Katedra fyziologie živočichů a vývojové biologie, PřF UK Oddělení fyziologie a biochemie buňky
Seminární práce na téma:
Problémy heterologní exprese transportních proteinů u S. cerevisiae
Vypracoval: Martin Zavřel Vedoucí seminární práce: RNDr. Hana Sychrová, DrSc.
Praha, červen 2003
Obsah
1.
Úvod
3
2.
Heterologní exprese
3
3.
Sekreční dráha
4
3.1
Translace
4
3.2
Disulfidické můstky
7
3.3
Glykosylace
8
3.4
Chaperony
9
3.5
Transport k plazmatické membráně
10
4.
Problémy heterologní exprese transportních proteinů
cytoplazmatické membrány u S. cerevisiae
5.
10
4.1
Původ genů, introny
10
4.2
Transkripce, stabilita mRNA
11
4.3
Translace
11
4.4
Glykosylace
12
4.5
Chaperony a faktory pro export z ER
13
4.6
Recyklace proteinů
14
Vliv lipidového složení membrány na transportní
a strukturní vlastnosti heterologních proteinů
15
6.
Závěr
18
7.
Seznam literatury
20
8.
Seznam zkratek
24
2
1.
Úvod V této seminární práci se chci věnovat hlavním problémům heterologní exprese transportních proteinů,
původem především ze savčích organismů, v kvasince S.
cerevisiae. Přiblížím sekreční dráhu obecné savčí buňky počínaje transkripcí, translací a konče vynesením proteinu do buněčné membrány. V následujícím oddílu se budu snažit poukázat na odlišnosti v sekreční dráze S. cerevisiae a přiblížit limitující kroky ke správné a funkční expresi. V hlavní části seminární práce se zaměřím na vliv složení buněčné membrány a jejímu vztahu ke strukturním a transportním vlastnostem membránových přenašečů.
2.
Heterologní exprese K jednomu z cílů nynějšího výzkumu kvasinek patří snaha použít tato nižší eukaryota k expresi proteinů jiných organismů, neboli vytvořit kmen či kmeny, které budou schopny exprese podle předlohy pocházející z jiného eukaryotického organismu (nejen savců, ale i jiných živočichů, hub či rostlin). Zatímco heterologní exprese solubilních proteinů v kvasinkách je využívána poměrně dlouho, v současnosti je hlavní snahou použít tento organismus k účinné syntéze transportních proteinů plazmatické membrány buněk. Záměrem je pochopit procesy a mechanismy podílející se na biogenezi membránových proteinů, od transformace buňky vhodnými vektory nesoucími příslušnou DNA, transkripci, translaci, až po procesy úpravy v sekreční dráze a finální vynesení do plazmatické membrány v transportních váčcích. Sleduje se subcelulární lokalizace, stabilita a chemické modifikace takovéhoto proteinu, které podstoupil během sekreční dráhy. Zjišťuje se též podíl druhově specifických chaperonů na funkční expresi heterologních proteinů. Na základě těchto poznatků by mohl být vyvinut kmen či kmeny, které by byly schopné funkční exprese membránových přenašečů z různých zdrojů eukaryotických organismů. Takto exprimované přenašeče v kvasince by měly značný význam nejen z fyziologického, ale i z farmaceutického hlediska. Bylo by možné zkoumat vlastnosti mutantních přenašečů například u geneticky podmíněných chorob. V případě správné funkce heterologního proteinu by bylo možné charakterizovat jeho transportní vlastnosti a zavádět cílené mutace, které by měnily jeho transportní aktivitu či jeho senzitivitu k inhibitorům. Použití S. cerevisiae má výhodu snazší a levnější kultivace vůči
3
tkáňovým kulturám, navíc je znám celý kvasinkový genom (8), a tudíž lze poměrně snadno vytvořit kmeny, které nebudou obsahovat vlastní přenašeče interferující s transportní aktivitou heterologního transportního systému.
3.
Sekreční dráha V eukaryotické buňce je několik možností lokalizace nově syntetizovaných proteinů. Syntéza nového proteinu obvykle začíná na volných cytosolických ribozómech a neobsahuje-li protein žádnou signální sekvenci, zůstává po syntéze lokalizován v cytosolu (viz obr. 1). Obsahuje-li signální sekvenci pro lokalizaci do některých kompartmentů jako mitochondrie, peroxyzóm nebo jádro (popř. chloroplast rostlin), je do těchto kompartmentů posttranslačně směrován příslušným transportním systémem.
