Obsah přednášky. 1) Exprese v Escherichia coli 2) Exprese v Saccharomyces cerevisiae 3) Exprese v Pichia pastoris 4) Exprese v hmyzích buňkách

Obsah přednášky 1) 2) 3) 4)

Exprese v Escherichia coli Exprese v Saccharomyces cerevisiae Exprese v Pichia pastoris Exprese v hmyzích buňkách

Exprese v Escherichia coli    

proteiny větší než malé proteiny menší než velké nesmí být příliš hydrofobní nesmí obsahovat mnoho cysteinů

Ideální situace pro expresi v E. coli  Protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem  Není nutná glykosylace  Velikost proteinu je < 50kDa  Protein je produkován v rozpustné cytosolické frakci  Protein je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností opětovného sbalení (refolding)

E.coli expresní systém – teplotní indukce pL promotor +

gen Met

E.coli B – represor cI857

30°C

42°C

Produkt exprese

E.coli expresní systém – IPTG indukce lac/tac promotor +

gen Met

E.coli XL1-Blue E.coli JM101 E.coli TOP10 E. coli BL21/λDE3

30°C/37°C

represor lacIq

30°C/37°C

IPTG

Produkt exprese

E.coli expresní systém – T7 RNA pol. systém T7 promotor +

gen Met

30°C/37°C E.coli BL21 lamdaDE3

IPTG 30°C/37°C

Produkt exprese

Kam lze exprimovat v E. coli sekrece do periplasmatického prostoru

přímá intracelulární exprese

fůzní proteiny

přímá extracelulární exprese

Přímá intracelulární exprese Met

produkt translace

 intracelulární exprese intracelulárních proteinů  intracelulární exprese secernovaných proteinů

Extracelulární exprese Met

signální peptid produkt translace

 signální peptid = signál pro sekreci

Výhody exprese v Escherichia coli  vysoké výtěžky produktu  purifikovatelné produkty vhodné pro další analýzu  levná produkce redukující prostředí

S

S

Inkluzní tělíska „Nechtěný“ produkt rekombinantních technologií  nerozpustné nefunkční komplexy

ALE  rezistentní k proteázám  snadno purifikovatelné ALE  refolding

Ovlivnění rozpustnosti proteinů

• • • •

Nízká teplota ↑ Intracelulární fúze ↓ Fúzní/purifikační kotva (MalE, His, GST) ↑ ↑ ↑* Periplasmatická exprese (S-S můstky) ↑

* Fúzní značky mnohdy zvyšují výtěžek

Test rozpustnosti Biomasa

Dezitegrace buněk (French press, ultrazvuk, lysozym) Denaturační činidla

Buněčný extrakt

Centrifugace 30min, 15 000xg

Supernatant

Sediment

Rozpustné proteiny

Inkluzní tělíska

Denaturované proteiny

Postup při izolaci rozpustných proteinů Supernatant Rozpustné proteiny Sediment Centrifugace 90min, 60 000g

Membránové vezikly, ribosomy

supernatant Cytoplasmatické a periplasmatické proteiny

Materiál pro purifikaci v nativních podmínkách

DNázy, RNázy, proteasové inhibitory

Purifikace rozpustných proteinů Materiál pro purifikaci v nativních podmínkách

1B. Krok – iontovyměnná chromatografie

1A. Krok – zahřátí nebo diferenciální srážení (NH4)2SO4

2. Krok – afinitní chromatografie/

3. Krok – zakoncentrování/

hydrofóbní chromatografie

Gelová filtrace/ dialýza

Čistý protein

4. Krok – sterilizace filtrováním

Purifikace secernovaných proteinů Biomasa kultivačním médiem

Centrifugace 30min, 10 000g Buněčný sediment

Supernatant obohacené o secernovaný protein

Srážecí metody (síran amonný, aceton, atd.)

Izolace proteinů z inkluzních tělísek biomasa Centrifugace 30min, 10 000g Buněčný extrakt

6-8M Gu.HCl + DTT 8M urea +DTT

Sediment Inkluzní tělíska

Denaturační činidla

Denaturované proteiny Monomerní a redukované proteiny

Membránová frakce Re-foldovaný protein Celé buňky Inkluzní tělíska

Denaturované proteiny

Purifikované proteiny

Expresní systémy kvasinkové Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris

Typy vektorů u kvasinek 1) Replikativní 2) Integrativní

Replikativní vektory 1) Transformace probíhá snadno s vysokou frekvencí

2) Vnesená molekula se liší od přirozených chromozómů, plasmid je kružnicový a malý, chromozóm lineární a velký 3) Molekuly bez centromér jsou v průběhu mitózy a meiózy nestabilní a vyskytují se v dceřinných buňkách v různém počtu kopií

