PENDAHULUAN Latar Belakang Diare merupakan penyakit yang masih menjadi masalah kesehatan di dunia khususnya negara berkembang. Masalah tersebut dapat terlihat dengan meningkatnya angka penderita dan kematian akibat diare (Adisasmito 2007). Kejadian diare di Indonesia mulai dari tahun 2002 adalah sebesar 1,62% , tahun 2003 sebesar 2,77% , tahun 2004 sebesar 1,60%, tahun 2005 sebesar 2,51%, tahun 2006 sebesar 2,52% (DEPKES RI 2007) tahun 2007 sebesar 1,3% (DEPKES RI 2008). Kasus diare dinegara berkembang lainnya di Turki yaitu sebesar 1,6% (Al-Gallas et al. 2009). Data tersebut menunjukkan bahwa angka penderita diare di Indonesia masih tinggi khususnya untuk daerah kota Bogor. Tahun 2005 terdapat 98 anak meninggal dan pada tahun 2007 sebanyak 23,416% dari jumlah 74.880 anak di kota Bogor meninggal akibat diare (Bappeda kota Bogor 2005). Hal tersebut menunjukkan masih lemahnya data mikrobiologi bagi penderita diare khususnya yang disebabkan oleh bakteri Salmonella, sehingga penelitian ini harus dilakukan. Diare adalah buang air besar (defekasi) dengan tinja berbentuk cair atau setengah cair, kandungan air tinja lebih banyak dari biasanya lebih dari 200 g atau 200 ml. Buang air besar encer tersebut dapat atau tanpa disertai lendir dan darah (Eppy 2009). Bakteri Salmonella merupakan anggota famili Enterobacteriaceae, bakteri gram negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora dan berbentuk batang. Habitat normalnya adalah didalam saluran pencernaan. Lebih dari 2000 serotip Salmonella adalah patogen, salah satunya yaitu penyebab gastroenteritis atau lebih dikenal dengan diare. Secara patologi, bakteri Salmonella dibagi menjadi dua yaitu Salmonella thypoid dan Salmonella non-thypoid (Madigan et al. 2009). Bakteri Salmonella memiliki dosis infektif 104 sampai 108 sel dengan lama inkubasi 5-72 jam, normal 12-36 jam (Sørensen 2006). Sebagian orang yang terinfeksi Salmonella enteritidis umumnya menderita diare (Blackburn & McClure 2003). Infeksi bakteri Salmonella sp. pada manusia dapat mengakibatkan penyakit dengan gangguan pada bagian saluran pencernaan atau gastroenteritis dan penyakit akibat infeksi Salmonella disebut
salmonellosis (Marriot 1999). Salmonellosis menyebabkan berbagai gejala seperti gastroenteritis, demam enterik, septikemia, dan infeksi fokal. Bakteri Salmonella masuk melalui makanan yang dicerna dalam lambung dan berkoloni di ileum dan kolon, kemudian masuk kedalam epitel usus dan terjadi proliferasi epitel (Gianella 2001). Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolitmetabolit yang dihasilkan dengan reagenreagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo 2004). Uji biokimia dilakukan dengan tujuan untuk identifikasi bakteri. Bakteri yang telah ditumbuhkan dalam media sfelektif dinyatakan Salmonella sp. jika memberikan reaksi positif pada hasil uji H2S, uji Metil Red (MR), dan memberikan reaksi negatif untuk uji Kalium Sianida (KCN), uji Indol, uji Voges Proskauer (VP) dan uji Urea (Madigan et al. 2009). Infeksi dapat menyebabkan kenaikan jumlah leukosit. Leukosit berfungsi sebagai pertahanan tubuh melawan infeksi . Jumlah normal sel darah putih adalah 4000-10000/mm3 (Aryoseto 2009). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Salmonella sp pada penderita diare serta melihat jumlah sel darah putih di Puskesmas Sindang Barang, Bogor. METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Oktober tahun 2010. Pengambilan sampel bertempat di Puskesmas Sindang Barang Bogor, kegiatan laboratorium dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi dan penghitungan darah dilakukan di laboratorium Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi IPB Bogor. Probandus Pengambilan sampel dilakukan mulai bulan Februari sampai Juni 2010. Sampel feses dan darah diambil dari 100 pasien diare anak-anak mulai usia 2 bulan sampai 11 tahun.