Obrázek 1. Syntéza proteinů na ribozómech K syntéze nového proteinu může docházet buď na volných ribozómech v cytosolu, nebo obsahuje-li protein signální sekvenci, váže se k ER a je dále kotranslačně přenášen do lumen či membrány ER. Převzato z (1). 3.1 Translace V případě že protein obsahuje na N-konci signální sekvenci pro endoplazmatické retikulum, probíhá další syntéza na drsném endoplazmatickém retikulu (viz obr. 1). U savčích buněk tvoří signální sekvenci endoplazmatického retikula úsek 16-30 4
aminokyselin na N-konci proteinu, skládající se z jedné nebo více kladně nabitých aminokyselin následovaných většinou 6-12 hydrofobními aminokyselinami (17). U rozpustných proteinů je tato signální sekvence následně po přenosu do ER štěpena signální peptidázou v místě polárních aminokyselin, kde -1. a -3. aminokyselinový zbytek od místa štěpení je polární (12). V některých případech může u kratších proteinů docházet k syntéze na volných ribozómech. Takovýto protein je následně posttranslačně přenesen do ER, jako je tomu například i u mitochondrií či peroxizómů, (17). V tomto případě se v cytosolu na tento protein váže specifický chaperon z rodiny Hsp70 a přenáší ho k membráně ER v nesbaleném stavu. Při odhalení příslušné signální sekvence pro vstup do ER se k této doméně nově syntetizovaného proteinu váže částice SRP (signal recognition particle) a tento komplex (SRP, mRNA, ribozóm a N-koncová část proteinu) putuje k receptoru SRP na membráně endoplazmatického retikula. Nepřítomnost membrány endoplazmatického retikula v blízkosti tohoto komplexu brání částici SRP v pokračování syntézy proteinu, jehož elongace se zastaví kolem 70. aminokyseliny. V případě navázání přes receptor SRP k ER je komplex nasměrován ke speciálnímu kanálu membrány ER pro translokaci proteinů – translokonu. Zde SRP a receptor SRP od ribozómu oddisociují za spotřeby GTP, zatímco se signální sekvence váže k translokonu (17). Po oddisociování SRP a receptoru pokračuje syntéza proteinu, který je kotranslačně transportován přes translokon do ER. Během syntézy se k proteinům v ER průběžně váží chaperony endoplazmatického retikula, bránící sbalení do nesprávné konformace. Transmembránové proteiny ve své primární struktuře obsahují jeden či více úseků obsahujících
nejméně
20
hydrofobních
aminokyselin,
které
tvoří
typický
transmembránový α-helix ukotvující protein v membráně. Orientace C- a N- konce proteinu může být jak cytosolická, tak směřující do lumen ER (viz obr. 2). Při průchodu kotevní sekvence translokonem dochází k jejímu zaseknutí v kanálu, zastavení přenosu proteinu, a kotevní sekvence disociuje stranou do fosfolipidové dvojvrstvy mimo kanál. Některé proteiny mohou být k cytoplazmatické membráně připojeny i prostřednictvím hydrofobní kotvy glykosylfosfatidylinozitolu (GPI), v tomto případě protein neprochází membránou, ale je k ní jen připojen; nejedná se tedy o typický transmembránový protein (17).
5
Obrázek 2. Možné topologie membránových proteinů ve fosfolipidové dvojvrstvě. Schéma nastiňuje možnosti inzerce proteinů do membrány a různé možnosti orientace C- i N-konců s příklady jednotlivých membránových proteinů. Převzato z (17). V případě, kdy N-konec směřuje do ER, je signální sekvence ER přítomna na Nkonci a po transportu je odštěpena signální peptidázou. Má-li N-konec cytosolickou lokalizaci, je první kotevní sekvence zároveň i signální sekvencí, tudíž tomuto transmembránovému úseku hydrofobních aminokyselin předchází několik aminokyselin kladně nabitých (17). V tomto případě se částice SRP váže k transmembránové a zároveň signální sekvenci. Po přenosu k translokonu již N-konec tímto kanálem neprochází, zůstává orientován do cytosolu a v translokonu se tak tvoří vlásenka proteinu, protože dochází k přenosu řetězce až za kotevní sekvencí. U těchto proteinů zůstává signální sekvence jejich součástí a není v ER odštěpena. Orientace konců může být částečně ovlivněna i délkou a složením hydrofobních úseků, kdy úseky do 20 aminokyselin obvykle směrují N-konec do cytosolu, zatímco úseky dlouhé nad 20 aminokyselin se nacházejí spíše u proteinů s N-koncem směřujícím do lumen ER (17). Jen správně sbalené proteiny mohou opustit endoplazmatické retikulum a postoupit do Golgiho aparátu. K tomu účelu slouží posttranslační modifikace odehrávající se převážně v endoplazmatickém retikulu, napomáhající proteinu zaujmout správnou a co nejstabilnější konformaci v celé škále možných stavů. K takovýmto modifikacím patří například tvorba disulfidických můstků či glykosylace proteinů. V opačném případě jsou proteiny degradovány. V případě rozpustných proteinů jsou translokonem přeneseny zpět do cytosolu, kde jsou ubikvitinovány a následně degradovány 6
v proteazómu (17). Chybně složené membránové proteiny jsou směrovány do lysozómu (popř. do vakuoly u hub a rostlin), kde podléhají vlastní degradaci .
Obrázek 3. Sekreční dráha Sekreční dráha eukaryotické buňky zajišťující funkční expresi proteinů a jejich směrování do příslušných kompartmentů. Převzato z (6). 3.2 Disulfidické můstky Disulfidické můstky vznikají v oxidačním prostředí kovalentním spojením dvou skupin –SH cysteinů, mezi oblastmi jednoho proteinu či více proteiny navzájem. Je to jeden ze způsobů, jak se stabilizuje terciární a kvartérní struktura mnoha proteinů. Můstky S-S vznikají v ER nejprve spontánně, podle pokračující syntézy řetězce – tj první Cys s druhým, třetí se čtvrtým... Za tímto účelem endoplazmatické retikulum obsahuje protein PDI (proteindisulfidizomeráza), který náhodně vzniklé můstky S-S redukuje a přestavuje do takové podoby, v níž by protein zaujal termodynamicky co nejstabilnější konformaci. PDI je přítomna i v S. cerevisiae a její vlastnosti odpovídají té v savčích buňkách ( jsou z cca 30% homologní) (12). Disulfidické můstky vznikají pouze v ER, v cytosolických proteinech nejsou přítomny i díky redukujícímu prostředí cytoplazmy, kde cytosolický tripeptid glutathion brání spontánnímu vzniku takovýchto 7
