Přednáška 7: Neuropřenašeče: neurotrofické faktory Představa o tom, že extracelulární signály mohou zprostředkovávat růst a diferenciaci nervových buněk, je více než půl století starý. Nicméně až v posledních cca 20 letech vědci začali rozkrývat značnou molekulární diverzitu růstových faktorů a jejich signálních kaskád. Pochopení signálního působení růstových faktorů zásadně změnilo naše chápání způsobů, jakými se nervový systém ontogeneticky vyvíjí a jak se adaptuje během dospělého života organismu. Tyto poznatky nám pomáhají chápat i mechanismy zodpovědné za přežití neuronu, jejichž selhání podmiňuje vznik různých neurodegenerativních chorob jako Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntigtonova choroba nebo amyotrofická laterální skleróza. Růstové faktory a jejich signální proteiny jsou tedy zajímavým farmakologickým cílem v terapii nejen těchto neuropsychiatrických onemocnění. V rámci diskuse o neurotrofických faktorech bychom si měli vymezit pojmy neurotrofické faktory a cytokiny. Kanonicky pojato, neurotrofické faktory jsou látky ovlivňující růst, diferenciaci a přežívání neuronů. Příbuzný termín cytokiny je zapůjčen od imunologů, kde popisuje molekuly uvolňované aktivovanými lymfoidními buňkami a sloužícími k modulaci aktivity dalších buněk. Někteří autoři používají termín cytokiny na všechny látky nějakým způsobem spojené s růstem populace nervových buněk (tj. mezi cytokiny zahrnují i neurotrofické faktory), jiní popisují termínem cytokiny látky ovlivňující růst toliko gliální populace a pod. My budeme jako neurotrofické faktory označovat ty molekuly, které v rámci nervového systému ovlivňují růst, diferenciaci a buněčný cyklus neuronů i glií. Pod tímto termínem jsou sdruženy proteiny, které slouží v uvedeným funkcím, takže si je odlišíme od mnoha non-peptidových molekul (jako např. steroidní hormony, kyselina retinová a neuropřenašeče, které také ovlivňují růst a integritu nervového systému). Ačkoliv neurotrofické faktory byly původně dávány do souvislosti s vývojem nervového systému a neuropřenašeče do souvislosti se synaptickým přenosem v dospělém CNS, v mnoha rolích se překrývají a hranice mezi nimi není v moha případech vůbec jasná. Podobně jako neuropřenašeče, i neurotrofické faktory jsou syntetizovány v neuronu a ovlivňují funkci dalších neuronů, za některých okolností mohou být i vylévaný jako důsledek neuronální aktivity. Mohou také vyvolávat rychle změny v cílovém neuronu, které jsou v podstatě neodlišitelné od odpovědí vyvolaných „klasickým“ neuropřenašečem uvolněným v rámci synaptického přenosu. A podobně, mnoho neurotransmiterů může ovlivňovat růst a přežití neuronů a diferenciaci jejich adultních fenotypů. Od např. neuropeptidů ovšem neurotrofické faktory odlišují přinejmenším dvě charakteristiky: • •
jsou větší: např. z mozku odvozený neurotrofický faktor (brain-derived neurotrofic factor, BDNF) je protein velikosti 14 kDa, zatímco neuropeptidy jsou malé peptidické molekuly; fungují regulací proteinkinas, nikoliv cestou G-receptorů a klasických kaskád druhých poslů.
Funkční charakteristiky neurotrofických faktorů O životním cyklu neurotrofických faktorů se ví podstatně méně než o osudech neuropřenašečů. Jsou syntetizovány v tělech některých neuronů a glií jako proteiny. Některé
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7 jsou v těchto buňkách i skladovány, nejspíše ve velkých denzních váčcích, a jsou transportovány do nervových zakončení nebo do dendritických větví. Mechanismus kontrolující výlev neurotrofických faktorů není plně objasněn. Mnoho těchto látek, jako IL-1, BDNF a neurotrofické faktory pocházející z gliální linie (GDNF) jsou produkty časných genů, jejich syntéza je podmíněna aktivitou neuronu a limituje jejich výlev. Výlev dalších neurotrofických faktorů může spouštět depolarizace. Hlavním mechanismem ukončení účinku neurotrofických faktorů je patrně jejich proteolytická degradace, nicméně např. BDNF jsou sekvestrovány s funkčně inaktivními receptory, což limituje jejich difusi a nejspíše i dobu účinkování. Zajímavou otázkou je místo působení neurotrofických faktorů. Před