RNA polymerasa
sigma faktory
Transkripce DNA do RNA enzymem RNApolymerasou RNA-transkript
RNA-polymerasa
-faktor místo rozepnutí
dvojšroubovnice DNA
místo opětného spojení
Buňka uskutečňuje své genetické informace teprve transkripcí a
translací DNA do RNA a pak do bílkovin. Nejprve dojde k rozvolnění určitého úseku dvojšroubovice DNA, pak jeden z uvolněného úseku slouží jako matice (templát) pro tvorbu RNA.
RNA polymerasa – objevena v roce 1961
• Katalyzuje vazbu ribonukleosidtrifosfátů ATP, CTP, GTP, a UTP na templátu DNA U prokaryot je holoenzym RNA polymerasa složen z podjednotek – α2ββ´ω σ . Zahajuje transkripci vazbou na oblast 40 až 60 párů bazí (bp), která obsahuje dva konservované promotorové úseky: -10 sekvence (Pribnow box) se strukturou TATAAT - 35 sekvence se strukturou TTGACA Pro iniciaci je zásadní σ faktor.
DNA dependentní RNA polymerasa
σ podjednotka • RNA polymerasa u prokaryot - α podjednotka rozpoznává upstream element (-40 až -70 párů bazí) na DNA, zatímco σ faktor rozpoznává v oblasti -10 to -35. • σ faktory jsou početné, aby byly schopné regulovat genovou expresi. • Např. σ70 je exprimovaná za normálních podmínek a dovoluje vazbu RNAP k house-keeping genům, σ32 navozuje vazbu RNAP k heat-shock genům.
σ podjednotka • Po navázání na DNA, RNA polymerasa se promění z uzavřeného komplexu na otevřený komplex. Tato změna zahrnuje separaci DNA řetězců do rozpleteného úseku DNA přibližně 13 bp. • Supercoiling hraje významnou úlohu v aktivitě polymerasy při uvolňování a zpětném zavíjení DNA. Vzhledem k faktu že oblasti DNA před RNAP jsou rozvolněné, je pozitivní supercoiling kompenzací. • Oblasti za RNAP jsou opět svinuté - negativní supercoiling je přítomný.
Vlastnosti RNAP • RNAP je relativně velká molekula. Funkční enzym má 5 podjednotek (~400kDa): • α2: dvě α podjednotky tvoří enzym a rozpoznávají regulační faktory. Každá podjednotka má dvě domény: αCTD (Cterminální doména) váže se na prodloužený promotor, a αNTD (N-terminální doména) váže zbylou polymerasu. Tato podjednotka není vázaná na promotery bez UP (upstream promoter) části..
Vlastnosti RNAP • β: má vlastní polymerasovou aktivitu (katalyzuje syntézu RNA) což zahrnuje iniciaci řetězce a elongaci. • β': váže se na DNA (nespecificky). • ω: obnovuje denaturovanou RNA polymerasu do funkční formy in vitro. Bylo pozorováno, že poskytuje protektivní/chaperone funkci pro β' podjednotku u Mycobacterium smegmatis. Také je známo, že navozuje seskupení celého enzymu (assembly).
A schematic outline of the transcription cycle phases at the operon level of genomic organization.
Brenowitz M et al. PNAS 2005;102:4659-4660
©2005 by National Academy of Sciences
Vyhledávání promotorů • Pro vazbu na promotor-specifické úseky, funkční (core) enzym vyžaduje další podjednotku, sigma (σ). • Sigma σ redukuje afinitu RNAP k nespecifické DNA zatímco zvyšuje specificitu k určitým oblastem promotoru, v závislosti na typu sigma faktoru. Tímto způsobem, je transkripce iniciovaná ve správné oblasti.
Vazba na promotor • Kompletní holoenzym má tedy 6 podjednotek : α2ββ'σω (~480 kDa). Struktura RNAP vykazuje žlábek o délce 55 Å (5.5 nm) a průměru 25 Å (2.5 nm). Tento žlábek dobře zapadá do 20 Å (2 nm) dvojšroubovice DNA. Délka 55 Å (5.5 nm) může zabrat 16 nukleotidů. • Pokud není užívaná, RNA polymerasa se váže tak aby umožnila rychlou změnu k aktivnímu promotorovému místu, jakmile se otevře. Holoenzym RNA polymerasy, se tedy volně nepohybuje v buňce, když není užíván.