2
Pengambilan Sampel A. Feses Pengambilan sampel feses dilakukan dengan menggunakan metode rectal swab (Funk et al. 2000) yaitu mengambil feses dari anus pasien dengan cotton bud steril kemudian dimasukkan kedalam 0,9 ml larutan buffer saline steril (PBS) untuk dilakukan isolasi bakteri Salmonella. B. Darah Pengambilan darah dilakukan dengan membersihkan jari tengah pasien dengan alkohol 70% kemudian ditusuk dengan lanset pen. Darah yang keluar ditampung oleh hematokrit (Marienfeld). Perhitungan Sel Darah Putih Darah yang berada dalam tabung hematokrit dikeluarkan dengan menggunakan kikir dan ditempatkan dalam tabung ependof. Darah diambil dengan pipet leukosit sampai sampai batas kurang lebih 0,5 dan dicampur dengan larutan Turk sampai batas 11. Kocok dengan gerakan membentuk angka delapan selama 12 kali kemudian diteteskan pada kaca hemasitometer dan tutup dengan kaca penutup. Sel leukosit yang dihitung dengan counter pada hemasitometer yaitu empat kotak terbesar terletak pada tiap sudut hemasitometer. Penentuan jumlah total leukosit dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : V= p l t V= 1 * 1 * 1/10 V untuk 4 kotak = 4 * 1/10mm3 1 mm3 = 10/4 * Σ butir darah yang dihitung Faktor pengenceran = 20 * 10/4 * Σ butir darah yang dihitung (Simmon 1976) Isolasi bakteri Sampel yang diduga bakteri Salmonella sp. diinkubasi pada media cawan SSA (Criterion) selama 24 jam didalam inkubator (Gemmyco IN-010). Koloni yang telah murni dipindahkan kedalam media SSA miring. Identifikasi Bakteri Sampel yang diduga bakteri Salmonella sp. dilakukan dua tahap uji yaitu pewarnaan gram dan uji biokimia.
A. Pewarnaan gram Pewarnaan gram dimulai dengan mengambil satu ose biakan yang diduga Salmonella sp. lalu dicampur dengan air steril kemudian dilakukan fiksasi panas. Kaca objek yang telah berisi bakteri Salmonella sp. diberikan kristal violet sampai menggenangi kaca objek dan dibiarkan selama satu menit lalu dibilas dengan air akuades. Pewarna selanjutnya yaitu iodin selama dua menit kemudian bilas dengan air akuades. Proses dekolorisasi dilakukan dengan menambahkan alkohol 90% beberapa saat kemudian dibersihkan dengan air akuades. Tahap terakhir yaitu pemberian safranin selama 30 detik, dibilas kembali dengan air akuades. Kelebihan air diserap oleh kertas serap. Pewarnaan selesai dan diamati di mikroskop cahaya perbesaran 1000 x menggunakan minyak imersi. B. Uji Biokimia (Madigan et al. 2009) Uji biokimia untuk bakteri yang diduga Salmonella sp. dilakukan uji Metil Red (MR), uji Voges Proskauer (VP), uji Urease, uji H2S, uji KCN, uji Indol dan uji Sitrat. Media yang digunakan pada uji MR dan VP adalah sama yaitu dengan memakai media MRVP. 1. Uji MR (Metil Red) Bakteri yang diduga Salmonella sp. diinokulasikan pada media MRVP (Difco) dan inkubasi (Gemmyco IN-010) selama 24 jam pada suhu 370C. Uji MR dilakukan dengan menambahkan 10 tetes indikator metil red. Hasil positif dinyatakan dengan berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi indikator merah metil. Medium yang tidak berubah warna dinyatakan negatif. 2. Uji VP Sebanyak satu lup bakteri dimasukkan kedalam media MRVP (Difco) kemudian dilakukan inkubasi selama 96 jam. Uji VP dilakukan penambahan indikator α-naphtol 5% sebanyak 5 tetes dan larutan KOH 40% 5 tetes dan dibiarkan selama dua jam untuk dilihat perubahan warna media dari warna kuning menjadi warna kemerahan. Hasil negatif tidak merubah warna media. 2.Uji Urease Bakteri yang diduga Salmonella sp. diisolasi kedalam media urea (Difco) secara aseptik lalu diinkubasi selama 96 jam dengan pengamatan tiap 24 jam pada suhu 370C. Warna merah violet akan ditunjukkan jika reaksinya positif dan tidak terjadi perubahan warna media.