cca 60 lety (!) bylo vytvořeno schéma „klasické“ syntézy a aktivity neurotrofického faktoru, konkrétně prvního popsaného neurotrofického faktoru NGF (nerve growth factor). Paní profesorka Rita Levi-Motalciniová ukázala na sympatetických gangliích kuřecích embryí, že množství a růst jejich nervových vláken závisí na přítomnosti specifického růstového faktoru. Na myších sakrkomech implantovaných do 11denních kuřecích embryí detekovala charakteristické „hallo“ vláken rostoucích z ganglia v přítomnosti nádoru (vpravo), části jeho tkáně nebo alespoň extraktu. Vlákna velmi intenzivně inervovala nádor. Látku se jí ve spolupráci se Stanley Cohenem podařilo identifikovat, purifikovat a prokázat, že růst nervových vláken je závislý na koncentraci této látky – tedy NGF. Rita Levi-Montalcini (* 22. dubna 1909, zemřela 30. prosince 2012) byla italská neuroložka židovského původu. Je považována za jednu z nejvýznamnějších neuroložek 20. století, obdržela ta nejprestižnější ocenění ve svém oboru, včetně Albert Lasker Award for Basic Medical Research a Nobelovy ceny za fyziologii a lékařství (obě v roce 1986 spolu se Stanleym Cohenem). Byla členkou Papežské akademie věd (nominována v roce 1974) a Národní akademie věd Spojených států (od 1968) a doživotní senátorkou Itálie (od 2001). Ukázali také, že produkce NGF
cílovým inervačním orgánem daného neuronu je nezbytná pro to, aby neuron přežil a cílový orgán inervoval. Neuron musí také na NGF správně odpovídat. Produkce NGF je omezená, takže nervová vlákna mezi sebou kompetují. Tato pozorování bývají také shrnována pod termín neurotrofická hypotéza. Ačkoliv její (a NGF) typické projevy jsou dobře stopovatelné zejména na periferii, určité její podoby se vyvinuly i v CNS. V mozku a páteřní míše může neuron produkovat neurotrofické faktory zásobují jiný neuron, který ho inervuje, nicméně produkuje celou řádku neurotrofických faktorů, které na něj samotný působí autokrinně. Některé neurotrofické faktory mohou být dokonce anterográdně transportovány do terminál, kde po výlevu působí na somata a zakončení jiných nervových vláken. Stejně tak komplex neurotrofický faktor – jeho receptor zformovaný na plasmatické membráně terminály může být retrográdně transportován do těla neuronu, kde má další biologické funkce. Část neurotrofických faktorů dále produkují glie. Některé faktory jsou produkovány gliemi i neurony a jejich receptory jsou rovněž exprimována na obou buněčných typech. Mezi gliemi a neurony se tak formuje velmi složitá intercelulární komunikace. RODINY NEUROTROFICKÝCH FAKTORŮ S klasifikací neurotrofických faktorů to není snadné, neboť je částečně poznamenána jejich historií. Jména mnoha neurotrofických faktorů byla odvozena od účinku, se kterým byli primárně spojováni. Např. interleukiny dostaly své jméno podle toho, že modulují komunikaci mezi elementy bílé krevní linie – ačkoliv jsou produkovány i gliemi. Podobně, GNDF byl původně identifikován jako faktor odvozený z gliální buněčné linie, ačkoliv jeho producenty jsou i mnohé neuronální populace; FGF (fibroblast growth factor) dostal jméno jako růstový faktor fibroblastů, ačkoliv jej produkují i glie a CNTF (ciliary neurotrophic factor), který je
2
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7 produkován i gliemi a několika typy neuronů, dostal své jméno podle toho, že podporuje růst a udržování neuronů ciliárního ganglia oka. Dnes jsou neurotrofické faktory kategorizovány na základě své homologie a podle toho, jaký sdílejí transdukční mechanismus, kterým navozují své biologické odpovědi. Mezi všemi rodinami neurotrofických faktorů jsou nejlépe charakterizovány tři: neurotrofiny, GNDF a příbuzné faktory a CNTF-příbuzné faktory. Důležité jsou samozřejmě i ty zbylé, neboť také regulují funkce neuraxis za fyziologických a patofyziologických stavů. Přehled častého členění rodin neurotrofických faktorů máte v následující tabulce. Rodina neurotrofických faktorů Neurotrofiny GDNF rodina CNTF rodina
Typičtí zástupci NGF, BDNF, NT-3, NT-4 GDNF, neurturin, persephin
Další růstové faktory Interleukiny a příbuzné cytokiny TGF rodina Jiné cytokiny
