PAXgene Blood RNA Kit Manuál

PAXgene® Blood RNA Kit Manuál Verze 2 Systém PAXgene Blood RNA se skládá ze zkumavek pro odběr krve (PAXgene Blood RNA Tubes) a diagnostické soupravy k izolaci nukleových kyselin (PAXgene Blood RNA Kit). Systém slouží k odběru, skladování a přepravě krevních vzorků, k stabilizaci intracelulární RNA v uzavřených zkumavkách, stejně jako k následující izolaci a purifikaci intracelulární RNA z plné krve. RNA purifikovaná pomocí systému PAXgene Blood RNA může být použita při molekulárně diagnostických testech zakládajících se na RT PCR. Charakteristika výkonu systému PAXgene Blood RNA uvedená v tomto manuálu platí pro transkripty genů FOS a IL1B. Uživatel je zodpovědný za stanovení odpovídající charakteristiky výkonu systému PAXgene Blood RNA pro jiné cílové transkripty.

Pro diagnostické použití in vitro

762174 1051083CS PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Vyrobeno QIAGEN GmbH pro PreAnalytiX R1

1051083CS

Duben 2008

Ochranné známky: PAXgene®, PreAnalytiX™ (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN®, QIAcube® (QIAGEN Group); BD Vacutainer®, BD Hemogard™, Safety-Lok™ (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA); Eppendorf® (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Soupravy PAXgene Blood RNA Kit nejsou dostupné ve všech zemích; prosím informujte se. Licenční ujednání Použitím produktu vyjadřuje kupec nebo uživatel soupravy PAXgene Blood RNA Kit souhlas s následujícími podmínkami: 1.

PAXgene Blood RNA Kit smí být používán výhradně v souladu s Manuálem PAXgene Blood RNA Kit a pouze s komponenty obsaženými v soupravě. PreAnalytiX neposkytuje žádnou licenci v rámci kteréhokoliv svého duševního vlastnictví k použití nebo k začlenění přiložených komponent kitu s komponenty, které nejsou zahrnuty v této soupravě, s vyjímkou případů uvedených v Manuálu PAXgene Blood RNA Kit a dodatečných protokolech dostupných na www.preanalytix.com.

2.

Mimo výslovně uvedenou licenci PreAnalytiX neposkytuje žádnou záruku, že tato souprava a/nebo její použití neporušuje práva třetích stran.

3.

Tento kit a jeho komponenty jsou licencovány pro jedno použití a nesmí být znovu použity, obnoveny či znovu prodány.

4.

PreAnalytiX zvláště vylučuje odpovědnost za jakékoliv jiné licence, vyjádřené či implikované, než výslovně uvedené.

5.

Kupec a uživatel kitu souhlasí s tím, že nepodnikne nebo nikomu neumožní podniknout kroky, které by mohly vést nebo usnadnit zakázané skutky uvedené výše. PreAnalytiX může zákazy tohoto Licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích a soudních poplatků, inkl. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto Licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv duševního vlastnictví vztahujících se na tento kit a/nebo jeho komponenty.

Pro aktualizovaná licenční ustanovení viz. www.preanalytix.com. © 2005–2008 PreAnalytiX GmbH, všechna práva vyhrazena.

PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH – 8634 Hombrechtikon Švýcarsko Distributoři PreAnalytiX Produkty PreAnalytiX jsou pro PreAnalytiX vyráběny společností QIAGEN nebo BD a jsou dodávané pro PreAnalytiX společností QIAGEN nebo BD. Produkty nelze objednat u PreAnalytiX GmbH. Adresu Vašeho regionálního distributora PreAnalytiX naleznete na poslední straně.

Obsah Vysvětlení symbolů

4

Obsah soupravy

5

Podmínky skladování

6

Zamýšlený účel použití

6

Omezení použití

7

Kontrola kvality

7

Technická podpora

7

Bezpečnostní informace

7

Úvod

10

Princip a jeho použití

10

Odběr vzorku a stabilizace

10

Manuální purifikace RNA

19

Automatizovaná purifikace RNA

27

Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou

31

Důležité pokyny

32

Používání QIAcube

32

Start QIAcube

32

Instalace protokolu na QIAcube

32

Naplnění QIAcube

34

Protokol: Manuální purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 41 Protokol: Automatizovaná purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT)

47

Pomoc při řešení problémů

52

Příloha A: Obecné pokyny k zacházení s RNA

54

Příloha B: Určení koncentrace, výtěžku a čistoty celkové RNA

55

Příloha C: Manipulace s PAXgene Blood RNA Tubes

57

Informace o objednání

58

PAXgene Blood RNA Kit Manuál 04/2008

3

Vysvětlení symbolů

Obsah postačující k provedení zkoušek Sledujte návod k použití

i

Použitelné do Pro jednorázové použití Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiál Komponenty Počet Sterilizováno ozářením Kunitz jednotky Teplotní rozmezí Horní mez teploty Výrobce Důležité upozornění

?

Zapište aktuální datum po přidání ethanolu do láhve

EtOH

Po dodání Přidat Obsahuje Rekonstituováno Deoxyribonukleáza I Ethanol Guanidin isothiokyanát RNase-Free DNase Set Vede k

4


Obsah soupravy PAXgene Blood RNA Kit Katalog čís. Počet příprav

(50) 762174 50

BR 1

Pufr k resuspenzi

20 ml

BR 2

Vazebný pufr *

18 ml

BR 3

Promývací pufr 1*

45 ml

BR 4

Promývací pufr 2† (koncentrát)

11 ml

BR5

Eluční pufr

RNFW

Voda prostá RNázy (láhev)

2x 125 ml

PK

Proteináza K (zelené víčko)

2x 1,4 ml

PRC

PAXgene RNA kolonky (červená)

5 x 10

PT

2 ml zkumavky (Processing Tubes)

6 x 50

Hemogard Sekundární BD Hemogard™ uzávěry MCT

mikrocentrifugační zkumavky (1,5 ml)

RNFD

DNáza l, prostá RNázy (lyofilizovaná)

6 ml

50 3 x 50 1 x 10 1500 Kunitz jednotky‡

Pokračování tabulky na druhé straně * Nesmí přijít do kontaktu s desinfekčními prostředky, které obsahují chlorová bělidla (chlornan sodný, NaOCl). Obsahuje sůl guanidinu. Viz bezpečnostní informace na straně 7. † Promývací pufr 2 (BR4) se dodává jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96–100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok. ‡ Kunitz jsou běžně užívané jednotky pro měření enzymatické aktivity DNázy I; definici naleznete na straně 42 nebo 48.


5

PAXgene Blood RNA Kit Katalog čís.

(50) 762174

Počet příprav RDD

Pufr k digesci DNA (bílé víčko)

DRB

Pufr k resuspenzi DNázy (zkumavka, fialové víčko)

PSC

PAXgene Shredder kolonky (fialová) PAXgene Blood RNA Kit Manuál (verze 2)

50 2 x 2 ml 2 ml 5 x 10 1

Podmínky skladování PAXgene RNA kolonky (PRC), PAXgene Shredder kolonky (PSC), proteináza K (PK), a pufry (BR1, BR2, BR3, BR4, a BR5) mohou být skladovány v suchu a při teplotě uvedené na štítku soupravy. RNase-Free DNase Set, který obsahuje DNázu I (RNFD), pufr k digesci DNA (RDD) a pufr k resuspenzi DNázy (DRB), se zasílá při okolní teplotě. Všechny komponenty RNase-Free DNase Setu ihned po dodání uskladněte při teplotě uvedené na štítku.

Zamýšlený účel použití PAXgene Blood RNA Kit slouží k purifikaci celulární RNA z plné krve, která byla odebrána pomocí PAXgene Blood RNA Tubes (BRT). Pomocí tohoto systému, který se skládá z kitu a PAXgene Blood RNA Tubes, získáte ze vzorků plné krve purifikovanou intracelulární RNA, která může být použita v molekulárně diagnostických testech zakládajících se na RT PCR. Pokyny k použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) naleznete v popisu výrobku PAXgene Blood RNA Tubes. Charakteristika výkonu systému PAXgene Blood RNA uvedená v tomto manuálu platí pro transkripty genů FOS a IL1B. Uživatel je zodpovědný za stanovení odpovídající charakteristiky výkonu systému PAXgene Blood RNA pro jiné transkripty.

6


Omezení použití PAXgene Blood RNA Kit je koncipován jako pomocný prostředek k purifikaci intracelulární RNA z lidské plné krve (4,8 x 106 – 1,1 x 107 leukocytů/ml) pro diagnostické použití in vitro. Není určen k purifikaci genomické DNA nebo virových nukleových kyselin z plné krve. Vzhledem k tomu, že byl pro stabilizační podmínky uvedené v tomto manuálu validován jen omezený počet RNA transkriptů (transkripty genů FOS a IL1B), nebyla charakteristika výkonu stanovena pro všechny transkripty. Uživatel kitu by měl zhodnotit vlastní data a údaje výrobce, aby určil, zda je validace nezbytná i pro jiné transkripty neuvedené v této dokumentaci.

Kontrola kvality Podle ISO certifikovaného systému managementu jakosti společnosti QIAGEN je každá šarže PAXgene Blood RNA Kit testována podle předem stanovených kritérií, aby byla zaručena jednotná kvalita produktu.

Technická podpora Technická podpora společnosti QIAGEN ručí za kvalitu vědeckého poradenství našich zákazníků. Naši zkušení vědci jsou Vám a Vašim otázkám ohledně produktů PreAnalytiX vždy k dispozici. Pokud máte otázky ohledně PAXgene Blood RNA Kit, prosím kontaktujte nás. Pro technickou asistenci a další informace kontaktujte prosím Technickou podporu QIAGEN (viz strana 61).

Bezpečnostní informace Při práci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Aby se vyloučilo riziko infekce (např. virem HIV nebo hepatitidy B) nebo zranění, noste také při manipulaci s biologickými a chemickými materiály vhodný laboratorní oděv, jednorázové ochranné rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (material safety data sheets, MSDS). V naší online sbírce bezpečnostních listů na www.preanalytix.com/RNA_msds je k tomuto kitu a každému komponentu k dispozici příslušný MSDS v souboru PDF, který si můžete prohlédnout a vytisknout. Vazebný pufr (BR2) a promývací pufr 1 (BR3) obsahují guanidin isothiokyanát, který může při kontaktu s chlorovými bělidly vytvářet vysoce reaktivní sloučeniny.


