Detekce exprese RNA v živých buňkách pomocí průtokové cytometrie

Detekce exprese RNA v živých buňkách pomocí průtokové cytometrie

Karel Souček Ján Remšík Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno

e-mail: [email protected] tel.: 541 517 166

Gene counts (Primary assembly) Coding genes:

20,805

Short non coding genes:

9,096

Long non coding genes:

13,870

Pseudogenes:

14,181

Gene transcripts:

196,501

Uhlen M, Ponten F. Antibody-based Proteomics for Human Tissue Profiling. Molecular & Cellular Proteomics 2005;4:384-393.

RNA molekuly  

Kódující (mRNA) Nekódující a regulační (tRNA, rRNA, miRNA, siRNA, …)

http://apbrwww5.apsu.edu/thompsonj/Anatomy%20&%20Physiology/2010/2010%20Exam%20Reviews/Exam%201%20Review/RNA_types.png

Proč studovat miRNA  Evolučně konzervovaný mechanismus  Tkáňově specifická a časově ohraničená 



exprese během embryogeneze Schopnost regulovat až třetinu genů v organismu (kontrola buněčného cyklu, apoptózy, vývojových a fyziologických procesů, buněčného cyklu, apoptózy, …) Změny v expresi při mnoha onemocněních

Regulační RNA molekuly siRNA – short interfering RNA (dsRNA prekurzory s perfektní komplementaritou)  miRNA – microRNA (dsRNA prekurzory s nedokonalým párováním)  piRNA – Piwi-interacting (sekvence nejsou konzervované; umlčení retrotransposonů v zárodečných buňkách) 

Kim V. N. Genes Dev. 2006;20:1993-1997

Funkce miRNA 

 

Vazba komplexu na 3´UTR Degradace mRNA Inhibice translace – iniciační nebo elongační fáze

http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html

Databáze a predikce miRNA miRBase (11/2013 ver. 20)  www.mirbase.org 

Počet miRNA 18/11/2008: 8 619 záznamů (700 lidských) 4/11/2010: 15 172 záznamů (1114 lidských) 22/11/2011: 18226 záznamů (1587 lidských) 19/11/2012: (2237 lidských) 12/11/2013: 24521 záznamů (2578 lidských)

Metody pro detekci mRNA Nuclease protection assay  Northern Blotting  RT-PCR  In Situ Hybridization 

Nuclease protection assay

Northern Blotting

PCR - Target Amplification No. of Cycles

No. Amplicon Copies of Target

1

2

3 cycle = 8 Amplicon

2

4


3

8


4

16

5

32

6

64

20

1,048,576

30

1,073,741,824





RT-PCR

In Situ Hybridization

Comparison of Different Methods for mRNA Quantitation Feature

Nuclease Protection Assays

Northern Blotting

RT-PCR

In Situ Hybridization

Relative and Absolute Quantitation

Yes

Yes

Yes

Yes

Detection Limit (Copies 4,000-5,000 of mRNA)

10,000

1 (theoretical)

Medium

Level of Optimization Required

Medium

Medium

High

High

Sample Size

100 µg max

30 µg max

Not critical

Tissue sections

Detect Multiple Transcripts

Yes, in same tube

Yes, generally requires Yes, in same tube stripping and reprobing

No

Localizes mRNA Expression within Tissues/Cells

No

No

No

Yes

Mapping Studies

Yes

No

No

No

Resolve Comigrating mRNAs

Yes

No

Yes

No

Sizing mRNAs

No

Yes

No

No

Detection of Alternatively Spliced Transcripts

No

Yes

No

No

Distinguish Between Members of Multi-Gene Yes Families

Only if they are different Only if they are sizes characterized

No

Tolerates Partially Degraded RNA

Yes

No

Yes

Yes

Advantages

•Can use up to 100 µg of sample RNA •Ease of multiprobing •Tolerates partially degraded RNA

•RNA undergoes minimal processing •Technique can be easily evaluated at various points in procedure

•Most sensitive technique available

•Localized mRNA within tissue •Tolerates partially degraded RNA

Detekce RNA – současné metody 

Výhody – citlivost – specifita – zavedené protokoly a optimalizační postupy



Nevýhody – nutnost lyze buněk a izolace RNA – fixace nebo permeabilizace buněk – nemožnost kombinovat s analýzou dalších parametrů na úrovni jedné buňky – nelze separovat živé buňky na základě exprese RNA a analyzovat jejich osud

Single molecule RNA FISH

Kwon S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep 2013;46:65-72.