Chemokiny
Typičtí zástupci jejich receptorů
Trk (R-PTks)
TrkA, TrkB, TrkC
spojené s Ret spřažené s Janus kinasami (JAK) EPH (R-PTKs)
CNTF, LIF, IL-6
Ephriny EGF rodina
Jejich receptory
EGF, TGFα, neureguliny insulin, IGF, FGF, PDGF
GFRα1, GFRα2, neznámé GP130, CNTFRα, LIFRα
ErbB (R-PTKs) R-PTKs
IL-1 R spřažený s PS/TK, R-PTK, R IL-1, IL-2, IL-3, ILspřažené s JAK, R 5, TNFα, TNFβ se vztahem k p75 („receptory smrti“) R-PS/TK TGFβ interferony spřažené s JAK, (IFNα, β, γ ), mR-PTKs CSF, gm-CSF CC chemokiny (IL8), CXC chemokiny receptory spřažené (MIP, MCP), CX3C s G-proteiny chemokiny (neurotactin)
CC1-CC8 R CXC1-CXC4 R CX3C1 R
R-PTK, receptor-associated protein tyrosine kinase; R-PS/TK, receptor-associated protein serine/threonine kinase; m-CSF, macrophage colony stimulating factor; gm-CSF; granulocyte-monocyte CSF; MIP, macrophage inflammatory protein; MPC, monocyte chamoattractant protein
3
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
NEUROTROFINY Rodina neurotrofinů zahrnuje NGF a následně identifikované neurotrofické faktory, které s ním sdílejí stejný signalizační mechanismus: BDNF (brain-derived neurotrophic factor), neurotrophin-3 (NT-3) a neurotrophin-4 (NT-4; také známý jako neurotrophin4/5). V rybách byl také popsán neurotrophin-6. Mezi jejich klasické charakteristiky patří malá velikost (BNDF má např. 14 kDa) a signalizace cestou Trk receptorové rodiny. Neurotrophiny působí na širokou škálu neuronů. Dobře popsána je jejich role v přežívání neuronů na periferii vzhledem k ustavení funkční synapse s cílovým orgánem. NGF je také přítomen v malých neuronech sympatiku a sensorických neuronech, které se účastní nocicepce a vnímání teploty. BDNF je produkován v kosterní svalovině inervované motoneurony. BDNF, NT-3 a NT-4 jsou zodpovědné za přežívání specifických sensorických neuronů na periferii. Ačkoliv neurotrofiny podobnými způsoby podporují přežívání neuronů na periferii, jejich role v mozku a prodloužené míše není detailně objasněna. NGF pravděpodobně podporuje přežití cholinergních neuronů jader septa (na bázi koncového mozku), které inervují hippokampální neurony.Acetylcholin uvolňovaný z terminál neuronů jader septa nejspíš aktivuje neurony hippokampu a zvyšuje jejich produkci NGF. Ten pak zpětně působní na septální neurony a umožňuje jejich přežití (pozitivní zpětná vazba). BDNF, NT-3 a NT-4 napomáhají přežívání motorických neuronů kůry a hippokampálních neuronů,a působí i na noradrenergní, dopoaminergní a serotoninergní neurony mozkového kmene. Jak přesně neurotrophiny přispívají j vývoji mozku není zatím detailně popsáno. Zda je jejich primární funkcí target-derived podpora aferentních neuronů, podpora neuronů eferentních nebo udržování diferenciálních rozdílů mezi neuronálními subtypy a populacemi, je předmětem intenzivního výzkumu. Trk receptory Všechny neurotrofiny se váží na třídu vysoce homologických receptorových tyrosinkinas označovaných jako Trk receptory. Jsou známy tři podtypy těchto receptorů: TrkA, TrkB a TrkC. Jde o transmembránové glykoproteiny o molekulární hmotnosti 140145 kDa.Každý z typů Trk Rs váže -s určitým překryvem- specifický neurotrofin:
TrkA – NGF, NT-3 TrkB – BNDF, NT-3 a NT-4 a TrkC – NT-3.
Trk Rs mají charakteristickou strukturální doménu. Extracelulární část obsahuje vazebné místo pro ligand a je bohaté na segmenty hojně tvořené leucinem (důležitý pro interakci protein-protein), klastry bohaté na cystein a dvě imunoglobulinům podobné domény. Vazba neurotrofinu na Trk receptor aktivuje jeho katalytickou doménu. Neurotrofiny se váží jako dimery, což vede k dimerizaci Trk receptorů a jejich následné autofosforylaci na vybraných aminokyselinových zbytcích tyrosinu. Fosforylovaný tyrosin formuje rozpoznávací sekvenci pro SH2 domény některých typů buněčných proteinů. Např. SH2 domény proteinů Shc a Grb2 spojují aktivaci Trk receptorů s aktivací malého G-proteinu Ras, který obratem aktivuje s mikrotubuly asoiciovanou proteinkinasovou kaskádu (MAPK-
4