7

Pokud se rozlije kapalina obsahující vazebný pufr (BR2) nebo promývací pufr 1 (BR3), vyčistěte postižené místo vhodným laboratorním detergentem a vodou. Obsahuje-li rozlitá kapalina potenciálně infekční látky, vyčistěte místo nejprve detergentem a vodou a potom 1 % (v/v) chlornanem sodným. UPOZORNĚNÍ: NEPŘIDÁVEJTE chlorová bělidla nebo kyselé roztoky přímo do odpadu, který vzniká při přípravě RNA. Stabilizační roztok RNA a krevní tekutina z PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) mohou být desinfikovány pomocí 1 jednotky objemu roztoku chlorového bělidla (5 % chlornan sodný) na 9 jednotek objemu stabilizačního roztoku RNA resp. krevní tekutiny. Odpad vznikající při přípravě RNA, např. supernatanty po centrifugačních krocích, by měl být vždy považován za potenciálně infekční. Proto by měl být odpad před likvidací autoklavován nebo spálen, aby byl infekční materiál zničen. Postupujte v každém případě podle platných předpisů a směrnic pro likvidaci. Následující rizikové a bezpečnostní věty (R- a S-věty) platí pro jednotlivé reagencie soupravy PAXgene Blood RNA Kit. Bezpečnostní pokyny pro použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) naleznete v popisu výrobku PAXgene Blood RNA Tube. Vazebný pufr (BR2) Xn Obsahuje guanidin isothiokyanát: zdraví škodlivý (Xn). R- a S- věty:* R20/21/22-32, S13-26-36-46 Promývací pufr 1 (BR3) Obsahuje ethanol: hořlavý. R-věta:* R10

* R10: Hořlavý. R20/21/22: Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. R32: Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. R36/37/38: Dráždí oči, dýchací orgány a kůži. R42/43: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování a při styku s kůží. S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv. S22: Nevdechujte prach. S23: Nevdechujte aerosoly. S24: Zamezte styku s kůží. S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. S36: Používejte vhodný ochranný oděv. S36/37: Používejte vhodný ochranný oděv a ochranné rukavice. S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení.

8


Proteináza K (PK) Xn Obsahuje proteinázu K (z Tritirachium album): senzibilátor, dráždivý. R- a Světy:* R36/37/38-42/43, S23-24-26-36/37 DNáza I Xn Obsahuje deoxyribonukleázu (bovinní): senzibilátor. R- a S-věty:* R42/43, S2224-26-36/37

24 hodinové tísňové volání V případě nouze získáte lékařské informace 24 hodin denně (v anglickém, francouzském a německém jazyce) na: Toxikologická informační služba v Mohuči (Giftnotruf der Beratungsstelle bei Vergiftungen in Mainz), Německo Tel: +49-6131-19240

* R10: Hořlavý. R20/21/22: Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. R32: Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. R36/37/38: Dráždí oči, dýchací orgány a kůži. R42/43: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování a při styku s kůží. S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv. S22: Nevdechujte prach. S23: Nevdechujte aerosoly. S24: Zamezte styku s kůží. S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. S36: Používejte vhodný ochranný oděv. S36/37: Používejte vhodný ochranný oděv a ochranné rukavice. S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení.


9

Úvod Odběr vzorku krve je u mnoha molekulárně biologických výzkumů celulární RNA prvním krokem. Hlavním problémem je přitom instabilita profilu celulární RNA in vitro. Výzkumy u PreAnalytiX ukázaly, že se počet kopií jednotlivých druhů mRNA v plné krvi mohou během přepravy nebo skladování při pokojové teplotě změnit více než tisícinásobně.* Příčinou je rychlá degradace RNA a indukovaná exprese určitých genů po odběru krve. Takové změny RNA profilu znemožňují spolehlivé studie genové exprese. Metoda k zachování profilu exprese RNA během a po odběru krve je tedy pro přesné analýzy genové exprese v lidské plné krvi nezbytná.

Princip a jeho použití PreAnalytiX vyvinul nový systém, který umožňuje odběr, stabilizaci, skladování a přepravu vzorků lidské plné krve, a s kterým je možné izolovat intracelulární RNA podle rychlého a efektivního protokolu. Systém vyžaduje použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; USA patenty 6,602,718 a 6,617,170) k odběru krve a současné stabilizaci RNA, a PAXgene Blood RNA Kit k následné manuální či automatizované purifikaci RNA. Manuální i automatizovaný protokol poskytují rovnocenný výkon vzhledem ke kvalitě RNA a výtěžku. Údaje výkonu pro manuální (str. 19–26) a automatizovaný (str. 27–30) protokol jsou obsaženy v tomto manuálu.

Odběr vzorku a stabilizace PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) obsahují reagencii, která se zakládá na patentované RNA stabilizační metodě (USA patenty 6.602.718 a 6.617.170). Tato reagencie chrání molekulu RNA před degradací RNázou a redukuje ex vivo změny genové exprese na minimum. PAXgene Blood RNA Tubes pro odběr lidské plné krve zaručují stabilizaci celulární RNA až po 3 dny při 18–25 °C (viz obr. 1 a 2, str. 12 a 13) nebo až po 5 dnů při 2–8 °C (obr. 3 a 4, str. 14 a 15). V současnosti dostupné údaje ukazují, že je celulární RNA při –20 °C nebo –70°C stabilní minimálně po dobu 24 měsíců. Další informace ze studií vyhodnucujících stabilitu po ještě delší dobu získáte u Technické podpory QIAGEN.

* Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mRNA expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, 1883.

10


Skutečná doba stabilizace RNA se může měnit podle druhů RNA a použité postupné aplikace. Vzhledem k tomu, že byl pro stabilizační podmínky uvedené v tomto manuálu validován jen omezený počet RNA transkriptů (transkripty genů FOS a IL1B), nebyla charakteristika výkonu stanovena pro všechny transkripty. Uživatel kitu by měl zhodnotit vlastní data a údaje výrobce, aby určil, zda je validace nezbytná i pro jiné, zde neuvedené transkripty.


11

Stabilita RNA v krevních vzorcích při 18–25 °C: FOS

Skladování (dny)

Skladování (dny) Obrázek 1. Krev byla odebrána deseti dárcům a před purifikací celkové RNA uskladněna při 18–25 °C po různě dlouhou dobu. Všechny vzorky byly odebrány v duplikátech. Odběr krve a skladování v PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), purifikace celkové RNA pomocí PAXgene Blood RNA Kit. Odběr krve a skladování ve standardních odběrových zkumavkách (EDTA jako antikoagulant), purifikace celkové RNA standardní extrakční metodou (s organickými rozpouštědly) a čištění RNA zakládající se na silikátové membráně. Relativní koncentrace FOS transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18S-rRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 CT).

12


Stabilita RNA v krevních vzorcích při 18–25 °C: IL1B

Skladování (dny)

Skladování (dny) Obrázek 2. Odběr krevních vzorků a purifikace celkové RNA po uskladnění při 18–25 °C proběhly tak, jak je popsáno na obrázku 1. Relativní koncentrace IL1B transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18S-rRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 1,93 CT).


13

Stabilita RNA v krevních vzorcích při 2–8 °C: FOS

Skladování (dny)

Skladování (dny) Obrázek 3 Krev byla odebrána deseti dárcům a před purifikací celkové RNA uskladněna při 2–8 °C po různě dlouhou dobu. Všechny vzorky byly odebrány v duplikátech. Odběr krve a skladování v PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), purifikace celkové RNA pomocí PAXgene Blood RNA Kit. Odběr krve a skladování ve standardních odběrových zkumavkách (EDTA jako antikoagulant), purifikace celkové RNA standardní extrakční metodou (s organickými rozpouštědly) a čištění RNA zakládající se na silikátové membráně. Relativní koncentrace FOS transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18S-rRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 CT).

14


Stabilita RNA v krevních vzorcích při 2–8 °C: IL1B

Skladování (dny)

Skladování (dny) Obrázek 4 Odběr krevních vzorků a purifikace celkové RNA po uskladnění při 2-8 °C proběhly tak, jak je popsáno na obrázku 3. Relativní koncentrace IL1B transkriptů byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za použití 18SrRNA jako interního standardu. Zaneseny jsou hodnoty všech analyzovaných vzorků s průměrem a standardní odchylkou. Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 1,93 CT).


15

Koncentrace a purifikace RNA PAXgene Blood RNA Kit je určen k purifikaci celkové RNA z 2,5 ml lidské plné krve, která byla odebrána do PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Postup je jednoduchý a může být proveden za užití manuální i automatizované procedury (viz diagram). Purifikace RNA začíná v obou protokolech centrifugačním krokem, aby nukleové kyseliny v PAXgene Blood RNA Tube (BRT) sedimentovaly. Pelet se promyje a resuspenduje, následuje manuální nebo automatizovaná purifikace RNA. Oba protokoly v podstatě postupují podle stejných kroků a pracují se stejnými komponenty soupravy.

16


Manuální postup PAXgene Blood RNA Přidat proteinázu K (PK) a vazebný pufr (BR2)

Krev

Inkubovat Nanést na PAXgene Shredder kolonku (PSC) Promíchat Převést supernatant průtoku do mikrocentrifugační zkumavky Přidat ethanol

Nanést na PAXgene RNA kolonku (PRC)

Promýt pelet

Navázat celkovou RNA

Promýt

Digesce DNA Resuspendovat

Převést do mikrocentrifugační zkumavky (MCT)

Promýt

Eluovat

Ohřát na 65°C

RNA připravená k použití


17

Automatizovaný postup PAXgene Blood RNA Krev

Přidat proteinázu K (PK) a vazebný pufr (BR2) Inkubovat

Promíchat

Převést na PAXgene Shredder kolonku (PSC)

Přidat ethanol k průtoku Promíchat pelet

Resuspendovat

Promýt

Převést do zkumavky (PT) a nanést na QIAcube shaker Digesce DNA

Plně automatizováno na QIAcube

Nanést na PAXgene RNA kolonku (PRC) Návázat celkovou RNA

Promýt

Převést PAXgene RNA kolonku (PRC)

Eluovat Zavřít víčko zkumavky (MCT) a převést do QIAcube shaker Ohřát 95°C RNA připravená k použití

18


Manuální purifikace RNA Resuspendovaný pelet se inkubuje v optimalizovaných pufrech spolu s proteinázou K (PK), aby se navodila proteinová digesce. Dodatečný centrifugační krok přes PAXgene Shredder kolonku (PSC) slouží k homogenizaci buněčného lyzátu a k odstranění zbylých buněčných úlomků. Supernatant průtoku se převede do nové 1,5 ml zkumavky. Přidáním ethanolu se nastaví optimální vazební podmínky a lyzát se nanese na PAXgene RNA kolonku (PRC). Při následné krátké centrifugaci se RNA selektivně naváže na PAXgene silika membránu, kdežto kontaminace jí projdou. Zbylé kontaminace se odstraní mnoha účinnými promývacími kroky. Mezi prvním a druhým promývacím krokem se membrána inkubuje DNázou I (RNFD), aby se odstranily případné navázané zbytky DNA. Po promývacích krocích se RNA eluuje v elučním pufru (BR5) a denaturuje teplem. Celková RNA purifikovaná pomocí systému PAXgene Blood RNA je vysoce čistá. Při použití manuálního protokolu leží hodnoty A260/A280 mezi 1,8 a 2,2; podíl genomické DNA tvoří u ≥95% všech vzorků ≤ 1,0 % (w/w), jak bylo změřeno pomocí kvantitativní real-time-PCR jedné sekvence genu beta-aktinu. U RT PCR experimentů, při kterých tvořil eluát až 30 % reakčního objemu, nebyly u více než 95 % vzorků RNA zjištěny žádné známky inhibice rozborového systému. Při použití manuálního protokolu je průměrná doba přípravy vzorku (určeno na základě 12 provedených příprav RNA) přibližně 90 minut, přičemž doba manipulace činí cca 40 minut. U více než 95 % zpracovaných vzorků byl dosažen výtěžek RNA o ≥ 3 μg z 2,5 ml plné krve zdravých probandů. Protože výtěžky silně závisí na probandech, mohou se jednotlivé výtěžky RNA lišit. Systém PAXgene Blood RNA poskytuje při testování jednotlivých osob reprodukovatelné a opakovatelné výtěžky (viz obrázky 5 a 6 na stranách 20 a 21), stejně jako reprodukovatelné a opakovatelné výsledky RT-PCR (viz obrázky 7 a 8 na stranách 24 a 25), takže je velmi vhodný pro klinicko-diagnostické testy. Obrázek 5 zobrazuje reprodukovatelnost a opakovatelnost systému PAXgene Blood RNA. V dalších studiích byly zkoumány jednak různé šarže souprav PAXgene Blood RNA Kit, jednak vliv laborantů provádějících testy na reprodukovatelnost výtěžku RNA a výsledků Real-Time-RT-PCR. Protože byly pro tyto testy použity sdružené krevní vzorky, a ne vzorky individuálně získané s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), neodráží výsledky těchto pokusů opakovatelnost celého systému, která zohledňuje také rozdíly při odběru krve, nýbrž pouze opakovatelnost přípravy RNA (viz obrázek 6).