Raj A, van den Bogaard P, Rifkin SA, van Oudenaarden A, Tyagi S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Meth 2008;5:877-879.

– Kvantifikace RNA na úrovni jedné buňky – Možnost kombinace hybridizace a imunofluorescence

Stellaris™ FISH Probes

Fluorophore

EX (nm)

EM (nm)

Fluorescein*

495

520

CAL Fluor® Orange 560

538

559

Quasar® 570 (Cy3™ Replacement)**

548

566

TAMRA

557

583

CAL Fluor Red 590 (TAMRA Replacement)

569

591

CAL Fluor Red 610 (Alexa Fluor® 594 Replacement)

590

610

CAL Fluor Red 635

618

637

Quasar 670 (Cy5 Replacement)**

647

670

Stellaris™ FISH Probes 

Výhody – – – –



analýza RNA na úrovni jedné buňky single-molecule analýza a kvantifikace lze kombinovat s immunofluorescenci Komerčně dostupné včetně algoritmu pro analýzu vlastních setů sond

Nevýhody – fixace buněk – detekce pomocí epifluorescenčního mikroskopu – denzita buněk výrazně ovlivňuje možnost kvantifikace signálu – pro automatickou kvantifikaci nutné použít speciální sw a algoritmy pro identifikaci spotů LNCaP, KLK3 mRNA

Fluorescenční próby SmartFlare™

SmartFlare™ Technologie - fluorofory Dostupné fluorofory: Excitace

Emise

Guava PMT

CY5

CY3

Stanislav KUKLA

650 nm

550 nm

670 nm

570 nm

Red2

Yellow

Mikroskop

Laser

Filtr

Red

CY5 compatible filter

Blue

CY3 compatible filter

SmartFlare™ Technologie - princip

Stanislav KUKLA

SmartFlare™ Jednoduchý mix-and-read postup

1. Rekonstituce a zředění

Stanislav KUKLA - Nech buňky žít!

2. Přidání naředěného roztoku prób do buněčné kultury

3. Detekce fluorescence na libovolné platformě

SmartFlare™ Jednoduchý mix-and-read postup Rekonstituce

50 ml sterilní vody bez nukleáz (takto rekonstituovaná reagencie je stabilní 1 rok při teplotě 23-27°C)

Ředění

1: 20 v PBS (výsledná koncentrace je 100 pM)

Konfluence

Optimální je 60-70%

Viabilita

SmartFlare próby vniknou pouze do živých buněk, ideálně viabilita 80%+

Čas detekce

Pro většinu testovaných buněk 16 hodin

Stanislav KUKLA - Nech buňky žít!

SmartFlare™ Kontrolní próby Housekeeping kontroly pro běžně exprimované geny (RNA Pol II, GAPDH a další), ideální pro první experimenty. Pozitivní uptake kontroly, použití při ověření, zda daná buněčná linie je schopná próby přijmout.

Negativní scramble kontroly pro ověření fluorescenčního pozadí při experimentech. Stanislav KUKLA

Detekce pomocí mikroskopie Vizualizace miRNA a mRNA in vivo

Bright Field Housekeeping 18S Cy3 in B35 Cells

SmartFlare miR-21 Cy5 In DU145 Cells

EGFR Cy5 in HeLa cells

Overlay

Stanislav KUKLA

Identifikace různých populací buněk S využitím průtokové cytometrie Il-6 expression by SmartFlare

Il-6 expression by qRT-PCR

MDA

100% MDA-MB231

MCF-7

100% MCF-7

MDA MCF-7

Stanislav KUKLA

Ct = 30.47 ± 0.09

Ct = ~37

Ct = 31.71 ± 0.16

45% MDA-MB-231/ 55% MCF-7

SmartFlare ™ pomocí imaging FC (Amnis) Multiplexové měření exprese EGFR v SKBR

Stanislav KUKLA

Sortování buněk na základě obsahu RNA pomocí SmartFlare ™

HeLa

HUVEC

Sortování na základě exprese miR-155

Stanislav KUKLA

Značení anti-VCAM po 5 dnech

Screening of selected cell lines for uptake capability Colon AA/C1 DLD1 FHC HCT 116 p53 +/+ HT29 HT29 OPT res. RKO SW620 Other COV434 MCF10A NMuMG ST2 WB-F344

