35,0
35,00
29,0 29,2
29,10
2λ
Persamaan : Log (Tg) = -0,2400 Log (C) + 1,326
r = -0,9909 Persyaratan nilai r ≥-0,980 (USP 30 : 112)
Hasil Pengujian Sampel uji diicemari dengan endotoksin : - Sampel neat = 0,4761 EU/ml - Sampel 1 : 2 = ½ x 0,4761 EU/ml = 0,2381
Pen guji an
Sampel Neat
1:2
T
[ ]
Ratarata T
Ratarata [ ]
% recov ery
T
[ ]
Ratarata T
Ratarata [ ]
% recove ry
1
26,0 25,8
0,4258 0,4382
25,9
0,4320
90,73
30,6 31,8
0,2154 0,1848
31,2
0,2001
84,04
2
25,0 25,0
0,3931 0,3931
25,0
0,3931
82,57
28,4 29,6
0,2560 0,2227
29,0
0,2393
100,50
Persyaratan % recovery metode turbidimetri adalah 50% - 200% (USP 30 : 113)
Terima kasih