19

RNA výtěžek (μg/2,5 ml krve)

Reprodukovatelná a opakovatelná purifikace RNA

Průměrný výtěžek RNA (μg/2.5 ml krve)

Proband

Proband Obrázek 5 Čtyřnásobná stanovení krevních vzorků 14 probandů byla manuálně provedena třemi různými laboranty (A, B, C). Přitom byly použity tři různé soupravy laboratorních přístrojů a jiných pomocných prostředků, přičemž každý laborant používal pro zpracování vzorků vždy jednu a tu samou soupravu přístrojů. Zobrazeny jsou průměrné hodnoty a standardní odchylky výtěžku RNA pro každý replikát vzorku stejného probanda zpracovaného různými laboranty. Dvanáct replikátů krevních vzorků každého z 14 probandů byly zpracovány třemi různými laboranty. Zobrazeny jsou průměrné hodnoty a standardní odchylky výtěžku RNA pro každý vzorek stejného probanda zpracovaného všemi třemi laboranty. U všech vzorků RNA ležel poměr absorbancí A260/A280 v oblasti od 1,8 do 2,2.

20


RNA výtěžek (μg/2,5 ml krve)

Opakovatelnost a reprodukovatelnost výtěžku RNA u různých laborantů a různých šarží soupravy PAXgene Blood RNA Kit za užití sdružených krevních vzorků

CV výtěžku RNA (%)

Soubor probandů

Proband Obrázek 6. Krevní vzorky 30 probandů byly odebrány do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; 12 zkumavek na probanda, tzn. celkově 360 zkumavek). Obsah všech zkumavek od 3 probandů byl sdružen a následně znovu rozpipetován na 36 vzorků. Těchto 36 vzorků na jeden soubor tří probandů bylo manuálně zpracováno třemi různými laboranty. Každý laborant použil pro izolaci RNA tři různé šarže soupravy PAXgene Blood RNA Kit a Výtěžek RNA a standardní odchylka pro každou zpracoval čtyři replikáty z každého z deseti souborů probandů. kombinaci laborant-šarže. Čtyřikrát opakované zpracování krevních vzorků z 10 souborů bylo provedeno třemi různými laboranty (A, B, C) pomocí každé ze tří šarží (1, 2, 3). Zobrazeny jsou průměrné výtěžky (sloupce) a standardní odchylky (chybové úsečky) na jedno čtyřnásobné stanovení ze stejného souboru probandů, pro různé laboranty a šarže soupravy. Variační koeficient (CV) výtěžku RNA na jeden soubor probandů, pro všechny kombinace laborant-šarže (A, B, C); 1, 2, 3); vypočítáno z průměrných výtěžků a standardních odchylek zobrazených na obrázku 6A.


21

22


7,98

7,87

7,32

6,09

6,87

7,04

6,98

8,78

Šarže 1, laborant B

Šarže 1, laborant C

Šarže 2, laborant A


Šarže 2, laborant C



Šarže 3, laborant C 0,89

1,22

0,90

0,31

1,04

0,98

0,45

1,17

0,42

SD (μg)

10

17

13

4

17

13

6

15

5

CV (%)

10,59

7,73

8,96

10,37

9,82

9,78

10,71

9,38

9,55

Průměrný výtěžek (μg)

1,94

0,97

0,68

0,74

2,83

1,89

0,65

1,94

0,99

SD (μg)

Soubor probandů 6 6,5 x 106 buněk /ml

18

13

8

7

29

19

6

21

10

CV (%)

10,78

6,41

8,18

9,14

7,20

6,92

10,14

8,82

7,52


7,46

7,02

7,84

Laborant A, všechny šarže

Laborant B, všechny šarže

Laborant C, všechny šarže

Kombinace dat


0,98

1,31

0,85

SD (μg)

13

19

11

CV (%)


10,56

8,98

9,43


1,15

2,09

1,22

SD (μg)

11

23

13

CV (%)


10,02

7,48

7,54


1,34

1,50

0,72

SD (μg)

13

20

10

CV (%)

5

14

9

17

10

4

14

19

6

CV (%)


0,56

0,88

0,76

1,52

0,71

0,27

1,46

1,72

0,41

SD (μg)


Tabulka 1B. Reprodukovatelnost v rámci každého laboranta a mezi všemi šaržemi

8,03



Kombinace dat

Soubor probandů 1 5,1 x 106 buněk/ml

Tabulka 1A. Reprodukovatelnost v rámci každé šarže a každého uživatele

0,37

2,17

0,82

1,21

0,56

1,23

1,29

0,76

0,49

SD (μg)

10,89

8,26

7,81


1,10

1,54

0,82

SD (μg)

10

19

11

CV (%)

3

24

10

10

8

16

13

9

6

CV (%)


10,88

8,88

7,85

11,56

7,00

7,63

10,22

8,90

7,96




23

6,76 7,60

Šarže 2, všichni laboranti

Šarže 3, všichni laboranti 1,27

0,93

0,69

SD (μg)

17

14

9

CV (%)

9,09

9,99

9,88


1,71

1,84

1,34

SD (μg)

7,44 1,09

SD (μg) 15

CV (%) 9,66


1,65

SD (μg)

17

CV (%)


1,99

1,36

1,63

SD (μg)

24

18

19

CV (%)

8,35


1,70

SD (μg)

20

CV (%)


8,46

7,75

8,83



1,80

2,31

1,27

SD (μg)

20

26

14

CV (%)

8,99


1,8

SD (μg)

20

CV (%)


9,20

8,73

9,02



Detailní analýza 4 souborů probandů. Soubory byly vybrány podle počtu leukocytů a udávají nejvyšší, střední a nejnižší hodnotu normální oblasti množství leukocytů (4,8 x 106 – 1,1 x 107 leukocytů/ml). Počet leukocytů představuje průměr množství leukocytů tří probandů z jednoho souboru probandů.

Všechny šarže; všichni laboranti

Kombinace dat



19

18

14

CV (%)


Tabulka 1D. Reprodukovatelnost mezi všemi šaržemi a všemi laboranty

7,96

Šarže 1, všichni laboranti

Kombinace dat



Tabulka 1C. Reprodukovatelnost v rámci každé šarže a mezi všemi laboranty

Reprodukovatelnost RT-PCR – mezi uživately

Uživatel

Uživatel Obrázek 7 Vzorky RNA izolované v experimentu popsaném v obr. 6 byly použity pro Real-Time-RT-PCR. Relativní a IL1B byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za užití 18S-rRNA jako koncentrace transkriptů FOS interního standardu. Zobrazeny jsou hodnoty všech vzorků, a sice v poměru k hodnotám pro uživatele 1 (10 souborů probandů x 3 šarže soupravy x 4 replikáty = 120 souborů dat pro každý gen) s průměrem (červená linie) a standardní odchylkou (černá úsečka). Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 CT (FOS) a ± 1,93 CT (IL1B)).

24


Reprodukovatelnost RT-PCR – mezi šaržemi

Šarže

Šarže

Obrázek 8 Vzorky RNA izolované v experimentu popsaném v obr. 6 byly použity pro Real-Time-RT-PCR. Relativní a IL1B byly určeny pomocí Real-Time-Duplex-RT-PCR za užití 18S-rRNA jako koncentrace transkriptů FOS interního standardu. Zobrazeny jsou hodnoty všech vzorků, a sice v poměru k hodnotám pro šarži soupravy 1 (10 souborů probandů x 3 uživatelé x 4 replikáty = 120 souborů dat pro každý gen) s průměrem (červená linie) a standardní odchylkou (černá úsečka). Čárkované linie znázorňují oblast přesnosti měření rozboru (± 3 násobná celková přesnost o ± 2,34 CT (FOS) a ± 1,93 CT (IL1B)).


25

Tabulka 2. Souhrn dat RT-PCR z obrázků 7 a 8 Testovací systém Porovnání dat

rozbor FOS/18S rRNA rozbor IL1B/18S rRNA Průměr (∆∆ CT)

±SD (∆∆ CT)

Průměr (∆∆ CT)

±SD (∆∆ CT)

Reprodukovatelnost v rámci každého laboranta a mezi všemi šaržemi Všichni laboranti, šarže 1 – šarže 1

0,00

0,00

0,00

0,00

Všichni laboranti, šarže 2 – šarže 2

–0,03

0,48

–0,07

0,66

Všichni laboranti, šarže 3 – šarže 3

–0,21

0,52

0,11

0,71

Reprodukovatelnost mezi všemi laboranty a v rámci každé šarže Všechny šarže, laborant A – laborant A

0,00

0,00

0,00

0,00

Všechny šarže, laborant A – laborant B

–0,46

0,44

–0,06

0,69

Všechny šarže, laborant A – laborant C

–0,31

0,60

–0,15

0,71

Laborant: Technický(á) asistent(ka), který(á) provedl(a) experimenty. Šarže: Číslo šarže použitého kitu. SD: Standardní odchylka. Zobrazeny jsou průměry ∆∆CT hodnot (N = 120) a standarní odchylky dat znázorněných na obrázcích 7 a 8.

26


Automatizovaná purifikace RNA Příprava vzorku za užití přístroje QIAcube® probíhá stejně jako manuální procedura, která umožňuje použití PAXgene Blood RNA Kit pro purifikaci vysoce kvalitní RNA. Více iformací o QIAcube získáte v QIAcube User Manual a na www.qiagen.com/MyQIAcube. Protokol automatizované purifikace RNA obsahuje dvě části (resp. protokoly) “PAXgene Blood RNA Part A” a “PAXgene Blood RNA Part B” s krátkou manuální intervencí mezi oběma částmi. Centrifugovaný, promytý a resuspendovaný pelet nukleové kyseliny (viz “Koncentrace a purifikace RNA”, str. 16) se přenese z PAXgene Blood RNA Tube (BRT) do zkumavek (PT), které jsou umístěny v termotřepačce na pracovní desce QIAcube. Operátor vybere a spustí protokol “PAXgene Blood RNA Part A”. QIAcube provede kroky protokolu až po eluci RNA v elučním pufru (BR5). Operátor přenese mikrocentrifugační zkumavky (MCT) obsahující purifikovanou RNA do termotřepačky v QIAcube. Operátor vybere a spustí protokol “PAXgene Blood RNA Part B”, tepelnou denaturaci provede QIAcube. Průměrná doba přípravy vzorku (určeno na základě 12 provedených příprav) je 125 minut, z toho tvoří manuální manipulace pouze cca 20 minut. U více než 95 % zpracovaných vzorků byl dosažen výtěžek RNA o ≥ 3 μg z 2,5 ml plné krve zdravých probandů. Obrázek 19 uvádí výtěžky RNA z 288 vzorků, které byly za užití automatizovaného protokolu zpracovány třemi laboranty se 3 šaržemi soupravy. Protože byly pro tyto testy použity sdružené krevní vzorky, a ne vzorky individuálně získané s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), neodráží tyto výsledky vytěžky RNA očekávané od individuálních vzorků z jednotlivých odběrů. Protože výtežky silně závisí na probandech, mohou se jednotlivé výtěžky lišit (obr. 9).