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7 kinasovou kaskádu). Genetické abnormality v oblasti Ras proteinů vedou u lidí k neurofibromatóze, což je choroba zahrnující např. nadměrný růst Schwannových buněk. Rozlišujeme tři cesty Trk aktivace MAPKs: 1. dráha – cestou protein. Shc, Grb-2, SOS, Ras a Raf 2. dráha - cestou proteinů CrkL, Rap a Raf Tyto dráhy závisí nejen na fosforylaci Trk receptoru na Y490 tyrosinovém zbytku, ale i na ARMS proteinu (ankyrin repeat-rich membrane spanning protein). MAPKs následně aktivují CREB transkripční faktory, což vede ke stimulaci diferenciace a přežívání. 3. cestou je Trk aktivace vedoucí ke spuštění PI 3K/Akt dráhy. Realizuje se přes Shc/Grb-2 a Gab-1 proteiny. Vede k fosforylaci proapoptotického proteinu Bad, aktivuje prosurvival transkripční faktor NF-κB - PLCγ je aktivována v důsledky fosforylace Trk R na tyrosinovém zbytku Y785; představuje doplňkovou dráhu zahrnující MAP kinázy a zodpovědnou za stimulaci diferenciace a zejména za přežívání buněk. Dalším biologickým projevem aktivace Trk receptorů je fosforylace různých signálních proteinů na tyrosinu. Z nich nejdůležitější jsou fosfolipasy Cγ (PLCγ ) spouštějící fosfatidylinositolovou kaskádu, a substrát inzulínového receptoru (IRS), který vede k aktivaci fosfatidylinositol-3-kinasové kaskády. Mutace v genu ATM, který kóduje jeden ze subtypů fosfatidylinositol-3-kinasy, vede k ataxii-telangiectasii. To je choroba vyznačující se progresivní degenerací a atrofií určitých mozkových oblastí, zejména mozečku. Trk receptory vykazují různé sestřihové varianty. Nejlépe prozkoumané jsou TrkB a TrkC isoformy, které obsahují normální vazebnou doménu, ale postrádají katalytickou doménu tyrosinkinasovou. Zkrácené isoformy Trk receptorů mohou snižovat aktivitu neurotrofnů. p75 receptor První naklonovaný receptor pro neurotrofiny nebyl Trk receptor, ale receptor p75. Je to 75 kDa velký protein s nízkou afinitou k neurotrofinům. Všechny neurotrofiny váže se zhruba stejnou afinitou a může modulovat i signalizaci Trk receptorů – zvyšuje afinitu vysokoafinitních vazebných míst pro NGF na TrkA. TrkA receptor může zprostředkovat funkční odpověď i bez p75 receptoru, nicméně tato odpověď je výrazně nižší a přežití některých neuronálních populací vyžaduje až několikanásobně vyšší hladiny NGF a jiných neurotrofinů. Vzhledem ke kompetici neuronů o NGF je funkce p75 receptoru často klíčová pro osud určitého neuronu. exprese p75 receptoru ovlivňuje také přežití neuronů při nemocech či traumatickcýh stavech. Typy neuronů a patofyziologické stavy, do kterých je p75 receptor zapojen u různých buněčných typů neuraxis, jsou v následující tabulce.
5
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
Na obrázku vlevo vidíte schematické modely aktivace Trk a p75 receptorů. Z Neurotrophins and their receptors: A convergence point for many signalling pathways , Moses V. Chao, Nature Reviews Neuroscience 4, 299-309 (April 2003)
Malé ligandové molekuly, agonisté i antagonisté, obvykle nejsou pro farmakologické studie funkcí receptorů pro neurotrofiny dostupné. Často jsou proto tedy využívány zvířecí modely knoc-outované pro vybranou molekulu. Myši knock-outované pro NGF a TrkA receptor vykazovaly ztrátu neuronů sympatiku i sensorických neuronů zadních kořenových ganglií trigeminu, stejně jako částečnou ztrátu cholinergních neuronů septálních jader projikujících do hippokampu. V případě posledně jmenovaných neuronů by snad agonisté TrkA receptorů mohli najít uplatnění v podpůrné léčbě Alzheimeovy choroby. Studium zvířat knock-outovaných pro TrkB receptory je trochu komplikovanější, neboť ty váží kromě NGF i NT-4 a BDNF, a v nižší míře i NT-3. Takto upravená zvířata nicméně také vykazovala ztráty kraniálních motorických neuronů či neuronů ganglií trigeminu. Myši knock-outované pro BDNF se projevovaly ztrátou specifických populací motorických neuronů (kortikálních), která může být spoje s chorobami jako amyotrofická laterální skleróza (ALS). TrkC knock-outované myši se projevovaly ztrátou propriorecepčních neuronů ganglií zadních kořenů míšních a defekty v pohybu a koordinaci polohy končetin. Typická pro ně byla také ztráta myelinizace Ia aferentních sensorických nervových vláken.
