Dr. Heni Rachmawati
School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung
LATAR BELAKANG Biologically active peptides and proteins are becoming m g an increasingly g y important mp class of f drugs. Their use for human and animal treatment is problematic, however, because some of these drugs are generally ineffective when taken orally
1
STUDI PREFORMULASI Formulasi protein/peptida sangat berbeda dengan formulasi obat lainnya lainnya, karena struktur protein (1,2,3,4) (1 2 3 4) yang reaksi degradasinya tidak satu tahap, hasil degradasi tidak bisa dideteksi dengan hanya 1 metode analisis Saat pengembangan formulasi harus diperhatikan: Struktur protein Faktor-faktor f y yang g mempengaruhi p g stabilitas kimia dan fisika Teknik yang digunakan untuk stabilisasi protein
Studi preformulasi: 9 Mempelajari data fisikokimia protein dan eksipiennya 9 Evaluasi kelarutan 9 Evaluasi stabilitasnya 9 Mempelajari metode analisisnya Pemahaman data kelarutan, stabilitas, dan titik isoelektrik akan menentukan pH yang paling sesuai pada saat pengembangan formulasi
2
PROTEIN 9 Senyawa organik makromolekul (BM 5500 – 220.000 dalton atau 50 – 2000 asam amino) 9 Tersusun dari asam amino-asam amino (BUILDING BLOCK) 9 Ikatan yang menghubungkan asam amino satu dengan lainnya adalah ikatan peptida, menghubungkan gugus karbonil dengan gugus amin
3
ASAM AMINO ESENSIAL
4
BIOSINTESIS PROTEIN 9 Sintesis protein dikode oleh gen tertentu (genetic code) 9 Setiap protein mempunyai sekuen (urutan) asam amino yang unik yang diturunkan dari sekuen nukleotida pengkode protein (genetic code) 9 Kode gen merupakan rangkaian terdiri dari 3 nukleotida disebut kodon. 9 Setiap kodon akan mengkode 1 asam amino
STRUKTUR PROTEIN Primer: sekuen dari rantai asam-asam amino Sekunder: Jika sekuen asam amino dihubungkan oleh ikatan hidrogen Tersier Jika terjadi interaksi antara alfa heliks dan beta sheet.Struktur distabilisasi oleh ik hidrogen, jembatan garam, disulfida, dan inti hidrofobik Kuarterner Protein yang terdiri dari lebih dari 1 molekul protein: dimer, trimer, oligomer, baik homomer atau heteromer.
5
IKATAN KIMIA DALAM PROTEIN UNTUK STABILISASI PROTEIN
FUNGSI PROTEIN (protein endogen = dihasilkan oleh tubuh)
Metabolisme: enzim,, hormon Imunologi: antibodi, sitokin Pertumbuhan: hormon, faktor pertumbuhan Transport dan penyimpanan: hemoglobin Dan lain-lain
Potensial sebagai obat
6
Karakteristik khusus senyawa protein 1. Merupakan senyawa makromolekul yang sangat kompleks 2. Aktivitas biologinya sangat dipengaruhi oleh struktur dan konformasinya (primer, sekunder, tersier, dan kuarterner) 3. Sangat poten (dosis terapi sangat kecil) 4. Sangat tidak stabil oleh berbagai faktor
SIFAT PRODUKSI PROTEIN ENDOGEN
Beberapa protein endogen diproduksi secara konstitutif (diproduksi pada kondisi normal): hormon, enzim, albumin Beberapa protein endogen diproduksi secara induktif (diproduksi hanya kalau ada stimulus): antibodi, sitokin, faktor pertumbuhan, enzim Beberapa protein diproduksi konstitutif dan induktif: albumin, hormon, enzim
7
KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN ENDOGEN SEBAGAI OBAT
Jumlah protein yang diproduksi tidak mencukupi untuk terapi roduks prote n ter nh b s /menurun pada kond s tertentu Produksi protein terinhibisi/menurun kondisi
PERLU ASUPAN/TAMBAHAN PROTEIN DARI LUAR TUBUH (PROTEIN EKSOGEN)
PROTEIN EKSOGEN HARUS DIISOLASI
KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN EKSOGEN SEBAGAI OBAT
Keterbatasan donor atau tidak memungkinkan secara etik Reaksi penolakan jika digunakan donor dari spesies yang berbeda
PROTEIN REKOMBINAN
8
ORGANISME UNTUK REKOMBINASI PROTEIN TERAPI BAKTERI RAGI (YEAST) TANAMAN MAMALIA
TERGLIKOSILASI ((mengandung d gugus gula) l )
TIDAK TERGLIKOSILASI (tidak (tid k mengandung d gugus gula) l )
AKTIVITAS? STABILITAS?