• Sigma factory v E. coli: • σ70 (RpoD) - "housekeeping" sigma faktor, transkribuje většinu genů v rostoucích buňkách. Tvoří proteiny nezbytné k udržení buněk živých. • σ54 (RpoN) -sigma faktor pro nedostatek dusíku. • σ38 (RpoS) - sigma faktor pro období hladu/stacionární fáze • σ32 (RpoH) - heat shock sigma faktor, nastupuje po expozici buněk teplu • σ28 (RpoF) – bičíkový sigma faktor • σ24 (RpoE) - sigma faktor pro extracytoplasmatický extrémní tepelný stres • σ19 (FecI) - sigma faktor pro citrát železitý, reguluje fec gen pro transport železa (Fe). • Také jsou anti-sigma faktory, které inhibují funkci sigma faktorů.
Funkce genů sigma faktoru • s70 rpoD Hlavní sigma faktor (exponenciální růst) • s54 rpoN (ntrA, glnF) nitrogen-regulovaná transkripce genů • s32 rpoH heat-shock transkripce genů • sS rpoS - sigma faktor genů exprimovaných ve stacionární fázi sF rpoF - sigma faktor k expresi bičíkového ( flagelárního) operonu • sE rpoE - sigma pro „heat shock“ a oxidativní stresy; reguluje
•
expresi extracytoplasmatických proteinů
• sFecl fecl – reguluje fec geny k transportu Fe dicitrátu •
Consensus sekvence různých sigma faktorů
Shoda sekvencí σ faktorů v oblastech -35 a -10 u eubakterií. Povšimněte si odlišných sekvencí sporulačních σ faktorů.
Charakteristika struktur σ 70 u E.coli.
Sigma faktory Pseudomonas aeruginosa
RNA polymerasa II (také označovaná RNAP II a Pol II) • Je enzym nalézající se v eukaryotických buňkách. Katalyzuje transkripci DNA tak, že syntetizuje prekursory mRNA a většinu snRNA a microRNA • 550 kDa velký komplex 12 podjednotek, RNAP II je nejvíce studovaným typem RNA polymerasy • Celá řada transkripčních faktorů je nutná pro vazbu na promotory a zahájení transkripce.
RNAP II Saccharomyces cerevisiae
Archaea • Archaea mají pouze jeden enzym – RNAP, který je úzce podobný ke třem hlavním eukaryotním polymerasám. • Tudíž, tento fakt podpořil úvahy, že archaeální polymerasa je podobná předchůdci specializovaných eukaryotních polymeras.
Životnost mRNA • Prokaryotní mRNA má velmi krátkou životnost. Je stále degradovaná na své složky – ribonukleotidy specifickými ribonukleasami. • U E. coli je průměrný poločas života některých mRNA okolo dvou minut. • Bakteriální mRNA může být takto krátce aktivní neboť zatímco jeden konec translatuje proteiny, opačný konec už je rozkládán.
Prokaryotní X eukaryotní mRNA U většiny bakteriálních mRNA translace začíná ještě v momentu přepisu mRNA z DNA. U eukaryotů je mRNA transkribovaná na chromosomech a přechází póry v jaderné membráně do cytoplasmy. Teprve zde tvoří komplexy s ribosomy, a nastává syntéza proteinů. Tedy translace obvykle začíná po dokončení transkripce.
Jak mitochondrie regulují rozpad mRNA Stabilita mRNA v cytosolu eukaryot je zvýšena
prodloužením 3’ poly(A). • Naopak u prokaryot tento proces vyvolává rychlý rozpad RNA. Jejich monofyletický původ, vycházející z αproteobakterií předurčuje, že polyadenylace bude indukovat rychlý rozpad pomocí nukleás a připojených faktorů, které jsou podobné jejich bakteriálním předkům. • Je to pravda?
Exonukleasy • Dvě exonukleasy jsou odpovědné za většinu degradace mRNA na mononukleotidy: RNasa II a polynukleotid fosforylasa (PNPasa). • Oba enzymy degradují mRNA ve směru od 3' k 5' , což vysvětluje fakt, že jejich aktivity jsou spojené více s mRNA degradací, než její inaktivací. • Jelikož transkripce a translace probíhá od 5' k 3' směru, buňky se nemohou vyhnout syntéze nonsense proteinů, která je následovaná štěpením exonukleasou od 3'konce mRNA. • Funkce exonukleas se zdají být nadbytečné ale je-li v buňce mutace jednoho typu enzymu, buňka přežije, ale mutace obou enzymů jsou letální.