disulfidických můstků (17). Disulfidické můstky jsou proto přítomny jen na sekretovaných proteinech a hydrofilních částech transmembránových proteinů směřujících do lumen ER. 3.3 Glykosylace K jedné z nejdůležitějších posttranslačních modifikací patří nesporně glykosylace, která je uskutečňována ve dvou formách. K prvnímu druhu patří O-glykosylace, kdy k hydroxylové skupině serinu či threoninu je připojeno několik (převážně čtyři) cukerných zbytků. O-glykosylace probíhá pomalu a každý ze sacharidů má svou vlastní glykosyltransferázu. V druhém případě, N-glykosylaci, je na asparagin proteinu (v sekvenci Asn-X-Ser/Thr) přidán přímo celý oligosacharid, který je dále upravován v Golgiho aparátu. Glykosylace se týká opět jen proteinů sekreční dráhy, u cytosolických proteinů není (až na výjimky) vůbec přítomna (17). Při O-glykosylaci jsou sacharidové zbytky z nukleotidových prekurzorů (NDP, NMP) připojovány ke skupině –OH serinového či threoninového zbytku. O-glykosylace je započata vazbou GalNac (N-acetyl-D-galaktóza) z UDP-GalNac k Ser/Thr. GalNac transferáza je přítomna v drsném ER a cis-Golgi. V trans-Golgi dochází k následnému přidání galaktózy jako druhého cukerného zbytku. Obratlovci řetězec charakteristicky zakončují
v trans-Golgi
přidáním
dvou
záporně
nabitých
sialových
(N-
acetylneuraminových) kyselin z prekurzoru CMP (17). N-glykosylace začíná v drsném ER přidáním oligosacharidového prekurzoru, který je původně připojen na membránu k nosiči – dolicholu dvěma fosfátovými zbytky. Syntéza oligosacharidu nejprve probíhá na cytosolické straně, následně je prekurzor překlopen do lumen ER, kde syntéza pokračuje. Enzym oligosacharidproteintransferáza připojí k asparaginu v sekvenci Asn-X-Ser (X = vše mimo Pro) oligosacharidový prekurzor Glc3Man9(GlcNac)2, který je stejný u rostlin, živočichů i jednobuněčných eukaryot (17). Po přenosu jsou z oligosacharidu odštěpeny 3 glukózy a 1 manóza. Takto upravený protein postupuje sekreční dráhou dále do GA. V savčí buňce je v případě chybného sbalení proteinu k oligosacharidu nazpět přidán jeden glukózový zbytek, signalizující jeho nesprávnou konformaci. Na takovýto oligosacharid (Glc1Man7-9(GlcNac)2) se váží proteiny kalnexin a kalcineurin, které brání sbalení okolních oblastí proteinu. Většinou se oligosacharid odštěpí úplně a protein již není v tomto místě reglykosylován. 8
Správně
sbalené
a
preglykosylované
proteiny
do
GA
vstupují
s
prekurzorem Man8(GlcNac)2, ten je upraven do konečné podoby osahující oligosacharid skládající se z 3 sialových kyselin, 3 galaktóz, 4 GalNac, 3 manóz a jedné fukózy. V případě kdy je oligosacharid špatně prostorově dostupný pro enzymy, dochází již k minimálním úpravám, a zůstává tak oligosacharid s vysokým podílem manózy – Man8(GlcNac)2 či Man5(GlcNac)2 (17). Část N-glykosylace probíhající v GA se u kvasinek od savčí značně liší a bude podrobněji probrána v další kapitole zabývající se problémy heterologní exprese. Některé proteiny potřebují N-glykosylaci aby se správně sbalily do nativní konformace, a bez správné glykosylace zůstávají v endoplazmatickém retikulu. Na druhou stranu ji značná část proteinů nepotřebuje vůbec, jsou totiž náležitě sbaleny i bez navázaných oligosacharidových řetězců. Bylo též pozorováno, že proteiny bez glykosylace jsou degradovány mnohem rychleji než jejich glykosylované analogy, tudíž lze předpokládat, že glykosylace proteinů má pozitivní vliv na jejich stabilitu (17). V případě proteinů směřovaných do vakuoly či lysozómu je jedna nebo více manóz fosforylována. Ve váčcích směřujících do lysozómu jsou obsaženy receptory pro manózo-6-fosfát (M6P), které transportují tyto proteiny do příslušného kompartmentu. Na transportu mají podíl i jiné (pravděpodobně strukturní) vlastnosti transportovaných proteinů. 3.4 Chaperony Na zaujmutí správné konformace se dále podílejí molekulární chaperony, které zabraňují agregaci či chybnému sbalení nově syntetizovaného proteinu. K těmto pomocným proteinům patří např. Hsp 70, který brání právě agregaci nesbalených proteinů, a pomáhá jim zaujmout nativní konformaci. Při translokaci v kvasinkách chaperony ER rodiny Hsp70 hydrolyzují ATP a umožňují vlastní pohyb proteinu translokonem, zatímco translokace v savčích buňkách je na ATP nezávislá (17). Lektiny kalnexin a kalcineurin v savčích buňkách váží cukerné zbytky glykosylovaných částí a pomáhají
opět
sbalení
těchto
proteinů.
Další
skupinou
chaperonů
jsou
peptidylprolylizomerázy, rotující peptidické vazby na ještě nesbalených částech proteinu mezi prolinem a vedlejším aminokyselinovým zbytkem. Tyto enzymy jsou často specifické pro určitý protein či skupinu proteinů (17). Jak bude ukázáno dále, chaperony (jak obecné, tak specifické) jsou důležitou složkou, podílející se na 9
samotném transportu proteinů sekreční dráhou (hlavně na jejich ukládání do transportních a sekrečních váčků). 3.5 Transport k plazmatické membráně Enzymy, které mají zůstat v GA, používají jako signál k retenci pravděpodobně transmembránový helix, kterým jsou ukotveny v membráně. Transmembránové domény enzymů GA bývají obvykle o 2-3 aminokyseliny kratší než helixy proteinů směřujících do plazmatické membrány. Není ovšem znám přesný způsob, jakým se tyto vlastní proteiny drží v Golgiho aparátu a nejsou vyneseny do buněčné membrány. Předpokládá se, že tyto enzymy agregují do shluků díky transmembránovým doménám, a tyto shluky mohou být napojeny přímo na cytoskelet (17). Ty savčí buňky, které jsou funkčně rozděleny na apikální a bazolaterální část, jsou schopny vynášet selektivně proteiny na tu či onu část membrány, avšak mechanismus tohoto třídění není doposud plně objasněn. V tomto případě z GA odcházejí dva typy váčků s charakteristickými povrchovými molekulami (V-SNARE a Rab), které směřují do daného kompartmentu a obsahují i specifický náklad proteinů pro danou část membrány. Mimo GPI-kotvy (směřující proteiny většinou do apikální membrány) nejsou mechanismy třídění do váčků známy, i zde se však předpokládají specifické typy interakcí s cytoskeletem. Bohužel není znám ani signál směřující proteiny do váčků putujících k plazmatické membráně, nelze tudíž předpovědět místo jejich určení.
