Změny genomu a jeho exprese u chronické lymfocytární leukémie Šárka Pospíšilová Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Konference DNA Analýza V, Praha 4. června 2008
Molekulární Diagnostika CLL CLL - lymfoproliferativní onemocnění způsobené monoklonální expanzí zralých B-lymfocytů exprimujících CD5+; nejčastější typ leukémie u dospělých v západním světě
CGH Arrays
Expresní Microarrays
MicroRNA Arrays
Proteinové Arrays
Detekce genů a jejich exprese na úrovni DNA, RNA, miRNA i proteinů
Prognostické markery u B-CLL
Mutační status genu pro těžký řetězec imunoglobulinu Mutace v IgVH znamenají lepší prognózu (přežití 8 vs. 25 let)
Mutační status genu pro p53 (do 2 let od diagnózy zemře 6x více pacientů s p53 mutací)
Chromosomální aberace: Trizomie 12 Delece 11q22 (ATM) Delece 13q14 (miRNA) Delece 17p13 (Tp53)
Exprese CD38, ZAP-70 na povrchu B-CLL lymfocytů
Analýza genové exprese u B-CLL buněk RNA Vzorek A
Oligomery
RNA Vzorek B
Hybridizace Scan A
Scan B
Microarray Obraz A
Obraz B
Kombinace a vyhodnocení obrazů pomocí softwaru
Třídění podle mutačního statusu IgVH: Mutovaní versus nemutovaní (průnik T-testu a SAM)
Significance Analysis of Microarrays (SAM) Skupiny genů, které rozdělují pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH
Geny nejlépe rozlišující pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH.
Analýza dat: PTM analýza (podle Pavlidis Template Matching)
LPL (lipoprotein lipase) nejvýznamnější gen, identifikovaný pomocí SAM, byl použit jako templát pro Template Matching Analysis a byly nalezeny geny s expresním profilem podobným jako má LPL.
Expresní čipová analýza B-CLL buněk: VÝSLEDKY bylo nalezeno asi 50 genů s rozdílnou mírou exprese u mutovaných a nemutovaných IgVH Potenciální prognostické markery (nalezené ve shodě s literaturou): LPL (lipoproteinová lipáza), ADAM29 (A Disintegrin And Metalloproteinase domain 29), ZAP7O (Zeta-chain-Associated Proteinová Kináza) … Nový prognostický marker významně korelující se statutem IgVH:
LAG3
(lymphocyte-activation gene 3, CD223) – má úlohu při regulaci homeostázy T-lymfocytů
Analýza genové exprese u B-CLL buněk: Gene
Number of samples tested
p-value
Gene expression level in samples with unmutated IgVH
LAG3
Lymphocyte activation gene 3
94 (103 +poly)
< 0,001
up-regulated
LPL
Lipoprotein lipase
94 (103)
< 0,001
up-regulated
ZAP70
ζ-chain associated protein kinase 70 kDa
94 (103)
< 0,001
up-regulated
AICDA
Activation-induced cytidine deaminase
69 (72)
0,006
up-regulated
BCL2
B-cell-leukemia/lymphoma 2
73 (82)
0,031
down- regulated
CLLU1
Chronic lymphocytic leukemia upregulated 1
70 (78)
0,032
up-regulated
TCF7
Transcription factor 7
23 (25)
0,047
down- regulated
SEPT10
Septin 10
23 (25)
0,056
up-regulated
ADAM29
A disintegrin and metalloproteinase domain 29
73 (82)
0,267
down- regulated
gen exprese
LPL
ZAP70
LAG3
3 geny
IgVH UNMUT (n = 40)
POZITI VNÍ
39 (97,5%)
39 (97,5%)
40 (100,0%)
38 (95,0%)
NEGATI VNÍ
1 (2,5%)
1 (2,5%)
0 (0%)
2 (5,0%)
IgVH MUT (n = 54)
POZITI VNÍ
9 (16,7%)
22 (40,7%)
36 (66,7%)
3 (5,6%)
NEGATI VNÍ
45 (83,3%)
32 (59,3%)
18 (33,3%)
51 (94,4%)
89%
80%
62%
95%
Procento správně určeného mutačního statusu
Příklad praktického využití nových expresních markerů mutačního statutu IgVH
Fragmentační analýza před terapií: IgVH klon VH 3 – 30 byl identifikován jako mutovaný.