Endonukleasy • Tři endonukleolytické aktivity jsou odpovědné za degradaci mRNA a zřejmě odpovídají třem endonukleasám: RNasa III, RNasa E, a RNasa K . • RNasa III štěpí mRNA v místech se slabou „consensus sequence“ často uvnitř vlásenek (hairpins) obsahujících nepárové vnitřní oblasti. • Úloha RNasy III pro stabilitu mRNA stability může být charakterizovaná jako úprava, typicky štěpící vlásenky uvnitř netranslatovaných oblastí a nedeaktivuje mRNA přímo. • Zabezpečují-li tyto vlásenky stabilizaci proti ostatním ribonukleasám, pak odnětí sekundárních struktur RNasou III může otevřít mRNA k rapidnímu rozkladu.
Rozpad mRNA u E.coli
RNAasa E degradosome
Život a smrt ve stacionární fázi růstu • Escherichia coli - ideální model ke studiu hladovění • Vykazuje typickou růstovou křivku jak na komplexním, tak na minimálním mediu • Po vyčerpání živin nastupuje stacinární fáze, během které klesá počet živých buněk (CFU/ml) • Kultura byla dlouhodobě kultivovaná za stejných podmínek, pravidelný přídavek sterilní destilované vody, aby byl zachován stálý objem • Buňky E. coli ve stacionární fázi (začátek hladovění) se zmenšují a tvar je více kulovitý, než tyčinkovitý.
Dlouhodobá kultivace E. coli
Charakteristika buněk ve stacionární fázi • Po nástupu stacinární fáze začíná období odumírání • Jak dlouho zůstávají buňky živé? • Po 3 dnech ztrácí životnost cca 99% všech buněk • 8. až 10. den se objevuje malá frakce buněk, morfologie odpovídá dělícím se buňkám • Jak tyto buňky přežívají?
Hypotetické závěry směsných experimentů: A „Staré“ buňky ■, se smíchaly jako minoritní populace s „mladými“ buňkami □. B – Očekávané výsledky v případě, že smrt je stochastický proces.
Skutečné výsledky směsných experimentů • Předchozí graf ukazoval předpokládané výsledky v případě smíchání „starých“ (10 denní kultura) a „mladých“ (1denní kultura) buněk. • K rozlišení „starých“ a „mladých“ buněk byla použita isogenní kultura E.coli, která se lišila rezistencí k antibiotikům. Tato vlastnost nijak nezvýhodňovala jeden kmen před druhým. • Graf GASP1 ukazuje výsledky společné kultivace „starých“ buněk (minorita) a „mladých“ buněk (majoritní populace. Po čtyřech dnech přerůstají „staré“ buňky „mladé“. • Následné pokusy s 10 denními populacemi smíšenými s jednodenní kulturou daly vznik fenotypu GASP2 a GASP3.
Staré buňky ■ 10 dní Mladé buňky □ 1 den
Genetický základ GASP a role rpoS • GASP fenotyp není jednoduchou fyziologickou adaptací na podmínky hladovění. • GASP vzniká procesem, ve kterém mutující buňky schopné růst za podmínek stacinární fáze jsou selektovány. • Průkaz byl podán 2 způsoby: a) GASP buňky byly kultivovány mnoho generací v bohatém mediu, ale stály vykazovaly fenotyp GASP to znamená, že vždy přerostly buňky kultivované ve stacionární fázi pouze krátce. • b) Důkaz pro genetický základ GASP byl podán pomocí možnosti transdukce z jednoho kmene na druhý, aniž bylo nutné recipientní buňky kultivovat ve stacionární fázi. • Lokus odpovídající GASP fenotypu byl přenesen pomocí bakteriofága P1.
Jaké geny jsou mutovány pro vznik GASP? • Nejčasnější GASP mutace, získaná během aerobní inkubace ve stacionární fázi na LB mediu (GASP1 alela) je nepochybně mutace rpoS genu, která kóduje sigma faktor stacionární fáze – σS .Tato σS podjednotka, která se akumuluje během stacionární fáze reguluje expresi celé řady genů, včetně těch, které chrání DNA před poškozením. • Analýza časných GASP mutantů ukázala, že tyto kmeny mají sníženou, nikoli eliminovanou σS aktivitu. • Na alele rpoS byla nalezena malá duplikace blízko 3´konce genu, která posunula čtecí rámec a poslední 4 aminokyseliny byly nahrazeny 39 novými. • Ostatní rpoS alely identifikované z GASP mutant vykazují různé změny (Missense a posunové mutace ). Atenuace σS aktivity.
GASP mutanty vznikají při prodloužené inkubaci. staré buňky (■) vždy jako minoritní, byly smíchány s „mladými“ (□) kulturami .
* Žádné zjistitelné CFU.
Kultury ve stacionární fázi jsou dynamické • Zisk GASP fenotypu indikuje dynamiku stacionární fáze. Buňky nesoucí GASP alelu lze izolovat , pasážovat a kultivovat 10 dní a opět vznikají další mutace. Tento proces lze několikrát opakovat. • Následují graf ukazuje dynamiku vzniku nových GASP mutací.