27

Výtěžek RNA (μg/2.5 ml krve)

Výtěžek RNA– automatizované zpracování

Obrázek 9 Krevní vzorky 48 různých probandů byly odebrány do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; 6 zkumavek na probanda, celkově 288 zkumavek). Obsah všech zkumavek od 6 probandů byl sdružen a následně znovu rozpipetován na 36 vzorků. Těchto 36 vzorků na jeden soubor 6 probandů bylo zpracováno třemi různými laboranty (A, B, C). Každý laborant použil pro automatizovanou izolaci RNA tři různé šarže (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit a zpracoval čtyři replikáty z každého z osmi souborů probandů. Zobrazeny jsou výtěžky RNA všech jednotlivých vzorků na každou kombinaci operátor-šarže.

Přinejmenším 95% vzorků nevykazovalo za užití 30 % eluátu žádnou inhibici RT-PCR. U automatizovaného protokolu nebyly detekovány žádné křížové kontaminace mezi vzorky, tak bylo změřeno kvantitativní real-time RT-PCR sekvencí beta-globinu a FOS transkriptů v RNA negativních vzorcích (voda) spárovaných s RNA pozitivními vzorky (lidská plná krev). RNA purifikovaná pomocí systému PAXgene Blood RNA a automatizovaného protokolu je vysoce čistá, jak ukazuje nepřítomnost RT-PCR inhibicí (viz výše) a hodnoty A260/A280 mezi 1,8 a 2,2. Genomická DNA je přítomna u ≤1% (w/w) ve ≥95% všech vzorků, tak bylo změřeno kvantitativní real-time RT-PCR sekvence genu beta-aktinu. Obrázky 10 a 11 znázorňují hodnoty A260/A280 a relativní genomickou DNA všech 288 vzorků připravených pomocí automatizovaného protokolu se 3 šaržemi a 3 laboranty.

28


Čistota RNA (A260/A280)

Čistota RNA (hodnoty A260/A280) — automatizované zpracování

Obrázek 10 RNA byla v rámci experimentu popsaném v obrázku 9 purifikovaná 3 různými operátory (A, B, C) za užití 3 různých šarží (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit. Hodnoty A260/A280 všech jednotlivých vzorků jsou zobrazeny pro každou kombinaci operátor-šarže.

Genomická DNA (w/w) (%)

Čistota RNA (% kontaminace genomickou DNA) — automatizované zpracování

Obrázek 11 RNA byla v rámci experimentu popsaném v obrázku 9 purifikovaná 3 různými operátory (A, B, C) za užití 3 různých šarží (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit. Zobrazeno je množství genomické DNA (w/w) ve všech jednotlivých vzorcích pro každou kombinaci operátor-šarže.


29

Automatizovaný protokol purifikace RNA za užití systému PAXgene Blood RNA poskytuje vysoce reprodukovatelné a opakovatelné výsledky RT-PCR, jak je znázorněno na obrázku 12, a je tedy velmi vhodný pro klinicko-diagnostické testy. Reprodukovatelnost RT-PCR — mezi automatizovaným a manuálním protokolem

Obrázek 12 RNA byla v rámci experimentu popsaném na obrázku 9 purifikovaná 3 různými operátory (A, B, C) za užití 3 různých šarží (1, 2, 3) soupravy PAXgene Blood RNA Kit ve spojení s automatizovaným protokolem. Zároveň byla RNA purifikována z odpovídajících replikátů za užití manuálního protokolu. Relativní hladiny transkriptu IL1B byly určeny real-time duplex RT-PCR za užití 18S rRNA jako interního standardu. Možné rozdíly FOS a hladin transkriptů mezi RNA připravenou ze spárovaných krevních vzorků za užití obou extrakčních protokolů (manuální a automatizovaný protokol) byly vypočítány podle ∆∆CT metody. Jednotlivé ∆∆CT hodnoty všech párů vzorků (4 replikáty x 8 probandů x 3 šarže kitu x 3 operátoři = 288 párů každého genu) byly vyneseny do jednoho bodu s průměrem (větší body) a standardní odchylkou (černé úsečky). Čárkované linie uvádí ±3x celkovou přesnost rozborů (FOS: 2.34 CT; IL1B, 1.93 CT).

30


Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou Při manipulaci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (material safety data sheets, MSDS), které získáte u výrobce. Pro všechny protokoly • PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; kat. čís. 7642165) • Ethanol (96–100%, stupeň čistoty p.a.) • Pipety* (10 μl – 4 ml) • Sterilní pipetovací špičky prosté RNázy, s aerosolovou bariérou jako ochranou před kontaminací † • Odměrný válec ‡ • Centrifuga* s výkyvným rotorem a vhodnými adaptéry pro PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) a s rychlostí od 3000–5000 x g • Vortex mixer* • Drcený led • Permanentní fixa pro popisování Pro manuální protokol • Mikrocentrifuga* s rotorem pro 2 ml zkumavky a s variabilní rychlostí od 1000–8000 x g • Třepací inkubátor* pro inkubace při 55 °C a 65 °C s variabilní rychlostí mezi 400 a 1400 ot/min, např. Eppendorf® Thermomixer Compact nebo ekvivalent Pro automatizovaný protokol • QIAcube* (QIAGEN, kat. čís. 9001292 [110 V], kat. čís. 9001293 [230 V]) • QIAcube spotřební materiál • Špičky s filtrem, 1000 μl (1024) (QIAGEN, kat. čís. 990352)§ • Reagenční láhve, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. čís. 990393)§ • Adaptéry do rotoru (10 x 24) (QIAGEN, kat. čís. 990394)§ * Ujistěte se, že jsou přístroje pravidelně kontrolovány, udržovány a kalibrovány podle údajů výrobce. † Ujistěte se, že jste obeznámeni s pokyny pro zacházení s RNA (příloha A, str. 54). ‡ K odměření množství ethanolu, které se přidává ke koncentrátu pufru BR4. § Obsaženo také v Starter Pack, QIAcube (QIAGEN, kat. čís. 990395).


31

• QIAcube doplňky • Stojan na reagenční láhve (QIAGEN, kat. čís. 990390)§ • Držák pro adaptéry do rotoru (QIAGEN, kat. čís. 990392)§ • Nůžky

Důležité pokyny Používání QIAcube Ujistěte se, že jste obeznámeni s manipulací s přístrojem QIAcube. Prosím prostudujte si QIAcube User Manual a dodatečné informace dodávané s QIAcube. Prosím věnujte před začátkem automatizovaného PAXgene Blood RNA protokolu zvláštní pozornost bezpečnostním informacím.

Start QIAcube Zavřete dvířka QIAcube a zapněte QIAcube pomocí spínače (viz obrázek 13). Zazní pípnutí a objeví se startovací obrazovka. Přístroj automaticky provede zahajovací testy.

Instalace protokolu na QIAcube Před prvním během přípravy RNA na QIAcube je potřebný zahajovací protokol instalace. Instalujte oba “PAXgene Blood RNA Part A” a “PAXgene Blood RNA Part B” protokoly. Protokoly jsou k dispozici na www.qiagen.com/MyQIAcube. Musí být staženy na USB flash disk dodávaný s QIAcube a přeneseny do QIAcube přes USB port. USB port, který se nachází za ochranným panelem (viz obrázek 13), umožňuje spojení mezi QIAcube a USB flash diskem (dodávaným s QIAcube). Soubory dat, jako například log či report soubory, mohou být přeneseny přes USB port z QIAcube na USB flash disk. USB port se smí používat pouze pro USB flash disk dodávaný firmou QIAGEN. Nepoužívejte tento port s jinými zařízeními. Neodstraňujte USB flash disk během stahování protokolů, přenosu souborů dat nebo při běhu protokolu.

§

Obsaženo také v Starter Pack, QIAcube (QIAGEN, kat. čís. 990395).

32


Přední strana QIAcube

Obrázek 13 Dotyková obrazovka

USB port za ochranným panelem

Dvířka

Spínač

Sériový port RS232 za ochranným panelem (použití pouze pro specialisty firmy QIAGEN)


Odpadní zásuvka

33

Naplnění QIAcube Aby se ušetřil čas, může se QIAcube naplnit během jednoho nebo obou desetiminutových centrifugačních kroků (kroky 3 a 5) podle “Protokol: Automatizovaná purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT)”, strana 47. Reagenční láhve Opatrně naplňte 4 reagenční láhve QIAcube reagenciemi, které jsou uvedeny v tabulce 3 (láhve naplňte až po vyznačenou rysku). Na láhve a víčka jasně napište názvy pufrů a umístěte je do náležitých pozicí na stojanech na reagenční láhve (viz obrázky 14 a 15). Před každým během na QIAcube se ujistěte, že jsou reagenční láhve naplňené až po vyznačenou rysku (pro naplnění reagenčních lahví by měl být použit objem zbývající v láhvích s pufry původního kitu). Umístěte stojan s naplněnými reagenčními láhvemi na QIAcube pracovní desku, jak je znázorněno na obr. 14 a 15. Před umístěním lahví na pracovní desku se ujistěte, že jste odstranili jejich víčka. Objem pufrů dodávaných s PAXgene Blood RNA Kit (50) vystačí na max. 7 příprav RNA na QIAcube. Více běhům s malým množstvím vzorků by se mělo předejít, aby byl zajištěn dostatečný objem pufrů pro všech 50 zpracovaných vzorků. Tabulka 3. Pozice na stojanu na reagenční láhve Pozice

Reagencie

1

Vazebný pufr (BR2)

2

96–100% ethanol

3

Promývací pufr 1 (BR3)

4

Promývací pufr 2 (BR4)*

5

– (ponechte prázdnou)

6

– (ponechte prázdnou)

* Promývací pufr 2 (BR4) se dodává jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96–100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok.

34


Pozice 1 vazebný pufr (BR2)

Pozice 2 96-100% ethanol

Pozice 3 promývací pufr1 (BR3)

Pozice 4 promývací pufr 2 (BR4)

Pozice 5

Pozice 6

prázdná

prázdná

Proužek pro popis

Proužek pro popis

Vložení stojanu na reagenční láhve

Obrázek 14 Schéma pozic a obsahu láhví na stojanu pro reagenční láhve. Vložení stojanu do QIAcube.