Integrativní vektory

linearizovaný plasmid chromozóm P.pastoris

plasmid v chromozómu

Požadavky na kvasinkové vektory počátek replikace, selekční znak a klonovací místo "shuttle" vektory, neboli pendlující či binární = schopny replikace jak v eukaryotických buňkách, tak v E. coli

Vlastnosti binárních vektorů  dva počátky replikace – prokaryotický a eukaryotický  není zapotřebí u integrativních vektorů

 dva typy selekčních znaků  prokaryotický = rezistence k antibiotiku

 eukaryotický = komplementace výživové deficience, ura3  ura3-

Typy kvasinkových vektorů  YIp, YRp, YCp, YEp a YLp

 s výjimkou YLp jsou binární

Promotory kvasinkových vektorů  GAL 1 promotor, indukovatelný galaktózou

 konstitutivní promotory fosfoglycerát kinázy (pGK), glyceraldehyd 3 fosfát dehydrogenázy (GPD), alkohol dehydrogenázy (ADH1) 

ADH2 je glukózou reprimovatelný promotor (podobně jako GAL 1, ale není indukovatelný galaktózou), zajišťuje silnou transkripci v přítomnosti nefermentovatelných zdrojů uhlíku

 CUP 1 promotor metalothioneinového genu, indukovatelný měďnatými nebo ionty stříbra, přítomen až v 8 kopiích  PHO5 je indukovatelný promotor genu kódujícího secernovanou kyselou fosfatázu

Plasmidy YIp  obsahuje selektovatelné kvasinkové geny  ztratil sekvence umožňující autonomní replikaci v kvasinkách

 začleňují se do chromozómu rekombinací mezi kvasinkovými sekvencemi nesenými na plasmidu a homologickými sekvencemi v genomu kvasinky

 reverze v nízké frekvenci 0,1-1,0% na generaci  frekvence transformace jen 1-10 transformantů/μg DNA  může být zvýšena 10-103x po linearizaci plasmidu v místě integrace

Plasmidy YRp  obsahuje selektovatelné kvasinkové geny  obsahují ARS = schopnost autonomní replikace v kvasinkách

 plasmidy jsou v buňce přítomny až ve více než 100 kopiích, průměrný počet kopií je ale 1-10/buňku.  frekvence transformace vysoká (103 až 104 tr./μg DNA  nestabilní transformanti – po mitóze 5 až 10 % buněk  jednostranná segregace

Plasmidy YEp  kružnicové molekuly  obsahují sekvence divokého kvasinkového plasmidu 2μm

 sekvence plasmidu 2μm zajišťují udržování v extrachromozomálním stavu a vysokou frekvenci transformace (104 až 105 transformantů/μg)  velmi stabilní, výskyt 20 až 50 molekul/buňku  často místně specifické rekombinace díky přítomnosti obrácených repeticí dlouhých 599 bp, které pocházejí z plasmidu 2μm  často také tvoří multimerní jednotky

Plasmidy YCp  vznikají začleněním segmentů centromer z kvasinkových chromozómů (tzv. CEN elementů) do plasmidů YRp

 Extrémně stabilní, mezi buňkou mateřskou a dceřinnou distribuovány rovnoměrně  ztráta při mitóze s četností 1% na generaci  v buňkách přítomny v počtu 1-2 kopie  během meiózy se chovají jako chromozómy  segregují však v poměru 2+ : 2-, tzn., že dvě spóry je obsahují a dvě nikoli

Plasmidy YLp  na koncích nesou teloméry  replikace v lineárním stavu z  telomery z tandemových repeticí sekvence 5´(dG1-3dT)3´

 velmi krátké plasmidy YLp o velikosti 10-15 kbp jsou nestabilní a vyskytují se ve velkém počtu kopií  zvýšením velikosti plasmidu na 50-100 kbp vznikají YLp, které se při mitóze rozcházejí způsobem připomínajícím segregaci chromozómů  výskyt v počtu 1ks/genom  ztráta s četností 10-2 až 10-3/generaci, tzn. že jsou stále ještě 100x méně stabilní než přirozené chromozómy kvasinek

Expresní systém Pichia pastoris  metylotrofní kvasinka

 metanol jako jediný zdroj uhlíku  je schopna produkovat rekombinantní proteiny jak intracelulárně, tak extracelulárně, a to ve vysokých koncentracích, které se často pohybují v řádech g/l  posttranslační modifikace - N a O glykosylace, tvorba disulfidických můstků  roste na levných médiích  vhodná pro terapeutické proteiny