9
DEGRADASI (PENGURAIAN PROTEIN)
KIMIA FISIKA BIOLOGI
10
PROSES DEGRADASI PROTEIN DAPAT TERJADI SELAMA: ISOLASI PEMURNIAN PENYIMPANAN
PENYIAPAN BAHAN BAKU PROTEIN REKOMBINAN
PENANGANAN LANJUT PENGGUNAAN
DEGRADASI PROTEIN DAPAT MENYEBABKAN PROTEIN KEHILANGAN AKTIFITASNYA
11
FAKTOR KIMIA PENYEBAB DEGRADASI PROTEIN
Reaksi kimia dapat merusak protein sehingga aktivitas biologinya hilang Sumber p pemicu reaksi kimia 9 Air 9 Keasaman/kebasaan (pH) 9 Bahan tambahan yang digunakan dalam formulasi 9 Pelarut pembantu 9 suhu 9 senyawa garam 9 ion-ion logam 9 mekanik (pengocokan) 9 konsentrasi protein
12
p Protein disusun oleh rantai p polipetida membentuk struktur 3 dimensi yang unik Struktur protein distabilisasi oleh kombinasi interaksi elektrostatik dan hidrofobik, dengan fleksibilitas molekul pada struktur bagian dalam yang tinggi Dalam larutan, struktur molekul dapat terganggu jika kondisi lingkungan berubah termasuk perubahan dalam ukuran molekulnya.
Stabilitas protein dalam larutan
Reaksi kimia pemicu instabilitas protein Deamidasi Hidrolisis Isomerisasi Deglikosilasi Oksidasi Reaksi Maillard
13
Contoh reaksi degradasi protein Degradasi
protein
Pemotongan (cleavage) D Deamidasi id i Deamidasi Deamidasi Deamidase Oksidasi Suksinimidasi
bFGF hEGF bFGF insulin RNase A rhPTH bFGF
kondisi sangat asam netral t l – basa b netral – basa pH < 5 pH tinggi pH 10 pH 4 - 5
(DENATURASI)
Adalah perubahan lipatan global dari protein (gangguan pada struktur molekul tertingginya, yaitu struktur tersier) Denaturasi juga sering terjadi karena perubahan pada struktur sekundernya.
14
Agregasi dan presipitasi AGREGASI
Bentuk non-native self association dari suatu protein yang masih berada dalam larutan dan secara visibel tidak dapat terlihat dengan mata telanjang 9 Proses utama dari instabilitas fisika. 9 Pada kondisi k tertentu, struktur k sekunder, k tersier dan kuarterner protein dapat berubah, menyebabkan agregasi Aktivitas
Kelarutan
Imunogenesitas berubah
PRESIPITASI
Suatu proses makroskopik yang menghasilkan perubahan yang visibel (peningkatan viskositas atau kekeruhan pada larutan) Reaksi polimerisasi (kovalen) dan agregasi (nonkovalen) berperan terhadap pembentukan presipitat yang tidak larut Faktor fisik penyebab agregasi dan presipitasi Suhu (peningkatan atau penurunan) Kekuatan ion mekanik (Vorteks) pH Penambahan pelarut organik, surfaktan
15
Perubahan suhu menyebabkan hilangnya struktur natif protein: Ikatan hidrogen menjadi lemah Interaksi hidrofobik menjadi kuat Gaya nonkovalen terganggu Protein rot n m menjadi nja lebih hf fleksibel s m menyebabkan ny a an unfolding parsial Frekuensi kolisi (tumbukan) meningkat menghasilkan agregat
16
pH dari larutan protein merupakan faktor paling penting dalam menentukan struktur protein. pH rendah menurunkan stabilitas sebagai akibat terjadinya interaksi elektrostatik yang dipicu oleh peningkatan muatan positif dari protein. pH tinggi menurunkan stabilitas melalui tolak-menolak muatan negatif dari protein. Kebanyakan protein menunjukkan stabilitas maksimum pada atau mendekati titik isoelektrik, di mana muatan netto protein adalah netral Banyak protein membentuk struktut unfolded pada pH asam (2-3)
Reversibilitas agregat protein Reversibel
dapat dilarutkan kembali dalam zat pereduksi/pendenatur p p
Tidak reversibel
tidak dapat dilarutkan kembali dalam zat pereduksi/pendenatur
Dalam farmasi jika unfoleded protein tidak dapat kembali ke keadaan natifnya melalui refolding mis dengan penurunan suhu, maka denaturasinya disebut irreversible