4.
Problémy heterologní exprese transportních proteinů cytoplazmatické membrány u S. cerevisiae 4.1 Původ genů, introny Při transformaci buňky úsekem amplifikovaným přímo z genomu donorového organismu může v mnoha případech dojít k nerozpoznání přítomných intronů (obsahuje-li je příslušný gen). Tehdy je proteinový produkt bez jakéhokoli významu, protože obsahuje navíc úseky, které mění jeho topologii, nemluvě o možném posunu v čtecím rámci. Proto se při heterologní expresi nejčastěji používají fragmenty pocházející z cDNA knihoven příslušného organismu, jelikož jen tento způsob zaručuje správnou primární strukturu požadovaného proteinu (28).
10
4.2 Transkripce, stabilita mRNA Buňky S. cerevisiae se transformují podle potřeby exprese daného proteinu vektory multikopiovými, nebo centromerickými (obsažených v buňce většinou v jedné kopii). I když sledovaný „gen“ je pod vhodným kvasinkovým promotorem, frekvence exprese nemusí být vždy stejná. Na úrovni transkripce se dá říci, že frekvence transkripce genů pod stejným promotorem je u proteinů organismu vlastních obvykle vyšší než u heterologních. V kódujících oblastech mnoha genů S. cerevisiae byla nalezena tzv. „downstream“ aktivační sekvence (DAS), obvykle lokalizovaná na prvních cca 80 kódujících kodónech. Tento úsek je ovlivňuje množství transkriptu v buňce a jeho hladinu může změnit i o řád (28). Byl pozorován např. vliv výměny N-konce heterologního proteinu, kdy chiméra savčího Nhe1 s N-koncem kvasinkové H+-ATPázy Pma1 měla vyšší míru exprese než samotný protein pod stejným promotorem (18). V heterologních genech mohou být též obsaženy oblasti neobvykle bohaté AT. Jsou-li tyto úseky přítomny v kódujících oblastech, může u kvasinek dojít k předčasné terminaci transkripce požadovaného genu (11). Stabilizující či destabilizující efekt na transkript má i nepřekládaná oblast na 3´ konci mRNA - 3´UTR, která při heterologní expresi může mít odlišný efekt než u původního organismu (7). 4.3
Translace
Dalším regulačním krokem, určujícím množství heterologního proteinu v buňce, je míra translace. Jejím klíčovým regulačním mechanismem je samotná iniciace, která je modulovatelná řadou faktorů. Při heterologní expresi může být ovlivněna předně odlišnými sekvencemi v heterologním templátu, které kvasinka ve svém genomu obvykle nepoužívá v takové míře jako původní organismus. Kvasinkový genom má též odlišné nukleotidové sekvence v okolí iniciačního kodónu, které jsou rozpoznávány kvasinkovými ribozómy s vyšší afinitou než obdobné sekvence z jiných organismů (4). Míra iniciace je též ovlivněna i 5´ nepřekládanými oblastmi (5´UTR) obsaženými v transkriptu, které směřují translační aparát k iniciačnímu kodónu. Rozpoznání iniciačního methioninu se zdá jako specifické pro určitý typ buněk. Některé konsensus sekvence obratlovců jsou sdíleny i kvasinkou, neplatí to však pro všechny (14). Kvasinka S. cerevisiae během svého evolučního vývoje začala preferovat některé z řady synonymních kodónů a jiné se v jejím genomu vyskytují jen sporadicky. Použití preferenčních kodónů zvyšuje rychlost vlastní translace, ale neovlivňuje její iniciaci. 11
Limitním faktorem u kodónů, které nejsou kvasinkou preferovány, je nižší hladina tRNA a aminoacyl-tRNA-syntázy, než je tomu u kodónů preferenčních (28). V důsledku toho u „vzácných“ kodónů dochází k pomalejšímu překladu na ribozómech, a při nadexpresi je hladina aminoacyl-tRNA limitující, čímž roste i pravděpodobnost chybného zařazení aminokyselinového zbytku a předčasnému ukončení translace na ribozómu. Při výměně preferenčních kodónů za synonymní na N-konci fosfoglycerátkinázy exprimované v S. cerevisiae byl pozorován dramatický pokles hladiny exprese tohoto proteinu vůči původnímu stavu (10). Důležitost použití kodónů preferovaných kvasinkou bylo potvrzeno i v mnoha dalších publikacích. Též delece heterologní oblasti 5´UTR je schopna pozitivně ovlivnit míru exprese, jelikož její použití jako cizorodé ji snižuje (7). 4.4 Glykosylace Jedním ze zásadních rozdílů mezi eukaryotickými organismy je míra a způsob glykosylace proteinů, ke které dochází v GA. Nicméně sekvence v primární struktuře proteinu pro O- i N-glykosylaci je u kvasinky stejná jako u ostatních eukaryot. Typická glykosylace u savčích buněk byla popsána v úvodní části. N-glykosylace u S. cerevisiae znamená navázaný polysacharid s vysokým podílem manózy. Na základ řetězce oligosacharidu Glc3Man9(GlcNac)2 vycházejícího z ER (stejný prakticky u všech eukaryot) jsou tak přidávány již jen jednotlivé manózové jednotky. Výsledný polysacharid je složen u S. cerevisiae až z 75 sacharidových jednotek oproti 15 u savců (viz. obr. 4). O-glykosylace je v případě S. cerevisiae opět provedena přidáním jen manózových jednotek (obvykle 4-5) na serin či threonin v řetězci proteinu.