35

Náhled do vnitřní platformy QIAcube

Obrázek 15 Víčko centrifugy

Drážky pro umístění mikrocentrifugačních zkumavek

Centrifuga

Stojan na špičky

Třepačka

Kanálky pro likvidaci špiček a kolonek

Stojan na reagenční láhve

Robotická ruka

Senzor pro kontrolu pipetovacích špiček

36


Kolonky (PRC, PSC), mikrocentrifugační zkumavky (MCT) a umělohmotné části QIAcube Umístěte 2 stojany na špičky se špičkami s filtry o 1000 μl do QIAcube (viz obrázek 15). Je-li potřeba, stojany doplňte. Používejte pouze špičky o 1000 μl určené pro použití s QIAcube. Popište permanentní fixou adaptéry pro rotor a mikrocentrifugační zkumavky (MCT) pro každý použitý vzorek. Otevřete PAXgene Shredder kolonky (PSC) určené k použití a zcela odstřihněte jejich víčka pomocí nůžek (obrázek 16). Aby mohla robotická ruka přístroje QIAcube správně pracovat, zcela odstraňte (odstřihněte) víčka a umělohmotné části spojující víčko a PAXgene Shredder kolonku (PSC; viz obrázek 16). Jinak nemůže robotická ruka kolonky (PSC, PRC) správně uchopit. Vložte PAXgene RNA kolonky (PRC), PAXgene Shredder kolonky (PSC, bez víček) a popsané mikrocentrifugační zkumavky (MCT) do náležitých pozic do každého popsaného adaptéru, jak uvedeno v tabulce 4 a obrázku 17 (strana 38). Ujistěte se, že jsou víčka kolonek (PRC) a mikrocentrifugačních zkumavek (MCT) stlačena až na dno drážek na okraji adaptéru, jinak se mohou víčka během centrifugace odlomit. Vložení PAXgene Shredder kolonek (PSC)

Víčka kolonek (PSC) odstraněná správně

Víčka kolonek (PSC) odstraněná nesprávně; část víčka přebývá

Obrázek 16 PAXgene Shredder kolonky (PSC) jsou vloženy do střední pozice. Odstřihněte před vložením kolonek (PSC) víčka.


37

Tabulka 4. Laboratorní materiál v adaptéru Pozice

Materiál

Pozice víčka

1

PAXgene RNA kolonka (červená, PRC)

L1

2

PAXgene Shredder kolonka (fialová, PSC) (odstřihnout víčko před vložením do adaptéru)

–

3

Mikrocentrifugační zkumavka (MCT)*

L3

* Používejte mikrocentrifugační zkumavky (1,5 ml, MCT) dodávané s PAXgene Blood RNA Kit.

Obrázek 17 Adaptér má tři pozice zkumavek (1–3) a tři pozice víček (L1–L3).

Naplnění centrifugy Vložte sestavené adaptéry do jamek centrifugy, jak je ukázáno na obrázku 18. Při zpracování méně než 12 vzorků musí být rotor centrifugy naplněn paprskovitě (viz obrázek 19), aby zůstal vyvážen. Před začátkem protokolu musí být nasazeny všechny jamky centrifugy, i v případě, že je zpracováváno méně než 12 vzorků. Jediný vzorek nebo 11 vzorků nelze zpracovat. Vkládání do centrifugy

Obrázek 18 Vložte sestavené adaptéry do jamek centrifugy.

38


Plnění centrifugy a třepačky

2 vzorky

4 vzorky

3 vzorky

5 vzorků

6 vzorků

7 vzorků

8 vzorků

9 vzorků

10 vzorků

Obrázek 19 Pozice centrifugy a třepačky jsou zobrazeny pro zpracování dvou (2 vzorky) až deseti vzorků (10 vzorků). Jeden nebo jedenáct vzorků nelze zpracovat.


39

Zkumavky Processing tubes (PT) Vyjměte z drážek mikrocentrifugy všechny zkumavky (PT), které zbyly z předchozích běhů (viz obrázek 15, strana 36). Naplňte zkumavky (PT) množstvím reagencií uvedeném v tabulce 5. Jasně popište zkumavky (PT) názvy reagencií a umístěte je do odpovídajících pozic v drážkách, jak je uvedeno v tabulce 6. Pipetujte uvedený objem pufru k digesci DNA (RDD) do zkumavky (PT) a přidejte uvedený objem základního roztoku DNázy I (RNFD). Směs jemně promíchejte náběrem a následným vypuštěním pipety (opakujte třikrát, za užití pipetovací špičky o 1000 μl). Používejte 2 ml zkumavky (PT) dodávané s PAXgene Blood RNA Kit. Ujistěte se, že pipetujete správný objem uvedený v tabulce 5. Tabulka 5. Požadovaný objem reagencií ve zkumavkách umístěných v drážkách pro mikrocentrifugační zkumavky. Objem reagencií potřebný pro uvedený počet vzorků (μl) Počet vzorků

Proteináza K (PK)

Inkubační směs DNázy I

Eluční pufr (BR5)

2

126

187 (23 DNáza I [RNFD] + 164 RDD)

313

3

170

260 (33 DNáza I [RNFD] + 228 RDD)

399

4

213

334 (42 DNáza I [RNFD] + 292 RDD)

486

5

256

407 (51 DNáza I [RNFD] + 356 RDD)

572

6

299

481 (60 DNáza I [RNFD] + 421 RDD)

658

7

342

554 (69 DNáza I [RNFD] + 485 RDD)

745

8

386

628 (78 DNáza I [RNFD] + 549 RDD)

831

9

429

701 (88 DNáza I [RNFD] + 613 RDD)

918

10

472

774 (97 DNáza I [RNFD] + 678 RDD)

1004

12

558

921 (115 DNáza I [RNFD] + 806 RDD)

1177

Tabulka 6. Drážky pro mikrocentrifugační zkumavky Pozice

Obsah Nádobka

A

B

C

Proteináza K (PK)

inkubační směs DNázy I

eluční pufr (BR5)

zkumavky (PT)*

zkumavky (PT)*

zkumavky (PT)*

* Používejte 2 ml zkumavky (PT) dodávané s PAXgene Blood RNA Kit.

40


Protokol: Manuální purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) Důležité pokyny před začátkem • Při dodání se ujistěte, že je kit intaktní a nepoškozený, a že nedošlo k úniku pufrů. Nepoužívejte viditelně poškozený kit. • Při užívání pipet zkontrolujte, zda je správně nastaven objem a také se ujistěte, že je tekutina zcela nasáta a opět vypuštěna. • Aby se zabránilo převedení vzorku do špatné zkumavky či kolonky, měly by být všechny zkumavky a kolonky pečlivě označeny a víčka nadepsána. Označte víčka a trup každé zkumavky (PT, MCT). U kolonek nadepište také sběrnou zkumavku, ve které se eluuje (Processing Tube). Po přidání tekutiny vždy každou zkumavku a kolonku uzavřete. • Rozlití tekutiny vzorku nebo pufru během přípravy může snížit výtěžek a čistotu RNA. • Pokud není jinak uvedeno, měly by být všechny kroky protokolu (včetně centrifugace) provedeny při pokojové teplotě (15–25 °C). • Vzhledem k vysoké senzitivitě metod amplifikace nukleových kyselin by měla být k zamezení křížových kontaminací dodržována následující preventivní opatření. • Vzorky pipetujte do kolonek (PRC, PSC) tak, aby se nepotřísnil horní okraj kolonky. • Mezi pipetovacími kroky vždy vyměňte pipetovací špičky. Používejte špičky s aerosolovou bariérou. • Dbejte prosím na to, aby jste se pipetovací špičkou nedotkli membrány v kolonce (PRC, PSC). • Mikrocentrifugační zkumavky (MCT) po vortexování nebo ohřívání krátce centrifugujte, aby se odstranily kapky z vnitřní strany víčka. • Po celou dobu přípravy noste laboratorní rukavice. V případě kontaktu se vzorkem rukavice ihned vyměňte. • Kolonky (PRC, PSC) před vložením do mikrocentrifugy vždy uzavřete. Centrifugujte podle údajů v protokolu. • Otevírejte najednou vždy jen jednu kolonku (PRC, PSC) a zabraňte tvorbě aerosolu.


41

• Pro efektivní paralelní zpracování více vzorků se doporučuje připravit stojan se sběrnými zkumavkami (Processing Tubes, PT), do kterých se po centrifugaci mohou vložit kolonky (PRC, PSC). Použitou sběrnou zkumavku (PT) i s průtokem vyhoďte a vložte nové zkumavky (PT) s kolonkami (PRC, PSC) přímo do mikrocentrifugy. Příprava vzorků před začátkem • Krev odeberte do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) podle pokynů v příslušném popisu produktu. V příloze C (na straně 57) naleznete stručný návod k zacházení s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT). • Po odběru krve inkubujte PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) minimálně 2 hodiny při pokojové teplotě, aby byla zajištěna uplná lýza krevních buněk. Inkubace PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) přes noc může vést k vyšším výtěžkům. Byla-li PAXgene Blood RNA Tube (BRT) po odběru krve skladována při 2–8 °C, –20 °C nebo –70 °C, ponechte ji před začátkem protokolu nejdříve ekvilibrovat na pokojovou teplotu a potom 2 hodiny inkubovat. • Přečtěte si bezpečnostní informace na straně 7. • Přečtěte si „Všeobecné pokyny k zacházení s RNA“ (příloha A na straně 54). • Ujistěte se, že jsou všechny použité přístroje, např. pipety a třepací inkubátory, pravidelně přezkoušeny a kalibrovány podle údajů výrobce. • Třepací inkubátor je zapotřebí u kroků 5 a 20. Nastavte teplotu inkubátoru na 55 °C. • Ve vazebném pufru (BR2) se může po delším skladování vytvořit sraženina. V tomto případě ji rozpust’te ohřátím na 37 °C. • Promývací pufr 2 (BR4) je dodáván jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96–100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok. • Před prvním použitím RNase-Free DNase Setu připravte základní roztok DNázy I. DNázu I (RNFD; 1500 Kunitz jednotek*) rozpust’te v 550 μl pufru k resuspenzi DNázy (DNase Resuspension Buffer; DRB), který je dodáván se soupravou. Dbejte na to, aby při otevření nádobky neunikla žádná DNáza I (RNFD). Rekonstituovaná DNáza I nesmí být vortexována. DNáza I je velmi náchylná k fyzikální denaturaci. Roztok DNázy I promíchejte pouze jemným převracením zkumavky.

* Kunitz jednotka je běžně užívaná jednotka pro měření enzymatické aktivity DNázy I; je definovaná jako množství DNázy I způsobující nárůst absorbance při 260 nm (A260) o 0,001 za minutu a mililitr při 25 °C a pH 5,0, přičemž je jako substrát použita vysoce polymerní DNA (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 und 363).