Prostate colorectal adenocarcinoma colorectal adenocarcinoma fetal colon colorectal carcinoma colorectal adenoma colorectal adenoma resistant to oxaliplatin colon carcinoma lymph node metastasis of colon cancer

ovarian granulosa tumor mammary gland (non-tumor, spontaneously immortalised) mammary gland (mouse) bone marrow (mouse) (non-tumor, spontaneously immortalised hepatocyte precursor (rat)

BPH-1 BPH-1 CAFTD01 BPH-1 CAFTD03 BPH-1 CAFTD04 DU-145 LAPC4 LNCaP PC3 WPMY-1

benign prostate epithelium (SV40 immortalised) transformed BPH-1 tumorigenic clone transformed BPH-1 tumorigenic clone transformed BPH-1 tumorigenic clone brain metastasis of prostate cancer lymph node metastasis of prostate cancer lymph node metastasis of prostate cancer bone metastasis of prostate cancer stroma (non-tumor, SV40 immortalised)

Leukaemia & Lymphoma EL-4 lymphoma (mouse) Jurkat acute T-cell leukaemia LS/BL lymphosarcoma (mouse)

Gating strategy

After selection of viable cells, doublets were excluded. Autoflorescence was set (based on compact population) as a treshold for Cy3 detection.

Prostate cell lines with > 90 % uptake BPH-1 CAFTD01

BPH-1

DU-145

BPH-1 CAFTD03

LAPC4

(SmartFlare Cy3 UpTake Control, data shown in %)

BPH-1 CAFTD04

PC3

Colon cell lines with > 90 % uptake AA/C1

DLD1

HT29

HCT-116

FHC

HT29 OPT res.


RKO

Other cell lines with > 90 % uptake Jurkat

WB-F344


Cell lines with > 50 % uptake COV434

SW620


Cell lines with < 50 % uptake LNCaP

LS/BL

NMuMG

MCF10A


EL-4

ST2

Summary #1 Colon AA/C1 DLD1 FHC HCT p53 +/+ HT29 HT29 OPT res. RKO SW620

99,60% 89,80% 99,20% 93,10% 99,20% 92,70% 98,10% 79,20%

Other COV434 MCF10A NMuMG ST2 WB-F344

54,20% 27,70% 14,00% 34,90% 94,90%

Prostate BPH-1 BPH-1 CAFTD01 BPH-1 CAFTD03 BPH-1 CAFTD04 DU-145 LAPC4 LNCaP PC3 WPMY-1

99,70% 97,30% 97,50% 95,60% 93,50% 99,20% 6,83% 92,00% toxic effect

Leukaemia & Lymphoma EL-4 0,78% Jurkat 98,30% LS/BL 0,92%

Detection of MDM2 mRNA expression - MDM2 oncoprotein plays significant role in tumor metastatis and is responsible for inactivation of p53 - DNA damage leads to stabilisation of p53

- as a negative feedback, p53 transactivates expression of MDM2

Wang, S.P., et al., Nat Cell Biol, 2009. 11(6): p. 694-704.

Induction of MDM2 mRNA expression after DNA damage

cell line: HCT 116 p53 +/+ agent: gemcitabine (16,7 nM; 12 hrs) subtoxic treatment

Evaluation of raw data 500

Fluorescence median

Control

400

300 200 100 0 AF

Scramble

MDM2

Fluorescence median

Gemcitabine 500 400 300 200 100

0 AF

Scramble

MDM2

Levels of MDM2 mRNA expression with and without treatment with gemcitabine 200

MFI

150 100 50 0 control

MFI (normalized to SmartFlare scramble ctrl) control

99

gemcitabine

186

gemcitabine

Shrnutí SmartFlare 

Výhody – analýza RNA na úrovni jedné, živé (!!) buňky pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie – lze kombinovat s immunofluorescencí a dalšími analýzami na živých buňkách – komerčně dostupné včetně designu a validace vlastních cílových molekul



Nevýhody – nižší citlivost – závislost výsledku na typu buněčné linie – vysoká cena designu a validace sekvencí pro vlastní cílové molekuly

Detekce exprese RNA v živých buňkách pomocí průtokové cytometrie

Recommend Documents