12
savci
Asn
Ser/Thr
Asn
GlcNac Man Gal NANA Fuc GalNac
S. cerevisiae
P
Asn
ER
GA
Obrázek 4. Porovnání struktury oligosacharidů glykosylace v savčích buňkách a v S. cerevisiae Ačkoli membránové proteiny nebývají často nijak hojně glykosylovány, přesto může mít glykosylace na smyčkách mezi transmembránovými helixy vliv na dostupnost substrátu, či na konformaci rozsáhlejších hydrofilních oblastí. Zatímco u teplokrevných savců se stálou tělesnou teplotou se míra glykosylace nijak rapidně nemění (mimo hormonálních regulací), u S. cerevisiae byla pozorována za vyšších teplot snížená míra glykosylace heterologního proteinu – krysího přenašeče neurotransmiterů rVMAT (34). Při 16°C byla glykosylována zhruba polovina sledovaného proteinu, a při 30°C (optimální teplota pro růst S. cerevisiae) již k jeho glykosylaci nedocházelo vůbec. Tento fakt však neměl na funkčnost a lokalizaci proteinu žádný vliv. Také pro savčí Na+/H+ antiporter Nhe1 (18) byla pozorována odlišná míra glykosylace oproti proteinu v původním organismu a při heterologní expresi v S. cerevisiae. 4.5
Chaperony a faktory pro export z ER
Na maturaci proteinu v ER se podílí řada molekulárních chaperonů, zajišťujících jak zaujetí správné konformace, tak kontrolu její správnosti. Při chybném sbalení dochází k degradaci proteinů v kompartmentech k tomu určených. Experimentálně bylo prokázáno, že při deleci některého z kontrolních mechanismů kontroly kvality došlo k snadnějšímu průchodu cizorodého proteinu sekreční dráhou. Například odstraněním 13
genu CNE1 (kvasinkový homolog kalnexinu a kalretikulinu) došlo ke zvýšení množství heterologního lidského transferinového receptoru obsaženého v plazmatické membráně (25). Existuje řada faktorů jak obecných tak specifických pro jednotlivé proteiny, či pro proteinové rodiny, které zajišťují následný export z ER. Takovým faktorem může být např. Gsf2p v případě hexózových přenašečů Hxt1 a Gal2p (30), nebo Shr3p nezbytný k exportu přenašečů aminokyselin Hip1p, Gap1p a dalších (16). Předpokládá se, že tyto faktory obvykle obsahují na C-konci aminokyselinové sekvence vážící součásti váčků COPII a zajišťující tak jejich tvorbu (20) a následný posun sekreční dráhou směrem k plazmatické membráně. Například z šesti různých myších membránových proteinů byly v lidských buňkách úspěšně exprimovány všechny, ale u S. cerevisiae již jen tři (7). To dokazuje, že sekreční mašinérie preferuje u různých organismů různé signální sekvence k exportu z ER, i když některé mohou fungovat ve více organismech. Toto je asi hlavní limitní krok při neúspěšné funkční expresi heterologních membránových proteinů. Předpokládá se, že většina signálů k exportu jsou pravděpodobně strukturním motivem nacházejícím se na hydrofilním N-konci či v první, nebo druhé transmembránové doméně (H. Sychrová, osobní sdělení). Jedním z problémů, které mohou dále v této fázi vyvstat, je spuštění mechanismů pro přímou degradaci proteinů obsažených v ER, které směřují proteiny do vakuoly k degradaci. Toto nastává velmi často při nadexpresi proteinů a jejich následné agregaci v ER, což je vlastním signálem k odstranění. Dochází k tomu hlavně díky faktu, že míru exprese heterologního proteinu lze jen těžko dopředu odhadnout. 4.6
Recyklace proteinů Po vynesení proteinu až do plazmatické membrány vyvstává v případě jeho
funkčnosti, již jen otázka poločasu jeho života. Zdá se, že hlavním faktorem určujícím jeho stabilitu je primární aminokyselinová sekvence, která je určující pro napojení ubikvitinu či fosforylaci (H. Sychrová, osobní sdělení). To se stává signálem pro retenci a následnou degradaci ve vakuole.
14
5.
Vliv lipidového složení membrány na transportní a strukturní vlastnosti heterologních proteinů Lipidy jak známo tvoří s mnoha membránovými proteiny stabilní komplexy. Jeden z mnoha možných důvodů, proč je v buněčné membráně obecně tolik druhů lipidů, jsou možné specifické požadavky na lipidové složení okolí pro jednotlivé proteiny. Je evidentní, že membránové proteiny vyžadují specifické lipidy buď jako kofaktory k správné funkci, nebo jako části podílející se na správné a stabilní konformaci. Tento fakt by se měl vzít v potaz při heterologní expresi membránových proteinů. Specifickými požadavky na lipidy tak mohou nastat problémy i za přítomnosti funkčního promotoru, terminátoru i správného sbalení proteinu s funkčním signálem pro vynesení do membrány. Ve většině případů, kdy se membránové proteiny zbaví lipidové dvojvrstvy, dojde k jejich denaturaci, avšak v některých případech navrácení lipidů může vést k jejich opětovné renaturaci (22). Jak je patrno z tabulky 1, fosfolipidy se přímo podílejí na struktuře mnoha membránových proteinů (první tři byly vykrystalizovány) a jejich nepřítomnost může ovlivnit přímo funkci proteinu. Tabulka 1. Příklad proteinů vyžadující specifické fosfolipidy ke své funkci. Protein hovězí cytochrom c oxidáza S. c. cytochrom c oxidáza cytocrom c oxidáza P. denitrificans rodopsin Lac permeáza E. coli porin PhoE E. coli mitochondriální přenašeč fosfátu
Lipidy 3 PE, 7 PG, 1 PC, 3 CL 2 PE, 1 PI, 1 PC, 1 CL
Funkce
jeden z CL se možná podílí na translokaci H+
1 PC
-
Cholesterol PE PE
stabilizace molekuly chaperon trimerizace in vitro
CL
30x vzrůst aktivity
CL je esenciální pro aktivitu
Upraveno podle (22). Tabulka 2 shrnuje zastoupení jednotlivých druhů fosfolipidů v plazmatické membráně několika různých organismů ve srovnání s kvasinkou S. cerevisiae, která
15
byla vybrána jako modelový organismus k heterologní expresi. Z údajů vyplývá, že každý organismus má značně odlišné složení membrán, což ve finále může ovlivnit specifické lipidové nároky mnoha proteinů exprimovaných v jiném organismu. Pomlčka znamená, že daný fosfolipid nebyl uveden. Tabulka 2. Zastoupení fosfolipidů v membránách různých organismů.
