Malé RNA a regulace genomu
Změna paradigmatu „It appears that the genetic programming of humans and other complex organisms has been misunderstood for the past 50 years, due to the assumption that most genetic information is transacted by proteins.“ John S. Mattick, 2011
- Množství
genů je u metazoí podobné (C. elegans - 20 tisíc genů vs. člověk 23 tisíc) + často mají stejnou/podobnou funkci -X komplexita zvířat se velice liší (C. elegans má 1000 somatických buněk, člověk 1014 v komplexních strukturách
komplexita nebude v genech kódujících proteiny, ale v jejich regulaci.
Všudypřítomná transkripce (pervasive transcription) - Dlouho známé RNAs: rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA – stabilní, konkrétní funkce spojená se syntézou proteinů - První genomy + první transkriptomy nalezeno množství RNA, která nepatřila k žádnému genu/známému typu RNA – šum? - Zlepšení technik 1) potvrzena přítomnost množství ncRNAs (non-coding RNA), 2) nalezeny nové typy (bez polyA) – 50% RNA - Potřeba citlivé metody – transkripce velmi nízká/u několika buněk
Svět nekódující RNA 1) Dlouhá ncRNA (lncRNA) - hlavně intronové a mezigenové oblasti, někde známe funkci (Xist, Air, HOTAIR, …) – účastní se epigenetických regulací 2) Krátké RNAs (miRNA, siRNA, piRNA, množství krátkých RNA asociovaných s geny)
Taft et al. 2009
RNAs asociované s geny - PROMPts (promoter upstream transcripts) - tiRNAs (transcription-initiation RNAs) – na místech iniciace transkripce - možná označují/regulují pozici prvního nukleosomu
- PASRs (promoter associated sRNAs) - PALRs (promoter associated lRNAs ) - tssa-RNAs (transcription start siteassociated RNAs)
-TASRs (terminator-associated RNAs ) - spliRNAs (splice site RNA) - lokalizovaných na 3’ hranicích exonů
Funkce? Možná udržují chromatin v přístupném stavu transkripci a RNA polymerázu aktivní urychlení nástupu transkripce
Objev RNAi
Nature 1998 Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
V roce 2006 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu
RNAi 1) reguluje expresi genů (miRNA) 2) omezuje šíření mobilních elementů a virů (siRNA, piRNA) 3) moduluje chromatin (fungování centromer a telomer, formování heterochromatinu exprese genů)
Typy RNAi Small interfering RNA (siRNA)
microRNA (miRNA)
Piwi-interacting RNA (piRNA)
Jinek a Doudna 2009
piRNA (PIWI interacting RNA) Krátké RNA interagující s proteiny PIWI - jen u metazoí - transkripce jen v zárodečné linii - funkce: obrana proti mobilním elementům (RNAi a metylace) - inaktivace PIWI mobilita transposonů sterilita (hlavně u samců) - organizace v klastrech - nepotřebují Dicer
Siomi et al. 2011
piRNA a regulace protein kódujících genů Represe Stellate genů v testes drozofily - vyřazení PIWI overexprese Ste tvorba krystalů Ste proteinů sterilita
Represe Fasciclinu 3 v ováriích drozofily - vyřazení tj overexprese Fas3 somatické a zárodečné buňky se nepromíchají selhání oogeneze Siomi et al. 2011
piRNA a hybridní dysgeneze Hybridní dysgeneze u drozofily - reciproká křížení dvou linií (M a P) – rozdílné výsledky - samice P + samec M OK - samec P a samice M sterilita - způsobeno pohybem P-elementu po genomu
Represor = piRNA Příčina HD: matka ukládá do vajíčka piRISC s primární piRNA embryo využije k vybudování rezisence proti P-elementu X samice M linie nemají P-element ani příslušnou piRNA Siomi et al. 2011
miRNA (micro RNA) miRNAs - malé nekódující molekuly RNA, které postranskripčně regulují expresi genů - Identifikováno >25 tisíc miRNAs u různých organismů x u většiny neznáme funkci - Předpokládá se, že regulují expresi 20-30% genů - Jedna miRNA může regulovat více genů / jeden gen může být regulován více miRNAs - Evolučně konzervované i druhově specifické Př: let-7 - konzervovaný u obratlovců, členovců a nematod
- Nalezeny pouze u živočichů, rostlin a virů – žádný překryv
miRNA (micro RNA) - Velká část miRNA genů je v klastrech - Savčí miRNA často v intronech genů, které regulují (ko-exprese). - Expresní pattern miRNA je různý – některé kontinuálně, jiné jen někde a někdy - Jsou více abundantní než mRNA (až 500x víc) - Malá velikost a jednoduchá sekvence – snadná změna, rychlý vývoj a vznik - Cílová sekvence nemusí být 100% komplementární - U člověka dosud objeveno > 2000 miRNAs, ale pravděpodobně jich je mnohem víc (tkáňová a buněčná specifita).