6
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
Neurotrofiny a synaptická plasticita Vývoj zrakové dráhy: Role neurotrofinů v synaptické plasticitě byla primárně studována při vývoji zrakové kůry. Jak axony z ncl. geniculatus laterlis thalamu (LGN) rostou a formují synapse na primárních zrakových neuronech okcipitálního kortexu, seskupují se tyto neurony do specifických sloupců v korové vrstvě IV. Vznik těchto sloupců je spojen s dominancí levého nebo pravého oka a aktivitou jeho fotoreceptorů. Pokud pokusnému zvířeti zašijete oční víčko a jeho fotoreceptory tak nejsou stimulovány, LGN neurony obdrží z deprivovaného oka slabší signály. Vznik sloupců oční dominance ve zrakové kůře je pak zbržděn a omezen. Umělým podání NT-4 lze monookulární deprivaci postiženého oka ale zvrátit.Ve zrakové kůře se nachází BDNF a NT-4. Je možné, že neurony LGN kompetují o ligandy TrkB receptorů a tato kompetice může být ve tvorbě zrakových sloupců zásadní. Pokud do vizuálního kortexu infúzně podáváme BDNF nebo NT-4, nemusí neurony kompetovat a vznik sloupců je zablokován. Neurotrofiny regulují synaptickou plasticitu i v dospělém diferencovaném mozku. V dospělých neuronech reguluje jejich vzruchová aktivita velmi výrazně expresi některých neurotrofinů a jejich receptorů. Po křečích byla např. pozorována zvýšená exprese BDNF a Trk receptorů v hippokampu. Podobné změny v expresi některých neurotrofinů a jejich receptorů byly pozorovány i v hippokampálních neuronech po stimulační salvě spojené s LTP nebo v neuronech locus coeruleus reagujících na nedostatek opiátů u závislých jedinců. Naopak, exprese BNDF může být snížena vystavení inhibičním stimulům, jako jsou agonisté GABAA receptorů. Rychlost regulace hladiny BNDF odpovídá rychlosti regulace systémů spojených s jinými časnými geny, jako je c-fos; ostatně i indukce BNDF je zprostředkována aktivací preexistujících transkripčních faktorů jako CREB. Neurotrofické faktory mohou ovlivňovat synaptický přenos a regulovat vznik synapsí. Např. NT-3 rychle zvyšuje synaptický přenos na nervosvalovém spojení (typicky do 10 min). Děje se tak cestou zvyšování pravděpodobnosti výlevu acetylcholinu z terminály, neboť NT-3 zvyšuje frekvenci synaptických proudů, ne jejich amplitudu. Tento efekt NT3 může být zablokován nespecifickým inhibitorem Trk receptorů známým jako K252a. Neurotrofiny rovněž regulují synaptický přenos v hippokampu. BNDF a NT-3 (ne NGF) zvyšují excitační postsynaptické potenciály Schaefferových kolaterál CA1 neuronů až po dobu 2-3 hodin. Myši knock-outované pro BNDF naopak vykazují nižší bazální aktivitu těchto oblastí a např. deficienci v LTP. Na obrázku vidíte interakci Trk Rs s některými iontovými kanály – možnou cestu synaptické modulace.
7
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
GDNF
RODINA
GDNF je glykosylovaný protein o velikosti asi 18 kDa. Prvně byl izolován v tkáňových kulturách z gliální buněčné linie podporující přežívání dopamiergních neuronů středního mozku. Následně bylo prokázáno, že tyto neurony chrání i před toxickým poškozením in vivo. S degenerací dopaminergních neuronů je spojena Parkinsonova choroba, a proto byla GDNF následně věnována nemalá pozornost. GDNF ovšem působí protektivně i na přežití jiných neuronálních populací, např. neuronů myenterického plexu střeva. Zdá se, že je zásadním růstovým faktorem mimo nervový systém. Pozoruhodná je jeho role ve vývoji ledvin – myši knock-outované pro GDNF umírají krátce po narození díky selhání ledvinových funkcí. Při poškození genu pro GDNF se jim nevětví močové kalichy a nebo se v rámci růstu ledviny vůbec nevyvíjejí. Ureteric bud growth is dependent on GDNF and its receptor. (A) The ureteric bud from a 11.5-day wild-type mouse embryonic kidney cultured for 72 hours has a characteristic branching pattern. (B) In embryonic mice heterozygous for the genes encoding GDNF, the size of the ureteric bud and the number and length of its branches are reduced. (C) In mouse embryos missing both copies of the gdnf gene, the ureteric bud does not form. (Scale bars = 100 μm.) (D) The receptors for GDNF are concentrated in the posterior portion of the nephric duct. GDNF secreted by the metanephrogenic mesenchyme stimulates the growth of the ureteric bud from this duct. At later stages, the GDNF receptor is found exclusively at the tips of the ureteric buds. (A-C from Pichel et al. 1996, photographs courtesy of J. G. Pichel and H. Sariola; D after Schuchardt et al. 1996.) GNDF_ledviny_2: The effect of GDNF on the branching of the ureteric epithelium. The ureteric bud and its branches are stained orange (with antibodies to cytokeratin 18), while the nephrons are stained green (with antibodies to nephron brush border antigens). (A) 13-day embryonic mouse kidney cultured 2 days with a control bead (circle) has a normal branching pattern. (B) A similar kidney cultured 2 days with a GDNF-soaked bead shows a distorted pattern, as new branches are induced in the vicinity of the bead. (From Sainio et al. 1997; photographs courtesy of K. Sainio.)