42


• Současné údaje ukazují, že je rekonstituovaná DNáza I (RNFD) skladovaná při 2–8 °C stabilní až 6 týdnů. Pro dlouhodobé skladování DNázy I (RNFD) se doporučuje rozdělit základní roztok na menší alikvoty pro jedno použití (použijte k tomu 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky [MCT] dodávané s kitem, které postačí pro 5 alikvotů) a skladovat při –20 °C (až 9 měsíců). Rozmrazené alikvoty se mohou skladovat při 2–8 °C až 6 týdnů. Rozmrazené alikvoty znovu nezmrazujte. • Při rekonstituci a alikvotaci roztoku DNázy I (RNFD) neopomeňte „Všeobecné pokyny k zacházení s RNA“ (příloha A na straně 54). Provedení 1. Centrifugujte PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 10 minut ve výkyvném rotoru při 3000–5000 x g. Ujistěte se, že byly krevní vzorky minimálně 2 hodiny inkubovány v PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) při pokojové teplotě (15–25 °C), aby bylo dosaženo úplné lýzy krevních buněk. Rotor musí být vybaven adaptéry pro zkumavky s kulatým dnem. Při používání jiných typů adaptérů se mohou zkumavky během centrifugace poškodit. opatrně odstraňte supernatant dekantací nebo 2. Následně pipetováním. K peletu přidejte 4 ml vody prosté RNázy (RNFW) a uzavřete zkumavku novým bezpečnostním uzávěrem BD Hemogard (dodávaný s kitem). Během dekantace supernatantu dbejte na to, aby se pelet neoddělil od vnitřní stěny, a osušte okraj zkumavky čistým papírovým ručníkem. 3. Pelet resuspendujte vortexováním a centrifugujte 10 minut ve výkyvném rotoru při 3000–5000 x g. Supernatant následně úplně odstraňte a zlikvidujte. Menší buněčné úlomky obsažené před centrifugací v supernatantu nenarušují další průběh protokolu. Naproti tomu může neúplné odstranění supernatantu inhibovat lýzu a zředit lyzát, a tím narušit podmínky pro navázání RNA na PAXgene membránu. 4. Přidejte 350 μl pufru k resuspenzi (Resuspension Buffer; BR1) a vortexujte dokud se pelet plně neresuspenduje. 5. Převeďte vzorek pipetou do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky (MCT). K tomu pipetujte 300 μl vazebného pufru (BR2) a 40 μl proteinázy K (PK). Promíchejte (vortexem) cca 5 sekund a inkubujte 10 minut při 55 °C v třepacím inkubátoru při rychlosti 400–1400


43

ot/min. Po inkubaci zvyšte teplotu třepacího inkubátoru na 65 °C (pro krok 20). Vazebný pufr (BR2) a proteinázu K (PK) nesmíchávejte před přidáním do vzorku dohromady. 6. Lyzát pipetujte přímo do PAXgene Shredder kolonky (PSC, fialová), která byla předtím vložena do 2 ml Processing Tube (PT), a centrifugujte 3 minuty při maximálních otáčkách (max. 20 000 x g). Celý lyzát opatrně převed’te pipetou do kolonky (PSC). Aby se zabránilo poškození kolonek (PSC) a zkumavek (PT), nepřekračujte rychlost 20,000 x g. Některé vzorky mohou projít PAXgene Shredder kolonkou (PSC) bez centrifugace. To je způsobeno nízkou viskozitou některých vzorků a nemusí se tedy považovat za chybu produktu. 7. Následně převeďte celý supernatant bez zvíření peletu do nové 1,5 ml zkumavky (MCT). 8. Přidejte 350 μl ethanolu (96–100 %, stupeň čistoty p. a.). Promíchejte vortexem a krátce centrifugujte (1–2 sekundy při 500–1000 x g), aby se odstranily kapky z vnitřní strany víčka. Délka centrifugace nesmí překročit 1–2 sekundy, protože by jinak mohlo dojít k sedimentaci nukleových kyselin a tím k redukovanému celkovému výtěžku RNA. 9. Pipetujte 700 μl vzorku do PAXgene RNA kolonky (PRC, červená), která byla předtím vložena do 2 ml Processing Tube (PT), a centrifugujte 1 minutu při 8000–20 000 x g. Kolonku (PRC) vložte do nové 2 ml Processing Tube (PT), použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte. 10. Pipetujte zbytek vzorku do PAXgene RNA kolonky (PRC) a centrifugujte opět 1 minutu při 8000–20 000 x g. Kolonku (PRC) vložte do nové 2 ml Processing Tube (PT), použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte. Celý vzorek opatrně převeďte pipetou do kolonky (PRC). 11. Převeďte 350 μl promývacího pufru 1 (BR3) do PAXgene RNA kolonky (PRC). Centrifugujte 1 minutu při 8000–20 000 x g. Kolonku (PRC) vložte do nové 2 ml Processing Tube (PT), použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte.

44


12. Pipetujte 10 μl základního roztoku DNázy I (RNFD) k 70 μl pufru k digesci DNA (RDD) v 1,5 ml zkumavce (MCT). Promíchejte jemným cvrnkáním do zkumavky a krátce centrifugujte, aby se sesbírala zbylá tekutina z okrajů zkumavky. Pro zpracování např. 10 vzorků pipetujte 100 μl základního roztoku DNázy I (RNFD) k 700 μl pufru k digesci DNA (RDD). Používejte 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky (MCT) dodávané s kitem. DNáza I je velmi náchylná k fyzikální denaturaci. Roztok promíchejte lehkým cvrnkáním do zkumavky. Nevortexujte. 13. Inkubační směs DNázy I (80 μl) pipetujte přímo na membránu v PAXgene RNA kolonce (PRC) a inkubujte 15 minut při 20–30 °C. Ujistěte se, že byla inkubační směs DNázy I (RNFD) umístěna přímo na membránu. Digesce pomocí DNázy by mohla proběhnout neúplně, pokud by část směsi zůstala na vnitřní straně nebo na O-kroužku kolonky (PRC). 14. Pipetujte 350 μl promývacího pufru 1 (BR3) do PAXgene RNA kolonky (PRC) a centrifugujte 1 minutu při 8000–20 000 x g. Kolonku (PRC) vložte do nové 2 ml Processing Tube (PT), použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte. 15. Pipetujte 500 μl promývacího pufru 2 (BR4) do PAXgene RNA kolonky (PRC) a centrifugujte 1 minutu při 8000–20 000 x g. Kolonku (PRC) vložte do nové 2 ml Processing Tube (PT), použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte. Promývací pufr 2 (BR4) se dodává jako koncentrát. Ujistěte se, že byl před prvním použitím k promývacímu pufru (BR4) přidán ethanol (viz „Důležité pokyny před začátkem přípravy“ na straně 42). 16. Přidejte dalších 500 μl promývacího pufru 2 (BR4) do PAXgene RNA kolonky (PRC). Centrifugujte 3 minuty při 8000–20 000 x g. 17. PAXgene RNA kolonku (PRC) vložte do nové 2 ml Processing Tube (PT), použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte. Centrifugujte 1 minutu při 8000–20 000 x g. 18. Použitou Processing Tube (PT) spolu s průtokem vyhoďte. PAXgene RNA kolonku (PRC) vložte do 1,5 ml zkumavky (MCT) a pipetujte 40 μl elučního pufru (BR5) přímo na membránu v PAXgene RNA kolonce (PRC). Centrifugujte 1 minutu při 8000–20 000 x g, aby se docílilo eluce RNA. Aby se dosáhlo maximální efektivity eluce, je důležité pokrýt celou plochu membrány elučním pufrem (BR5).


45

19. Zopakujte eluční krok (krok 18) opět s 40 μl elučního pufru (BR5) a stejnou 1,5 ml zkumavkou (MCT). 20. Eluát inkubujte 5 minut při 65°C v třepacím inkubátoru (viz krok 5), ale bez třepání. Vzorky poté ihned zchlaďte na ledu. Touto inkubací při 65°C se RNA denaturuje pro následující aplikace. Nepřekročte přitom ani dobu ani teplotu inkubace. 21. Pokud nebudou vzorky RNA ihned dále použity, můžete je skladovat při –20°C nebo –70°C. Protože RNA zůstává denaturovaná i po více zmrazeních a rozmrazeních, není nutné inkubaci při 65°C opakovat. Pokud chcete vzorky RNA použít pro diagnostické rozbory, dbejte údajů výrobce. Pro co nejpřesnější a nejspolehlivější kvantifikaci RNA měřením absorbance při 260 nm doporučujeme zředit vzorek s 10 mM Tris·Cl (pH 7,5).* Naředění vzorku vodou prostou RNázy by mohlo vést k nepřesným resp. nízkým hodnotám. Pro nastavení nulového bodu na spektrofotometru používejte ten samý pufr, ve kterém je naředěna RNA, a přidejte ten samý objem elučního pufru (BR5), který odpovídá objemu eluované RNA. Eluční pufr (BR5) při 220 nm silně absorbuje, což může vést k vysokým hodnotám absorbance pozadí, nebyl-li nulový bod spektrálního fotometru nastaven správně. Poznámka: Pro určení koncentrace RNA v Tris pufru můžete použít vztah A260 = 1 =>44 μg/ml (viz příloha B na straně 35).

* Při manipulaci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (Material Safety Data Sheets, MSDS), které získáte u výrobce.

46


Protokol: Automatizovaná purifikace celkové RNA z plné lidské krve odebrané do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) Důležité pokyny před začátkem • Při dodání se ujistěte, že je kit intaktní a nepoškozený a že nedošlo k úniku pufrů. Nepoužívejte viditelně poškozený kit. • Při užívání pipet zkontrolujte, zda je správně nastaven objem a také se ujistěte, že je tekutina zcela nasáta a opět vypuštěna. • Aby se zabránilo převedení vzorku do špatné zkumavky či umělohmotných prvků, ujistěte se, že jsou všechny Processing Tube (PT), mikrocentrifugační zkumavky (MCT) a adaptéry do rotoru správně nadepsány permanentní fixou. Nadepište víčka a trup mikrocentrifugačních zkumavek (MCT), trup Processing Tube (PT) a vnější stranu každého adaptéru do rotoru. • Rozlití tekutiny vzorku nebo pufru během přípravy může snížit výtěžek a čistotu RNA. • Pokud není jinak uvedeno, měly by být všechny kroky protokolu (včetně centrifugace) provedeny při pokojové teplotě (15–25 °C). • Vzhledem k vysoké senzitivitě metod amplifikace nukleových kyselin by měla být k zamezení křížových kontaminací dodržována následující preventivní opatření. • Vzorky pipetujte opatrně na dno Processing Tube (PT) tak, aby se nepotřísnil horní okraj zkumavky. • Mezi pipetovacími kroky vždy vyměňte pipetovací špičky. Používejte špičky s aerosolovou bariérou. • Dbejte prosím na to, aby jste se pipetovací špičkou nedotkli membrány v kolonce (PRC, PSC). • Mikrocentrifugační zkumavky (MCT) po vortexování nebo ohřívání krátce centrifugujte, aby se odstranily kapky z vnitřní strany víčka. • Po celou dobu přípravy noste laboratorní rukavice. V případě kontaktu se vzorkem rukavice ihned vyměňte. Příprava vzorků před začátkem • Krev odeberte do PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) podle pokynů v příslušném popisu produktu. V příloze C (na straně 57) naleznete stručný návod k zacházení s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT).


47

• Po odběru krve inkubujte PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) minimálně 2 hodiny při pokojové teplotě, aby byla zajištěna uplná lýza krevních buněk. Inkubace PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) přes noc může vést k vyšším výtěžkům. Byla-li PAXgene Blood RNA Tube (BRT) po odběru krve skladována při 2–8 °C, –20 °C nebo –70 °C, ponechte ji před začátkem protokolu nejdříve ekvilibrovat na pokojovou teplotu a potom 2 hodiny inkubovat. • Přečtěte si bezpečnostní informace na straně 7. • Přečtěte si „Důležité pokyny“na straně 32-39. • Přečtěte si „Všeobecné pokyny k zacházení s RNA“ (příloha A na straně 54). • Přečtěte si QIAcube User Manual a další informace, které jsou dodávány s QIAcube a věnujte přitom pozornost především bezpečnostním informacím. • Ujistěte se, že jsou všechny použité přístroje, např. pipety a QIAcube, pravidelně přezkoušeny a kalibrovány podle údajů výrobce. • Ve vazebném pufru (BR2) se může po delším skladování vytvořit sraženina. V tomto případě ji rozpust’te ohřátím na 37 °C. • Promývací pufr 2 (BR4) je dodáván jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte do láhve čtyřnásobný objem ethanolu (96–100 %, stupeň čistoty p. a.), jak je popsáno na štítku, abyste vytvořili pracovní roztok. • Před prvním použitím RNase-Free DNase Setu připravte základní roztok DNázy I. DNázu I (RNFD; 1500 Kunitz jednotek)* rozpust’te v 550 μl pufru k resuspenzi DNázy (DRB), který je dodáván se soupravou. Dbejte na to, aby při otevření nádobky neunikla žádná DNáza I (RNFD). Rekonstituovaná DNáza I nesmí být vortexována. DNáza I je velmi náchylná k fyzikální denaturaci. Roztok DNázy I promíchejte pouze jemným převracením zkumavky. • Současné údaje ukazují, že je rekonstituovaná DNáza I (RNFD) skladovaná při 2–8 °C stabilní až 6 týdnů. Pro dlouhodobé skladování DNázy I (RNFD) se doporučuje rozdělit základní roztok na menší alikvoty pro jedno použití (použijte k tomu 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky [MCT] dodávané s kitem, které postačí pro 5 alikvotů) a skladovat při –20 °C (až 9 měsíců). Rozmrazené alikvoty se mohou skladovat při 2–8 °C až 6 týdnů. Rozmrazené alikvoty znovu nezmrazujte. • Při rekonstituci a alikvotaci roztoku DNázy I (RNFD) neopomeňte „Všeobecné pokyny k zacházení s RNA“ (příloha A na straně 54).