PC PE PI PS PA PG CL
S. cerevisiae 17% 20% 18% 34% 4% 0.2%
sfingolipidy
cca 30%
24% (sfingomyelin)
glykolipidy
11% (ergosterol)
11% (cholesterol)
steroly
savci – BHK21 2% 2% 3% 1% -
hepatocyt krysy 32-47% 14-20% 7-10% 4-8% 2-3% 13-24% (sfingomyelin) 1-3% (cerebrosidy) 14-17% (cholesterol)
rostliny
E. coli
9-14% 9-15% 2% 3-4% 11% 1-2% -
70-80% 15-20% 5%
-
-
25-39% 19-25% (specifické)
-
Upraveno podle (22). Organismy si udržují lipidové složení membrán v určitých definovaných mezích. I jednoduché prokaryotické organismy regulují složení svých membrán v závislosti na podmínkách prostředí. Příkladem regulace lipidového složení membrány v závislosti na teplotě je i Escherichia coli, tento organismus je schopen měnit jak procentuelní zastoupení fosfolipidů v membránách, tak i druh acylů ve fosfolipidrch (19). U S. cerevisiae se procentuelní zastoupení jednotlivých fosfolipidů liší v závislosti na kmeni, ale také zdroji uhlíku a kultivačních podmínkách (5). Hlavním sterolem v buňkách S. cerevisiae je ergosterol. Sfingolipidy jsou odvozeny od inozitolové kostry a v plazmatické membráně zabírají kolem 30% všech fosfolipidů, tj. 7-8% hmotnosti membrán (23). U savců je hlavním sterolem v membránách cholesterol. Jeho hladina v buňce je přísně
regulována.
Sfingolipidy
jsou
zde
zastoupeny
sfingomyelinem
a
glykosfingolipidy, jež jsou esenciálními komponenty membrán a vyskytují se převážně ve vnější polovině dvojvrstvy plazmatické membrány (13). Složení savčích membrán,
16
bohatých na sfingomyelin, sfingolipidy a cholesterol, se nijak výrazně neliší mezi tkání in vivo a tkáňovou kulturou (22). Cholesterol, sfingolipidy a některé proteiny tvoří charakteristické ostrůvky v určitých částech buněčné membrány savců (tzv. lipid rafts). Tyto ostrůvky se zdají být charakteristickým rysem savčích buněk a nacházejí se v nich přednostně proteiny vyžadující vysoké koncentrace cholesterolu (31). Podobné domény byly pozorovány i u kvasinek, zvláště v souvislosti s dopravou transmembránových proteinů do plazmatické membrány (2). Mezi různými fosfolipidy je fosfatidylcholin (PC) přítomen v drtivé většině organismů vyjma gram-pozitivních bakterií (32). Negativní náboj je do membrán vnesen anionickými lipidy jako fosfatidylserin (PS), fosfatidylglycerol (PG), kardiolipin (CL) a kyselina fosfatidová (PA). Zatímco PS reprezentuje hlavní anionický lipid eukaryot, u prokaryot a mitochondrií tuto funkci plní PG a CL. Všechny eukaryotické buňky obsahují ve své membráně steroly a sfingolipidy, které chybí u prokaryot a membrán uvnitř buňky. Membrány kompartmentů uvnitř eukaryotických buněk se blíží svým složením spíše prokaryotům než vlastním cytoplazmatickým membránám (22). Vliv lipidového složení membrány na funkční expresi heterologních membránových proteinů byl samozřejmě studován i v S. cerevisiae. Výhodou kvasinky vzhledem k složení membrán je eukaryotický původ, a tudíž se zastoupením lipidů co do druhu blíží ostatním eukaryotům, která jsou hlavními „dárci“ heterologních membránových proteinů. Plusem je i možnost přípravy mutantů defektních v jednotlivých typech lipidů. Jedním z problémů může být nepřítomnost cholesterolu vzhledem k savčím buňkám a oproti rostlinám nepřítomnost jejich specifických sterolů (campesterol, stigmasterol a sitosterol). Hlavní sterol kvasinek ergosterol sice může do určité míry nahradit rostlinné a živočišné steroly, ale většinou není dosaženo plné funkčnosti heterologního proteinu. V případě lidského přenašeče MDR1 (nízce specifický přenašeč xenobiotik) exprimovaného v S. cerevisiae byl pozorován rapidní pokles aktivity způsobený přítomností ergosterolu (29). Na druhou stranu může být cholesterol nahrazen ergosterolem bez ztráty funkce, např. u Na+/K+ ATPázy (24), nebo u lidského symportního přenašeče Na+/Glc hSGLT1 (26). Jiná studie potvrzuje, že i rostlinné steroly mohou být nahrazeny ergosterolem bez ztráty funkce, např. u H+-ATPázy (15).