Staré buňky ■ Mladé buňky □
Buňky vykazující GASP fenotyp rostou na podkladu „mladých“ buněk. Na živný agar se naočkuje vrstva GASP1 buněk. Pak se nanášejí GASP1 a GASP2 buňky. Buňky s fenotypem GASP2 rostou, ale GASP1 nikoli.
Další
D Další mutace: dnuoF, nuoM – kódují 2 podjednotky HADH d
Další mutace podporující GASP fenotyp • nuoF a nuoM – kódují dvě podjednotky bakteriální NADH dehydrogenasyI (NDH-1) • ompR regulátor porinu vnější membrány • nhaA kóduje Na- proton antiporter • Mutace v NDH-1 a antiporteru ovlivňují schopnost buňky modulovat tok energie v buňce a ztráta aktivity OmpR ovlivňuje schopnost buňky regulovat transport.
Buňky vykazující GASP fenotyp na minimálním glukosovém mdiu. Buňky staré 62 dnů (■) byly smíchány jako minoritní složka ke kultuře vyrostlé přes noc – mladé buňky (□).
Obecné rysy GASP fenotypu: Byla provedena celá řada kultivací za různých podmínek s cílem vyvolat GASP. E.coli vytváří GASP při růstu na LB mediu, na minimálním minerálním mediu doplněném glukosou a hydrolyzátem kaseinu, právě tak za anaerobních podmínek na LB. Podmínky ovšem ovlivňují typ mutace – Buňky kultivované anaerobně na LB, vykazující GASP fenotyp, nemohou jej exprimovat, jsou-li smíchány s mladými buňkami narostlými aerobně. GASP fenotyp byl nalezen také u dalších mikroorganismů: Shigella dysenteriae, Enterobacteriacae, Staphylococcus aureus, Bacillus globii, Enterococcus faecalis a rovněž kvasinka Saccharomyces cerevisiae.
GASP v klinických izolátech E.coli. Buńky z 10 denní kultury klinického izolátu E.coli (■) byly naočkovány jako minorita do přes noc narostlé kultury téhož klinického izolátu (□). * CFU nedetektovatelné.
Role GASP při adaptaci a evoluci • Studie v chemostatu prokázaly schopnost bakteriálních kultur vyvíjet se v čase. • Pasážování na minimálním mediu zvýšilo způsobilost utilizace zdroje uhlíku o 50% ( po 20 000 generací). • GASP fenotyp má odlišnou dynamiku, neboť rychlost jakou se mutace GASP objevují je rychlejší, než mutace v prostředí s ustálenými parametry. • Prostředí vykonává selektivní tlak a GASP mutace získaná po 10 dnech se liší od GASP alely po 5 měsících. • Pochopení změn ve stacionární fázi je nutným předpokladem k pochopení změn, které se v bakteriích odehrávají při limitaci živin.určitě budou nalezeny další geny jejichž funkce přispívá k přežívání patogenních bakterií.
Další regulační proteiny • Více než 10% genomu E.coli kóduje regulační proteiny jako je lac represor lacI, araC, a malT – aktivační proteiny
• CRP pro vazbu na lac promotor vyžaduje cAMP. • Kromě aktivátorů, rovněž represory regulují expresi. Vážou se většinou blízko začátku transkripce. • Buňky si vyvinuly systémy pro rychlou deaktivaci různých typů proteinů.
E. coli • Byl studován vliv růstové rychlosti bakterií na poločas čtyř různých monocistronických druhů mRNA u Escherichia coli. • Stability dvou těchto druhů, transkripty ompA a cat genů 4−6, vykazovaly značnou závislost na růstové rychlosti buněk, zatímco poločasy transkriptů lpp a bla genů 7,8 byly konstantní v širokém rozmezí časů zdvojení. • Výsledky ukazují, že E. coli může měnit rychlost syntézy určitých proteinů modulací stability mRNA jako odpověď na změny růstové rychlosti.
Kontrola transkripce u bakterií • Bakterie vyvinuly jedinečný mechanismus posttranskripční kontroly, který umožňuje adaptivní odpověď: 1) obecná degradace mRNA, • 2) diferenciální degradace mRNA použitím malých nekodujících RNAs (sRNAs), • 3) selektivní degradace mRNA využívající tmRNA quality control system. Molekulární mechanismus, na modelu Escherichia coli, ukazuje regulaci, stabilitu a degradaci normálních a defektních transkriptů .