* Kunitz jednotka je běžně užívaná jednotka pro měření enzymatické aktivity DNázy I; je definovaná jako množství DNázy I způsobující nárůst absorbance při 260 nm (A260) o 0,001 za minutu a mililitr při 25 °C a pH 5,0, přičemž je jako substrát použita vysoce polymerní DNA (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 und 363).

48


• Vložte správný adaptér třepačky (dodávaný s QIAcube; používejte adaptéry pro 2 ml zkumavky s bezpečnostním uzávěrem, označené “2”) a umístěte stojan na třepačku na vrch adaptéru. • Zkontrolujte zásuvku na odpad a vyprázdněte ji, je-li potřeba. • Instalujte protokoly, pokud ještě nebyly instalovány pro předešlé běhy. Instalujte oba protokoly “PAXgene Blood RNA Part A” a “PAXgene Blood RNA Part B”. Viz “Instalace protokolu na QIAcube”, strana 32. Provedení 1. Zavřete dvířka QIAcube a zapněte QIAcube pomocí spínače (viz obrázek 13, strana 33). Ozve se pípnutí a zobrazí se startovací obrazovka. Přístroj automaticky provede zahajovací testy. 2. Otevřete dvířka QIAcube a vložte do QIAcube potřebné reagencie a umělohmotné části (viz “Naplnění QIAcube”, strany 34–40). Aby se ušetřil čas, může se QIAcube naplnit během jednoho nebo obou desetiminutových centrifugačních kroků (kroky 3 a 5). 3. Centrifugujte PAXgene Blood RNA Tube (BRT) deset minut při 3000– 5000 x g za užití výkyvného rotoru. Ujistěte se, že byly krevní vzorky inkubovány v PAXgene Blood RNA Tube (BRT) při pokojové teplotě (15–25°C) po dobu minimálně 2 hodin, aby se dosáhlo úplné lýzy krevních buněk. Rotor musí být vybaven adaptéry pro zkumavky s kulatým dnem. Při používání jiných typů adaptérů se mohou zkumavky během centrifugace poškodit. 4. Následně opatrně odstraňte supenatant dekantací nebo pipetováním. K peletu přidejte 4 ml vody prosté RNázy (RNFW) a uzavřete zkumavku novým bezpečnostním uzávěrem BD Hemogard (dodávaný s kitem). Během dekantace supernatantu dbejte na to, aby se pelet nerozvířil, a osušte okraj zkumavky čistým papírovým ručníkem. 5. Pelet resuspendujte vortexováním a centrifugujte 10 minut ve výkyvném rotoru při 3000–5000 x g. Supernatant následně úplně odstraňte a zlikvidujte. Menší buněčné úlomky obsažené před centrifugací v supernatantu nenarušují další průběh protokolu.


49

Naproti tomu může neúplné odstranění supernatantu inhibovat lýzu a zředit lyzát, a tím narušit podmínky pro navázání RNA na PAXgene membránu. 6. Přidejte 350 μl pufru k resuspenzi (Resuspension Buffer; BR1) a vortexujte dokud se pelet plně neresuspenduje. 7. Pipetujte vzorek do 2 ml Processing Tube (PT). Používejte 2 ml Processing Tubes (PT) dodávanou s PAXgene Blood RNA Kit. 8. Vložte otevřené Processing Tube (PT) obsahující vzorek do třepačky QIAcube (viz obrázek 15, strana 36). Pozice vzorků jsou pro snadnější vkládání do třepačky očíslované. Zasuňte zátky (dodáváno s QIAcube) vedle každé Processing Tube do drážek na okraji stojanu třepačky. To umožní detekci vzorků během kontroly naplnění. Ujistěte se, že byl vložen správný adaptér třepačky (Shaker Adapter, 2 ml, zkumavky s bezpečnostním uzávěrem, označeno “2”, dodáváno s QIAcube). Pokud zpracováváte méně než 12 vzorků, tak se ujistěte, že byl stojan třepačky naplněn jak je zobrazeno na obrázku 19, strana 39. Jeden nebo 11 vzorků nelze zpracovat. 9. Zavřete dvířka přístroje QIAcube (viz obrázek 13, strana 33). 10. Zvolte protokol “PAXgene Blood RNA Part A” a začněte protokol. Postupujte podle pokynů uvedených na dotekové obrazovce QIAcube. Ujistěte se, že jsou na přístroji QIAcube instalovány obě části programu (část A a B; viz “Instalace protokolu na QIAcube”, strana 32). QIAcube provede kontrolu naplnění u vzorků, špiček, adaptérů do rotoru a reagenčních lahví. 11. Po ukončení protokolu “PAXgene Blood RNA Part A” otevřete dvířka přístroje QIAcube (viz obrázek 13, strana 33). Vyjměte a zlikvidujte PAXgene RNA kolonky (PRC) z adaptérů rotoru a prázdné Processing Tubes (PT) z třepačky. Během běhu přístroj převede kolonky z adaptéru rotoru na pozici 1 (pozice víčka L1) do adaptéru rotoru na pozici 3 (pozice víčka L1). Viz obrázek 17, strana 38. 12. Uzavřete víčka všech 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek (MCT) v adaptérech rotoru obsahující purifikovanou RNA (pozice 3, pozice

50


víčka L3, viz obrázek 17, strana 38). Převeďte 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky (MCT) do adaptéru třepačky QIAcube (viz obrázek 15, strana 36). 13. Zavřete dvířka přístroje QIAcube (viz obrázek 13, strana 33). 14. Zvolte protokol “PAXgene Blood RNA Part B” a začněte protokol. Postupujte podle pokynů uvedených na dotekové obrazovce QIAcube. Tento program inkubuje vzorky při 65°C a denaturuje RNA pro následující aplikace. Tento krok nevynechávejte ani v případě, že následující aplikace také obsahují tepelnou denaturaci. Dostatečná denaturace RNA je nezbytná pro maximální efektivitu následných aplikací. 15. Po ukončení programu “PAXgene Blood RNA Part B” otevřete dvířka přístroje QIAcube (viz obrázek 13, strana 33). Mikrocentrifugační zkumavky (MCT) obsahující purifikovanou RNA ihned uložte na led. VAROVÁNÍ Horký povrch Třepačka může dosáhnout teploty až 70°C (158°F). Nedotýkejte se jí, dokud je horká. Nenechávejte purifikovanou RNA v QIAcube. Jelikož nejsou vzorky chlazeny, může purifikovaná RNA degradovat. Nedoporučují se tedy běhy přes noc a bez dozoru. 16. Pokud nebudou RNA vzorky ihned použity, skladujte je při –20°C or -70°C. Jelikož zůstává RNA denaturovaná i po opětovném zmrazování a rozmrazování, není nutné opakovat tepelnou inkubaci (protokol “PAXgene Blood RNA Part B”). Pro kvantifikaci v Tris pufru použijte poměr A260 = 1 => 44 μg/ml. Viz Příloha B, strana 55. 17. Odeberte stojan na reagenční láhve z pracovní desky QIAcube (viz obrázek 15, strana 36) a uzavřete všechny láhve správně popsanými víčky. Pufry v láhvích mohou být skladovány při pokojové teplotě (15– 25°C) až po dobu 3 měsíců. Vyjměte a odstraňte zbývající reagencie z Processing Tubes (PT) v drážkách pro mikrocentrifugační zkumavky přístroje QIAcube (viz obrázek 15, strana 36). Vyjměte a zlikvidujte adaptéry rotoru z centrifugy (viz obrázek 15, strana 36). Vyprázdněte odpadní zásuvku přístroje QIAcube (viz obrázek 13, strana 33). Zavřete dvířka QIAcube a vypněte přístroj pomocí spínače (viz obrázek 13, strana 33).


51

Pomoc při řešení problémů V této kapitole naleznete užitečné informace, které Vám mohou pomoci při řešení případných problémů. Vědci z naší Technické podpory vždy rádi zodpoví Vaše otázky ohledně údajů a protokolu v tomto manuálu i obecně k molekulárně biologickým aplikacím (možnosti navázání kontaktu viz strana 61 nebo na www.qiagen.com). Komentáře a návrhy Degradace RNA Kontaminace RNázou

Dbejte na to, aby nebyly do reagencií během přípravy RNA nebo následujících analýz vneseny žádné RNázy (viz také příloha A na straně 54).

Nízký výtěžek RNA a) Méně než 2,5 ml krve v PAXgene Blood RNA (BRT)

b) Koncentrace RNA byla měřena ve vodě

c) Do PAXgene RNA kolonek (PRC) byly během kroků 9 a 10 manuálního protokolu vneseny buněčné úlomky d) Supernatant nebyl při kroku 3 úplně odstraněn.

Ujistěte se, že bylo při odběru krve odebráno do PAXgene Blood RNA Tube (BRT) 2,5 ml krve (viz také popis produktu PAXgene Blood RNA Tube). Pro co nejpřesnější kvantifikaci musí být koncentrace RNA měřena v 10 mM Tris·Cl, pH 7.5* (viz Příloha B, strana 55). Vyvarujte se převádění větších částic, když pipetujete supernatant po kroku 7 manuálního protokolu (přenos malých úlomků přípravu nenarušují). Ujistěte se, že byl supernatant úplně odstraněn. Pokud jej dekantujete, odstraňte kapky ulpělé na okraji zkumavky (BRT) pomocí papírového ručníku. Vykonejte náležitá bezpečnostní opatření, aby se zabránilo křížovým kontaminacím.


52


Komentáře a návrhy e) Po odběru krve do PAXgene Blood RNA Tube (BRT) byla krev inkubována méně než 2 hodiny

Inkubujte krev v PAXgene Blood RNA Tube (BRT) po odběru nejméně 2 hodiny.

Nízký poměr A260/A280 a) RNA byla před měřením čistoty naředěna vodou

b) Spektrofotometr nebyl správně vynulován

K ředění RNA před měřením čistoty používejte10 mM Tris·Cl, pH 7.5* (viz Příloha B, strana 55). Pro vynulování spektrálního fotometru použijte slepý vzorek (blank), jehož poměr elučního pufru (BR5) a ředícího pufru odpovídá měřeným vzorkům. Eluční pufr (BR5) má při 220 nm vysokou absorbanci, což může vést vysokým hodnotám absorbance pozadí, nebyl-li správně nastaven nulový bod spektrálního fotometru.