Jak funguje miRNA „Seed“ oblast – interakce s 3’ UTR regulovaného genu
Behura 2007
Cílová sekvence nemusí být 100% komplementární (Téměř) přesná komplementarita miRNA a mRNA štěpení mRNA X Přibližná komplementarita zablokování transkripce (mechanismus neznámý) deadenylace degradace Výhoda: regulace mnoha genů (i stovky) jednou miRNA najednou + jedna mRNA může interagovat se skupinou miRNAs
Wienholds a Plasterk 2005
miRNA a diferenciace buněk miRNA jsou klíčové pro diferenciaci buněk i tkání a pro udržení buněk v diferencovaném stavu. Jak to víme? 1) Chybí u jednobuněčných organismů, málo u kmenových buněk 2) Nediferencované nebo málo diferencované buňky nepotřebují k přežití (ESCs u myši, zárodečné buňky)
miRNA
3) U zebřičky většina miRNA během raného vývoje není exprimována x vysoká tkáňově specifická exprese v době diferenciace buněčných typů (př: miR-10, mir-196 v Hox genech, miR-1 ve svalech, miR-181 hematopoéza). 4) Redukce miRNA u rakovinných buněk (př: let-7 u rakovin plic) 5) Transfekce HeLa buněk miR-1 (svalově specifická) a miR-124 (mozkově specifická) změní expresní profil buněk na svalové/mozkové.
let-7 – příklad regulace (pomocí) miRNA - U metazoí vysoce konzervovaná - Hlavní regulátor vývoje a diferenciace v raném embryu i dospělci (mozek) - Cílem regulátory buněčného cyklu (např. Ras a Cdk6) - Diferenciační faktory (Notch) – indukují transkripci - Pluripotentní faktory (c-Myc) – inhibují let-7 - let-7 inhibuje LIN-28, c-Myc, ...) Taft et al. 2009
Jak vznikají nové miRNAs Výsledná RNA musí tvořit vlásenku - snadné, protože RNA má sklony se do takových útvarů skládat Čili vznik nové miRNA je snazší, než vytvořit protein kódující gen. Zdroje nových miRNAs: 1) duplikace 2) introny 3) tRNA, snoRNA a pseudogeny 4) mobilní elementy 5) de novo 6) „antisense“ transkript
Jak vznikají nové miRNAs Duplikace - genu, oblasti, genomu
vznik rodiny
- u člověka v rodinách 1/3 miRNAs, myši 38%, drozofily 13% - většina ne-lokálních duplikací u obratlovců je důsledkem duplikace celého genomu Duplikace genu následovaná subfunkcionalizací nebo neofunkcionalizací jsou největším zdrojem nových miRNA.
Jak vynikají nové miRNAs Introny - miRNA se vyskytuje v intronech protein-kódujících genů (1/2 lidských, 20% u C. elegans) - dobrý materiál pro vznik vlásenky + není potřeba nový promotor výhodné pro vznik nových miRNAs Nové miRNAs specifické pro určitou skupinu jsou častěji lokalizované v intronech (intronic exaptation)
Jak vynikají nové miRNAs „Antisense“ transkripty miRNAs - mají schopnost skládat se do vlásenek získat novou funkci
stačí jen
Jak vynikají nové miRNAs Pseudogeny, snoRNAs a tRNAs - snoRNAs a tRNAs se mohou účastnit miRNA mašinérie obtížné rozlišit co je skutečná miRNA)
TEs - člověka identifikováno 278 miRNAs, které jsou určitě/možná z TEs - více mezi mladšími, méně konzervovanými a linage-specific miRNAs - některé miRNA možná ve skutečnosti piRNAs
Jak vynikají nové miRNAs Vznik miRNA de novo - Velká část genomu se transkribuje mnoho substrátu pro nové miRNAs X stovky sekvencí tvoří suboptimální vlásenky potenciální miRNA x k tomu potřeba více kroků - Nové miRNAs mají náhodné cíle potenciálně fatální - řešení: nejprve slabá časově a prostorově omezená transkripce po vyladění silnější. Konzervované sekvence v genomu jsou transkribovány silněji.