Pozastavené ribosomy jsou rozpoznávány tmRNA a tRNA-like doména slouží jako substrát pro transpeptidaci, začleněním alaninu do nekompletního proteinu
• tmRNA quality-control systém je téměř všudypřítomný u eubakterií; • geny pro tmRNA byly identifikovány u všech testovaných kmenů, vyjma těch náležejících do α-pododdělení proteobakterií.
• 10Sa RNA
Transfer-messenger RNA (zkratka - tmRNA) • Označovaná jako 10Sa RNA a jejjí genetické označení - SsrA) je bakteriální RNA molekula s podvojnými vlastnostmi“ tRNA- a také mRNA. tmRNA tvoří ribonukleoproteinový komplex (tmRNP) spolu s malým proteinem B (Small Protein B (SmpB), elongačním faktoremTu (EF-T), a ribosomálním proteinem S1. • Během trans-translace, tmRNA a k ní asociované proteiny se váží na bakteriální ribosomy, které pozastavují biosyntézu proteinů, např. když dorazí ke konci mRNA, která ztratila svůj stop kodon. tmRNA má víceúčelové vlastnosti: recykluje pozastavené ribosomy, dodává proteolýzu-indukující značku (tag) k nedokončeným polypeptidům, a usnadňuje degradaci nenormální mRNA. U většiny bakterií tyto funkce jsou vykonávány standardní „onepiece tmRNAs“. Některé bakterie mají pozměněný gen ssrA a tvoří „Two-piece tmRNA ve které jsou dva separátní řetězce RNA spojeny párováním bazí.
Současný model funkce tmRNA •
V modelu, protein SmpB se váže na tmRNA, tento komplex je aminoacylován Ala-RS (a). Aminoacylovaný tmRNA-SmpB komplex je rozpoznáván faktorem EF-TuGTP (b) a je tvořen stalled ribosome = pozastavený rozpoznávací komplex. Ribosomy pozdržené na 3’-konci nonstop mRNAs jsou nejprve rozpoznány tímto kvartérním komplexem v pre-accommodated stavu (c). Správné umístění tRNA-podobné domény tmRNA na ribosomální A-místo je spouštěno kontakty pravděpodobně vyvolanými C-terminálním koncem SmpB, který vyvolává hydrolysu GTP na EF-Tu. „Umístnění“ je následováno první transpeptidační reakcí, která váže náboj alanine na tmRNA do nekompletního polypeptidu (d). tmRNA pak přepne z tRNA-like stavu do mRNA-like stavu, zapojením ribosomu na jeho vlastní peptidický čtecí rámec (e), za současného odstranění defektní mRNA (f). Poškozená mRNA je selektivně rozpoznána a degradovaná RNase R, v SmpB a tmRNA závislým způsobem. Uvolněný ribosom pokračuje v translaci s tmRNA ORF jako náhradním templátem (g). Translace je ukončena na tmRNA-kodovaném stop kodonu, umožňuje recyklaci pozastavených ribosomů do buněčného poolu (h). Nascentní polypeptid, nyní značený 11-aminokyselinovým degradačním značkou (tag),je uvolněn z translační mašinérie (i), a specificky rozpoznán a degradován C-terminálními specifickými buněčnými proteasami (j).
Rozpadové dráhy v savčích buňkách
• Deadenylace-závislé dráhy • Deadenylace-nezávislé dráhy: 1. endoribonukleolytický rozpad • 2. nonsense-mediated decay (NMD) • RNAi-závislá dráha
2006 Nobel Prize in Physiology/Medicine • za objev RNA interference = účast RNA • gene silencing by double-stranded RNA" • Craig C. Mello • U. Mass. • Andrew G. Fire • Stanford •
RNA interference • V roce 1998, američtí vědci Andrew Fire a Craig Mello publikovali objev mechanismu, který může degradovat mRNA specifického genu. Tento mechanismus, RNA interference, je aktivován za podmínek kdy se molekuly RNA vyskytují jako double-strandový pár v buňce. Double-strandová RNA aktivuje biochemické mechanismy, které degradují tyto mRNA molekuly které nesou genetický kód identický s double-strandovou RNA. Když takovéto mRNA molekuly zmizí, odpovídající gen je „umlčen“ (silenced) a žádný protein kódovaného typu se neutvoří.
RNA silencing
RNA interference • RNA interference se vyskytuje u rostlin, zvířat a člověka. Má velký význam pro regulaci genové exprese, účastní se obrany proti virovým infekcím, a udržuje „skákající geny pod kontrolou. RNA interference je využívaná v základním výzkumu jako metoda ke studiu funkce genů a může v budoucnu zavést nové terapeutické postupy.