3
3.Uji KCN Dua lup bakteri yang diduga Salmonella sp. diisolasi pada media KCN kemudian diinkubasi selama 96 jam dengan pengamatan tiap 24 jam pada suhu 370C . Warna keruh pada media dinyatakan reaksi positif, warna bening dinyatakan hasil negatif. 4.Uji Indol Bakteri yang diduga Salmonella sp. diisolasi pada media tripton (Oxoid) dan dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Bakteri Salmonella sp. pada media tripton ditambahkan reagen Kovac sebanyak 3 tetes sampai berubah menjadi warna merah pada permukaan media, hasil tersebut dinyatakan positif. Hasil negatif dinyatakan dengan tidak timbulnya warna merah pada permukaan media. 5.Uji Sitrat Media yang digunakan adalah media agar Simmons sitrat (Oxoid) . Bakteri yang diduga Salmonella sp. diisolasi dan diinkubasi selama 24 jam. Warna hijau pada media akan dirubah menjadi warna biru dengan adanya indikator warna bromtimol blue (BTB). Warna biru adalah reaksi positif dari uji ini. 6. Uji H2S Bakteri yang diduga Salmonella diisolasi dalam media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) selama 24 jam pada suhu 370C. Reaksi positif diberikan Salmonella sp. pada uji H2S ini adalah terbentuknya gas disertai dengan berubahnya media menjadi warna hitam atau berubahnya warna media menjadi kuning pada bagian dasar media dan permukaan miring media yang menunjukkan adanya proses fermentasi yang terjadi. HASIL Dari 100 sampel feses penderita diare di Puskesmas Sindang Barang Bogor terdapat 43 sampel perempuan dan 57 sampel lakilaki (Lampiran 1). Sampel tersebut terdapat delapan isolat (8%) yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA (Tabel 1). Koloni bakteri Salmonella sp. ditunjukkan oleh warna hitam pada pusatnya dan warna kusam pada pinggirannya (Gambar 1).
Gambar 1 Biakan murni Salmonella sp.
Delapan isolat yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA telah dilakukan pewarnaan gram. Hasil yang ditunjukkan setelah isolat bakteri Salmonella sp diwarnai adalah warna merah muda dan tiap sel berbentuk batang (Gambar 2).
Gambar 2 Hasil pewarnaan gram perbesaran 1000x Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi dugaan isolat bakteri Salmonella sp.. Delapan sampel bakteri yang diduga Salmonella sp. yaitu nomor 15, 19, 33, 38, 43, 58, 84, dan 87 (Tabel 2) dilakukan uji biokimia dengan mengacu pada metode dalam buku Brock Biology of Microorganism (2009). Hasil uji MR pada delapan isolat yang diduga Salmonella ditunjukkan dengan reaksi positif (Gambar 3).
Gambar 3 Uji Meti Red A : reaksi negatif B : reaksi positif Hasil uji VP pada delapan isolat menunjukkan hasil yang negatif karena tidak terbentuk warna merah pada media MRVP. (Gambar 4).
Gambar 4 Uji Voges Proskauer A : reaksi negatif B : reaksi positif
4
Tabel 1 Daftar keadaan pasien yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA No Isolat 15 19 33
Jenis Kelamin L P L L
Lama diare 2 hari 3 hari 4 hari
Jenis Feses Lunak Cair Lunak
5 tahun 2 bulan 5 bulan
38
1 tahun 1 bulan
43 58
2 tahun 2 bulan 5 tahun
7 hari 7 hari 1 hari
4 bulan
P L L
84 87
3 tahun
P
Usia
+ -
Jumlah Leukosit/ml 1250 2150 2250
Cair
+
8300
Cair Cair
+ +
3600 4100
4 hari
Lunak
-
5050
3 hari
Cair
+
1850
Demam
Keterangan : L : Laki-laki ; P : Perempuan + : demam ; - : tidak demam
Tabel 2 Hasil Uji Biokimia Isolat-isolat yang diduga Salmonella UJI BIOKIMIA No Isolat 15 19 33 38 43 58 84 87
Gram Stain
-* -* -* -* -* -* -* -*
MR
VP
Urea
TSIA
KCN
Indol
Sitrat
+ + + + + + + +
-
+ + +
+ kuning + kuning + H2S + kuning + kuning +H2S + kuning +H2S
-
-
+ + + + + + + +
Keterangan : -* : gram negatif - : reaksi negatif, + : reaksi positif, MR : Metil Red VP : Voges Proskauer Warna kuning nomor isolat 33, 58 dan 87 bukan Salmonella Uji Urea menunjukkan reaksi yang negatif pada isolat nomor 15, 19, 43, 84, dan 87 karena tidak terjadi perubahan pada warna media (Gambar 5A). Tiga isolat lainnya yaitu nomor 33, 58 dan 87 menunjukkan reaksi yang positif dengan berubahnya warna media menjadi merah violet (Gambar 5B).