Porucha přístroje QIAcube nefunguje správně

Přečtěte si QIAcube User Manual. Věnujte pozornost části o řešení problémů. Ujistěte se, že je přístroj spavně udržován, jak je popsáno v QIAcube User Manual.

* Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.


53

Příloha A: Obecné pokyny k zacházení s RNA Práce s RNA Ribonukleázy (RNázy) jsou velmi stabilní a aktivní enzymy, které k funkci obvykle nepotřebují žádné kofaktory. RNázy je těžké inaktivovat a k degradaci RNA stačí již velmi malé množství. Proto byste neměli používat žádné laboratorní pomůcky ze skla nebo umělé hmoty, které nebyly předtím zbaveny kontaminací RNázou. Během a po purifikaci nukleových kyselin dbejte pěčlivě na to, aby se do vzorků RNA nedostala žádná kontaminace RNázou. Aby se vytvořil a udržel prostor prostý RNázy, musí se při přípravě a při užívání roztoků a nádobek k jednomu či více použití dodržovat následující bezpečnostní opatření. Obecné pokyny k zacházení Práce s RNA by měla vždy probíhat podle zásad řádné mikrobiologické a aseptické pracovní techniky. Ruce a prachové částice mohou nést baktérie a plísně a jsou tedy nejčastější příčinou pro znečištění RNázou. Noste při práci s reagenciemi nebo vzorky RNA vždy latexové či vinylové rukavice, aby se zabránilo kontaminaci RNázou přes povrch pokožky nebo zaprášené laboratorní přístroje. Jednorázové rukavice častěji vyměňujte a uzavírejte všechny zkumavky ihned po použití. Pokud chcete purifikovanou RNA pro následující aplikace rozpipetovat, ponechte ji na ledu. Protokoly k odstranění kontaminací RNázou ze skleněných materiálů a z roztoků naleznete ve všeobecných molekulárně biologických metodických knihách jako např. Sambrook, J. und Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

54


Příloha B: Určení koncentrace, výtěžku a čistoty celkové RNA Kvantifikace RNA Koncentrace RNA by měla být určena měřením absorbance při 260 nm (A260) ve spektrofotometru. Aby bylo dosaženo co nejpřesnějšího měření, měl by záznam ležet v lineární oblasti spektrálního fotometru. Absorbance 1 jednotky při 260 nm odpovídá koncentraci o 44 μg RNA na ml (A260 = 1 odpovídá 44 μg/ml). Tento vztah platí jen pro měření v 10 mM Tris·Cl (pH 7,5).* Proto by měl být vzorek RNA v případě potřeby naředěn s 10 mM Tris·Cl. Jak je popsáno níže (viz odstavec „Čistota RNA” na straně 56), je poměr hodnot absorbancí při 260 nm a 280 nm měřítkem čistoty RNA. Ujistěte se, že jsou kyvety použité pro měření vzorků RNA prosté RNázy. Pro nastavení nulového bodu na spektrofotometru používejte ten samý pufr, ve kterém je naředěna RNA, a přidejte ten samý objem elučního pufru (BR5), který odpovídá objemu eluované RNA. Eluční pufr (BR5) má při 220 nm vysokou absorbanci, což může vést k vysokým hodnotám absorbance pozadí, nebyl-li nulový bod spektrálního fotometru nastaven správně. Níže je uveden příklad výpočtu koncentrace a výtěžku RNA: Objem vzorku RNA = 80 μl Ředění = 10 (1/15 ředění)

μl vzorku RNA + 140 μl 10 mM Tris·Cl, pH 7,5

Měření absorbance naředěného vzorku v kyvetách prostých RNázy. A260 = 0,3 Koncentrace vzorku RNA

= 44 x A260 x faktor ředění = 44 x 0,3 x 15 = 198 μg/ml

Celkový výtěžek

= koncentrace x objem vzroku v mililitrech = 198 μg/ml x 0,08 ml = 15,8 μg RNA



55

Čistota RNA Poměr hodnot absorbancí při 260 nm a 280 nm (A260/A280) je měřítkem čistoty RNA s ohledem na kontaminanty, které absorbují UV, jako např. proteiny. Poměr A260/A280 je závislý na hodnotě pH. Relativně nízké hodnoty pH mají za následek nižší poměr A260/A280 a redukovanou senzitivitu vůči kontaminacím proteiny.* Pro získání přesných dat doporučujeme určit absorbanci v 10 mM Tris·Cl (pH 7,5). Čistá RNA vykazuje v 10 mM Tris·Cl (pH 7,5) poměr A260/A280 o 1,8–2,2. Pro nastavení nulového bodu na spektrofotometru používejte ten samý pufr, ve kterém je naředěna RNA, a přidejte ten samý objem elučního pufru (BR5), který odpovídá objemu eluované RNA. Eluční pufr (BR5) má při 220 nm vysokou absorbanci, což může vést k vysokým hodnotám absorbance pozadí, nebyl-li nulový bod spektrálního fotometru nastaven správně.

* Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.

56


Příloha C: Manipulace s PAXgene Blood RNA Tubes Následující doporučení od BD Vám mohou být nápomocny při manipulaci s PAXgene Blood RNA Tubes (BRT). Další informace k použití PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) naleznete v PAXgene Blood RNA Tube Product Circular. Instrukce k odstranění bezpečnostního uzávěru BD Hemogard: 1.

Uchopte PAXgene Blood RNA Tube (BRT) jednou rukou, palec přitom umístěte přímo pod bezpečnostní uzávěr BD Hemogard. (Větší stabilitu získáte, opřete-li ruku o pevnou plochu.) Druhou rukou odšroubujte uzávěr BD Hemogard a zároveň jej tlačte palcem nahoru, DOKUD SE ZÁTKA ZKUMAVKY NEUVOLNÍ.

2.

Palec před sejmutím uzávěru oddalte. Uzávěr od zkumavky (BRT) NEODSUNUJTE palcem. Varování: Krev obsažená ve zkumavkách (BRT) představuje potenciální nebezpečí infekce. Abyste se vyvarovali zranění během sejmutí uzávěru, je důležité od zkumavky (BRT) oddálit palec, kterým tlačíte uzávěr nahoru, ihned jak se uzávěr BD Hemogard uvolní.

3.

Sejměte uzávěr ze zkumavky (BRT). Ve velmi nepravděpodobném případě, kdyby se umělohmotný kryt oddělil od gumové zátky, UZÁVĚR ZNOVU NESESTAVUJTE. Gumovou zátku ze zkumavky (BRT) opatrně sejměte.

Instrukce k opětovnému uzavření sekundárním bezpečnostním uzávěrem BD Hemogard 1.

Na zkumavku (BRT) nasaďte nový bezpečnostní uzávěr.

2.

Gumovou zátku otáčejte za současného tlaku na zkumavku. Zátka musí být úplně zasunuta, aby se se zkumavkou mohlo bezpečně manipulovat


57

Informace o objednání Produkt

Obsah

Kat. čís.

Systém PAXgene Blood RNA Produkty, které lze objednat u QIAGEN PAXgene Blood RNA Kit (50) 50 PAXgene kolonek, 50 PAXgene Shredder kolonek, Processing Tubes, DNáza I prostá RNázy, reagencie a pufry prosté RNázy. K použití ve spojení s PAXgene Blood RNA Tubes

762174

QIAcube (110 V)* QIAcube (230 V)†

Robotická pracovní stanice pro automatizovanou purifikaci DNA, RNA či proteinů pomocí QIAGEN kitů, roční záruka na součásti a servis‡

9001292* 9001293†

Záruka PLUS 2 Full, QIAcube

3 roky záruka, 48 hodin (2 pracovní dny) prioritní odpověd’, všechna práce, převoz a náhradní součásti

9240834

Starter Pack, QIAcube

Balíček zahrnuje: stojan na reagenční láhve (3); stojánek na proužky pro popis (8); 200 μl špičky s filtrem (1024); 1000 μl špičky s filtrem (1024); 1000 μl špičky s filtrem a s širokým otvorem (1024); 30 ml reagenční láhve (18); adaptéry do rotoru (240); držák na adaptéry do rotoru

990395

Špičky s filtrem, 1000 μl (1024)

Sterilní jednorázové špičky s filtrem, ve stojáncích;

990352

Reagenční láhve, 30 ml (6)

Reagenční láhve (30 ml) s víčky; balíček o 6; pro použití se stojanem na reagenční láhve QIAcube

990393

* USA, Kanada a Japonsko. † Ostatní země. ‡ Zde uvedené produkty jsou typickými doplňky pro odběr krve, které mohou být použity s PAXgene Blood RNA Tubes. Další informace (včetně informací o objednání) k těmto a jiným doplňkům naleznete na www.bd.com/vacutainer/products/venous .

58


Produkt

Obsah

Kat. čís.

Adaptéry do rotoru (10 x 24)

Pro 240 příprav: 240 jednorázové adaptéry do rotoru; pro použití s QIAcube

990394

Stojan na reagenční láhve

Stojan pro 6 x 30 ml reagenčních lahví na pracovní ploše QIAcube

990390

Držák na adaptéry do rotoru

Držák na 12 jednorázových adaptérů do rotoru; pro použití s QIAcube

990392

Produkty, které lze objednat u BD a autorizovaných distributorů BD‡ PAXgene Blood RNA Tubes (100)

100 zkumavek pro odběr krve. Pro použití s PAXgene Blood RNA Kit (50)

762165

Souprava pro odběr krve

BD Vacutainer® Safety-Lok™ souprava pro odběr krve: 21G, 0,75 palcová kanyla, 12 palcová hadička s adaptérem luer; 50 v krabičce, 200 v kartonu

367286

BD Vacutainer držák na jedno použití

Zásobník pouze pro průměr 13 mm a 16 mm; 1000/karton

364815

BD Vacutainer Plus Serum zkumavky

13 x 75 mm s 4,0 ml sáním a s červeným bezpečnostním uzávěrem BD Hemogard a papírovým štítkem; 100/krabice, 1000/karton

368975


59

Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdná

60


PreAnalytiX ve světě Produkty PreAnalytiX distribuují společnosti QIAGEN a BD Australia Orders 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800/28-10-10 Fax 0800/28-10-19 Technical 0800/28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 021-51345678 Fax 021-51342500 Technical 021-51345678 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-920 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Ireland Orders 1800 555 049 Fax 1800 555 048 Technical 1800 555 061 Italy Orders 02-33430411 Fax 02-33430426 Technical 800 787980 Japan Telephone 03-5547-0811 Fax 03-5547-0818 Technical 03-5547-0811 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)

www.qiagen.com

www.PreAnalytiX.com

Australia • BD •

North Ryde • Orders 612-8875-7000 • Fax 612-8875-7000

Belgium • BD

Erembodegem • Orders 32-53-720-408 • Fax 32-53-720-558

Canada • BD •

Oakville • Orders 800-268-5430 • Fax 800-565-0897

Poland • BD •

Warsaw • Orders 48-22-651-75-88 • Fax 48-22-651-75-89

USA • BD Diagnostics — Preanalytical Systems • 1 Becton Drive • Franklin Lakes • NJ 07417 Orders 888-237-2762 • Fax 800-847-2220 • Technical support 800-6310174

www.bd.com


www.PreAnalytiX.com

61

1051083CS 127153017

PAXgene Blood RNA Kit Manuál

Recommend Documents