Karakteristik fisika agregat yang reversibel dan tidak reversibel adalah sama Struktur agregat reversibel: secara energi lebih stabil, susunannya lebih teratur, serta lebih longgar
17
EKSIPIEN PADA FORMULASI PROTEIN 1. SISTEM DAPAR Dapar p yang y g bisa digunakan g untuk formulasi protein: p 9 Fosfat (pH 6,2-8,2) 9 Asetat (pH 3,8 – 5,8) 9 Sitrat (pH 2,1 – 6,2; pK 3,15 dan 6,4) 9 Suksinat (pH 3,2 – 6,6; pK 4,2 dan 5,6) 9 Histidin (pK 1,8;6 dan 9) 9 Glisin (p (pK 2,35 dan 9,8)) 9 Arginin (pK 2,18 dan 9,1) 9 Trietanolamin (pH 7-9) 9 Tris-hidroksimetilaminometan (pK 8,1) 9 Maleat
Fungsi dapar dalam formulasi: 9 Menjaga stabilitas sediaan dan bioaktivitas protein 9 Mempengaruhi kelarutan protein, selain kekuatan ion Muatan protein ~ titik isoelektrik 0 pada pH di titik isoelektriknya + pada pH di bawah titik isoelektriknya - Pada pH di atas titik isoelektriknya Pendaparan sangat dekat dengan titik isoelektrik tidak disarankan
18
2. KELARUTAN PROTEIN 9 Kelarutan protein: sangat larut, agak larut, tidak larut bergantung pada urutan asam amino dan konformasinya 9 Kelarutan asam amino berbanding terbalik dengan ukuran dan bagian nonpolarnya 9 Kelarutan protein ditentukan oleh kemampuan gugus polar berinteraksi dengan air 9 Kelarutan protein umumnya minimum pada titik isoelektriknya karena muatannya 0 sehingga interaksi antara protein protein-protein protein menjadi maksimum Dipengaruhi: 9 pH 9 Jenis eksipien yang digunakan 9 Suhu
3. PENGAWETAN SEDIAAN 9 Sediaan mengandung protein rentan terkontaminasi mikroba, ik b ssehingga hi pengawett merupakan k k komponen penting terutama untuk multiple dose 9 Pemilihan pengawet merupakan faktor kritik karena dapat mempengaruhi stabilitas fisik sediaan (presipitasi atau turbiditi larutan) Contoh: 9 NaHSO3 sebagai pengawet sediaan injeksi menyebabkan degradasi insulin pada pH 4-7
19
JENIS EKSIPIEN 1.Albumin (human serum albumin, HSA) 9 Protein (BM 66,4 kDa) berperan dalam ikatan dengan berbagai macam senyawa 9 Karena kelarutan dan stabilitasnya luar biasa, albumin banyak digunakan sebagai eksipien (stabiliser dan mencegah adsorpsi peptida atau protein lain pada berbagai permukaan) 9 Albumin mencegah adsorpsi protein lain pada permukaan karena kompetisi adsorpsi dengan protein lain di mana albumin lebih cenderung teradsorpsi (preferentially adsorption)
Kekurangan albumin sebagai eksipien: 9 Mengganggu analisa protein lain 9 Kemungkinan kontaminasi oleh patogen (diatasi dengan pengembangan rekombinan HSA)
20
2. Asam amino Fungsi: 9 Mengurangi adsorpsi 9 Menghambat agregasi 9 Menstabilkan protein terhadap denaturasi karena panas 9 Meningkatkan kelarutan protein 9 Asam amino y yang g sudah digunakan g untuk formulasi protein: glisin, arginin, alanin
3. Karbohidrat 9 Senyawa gula berfungsi menstabilkan protein terhadap situasi stres: panas, liofilisasi 9 Stabilisasi protein oleh gula adalah dari efeknya terhadap struktur air 9 Melindungi agregasi protein yang dipicu oleh lembap Contoh: sukrosa, maltosa, laktosa, trehalosa - Sukrosa, ¾ Dapat meningkatkan tegangan permukaan air oleh karenanya meningkatkan stabilitas protein ¾ Zat yang paling efektif melindungi hemoglobin dari oksidasi spontan menjadi methemoglobin selama proses liofilisasi dan penyimpanan
21
4. Zat pengkhelat Beberapa anion dan kation dapat berikatan dengan protein dan menurunkan kelarutannya p y Fungsi zat pengkhelat: 9 Menghilangkan ion-ion tersebut dan mempertahankan kelarutan protein 9 Menghambat reaksi oksidasi gugus sulfidril dari protein yang dipicu oleh logam 9 Meningkatkan stabilitas terhadap agregasi yang dipicu oleh pana 9 Contoh pengkhelat: EDTA