Fragmentační analýza po terapii: primární IgVH klon byl potlačen a byl detekován nový dominantní klon VH 169 identifikovaný jako nemutovaný.
MicroRNA – aberantní exprese u B-CLL 13q14 locus is frequently deleted in CLL and miR-15a-miR-161 are down-regulated in more than 60% of CLL cases (Calin et al., PNAS 2002) miR-15 and miR-16 regulate Bcl2 (Cimmino et al., PNAS 2005; Calin et al., PNAS 2008) MicroRNAS could distinguish CLL samples that express unmutated IgVh gene from those that express mutated IgVh gene (Calin et al., NEJM 2005) miRNAs could differentiate patients with a short interval from diagnosis to therapy (Calin et al., NEJM 2005)
miR15a miR16 miR17-5p miR17-3p miR18a miR19b miR19a miR20a miR20b miR21 miR23a miR23b miR24-2 miR29a miR29c miR29b miR34a miR34b miR34c miR92 miR142-3p miR142-5p miR146a miR146b miR155 miR181a miR181b miR181c miR181d miR195 miR221 miR222 miR223 miR372 miR373
Předběžné výsledky z QRT-PCR (analýza 35 microRNA)
MICRORNA rozdílně exprimované u subtypů B-CLL (p=0.05): MUTATED IgVH VS. UNMUTATED IgVH: 1 GEN miR-18a MUTATED IgVH VS. ABNORMAL P53: 3 GENY miR-let 7, miR-92, miR-34 UNMUTATED IGVH VS. ABNORMAL P53: 3 GENY miR-let 7, miR-92, miR-34
Exprese miR-34a u B-CLL pacientů Normalised miRNA 34a expression
miR-34a expression in patients (wt p53 vs. del/mut p53)
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
del/mut p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
wt p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
del/mut p53
28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
individual patients
p= 0,00002
p= 0,000001
p= 0,27 16 Normalised miRNA 34a expression
14 Normalised miRNA 34a expression
p= 0,00001
18
16
12 10 8 6 4 2
14 12 10 8 6 4 2
0
0
-2 wt p53
del/mut p53
CLL subgroups
Mean ±SE ±SD
-2 unmut IGVH
mut IGVH CLL subgroups
del/mut p53
Mean ±SE ±SD
DNA: Array-CGH u B-CLL pacientů CGH Labeling & Amplification Kits 44K Human CGH Microarray
CGH Application Development
Data Visualization & Analysis Tool
Rozlišení a pokrytí různých cytogenetických technik a technik založených na microarrays:
Cytogenetika
aCGH
Rozlišení
Pokrytí
Karyotypování
> 10 Mb
kompletní
SKY
> 2 Mb
kompletní
tradiční CGH
> 2 Mb (cytoband) kompletní
FISH (interfázní)
≥ 20 kb
Sondově Specifické
FISH (metafázní)
≥ 100 kb
Sondově Specifické
BAC
100 kb (Spektrální Genomika – 2 Mb)
kompletní
cDNA
2 kb
pouze geny
Oligo (60-mer)
0.06 kb
kompletní
Využití Array-CGH pro detekci nebalancovaných chromozomových aberací
Agilent Human Genome CGH Microarray; 4x44k CGH Microarrays
43,000 60-mer oligonukleotidových sond
pokrytí celého genomu
průměrná vzdálenost sond 30-35 kb
84% sond navrženo do intragenových oblastí (50% do intronů, 50% do exonů) + 16% sond do intergenových oblastí
dobře charakterizovaný gen – 1 sonda
geny související s nádory – 2 a více sond
Výsledky array-CGH u patienta č.1K: trisomie chromozomu 12, del 17p12-pter, del 18q12-q21, del 18q22-qter and monosomie chromozomu X; červeně = amplifikace, zeleně = delece chromozom 12
17
18
p 13.32 p 13.2
p 13.2
p 12.3 p 12.1
p 12
p 11.22
p 22.32 p 11.31 p 11.22
q 14.3
p 11.3 p 11.22 q 12
q 21.32
q 21.31
q 22
q 23.1 q q q q
23.3 24.12 24.21 24.23