17
Význam lipidů může tkvět nejen ve stabilizaci okolí proteinu, ale i ve funkci jako molekulárního chaperonu, jak dokazuje příklad přenašeče laktózy (LacY) E. coli (3). Zde figuruje PE jako neproteinový molekulární chaperon nutný jak k de novo sbalení, tak ke sbalení denaturovaného proteinu do nativní konformace. Po odebrání PE již protein svou konformaci nemění. Bez přítomnosti tohoto fosfolipidu zaujme část transmembránových domén ve fosfolipidové dvojvrstvě obrácenou orientaci. To dokazuje že sbalení proteinu je nejen věcí sekvence, ale i lipidového složení, ačkoli tento efekt u jiného druhu fosfolipidu nebyl doposud pozorován. Efekt je vysvětlován elektrostatickými interakcemi mezi nabitými aminokyselinami v hydrofilních smyčkách proteinu s PE. Nedostatek fosfatidyletanolaminu též zapříčinil chybné vynášení přenašeče argininu S. cerevisiae Can1p do plazmatické membrány (21). Množství proteinu v buňce se nezměnilo, ale jeho množství v cytoplazmatické membráně pokleslo na úkor jeho množství v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Snížené množství PE narušilo i sekreci dalších membránových proteinů, ale nikoli v takové míře. K obnovení normálního stavu stačilo jen 5% původního PE (tj. asi 1% zastoupení v membráně). Možným vysvětlením je v nepřítomnosti PE chybné sbalení Can1p, nebo chybná funkce chaperonu přenašečů aminokyselin – Shr3p, který třídí tyto proteiny do váčků.
6.
Závěr První úspěšná heterologní exprese membránového proteinu v S. cerevisiae byl bakteriální opsin z H. salinarum (9). Od té doby se již podařilo částečně funkčně exprimovat několik desítek membránových proteinů, například P-glykoprotein (27), přenašeč nukleosidů CNT člověka i krysy (33). Ve všech dosud popsaných příkladech heterologní exprese membránových proteinů v S. cerevisiae však zůstávala většina exprimovaných proteinů lokalizována uvnitř buňky, a jen malá část se ve funkčním stavu dostala do plazmatické membrány (H. Sychrová, osobní sdělení). Momentální snaha o řešení problému má čtyři hlavní směry:
1)
Příprava mutantů v lipidovém složení membrán Jak se ukazuje, tak lipidové složení membrán hraje určitý vliv v množství membránových proteinů dopravených z ER a GA do plazmatické membrány (21). Výzkum v tomto směru je veden otázkou jek se složení membrán může podílet na 18
průchodnosti sekreční dráhy možným ovlivněním některých chaperonů a dalších faktorů podílejících se na exportu nejen membránových proteinů z ER a GA. 2)
Příprava mutantů s průchodnější sekreční dráhou Další možností zprůchodnění sekreční dráhy pro heterologní membránové proteiny je příprava mutantů v jednotlivých krocích sekrece. Je zaměřena na potlačení kontrolních
mechanismů
bránících
v účinném průběhu
exportu
heterologních
membránových proteinů do plazmatické membrány. 3)
Příprava chimérních heterologních proteinů Asi nejčastějším řešením v současné době je příprava chimérních proteinů, kdy Nkonec, či první transmembránové domény jsou nahrazeny stejnou částí některého proteinu kvasince vlastní. Častým jevem při průchodu sekreční dráhou je následná nefunkčnost proteinu, pravděpodobně změnou struktury hydrofobních částí v membráně podílejících se přímo na transportu. I v případě funkčnosti v jednotlivých případech u jednotlivých proteinů, by výsledek pravděpodobně neměl obecné využití pro všechny ostatní membránové proteiny.
4)
Koexprese heterologních chaperonů spolu s transportními systémy Koexprese heterologních proteinů s heterologními chaperony zatím nepřinesla výsledky, např. koexprese savčího membránového přenašeče rVMAT s kalnexinem a větším množstvím Shr3p (faktor kvasinek zajišťující export aminokyselinových přenašečů z ER) nezměnilo nijak množství proteinu v membráně (34). Přesto je tento způsob nahlížení na problém momentálně jedna z nejnadějnějších perspektiv úspěšné exprese heterologních membránových proteinů a v mnoha laboratořích jej vyvíjena snaha „zefektivnit“ funkční expresi heterologního transportního systému současnou transformací kvasinek knihovnami cDNA z organismu, ze kterého pochází studovaný protein.
19
7.
Seznam Literatury 1.
Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and J. D. Watson. 1994. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed. Garland Publishing, New York and London.
2.
Bagnat, M., A. Chang, and K. Simons. 2001. Plasma membrane proton ATPase Pma1p requires raft association for surface delivery in yeast. Mol Biol Cell 12:4129-38. Převzato z (22).
3.
Bogdanov, M., P. N. Heacock, and W. Dowhan. 2002. A polytopic membrane protein displays a reversible topology dependent on membrane lipid composition. EMBO J 21:2107-16.
4.
Cigan, A. M., and T. F. Donahue. 1987. Sequence and structural features associated with translational initiator regions in yeast--a review. Gene 59:1-18. Převzato z (28).
5.
Daum, G., G. Tuller, T. Nemec, C. Hrastnik, G. Balliano, L. Cattel, P. Milla, F. Rocco, A. Conzelmann, C. Vionnet, D. E. Kelly, S. Kelly, E. Schweizer, H. J. Schuller, U. Hojad, E. Greiner, and K. Finger. 1999. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast 15:601-14. Převzato z (22).
6.
Ellgaard, L., M. Molinari, and A. Helenius. 1999. Setting the standards: quality control in the secretory pathway. Science 286:1882-8.
7.
Galliciotti, G., H. Schneider, L. Wyder, A. Vitaliti, M. Wittmer, M. Ajmo, and R. Klemenz. 2001. Signal-sequence trap in mammalian and yeast cells: a comparison. J Membr Biol 183:175-82.
8.
Goffeau, A., B. G. Barrell, H. Bussey, R. W. Davis, B. Dujon, H. Feldmann, F. Galibert, J. D. Hoheisel, C. Jacq, M. Johnston, E. J. Louis, H. W. Mewes, Y. Murakami, P. Philippsen, H. Tettelin, and S. G. Oliver. 1996. Life with 6000 genes. Science 274:546, 563-7.
9.
Hildebrandt, V. 1989. Regeneration and functional incorporation of bacteriorhodopsin in membranes of fission yeast but not in E. coli. J Protein Chem 8:345-6.
10.
Hoekema, A., R. A. Kastelein, M. Vasser, and H. A. de Boer. 1987. Codon replacement in the PGK1 gene of Saccharomyces cerevisiae: experimental
20
approach to study the role of biased codon usage in gene expression. Mol Cell Biol 7:2914-24. Převzato z (28). 11.