Podobně jako neurotrofiny funguje i GDNF cestou aktivace proteinové tyrosinkinasy. Této aktivace je ovšem dosaženo nepřímo pomocí intervenujícícho receptorového proteinu. Dimer GDNF se váže na specifický receptor o velikosti asi 40 kDa, označovaný jako GFR1α. GFR1α R je v membráně zakotven glykofosfatidylinositolovou (GPI) kotvou. Je členem rodiny GFRα receptorů (GFRα1-4) se specifickou afinitou k ligandům. Navázání GDNF na GFRα1 R spustí asociace GFRα1 s membránovou proteinovou tyrosinkinasou Ret, což je protein o velikosti asi 150 kDa. Byly identifikovány 3 isoformy Ret kinas (Ret 51, Ret 43 a Ret 9), s 51, 43 a 9 aminokyselinovými zbytky na svém C-konci. In vivo je nejlépe prostudována role Ret 51 a Ret 9, které jsou nejčastější. Asociace Ret a GFRα1 R s navázaným GDNF vede k fosforylaci mnoha biologických substrátů a změnám v MAPkinasové signalizaci. Poruchy funkce Ret kinasy vedou u lidí k Hirschprungově nemoci, což je porucha charakterizovaná neobvyklou střevní motilitou, zvětšením colon a obstukcí ampula rectis. Jiné typy mutací vede např. k mnohočetným endokrinním neoplasiím nebo k míšním karcinomům. I další dva členové rodiny neurotrofinů, neurturin a persephin, působí přes navázání na α podjednotky intervenujícícho receptoru a s ním následně na Ret kinasu. Neurturin podporuje přežití dopaminergním neuronů středního mozku, které vykazují vysokou expresi Ret kinas a GFRα1 receptoru, ale ne GDNF. GDNF exprimují dopaminergní neurony striata, které tak zásobují dopaminergní kolegy středního mozku – systém podobný jako na periferii, kde cílová tkáň produkuje NGF pro svá inervující vlákna. Regulace těchto dopaminergních okruhů středního mozku a striata by mohla být užitečná v léčbě parkinsonismu. Poslední zástupce, artemin (také neublastin či enovin), podporuje v kulturách přežití některých typů periferních a jednoho typu dopaminergních neuronů. Slouží jako naváděcí molekula
8
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7 uvolňovaná hladkou svalovinou cév, vytyčující trasu axonům sympatiku. Je regulován hladinou estrogenu, což zvyšuje rezistenci na anti-estrogenní léčbu některých typů nádorů. CNTF RODINA Ciliární neurotrofický faktor patří do rodiny růstových faktorů, která zahrnuje i LIF (leukemia inhibitory factor), interleukin-6 (IL-6), prolaktin, růstový hormon, leptin, interferony nebo např. onkostatin-M. Většina členů této rodiny působí hlavně mimo CNS a jsou často označovány za cytokiny. S poměrně dramatickou regulací přežití neuronů a jejich diferenciace jsou spojeny zejména CNTF, LIF a IL-6, které mohou být označovány i rigorózněji jako neurotrofické faktory. CNTF je protein velikosti zhruba 24 kDa. Primárně byl studován v ciliárních gangliích kuřat a je známo, že zvyšuje hladinu cholinacetyltransferasy. Reguluje přežití a diferenciaci mnoha neuronálních typů, jako jsou např. pregangliové neurony sympatiku, sensorické neurony, motorické neurony dopaminergní neurony středního mozku nebo neurony hippokampu v tkáňových kulturách. Velmi zajímavá je jeho role na motorických neuronech: nejen že podporuje jejich přežití in vitro, ale zabraňuje jejichdegeneraci po axotomiii nebo zmírňuje některé motorické defekty na myších modelech chorob motorických neuronů. Byl testován i terapeuticky, ale vyvolává velmi vážné vedlejší účinky. Axokin, modifikovaná verze lidského CNTF, zkrácená oproti CNTF o 15 aminokyselin a nesoucí dvě zaměněné aminokyseliny, je v in vitro i in vivo esejích 3-5 × účinnější než CNTF a je stabilnější. V 90. létech začal být testován v léčbě amyotrofické laterální sklerózy (ALS), kde sice nepůsobil na kosterní svalovinu tak, jak se očekávalo, ale ukázal se jako agens navozující ztrátu chuti k jídlu. Dobrovolníci, kteří denně dostávali subkutánně 1 mikrogram axokinu do podkoží, za rok zhubli o 12.5 libry (placebo skupina jen 4.5 libry). U 70% probandů vznily během 3 měsíců protilátky proti axokinu. LIF a IL-6 regulují podobným způsobem neuronální růst a diferenciaci. IL-6 napomáhá přežití cholinergních neuronů septa, katecholaminergních neuronů mesencefala nebo hypothalamických neuronů, a v tkáňových kulturách spouští neuronální diferenciaci PC12 buněk. Účinek LIF je in vivo nejlépe prozkoumán v hypothalamu. In vitro, LIF a CNTF potlačují adrenergní fenotyp neuronů symaptiku a indukují v nich fenotyp choilnergní. V mozku jsou za primární zdroj CNTF, LIF a IL-6 považovány glie, ačkoliv se nevylučuje ani jejich neuronální původ. Jejich receptorová signalizace je ovšem dobře popsána v gliích i neuronech. Signální dráhy CNTF Signální dráhy CNTF a dalších členů CNTF rodiny se poněkud liší. Komplex CNTF receptoru se skládá ze tří složek: • • •
přenašeče signálu známého jako LIF receptor (LIF R), glykoproteinu o hmotnosti 130 kDa (gp130) a vlastního proteinu vážícího CNTF (CNTF Rα).