Jak získají miRNAs novou funkci? 1) Přímá mutace v „seed“ oblasti 2) Posun „seed“ oblasti - časté (u 13% miRNAs
konzervovaných mezi drozofilou a Tribolium castaneum) - mir-100 u Nematostelly má seed posunutý o 1 bázi oproti bilateriím.
Jak získají miRNAs novou funkci? 3) Výměna ramen - miRNA passanger strands považovány za biologicky inertní x mohou být asociované s Argonautem a regulovat expresi genů materiál pro novou miRNA - po duplikaci může dojít k posunu transkripce ve prospěch druhého ramene a tím k zisku nové funkce - častý jev (u mnoha rodin miRNA drozofily a háďátka, u 11% ortologů u hmyzu) - je považován za jeden ze základních mechanismů diverzifikace miRNA
Jak získají miRNAs novou funkci? 4) Posun vlásenky (hairpin shifting) = výměna jednoho ramene za jinou sekvenci - mezi členy miRNA rodiny - nalezeno u 8 z 15 miRNA rodin nematod
Jak získají miRNAs novou funkci? 5) Editing - prováděn adenosin deaminázami (ADARs) – změna A na I v dsRNA změna cílových sekvencí - byl pozorován (v nervové tkáni) x zřejmě se nejedná o rozšířený jev - těžké odlišit od chyb v sekvenování.
Příklad ze života aneb co všechno se může stát po duplikaci úseku s miRNA 4 možnosti osudu miRNA a genu:
Evoluce cílového genu Změna 3’ UTR Nevhodná cílová místa miRNA jsou odstraněna selekcí x někdy vznikají často opakovaně zkrácení cílové 3’ UTR méně prostoru pro vznik cílů miRNA - Housekeeper geny (např. geny kódující ribosomální proteiny) mají kratší 3’UTR vs. geny s časově a tkáňově specifickou expresí (např. TFs) mají dlouhé 3’UTR s množstvím cílových míst pro miRNA.
Evoluce cílového genu Polymorfismus cílové oblasti Polymorfismus vytvoření nebo likvidace cílového místa pro miRNA změna regulace genu. - u člověka důkazy o roli SNPs v cílových místech miRNA ve vzniku rakoviny - Texel sheep, plemeno ovcí se silně vyvinutou svalovinou – způsobeno vnikem cílového místa pro mir-1 a miR-126 v 3’UTR genu pro myostatin.
Texel sheep
Evoluce cílového genu
Cichlidy z jezera Malawi - Stovky druhů z jedné linie během 1 milionu let. - Jejich genomy jsou velice podobné x diverzita morfologie a chování na úrovni obratlovčího řádu. - miRNA cílová místa vykazují vyšší množství SNPs - 86% cílových míst miRNA vykazuje variabilitu mezi hlavními liniemi malawských cichlid.
Změny v miRNA cílových oblastech jsou důležitým evolučním mechanismem diverzifikace a speciace.
miRNA jako marker fylogeneze - množství miRNAs narůstá během evoluce – časté rodiny specifické pro určitou linii - ztráty miRNAs vzácné
rodiny miRNA přítomny u +- všech dceřiných linií
- mutace v „seed“ oblasti jsou vzácné miRNA je skvělý marker evoluce/příslušnosti k taxonu
2 kola expanze miRNA: 1) Bilateria 2) obratlovci Obojí koreluje s nárůstem komplexity
Wheeler et al. 2009
miRNA u předka prvo- a druhoústých
Expanze miRNA rodin koreluje s narůstáním morfologické komplexity
miRNA jako marker fylogeneze Podle ESTs jsou Cnidaria a Porifera sesterské taxony x podle molekuláry a morfologie k sobě patří Cnidaria a Bilateria X Cnidaria a Bilateria sdílejí miR-100, který chybí u houbovců, žahavci nemají houbovčí miRNAs a houbovci žahavčí.
miRNA jako marker fylogeneze Žebernatky (Ctenophora) – nejasná fylogenetická pozice -osekvenován genom Mnemiopsis leidyi – nemá miRNA ani Droshu a Pashu podporuje bazální pozici žebernatek - Trichoplax adherens – nemá miRNA X má Droshu a Dicer liniích?