Humphrey, T., P. Sadhale, T. Platt, and N. Proudfoot. 1991. Homologous mRNA 3' end formation in fission and budding yeast. EMBO J 10:3503-11. Převzato z (28).
12.
Kaiser, C. A., R. E. Gimeno, and D. A. Shaywitz. 1997. Protein Secretion, Membrane Biogenesis, and Endocytosis, Cell Cycle and Cell Biology, vol. 3, Eds.: Pringle, J. R., Broach, J. R., Jones, E. W., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
13.
Karlsson, K. A. 1989. Animal glycosphingolipids as membrane attachment sites for bacteria. Annu Rev Biochem 58:309-50. Převzato z (22).
14.
Kozak, M. 1989. Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems. Mol Cell Biol 9:5073-80. Převzato z (28).
15.
Lanfermeijer, F. C., K. Venema, and M. G. Palmgren. 1998. Purification of a histidine-tagged plant plasma membrane H+-ATPase expressed in yeast. Protein Expr Purif 12:29-37. Převzato z (22).
16.
Ljungdahl, P. O., C. J. Gimeno, C. A. Styles, and G. R. Fink. 1992. SHR3: a novel component of the secretory pathway specifically required for localization of amino acid permeases in yeast. Cell 71:463-78.
17.
Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, and J. E. Darnell. 2000. Molecular Cell Biology, 4th ed. W H Freeman & Co, New York.
18.
Montero-Lomeli, M., and A. L. Okorokova Facanha. 1999. Expression of a mammalian Na+/H+ antiporter in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Cell Biol 77:25-31.
19.
Morein, S., A. Andersson, L. Rilfors, and G. Lindblom. 1996. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem 271:6801-9. Převzato z (22).
20.
Nufer, O., S. Guldbrandsen, M. Degen, F. Kappeler, J. P. Paccaud, K. Tani, and H. P. Hauri. 2002. Role of cytoplasmic C-terminal amino acids of membrane proteins in ER export. J Cell Sci 115:619-28.
21
21.
Opekarova, M., I. Robl, and W. Tanner. 2002. Phosphatidyl ethanolamine is essential for targeting the arginine transporter Can1p to the plasma membrane of yeast. Biochim Biophys Acta 1564:9-13.
22.
Opekarova, M., and W. Tanner. 2003. Specific lipid requirements of membrane proteins-a putative bottleneck in heterologous expression. Biochim Biophys Acta 1610:11-22.
23.
Patton, J. L., and R. L. Lester. 1991. The phosphoinositol sphingolipids of Saccharomyces cerevisiae are highly localized in the plasma membrane. J Bacteriol 173:3101-8. Převzato z (22).
24.
Pedersen, P. A., J. H. Rasmussen, and P. L. Joorgensen. 1996. Expression in high yield of pig alpha 1 beta 1 Na,K-ATPase and inactive mutants D369N and D807N in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 271:2514-22. Převzato z (22).
25.
Prinz, B., U. Stahl, and C. Lang. 2003. Intracellular transport of a heterologous membrane protein, the human transferrin receptor, in Saccharomyces cerevisiae. Int Microbiol 6:49-55.
26.
Quick, M., and E. M. Wright. 2002. Employing Escherichia coli to functionally express, purify, and characterize a human transporter. Proc Natl Acad Sci U S A 99:8597-601.
27.
Raymond, M., S. Ruetz, D. Y. Thomas, and P. Gros. 1994. Functional expression of P-glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae confers cellular resistance to the immunosuppressive and antifungal agent FK520. Mol Cell Biol 14:277-86.
28.
Romanos, M. A., C. A. Scorer, and J. J. Clare. 1992. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast 8:423-88.
29.
Saeki, T., A. M. Shimabuku, Y. Azuma, Y. Shibano, T. Komano, and K. Ueda. 1991. Expression of human P-glycoprotein in yeast cells--effects of membrane component sterols on the activity of P-glycoprotein. Agric Biol Chem 55:1859-65. Převzato z (22).
30.
Sherwood, P. W., and M. Carlson. 1999. Efficient export of the glucose transporter Hxt1p from the endoplasmic reticulum requires Gsf2p. Proc Natl Acad Sci U S A 96:7415-20. Převzato z (6).
31.
Simons, K., and E. Ikonen. 1997. Functional rafts in cell membranes. Nature 387:569-72. Převzato z (22). 22
32.
Veld, G. I., A. J. Driessen, and W. N. Konings. 1993. Bacterial solute transport proteins in their lipid environment. FEMS Microbiol Rev 12:293-314. Převzato z (22).
33.
Vickers, M. F., J. D. Young, S. A. Baldwin, M. J. Ellison, and C. E. Cass. 2001.
Functional
production
of
mammalian
concentrative
nucleoside
transporters in Saccharomyces cerevisiae. Mol Membr Biol 18:73-9. 34.
Yelin, R., and S. Schuldiner. 2001. Vesicular monoamine transporters heterologously expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae display highaffinity tetrabenazine binding. Biochim Biophys Acta 1510:426-41.
23
8.
Seznam zkratek CL
kardiolipin
DAS
„downstream“ aktivační sekvence
ER
endoplazmatické retikulum
Fuc
fukóza
GA
Golgiho aparát
Gal
galaktóza
GalNac
N-acetyl-D-galaktóza
GlcNac
galaktóza
M6P
manózo-6-fosfát
Man
manóza
NANA kyselina N-acetylneuraminová NDP
nukleosiddifosfát
NMP
nukleosidmonofosfát
PA
kyselina fosfatidová
PC
fosfatidylcholin
PDI
proteindisulfidizomeráza
PE
fosfatidyletanolamin
PG
fosfatidylglycerol
PI
fosfatidyinozitol
PM
plazmatická membrána
PS
fosfatidylserin
UTR
nepřekládaná oblast (untranslated region)
VTC
vesiculotubular cluster
24