Metabolismus metanolu peroxizóm metanol H 2O alkoholoxidáza

formaldehyd

dehydrogenázy

O2

kataláza

H2O2

HCOOH CO2

Metabolismus metanolu peroxizóm metanol H 2O alkoholoxidáza

formaldehyd

dehydrogenázy

O2

kataláza

H2O2

HCOOH CO2

Alkoholoxidáza  má silný indukovatelný promotor  řídí expresi rekombinantních proteinů  glukóza – represor  glycerol – derepresor  metanol - induktor promotor

operátor

glukóza

metanol

AOX1 Mut+

glycerol

promotor

operátor

AOX2

MutS

Glykosylace u Pichia pastoris N - glykosylace  8-14 zbytků manózy  u S. cerevisiae 50-150 zbytků, silně antigenní O - glykosylace  zanedbatelná

 glykoproteiny se podobají glykoproteinům vyšších eukaryot  rekombinantní proteiny z Pichia pastoris jsou vhodné pro terapeutické účely

N-glykosylace  připojení přes asparagin  začíná v drsném ER přidáním oligosacharidového prekurzoru  procesy v ER shodné u rostlin, živočichů i jednobuněčných eukaryot

 po připojení k asparaginu přesun do GA, od tohoto okamžiku se úpravy liší  V savčích buňkách málo zbytků manózy i jiné cukry  u S. cerevisiae 50-150 zbytků manózy, silně antigenní  U P. pastoris přidáno 8-14 zbytků manózy

Rozdíly v N-glykosylaci Mns = α-1,2-manosidáza MnsII = manosidáza II GnTI´ = β-1,2-N-acetylglukosaminyltransferáza I GnTI = β-1,2-N-acetylglukosaminyltransferáza II GalT = β-1,4-galaktosyltransferáza SiaT = α-2,6-sialyltransferáza MnT = manosyltransferáza

Expresní systémy hmyzích buněk Drosophilla melanogaster

baculovirus

Baculoviry  Velké tyčkovité dsDNA viry infikující hmyz  Nejběžnějším zástupcem je Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) parazitující na zástupcích řádu lepidoptera (Spodoptera frugiperda a Trichoplusia)  Virové částice jsou obaleny ochrannou matrix sestávající z proteinu polyhedrinu – umožňuje přežití ve vnějším prostředí a efektivní šíření mezi buňkami, v podmínkách in vitro není zapotřebí

 Promotor pPolh umožňuje expresi polyhedrinu nebo rekombinantního proteinu - až 50% celkového proteinu na konci cyklu bakuloviru

Základní vlastnosti I  vhodný k produkci vysokých hladin rekombinantních proteinů (až 1 000mg/ml)  správně posttranslačně modifikované (sbalení, tvorba S-S můstků, oligomerizace, glykosylace, acylace, proteolytické štěpení)  rekombinantní proteiny biologicky aktivní a funkční  rekombinantní gen je vnesen do oblastí virového genomu, které nejsou nutné pro replikaci viru

Základní vlastnosti II  začlenění genu se děje homologickou rekombinací s využitím sekvencí vektoru  rekombinantní bakulovirus ztrácí jeden z postradatelných genů (polh, v-cath, chiA ...), který je nahrazen genem rekombinantním  rekombinantní protein je exprimován v kulturách hmyzích buněk nebo hmyzích larvách

http://www.ent.iastate.edu/dept/faculty/bonningb/files/images/zebracaterpillar.jpg

Atraktivita systému  Vysoké hladiny genové exprese, zvláště u intracelulárních proteinů  Rekombinantní proteiny jsou většinou rozpustné, posttranslačně modifikované a snadno se izolují, obsah rodičovských proteinů je nízký, exprese probíhá v pozdních fázích infekce  Hmyzí buňky se dobře kultivují v suspenzních kulturách – snadný převod do biorektorů  Heterooligomerní proteiny lze exprimovat využitím simultánní infekce dvěma nebo více virovými vektory nebo vektorem s více expresními kazetami  Bakuloviry mají omezené spektrum hostitelů z řad bezobratlých – bezpečná technologie

Základní schéma transponáza

Bacmid  binární vektor, který se může replikovat v Escherichia coli a hmyzích buňkách  nese rezistenci ke kanamycinu  nese gen lacZ, jím transformované kolonie tedy rostou modře, v přítomnosti IPTG  rekombinantní gen je do něj vnášen transpozicí z jiného vektoru, transpozice směřuje do lacZ, výsledné kolonie rostou bíle

Příklad klonování do baculoviru

Shrnutí přednášky 1) 2) 3) 4)

Exprese v Escherichia coli Exprese v Saccharomyces cerevisiae Exprese v Pichia pastoris Exprese v hmyzích buňkách