q 24.32
q 12.1
q 21.2
q 21.1
q 21.33
p 22.2 p 22.12 p 21.3 p 21.1
q 12 q 13.12 q 13.2 q 14.1
X
q 23.2 q 24.1 q 24.3 q 25.2
q 12.3
q 21.2 q 21.32
q 12 q 13.2 q 21.1 q 21.31 q 21.33 q 22.2 q 23
q 22.1
q 25 q 26.2
q 22.3
q 27.1 q 27.3
Výsledky Array-CGH B-CLL Pacienta: del 13q14.2-q14.3
chromozom 13
Kazuistika – pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 del 13q14.2-q14.3 (3,7 Mb) včetně RB1
Kazuistika – pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 del 17 včetně TP53
Kazuistika – pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 del 2p24.2-p24.3, bialel. amp 2p24.3 (16027633-16135876) (MYCN)
Kazuistika – pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 (del 5q14.3-q33.2(95 Mb), del 6q14.3-q22.1(40 Mb))
Kazuistika – pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 (del 18q21.2 (1Mb), bialel. amp 18q21.2 (3.5Mb), amp 18q21.31-q22.1 (8Mb))
Využití Array-CGH u B-CLL pacientů
Komplexní analýza genomu
Informace o amplifikacích a delecích jednotlivých genů včetně genů pro microRNA
Možnost průběžného sledování změn genomu v průběhu onemocnění (vliv léčby, změny při relapsu…)
Výborné doplnění stávajících cytogenetických metod
Tp53 status u B-CLL pacientů • Funkční analýza Tp53 pomocí FASAY • 12% pacientů má Tp53 aberace
100% missense mutations
70% missense mutations
Distribuce Tp53 mutací – srovnání s IARC mutační databází Identifikovali jsme 11 nových mutací dosud nepublikovaných v IARC databázi u BCLL pacientů: Lys132Asn/Lys132Arg Val143Met Val157Gly/Val157Phe Val173Met Val216Met Tyr220Cys Tyr236Cys Tyr256Pro Cys275Tyr
Metodiky používané pro studium vlastností p53 mutantů: FASAY + Sekvenování (p53-mutované kolonie) I - FISH a array-CGH pro detekci 17p13 delece Western blotting pro analýzu hladiny proteinu Detekce funkčnosti proteinu p53: Real-Time PCR pro detekci exprese p53 - regulovaných genů Funkční proteinové čipy pro analýzu vazby protein-DNA EMSA (electromobility shift assay) pro p53-DNA interakce Reporter gene assays pro detekci aktivity mutantů v buňkách utlumení exprese wt-p53 a mut-p53 pomocí siRNA/shRNA, DNA expresí čipy a Real-time PCR
Funkční Proteinové Čipy pro analýzu aktivity p53 mutantů
Cy3-labelled BAX promoter binding region
0,0
GADD45 MDM2 NC1
S392A
L344P
R 337C
G325V
R 306P
R 306X
E286A
R 280K
P278L
R 273H
R 273C
V272L
L265P
E258K
L257Q
T256I
L252P
I251M
R 248Q
R 248W
G245D
G245S
G245C
S241F
N 235S
N 235D
H 233D
H 233N
S227T
Y220C
P219S
R 213X
R 209X
R 196X
H 193R
R 181H
R 181C
E180K
R 175H
G154V
P152L
P151S
C 141Y
Q136X
M 133T
P82L
R 72P
W 23G
W 23A
WT
Příklad: vazba p53 mutantů na promotory genů GADD45 a mdm2
350,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
Využití genomických přístupů u leukémií: výzkum i klinická praxe ¾ Jedinečné nástroje pro analýzu genomu a genové exprese – objasnění funkce genů ¾ Význam pro molekulární diagnostiku a personalizovanou medicínu
Poděkování : FN BRNO, Interní hematoonkologická klinika, Centrum Molekulární Biologie a Genové Terapie Martin Trbušek Jana Kotašková Jitka Malčíková Boris Tichý Kateřina Staňo-Kozubík Šárka Pavlová Yvona Brychtová Michael Doubek
Jiří Mayer Ústav patologie Jana Šmardová
Děkuji za pozornost