5. Siklodekstrin Siklodekstrin adalah senyawa karbohidrat tapi mempunyai mekanisme stabilisasi yang lebih unik dibandingkan karbohidrat lain Fungsi: 9 Meningkatkan kelarutan protein 9 Menstabilkan protein (mencegah agregasi) 9 Pembawa dalam sistem penghantaran protein
22
Struktur siklodekstrin
9 Struktur ring siklodekstrin menjadikannya mempunyai kemampuan membentuk kompleks inklusi karena sifat hidrofobik dari bagian dalamnya 9 Ukuran kantung sekitar 5-10 Å 9 Siklodekstrin yang paling banyak dipakai adalah β siklodekstrin (walaupun kelarutan dalam air sangat rendah)
Asam amino aromatik dapat membentuk kompleks dengan siklodekstrin
23
6. Alkohol polihidrat Contoh: gliserol, eritritol, arabitol, xylitol, sorbitol, manitol Fungsi: F g stabilisasi protein p (mencegah (m g agregasi) g g ) 7. Polietilen glikol Fungsi: 9 Mengurangi adsorpsi protein pada permukaan 9 Meningkatkan stabilitas protein (fisik + kimia) 9 Meningkatkan kelarutan protein
Melalui ikatan kovalen
8. Senyawa Garam Berfungsi meningkatkan kelarutan protein pada kekuatan ion rendah (salting in) akan tetapi jika konsentrasi garam terlalu tinggi, maka terjadi kompetisi antara ion dan protein untuk molekul air menghasilkan penurunan kelarutan protein (salting out)
Konsentrasi garam harus diperhatikan
24
9. Surfaktan 9 Surfaktan berfungsi meningkatkan stabilitas protein pada kondisi optimal 9 Surfaktan yang paling banyak digunakan dalam formulasi protein adalah tween 80 9 Pada pemakaian tween 80 perlu diperhatikan cemaran peroksida karena peroksida dapat mempercepat degradasi protein 9 Mekanisme stabilisasi protein oleh surfaktan diduga melalui preferential absorption pada permukaan
+ surfaktan, tidak terjadi agregasi Tanpa surfaktan Æ dimerisasi Æ agregasi
25
Pangsa g pasar p protein p rekombinan m berkembang pesat tuntutan keberhasilan formulasi sediaan protein Pertimbangan preformulasi dan penapisan p p bentuk molekul yang y g “formulable” Teknik yang mengindikasikan stabilitas (memonitor pembentukan atau peningkatan cemaran Eksipien penstabil dan peranannya dalam mencapai waktu simpan yang sesuai
Modifikasi struktur Substitusi asam amino meningkatkan termostabilitas Glikosilasi (menambahkan gugus gula) meningkatkan k k i ik farmakokinetik, karakteristik f k ki ik resistensi i i proteolitik, li ik stabilitas bili termal Pembentukan ikatan disulfida: perlindungan protein terhadap denaturasi Pegilasi (+ PEG) dapat meningkatkan kelarutan, menurunkan imunogenisitas, meningkatkan t1/2 dan menurunkan toksisitas
26
27
Penambahan eksipien Cryoprotectants : mencegah pembentukan kristal es saat menyimpan y p protein p pada p suhu -20C Contoh krioprotektan: senyawa gula (non-reducing sugar), poliol, Inhibitor protease untuk mencegah degradasi proteolitik
Antimikroba (natrium azide, NaN3) pada konsentrasi akhir 0.02-0.05% (w/v) atau timerosal pada konsentrasi akhir 0.01% Logam pengkhelat (EDTA) pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk mencegah oksidasi yang dikatalisis oleh logam Zat pereduksi (DTT, ditiotritiol dan merkaptoetanol, 2-ME) pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk mempertahankan protein dalam keadaan tereduksi dengan mencegah oksidasi sistein, Cys. Polimer seperti serum albumin, siklodekstrin: mencegah adsorpsi permukaan protein Asam-asam amino, seperti histidin dan metionin: antioksidan
28
Formulasi sediaan protein rekombinan
Sediaan padat
Sediaan cair
Mengontrol ukuran partikel dan distribusi ukuran partikel dalam sediaan cair protein merupakan hal yang sangat sulit.