nezávislé ztráty v obou
Maxwell et al. 2013
miRNA a vývoj lidského mozku Člověk, šimpanz a makak rhezus - Srovnání exprese v různých obdobích postnatálního vývoje ve dvou částech mozku: mozeček (motorika, paměť, řeč) a přední část čelního laloku (abstraktní myšlení, plánování, „operační“ paměť, sociální inteligence)
Časově konstantní exprese – stejně rychlá evoluce u všech druhů x vývojově omezená exprese - 3-5x rychlejší evoluce u člověka 2x rychlejší v čelním laloku než v mozečku Změna je v trans regulaci (hlavně miRNAs), identifikace 3 miRNAs regulujících expresi genů v neuronech. miRNAs jsou možná zodpovědné za evoluci lidského mozku
Somel et al. 2011
miRNA a rakovina miRNA regulují velké množství genů (60% lidských genů?) + účastní se buněčné proliferace, diferenciace, apoptózy a udržování zárodečných buněk deregulace rakovina miRNA může způsobit rakovinu dvěma mechanismy: 1) ztrátou funkce selže odbourání transkriptu onkogenu overexprese onkogenu 2) zesílení/zisk funkce supresorového genu
odbourání transkriptu tumor-
Příčinou může být: 1) změna exprese miRNA genu 2) změna processingu miRNA 3) změna v cílovém místě
miRNA a rakovina 1) změna exprese a) změna pozice miRNA genu v genomu Translokace onkogenu pod vlivem promotoru miRNA up-regulace Př.: mir-142 - marker hematopoetických buněk, na 17. chromosomu blízko zlomové bodu, který je často příčinou translokace t(8;17) translokace MYC, ten pod vlivem promotoru mir-142 upregulace MYC vznik agresivní leukemie B buněk
b) změna regulace transkripce Cca 1/3 lidských miRNA genů člověka v klastrech ko-exprimovány chyba v regulaci jednoho člena ovlivňuje i ostatní geny v klastru.
miRNA a rakovina c) mutace v regulační oblasti miRNA genu
Salzman et al. 2013
miRNA a rakovina 2) změna processingu miRNA a) SNPs v miRNA mohou inhibovat nebo urychlit processing Příklad: Chronická lymfatická leukémie – často delece 13q13.4 (tumor supresory miR-15a a miR-16-1) - SNP v miR-16-1 chyba ve zpracování CLL
Salzman et al. 2013
miRNA a rakovina 2) změna processingu miRNA - SNPs v miRNA mohou inhibovat nebo urychlit processing
Salzman et al. 2013
miRNA a rakovina 2) změna processingu miRNA b) Inhibice biogeneze miRNA = vážné defekty vývoje + u mnoha organizmů letální - 27% různých tumorů je hemizygotních pro deleci Diceru - Globální knockdown miRNAs vyřazením Diceru a DGCR8 rozvoje tumoru
rychlejší
- U myší prokázáno, že snížení množství Diceru urychluje růst nádoru - Experimenty s antisense oligonukleotidy na myších a primátech hladinu miRNA umíme manipulovat. - miR-143 se účastní diferenciace adipocytů (= tukových buněk) potenciální cíl léčby při obezitě a metabolických poruchách. miRNA v budoucnu snad diagnostický nástroj a terapeutický cíl nejen proti rakovině.
miRNA a rakovina 3) změna v cílovém místě
- let-7 – regulace onkogenů KRAS, MYC a HMGA2 - nízká exprese let-7 u řady rakovin - SNP v 3’ UTR KRAS a vaječníků
overexprese KRAS
riziko vzniku melanomu a rakoviny plic, prsu Salzman et al. 2013
O čem to bylo -Většina genomu je transkribovaná X jen malá část jsou protein kódující geny - Nekódující RNA – řada podob (lnRNA, snRNA, mnoho variant) - Nekódující RNA – řada funkcí (regulace, modulace chromatinu, boj proti cizí RNA a virům, …) - miRNA – důležitý regulační prvek (reguluje expresi 20-30% protein kódujících genů) - miRNA – snazší vznik než protein kódující geny X velmi konzervativní maker fylogeneze - miRNA – nárůst miRNA genů koreluje s nárůstem komplexity + diverzifikace druhů - miRNA – nutná pro diferenciaci - miRNA – regulace buněčné proliferace a apoptózy
selhání = rakovina
Konec