CNTF Rα je asi 80 kDa protein zakotvený v membráně GPI kotvou. Vazba CNTF na CNTF Rα způsobí jeho asociaci s gp130 a následné spojení tohoto subkomplexu s LIF R. Až vznik tohoto tříčlenného komplexu spustí vlastní signalizační krok – aktivaci Janus kinasy (JAK) a příbuzných tyrosinkinas (Tyk aj.), které následně vyvolají patřičnou biologickou odpověď, a to nejčastěji aktivací transkripčních faktorů rodiny STAT.
9
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7 Přenos signálu dalšími členy CNTF rodiny je podobný. IL-6 se váže na specifický protein IL-6Rα, který obratem asociuje s dimerem glykoproteinu gp130. Vzniklý komplex aktivuje JAK kinasy a následné signální kaskády. LIF se váže na dimer LIFR a gp130. Tento komplex opět aktivuje JAK kinasy. Jak je vidět, určité části signálního komplexu jsou unikátní pro určitý neurotrofický faktor (CNTF Rα, Ι L−6Rα) a jiné slouží více různým ligandům (gp130, LIFR). Signální kaskády CNTF rodiny nejsou zcela objasněny. Překvapivě, myši knock-outované pro CNTF se vyvíjejí normálně a vykazují v dospělosti jen mírný motorický deficit. V japonské populaci je asi 2.5% jedinců homozygotních pro inaktivující mutaci CNTF – jsou tedy lidskými „knoc-outy“ pro CNTF podobně jako myší model CNTF knock-outů. I tito jedinci se vyvíjejí bez zjevných defektů. A naopak, myši knock-outované pro CNTF Rα umírají do 24 hodin po narození. Tato pozorování naznačují, že pro CNTF Rα exituje ještě nějaký další endogenní ligand. CYTOKINY IMUNITNÍCH ODPOVĚDÍ A CNS Odpovědi na cytokiny jsou nejlépe prostudovány v prostředí imunitního systému. Nicméně některé z cytokinů prokazatelně zprostředkují odpovědi CNS na imunologické změny. Mezi tyto cytokiny patří např. IL-1 a IL-6, tumor-nekrotizující faktor α (tumor necrosis factor-α, TNFα) nebo transformující růstový faktor β (transforming growth factor-β, TGFβ). Cytokiny zapojené do imunitních funkci jsou kritické pro systémovou homeostázu. Každé narušení homeostázy (nemocí, strese ap.) vede k obranné reakci směřující ku znovuustavení homeostázy. Tato obranná reakce je zčásti zprostředkovaná i CNS, zejména její části jako horečka, pokles chuti k jídlu, kardiovaskulární změny, poruchy spánku a neklid. Účinek cytokinů imunitního systému na mozek je velmi dobře ilustrován na příkladu horečky. Horečku lze vyvolat ve zdravém jedinci periferním injikováním IL-1. Hematoencefalická bariéra sice do značné míry limituje průchod cytokinů do mozkového parenchymu, nicméně je umožněn v cirkumventrikulárních orgánech.Cytokiny mohou také v endotelových buňkách indukovat lipofilní signály (např. prostaglandiny) a následně difundovat z vaskulatury do mozkového paremchymu. I mozek může syntetizovat cytokiny imunitních odpovědí, a to zejména z mikroglích. Částečně je syntéza cytokinů možná i v astrocytech a zcela není vyloučena ani v neuronech. Receptory těchto cytokinů jsou primárně exprimovány v gliích. Téměř po všech nefyziologických událostech (mozkové infekce, poranění, hypoxie, toxiny nebo kraniotrauma) produkují aktivované mikroglie a astrocyty řadu cytokinů včetně IL-1, IL-6, TNFα nebo TGFβ. Jejich účinek může spočívat v další aktivaci gliových buněk a v gliosis (vzniku nových mikroglií a astrocytů). Aktivované glie také mozku pomáhají obnovit tkáňovou homeostázu. Vysoké hladiny cytokinů imunitních odpovědí mohou ovšem přispívat k neuronálnímu poškození. Myši nadměrně produkující IL-1 a/nebo IL-6vykazují výraznou neurodegeneraci. Vysoké hladiny těchto cytokinů jsou pozorovány i při Alzheimerově chorobě nebo roztroušené skleróze, autoimunitním onemocnění vedoucím k degeneraci myelinových pochev axonů. Kupodivu, jiný cytokin imunitních odpovědí interferon-β (INF-β) je z hlediska léčby roztroušené sklerózy slibný. V některých případech vyvolávají cytokiny imunitních odpovědí efekty podobné těm, které vyvolává CNTF. IL-6 podporuje přežívání některých neuronálních typů, IL-1 podporuje přežívání neuronů páteřní míchy, předního mozku a v tkáňových kulturách hippokampu. TGFβ je zřejmě podobně jako CNTF důležitý pro diferenciační procesy vývoje nervové lišty. Receptory pro IL-1, IL-6, TNFα a TGFβ jsou nejhustěji koncentrovány v oblasti hippokampu