Formulasi dalam sediaan kering (lebih diminati)
Spray-drying
Teknologi cair superkritik
Freeze drying/ liofilisasi
Protein yang stabil selama proses dan penyimpanan
29
Proses Spry freeze drying/liofilisasi untuk formulasi sediaan protein serbuk Atomisasi larutan protein + pembawa ke dalam nitrogen cair
dispersi kasar
Pemindahan dispersi padat ke precooled freeze dryer
Pengeringan menggunakan program standar freeze drying
reconsitutable
Liofilisat protein Kadar air < 3%
Stabilitas protein tetap terjamin: ¾ Struktur ¾ Aktivitas
30
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam proses liofilisasi protein
1 Jenis dan konsentrasi krioprotektan 1. 2.Konsentrasi protein 3.Konsentrasi bulking agent
Liofilisasi versus stabilitas protein : aktivitas Contoh formulasi tripsinogen dengan liofilisasi Pengaruh konsentrasi terhadap aktivitas produk akhir
31
Pengaruh konsentrasi lioprotektan
Pengaruh konsentrasi lioprotektan
32
Pengaruh konsentrasi protein
AAPS PharmsciTech 2005
Liofilisasi versus stabilitas protein : agregasi
J.Pharm.Sci., 2001, 90
33
Pengaruh jenis dan konsentrasi lioprotektan
J.Pharm.Sci., 2001, 90
Pengaruh konsentrasi protein
34
Liofilisasi versus rekonstitusi Pengaruh konsentrasi protein terhadapa struktur liofilisat Konsentrasi protein
Pengaruh konsentrasi protein terhadap waktu rekonstitusi
10 min setelah rekonstitusi
35
Sediaan protein liofilisat
Freeze dryer
Sistem penghantaran ¾ Merupakan bagian integral dari pengembangan produk farmasi terutama untuk biomolekul. ¾ Berperan tidak hanya dalam pengaturan siklus hidup suatu molekul tapi juga pada aspek farmakologinya ¾ Salah satu tantangan dalam terapi menggunakan protein adalah b bagaimana im n sist sistem mp penghantaran n h nt n yang n ttepat p t 9 Nyaman bagi pengguna 9 Efektif 9 Efisien
36
RUTE INJEKSI Sistem penghantaran pertama dan yang masih dipertahankan sampai sekarang untuk protein dan peptida
Ketidaknyamanan penggunaan Merupakan rute invasif Jaminan yang tinggi akan sterilitas sediaan Biaya dan keterbatasan penggunaan LIMITATION
Alternatif sistem penghantaran protein terapetik 1. Penghantaran protein melalui paru-paru (pulmonary delivery): untuk insulin 2. Penghantaran g melalui oral :terutama untuk pengobatan p g jangka panjang: MOST TARGET Penggunaan carrier untuk menghindari degradasi GI Strategi pengembangan untuk meningkatkan absorpsi 3. Penghantaran melalui nasal Merupakan pengembangan terkini penghantaran protein melalui absorpsi transmukosa, sangat efektif dan tidak iritan
Peluang pasar untuk sediaan protein terapetik
37
38
39
TUJUAN FORMULASI PROTEIN Secara umum sama dengan tujuan formulasi senyawa obat: 11. Meningkatkan k k penerimaan kepada k d pasien 2. Meningkatkan stabilitas dan efikasi 3. Memudahkan penggunaan 4. Meningkatkan performan
40