Gambar 5 Uji Urease A : reaksi negatif B : reaksi positif
Hasil uji pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) pada kedelapan isolat ditunjukkan dengan hasil positif.. Isolat yang menghasilkan gas H2S yaitu isolat nomor 33, 58 dan 87. Isolat yang tidak menghasilkan gas H2S namun warna media berubah menjadi kuning pada bagian dasar media dan permukaan miring media yaitu isolat nomor 15, 19, 38, 43 dan 84 (Gambar 6). Isolat 33, 58 dan 87 menunjukkan perubahan media menjadi warna hitam pada bagian dasar media dan merah pada bagian permukaan miring.
5
Uji Sitrat yang telah dilakukan pada delapan isolat menunjukkan reaksi positif dengan perubahan warna agar dari hijau menjadi warna biru (Gambar 9).
Gambar 6 Uji H2S A: H2S positif , B: Fermentasi glukosa, laktosa dFe an atau sukrosa, C : rmentasi glukosa, D: tidak ada reaksi fermentasi Uji KCN yang telah dilakukan pada delapan sampel yang diduga bakteri Salmonella sp. menunjukkan reaksi yang negatif pada semua isolat. Setelah dilakukan inkubasi selama 76 jam semua isolat tidak menunjukkan perubahan warna media (Gambar 7) .
Gambar 7 Uji KCN A: hasil positif B: hasil negatif Uji Indol yang telah dilakukan pada semua isolat menunjukkan reaksi yang negatif dengan tidak berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi Reagen Kovac (Gambar 8).
Gambar 8 Uji Indol A: hasil negatif B: hasil positif
Gambar 9 Uji Sitrat A: hasil negatif B: hasil positif
PEMBAHASAN Sampel yang berhasil diambil dari pasien diare anak menunjukkan jumlah lelaki lebih banyak dari jumlah perempuan. Menurut penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, dari sampel sampel penderita diare anak menunjukkan persentase yang lebih besar pada laki-laki dibanding pada pasien perempuan (Rahaman et al. 1982 ; Molbak et al. 1997 ; Wilunda & Panza 2009). Jenis feses yang diambil dari pasien diare anak yaitu lunak dan cair. Pasien penyakit diare akan mengalami peningkatan frekuensi pengeluaran feses dan kekentalan feses yang abnormal, yaitu lebih encer (70%-95% air terkandung dalam feses dan berat feses >200 g). Enterotoksin yang dimiliki Salmonella dapat merusak mukosa yang dapat menyebabkan ulkus sehingga feses yang dihasilkan tidak hanya lebih encer tetapi disertai dengan darah (Eppy 2009). Beberapa pasien diare yang dicurigai terinfeksi bakteri Salmonella mengalami demam. Hal ini disebabkan karena ketika PMN (polimorfonukleus) teraktivasi dan memfagosit bakteri Salmonella terjadi pelepasan beberapa mediator inflamasi yang menimbulkan gejala reaksi inflamasi seperti demam (Aulia & Widianto 2010) Delapan isolat yang diduga bakteri Salmonella dilakukan pewarnaan gram terlebih dahulu untuk mengetahui sifat dasar dari bakteri Salmonella sp. yaitu bakteri gram negatif. Sel bakteri yang telah terwarnai dengan kristal violet dan iodin akan membentuk kompleks crystal violet-iodine (CV-I). Tahap selanjutnya