10
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7 a hypothalamu, kde se jejich ligandy mohou podílet na procesech synaptické plasticity – IL-1 např. zeslabuje hippokampální LTP. Cytokiny imunitních odpovědí mohou rovněž ovlivňovat rychlost neurogenese a přežití nově vniklých neuronů v gyrus dentatus hippokampu. CHEMOKINY Chemokiny jsou rychle rostoucí rodina malých (8-10 kDa) proteinů, prvně popsaných v rámci imunitních odpovědí. Jejich vzájemná homologie se pohybuje mezi 20-50%.Byly např. zkoumány v souvislosti s atraktcí leukocytů do místa zánětu, studována byla i jejich role ve vlastním zánětlivém procesu. Chemokiny a jejich receptory (všechny spřažené s Gproteiny) jsou ovšem exprimovány i v mozku. Predominantně se vyskytují v mikrogliích, v menší míře v astrocytech a některých neuronech. Chemokiny se dělí do několika skupin podle toho, kolik aminokyselinových zbytků obsahují mezi dvěma určitými cysteiny své primární struktury. Většinou obsahují cysteiny v molekule 4, což formuje jejich typickou 3D strukturu (někdy přirovnávanou k řeckému písmenu kappa). Disulfidické můstky obvykle spojují první a třetí resp. druhý a čtvrtý tento cystein. První dva cysteiny bývají obvykle u N-konce, třetí cystein uprostřed a poslední na C-konci molekuly. CC chemokiny CC chemokiny (nebo též ß-chemokiny) obsahují dva přilehlé cysteiny bez další vmezeřené aminokyseliny. U savců jich zatím bylo identifikováno 27. Označují se jako CC chemokiny 1-28 (CC chemokiny 9 a 10 jsou identické). Chemokiny této skupiny obvykle obsahují 4 cysteiny, ale některé jích ve své primární struktuře mohou nést až šest (CC chemokiny CCL1, CCL15, CCL21, CCL23 a CCL28). Indukují migraci monocytů a dalších buněčných typů jako NK buňky nebo dendritické buňky. Jejich typickým zástupcem je monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1 nebo CCL2), díky kterému opouštějí monocyty krevní řečiště, invadují do periferní tkáně a stávají se z nich makrofágy. CCL5 (RANTES) chemokin atrahuje T-buňky, eosinofily a basofily nesoucí receptor CCR5. CXC chemokiny Dva N-koncové zbytky cysteinu jsou u této skupiny chemokinů odděleny jednou aminokyselinou, reprezentovanou v jejich názvu písmenem „X“. U savců jich zatím bylo identifikováno 17. Dělí se do dvou skupin: jedna obsahuje specifický aminokyselinový motiv kyselina glutamová-leucin-arginin (neboli ELR), který leží před prvním cysteinem CXC motivu , druhá pak ELR sekvenci neobsahuje. .ELR pozitivní CXC chemokiny specificky indukují migraci neutrofilů. Typickým zástupcem této podskupiny je IL-8. C chemokiny Třetí skupina chemokinl je označována jako C nebo také γ chemokiny. Oproti ostatním chemokinlm obsahují jen dva N-koncové cysteiny a jeden cystein níže položený. V této skupině byly zatím pospány dva chemokiny, XCL1 (lymphotactin-α) a XCL2 (lymphotactinß). Atrahují prekurzory T-buněk do brzlíku.
11
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 7
CX3C chemokiny Čtvrtá chemokinová skupina obsahuje mezi dvěma cysteinovými zbytky tři jiné aminokyseliny. Zatím byl popsán jen jeden zástupce této podskupin, fractalkin (nebo též CX3CL). Je secernován na povrch buňky, kde pravděpodobně slouží jako adhezní molekula i jako atraktant. Role chemokinů v mozku není příliš prozkoumá. Účastní se nejspíše odpovědí známek zánětu navozeném mukopolysacharidy buněk stěn grampozitivních bakterií.
Co si pamatovat z dnešní přednášky:
⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒
neurotrofické faktory vs. neuropeptidy neurotrofické faktory: klasifikace neurotrofické faktory: NTF rodina neurotrofické faktory: GDNF rodina neurotrofické faktory: CNTF rodina neurotrofické faktory: cytokiny imunitních odpovědí a CNS neurotrofické faktory: chemokiny u rodin zástupce a mechanismus působení
12
[email protected]
