Průtoková cytometrie • Princip průtokové cytometrie • Použití více fluorescenčních barev teorie kompenzace • Možnosti analýzy dat • Některé aplikace průtokové cytometrie Imunologické laboratorní metody 20.4.2009
Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“ Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky
Detekce & Počítání Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence.
Odpad
Vzorek
Nevýhody oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován
Složky průtokového cytometru Fluidika: vzorek – buněčná suspenze. Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření. Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry) Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu. Analýza dat: Zobrazení dat & analýza identifikace populací kvantifikace intenzity značení kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci
Schéma fluidiky vzorek
Odpad
Unášecí tekutina Vakuum
Tlak unáš. tek.
Tlak Vzorku (Variabilní)
(Stálý)
Natlakování
Princip průtokové cytometrie Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta Nasátí buněk Quartz nozzle
Fluorescenční signály
Laserový paprsek
Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm - na některých přístrojích lze měnit
Hydrodynamická fokusace v kyvetě Dobré rozlišení
Horší rozlišení
Vzorek
Vzorek Unášecí tekutina
Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorku Vhodné pro DNA analýzu
nízký
Unášecí tekutina
Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku. Nevhodné pro DNA analýzu
vysoký
Rozptyl světla buňkou: Forward Scatter (FSC) Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla
FSC závisí na velikosti buňky Laserový paprsek
FSC Detektor
Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC) Laserový paprsek FSC Detektor
Intenzita SSC je proporcionální množství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.) SSC závisí na granularitě buňky
Sběrné čočky
SSC Detektor
Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC Granulocyty SSC
Lymfocyty
Monocyty
Erytrocyty debris, Mrtvé buňky
FSC
Detekce fluorescence, značení protilátkami
TC
Intenzita fluorescence
FITC TC
TC
FITC
FI
FITC
FITC
102
C
101
FIT
Počet buněk
FI
FITC
FI
FITC
103
Relativní intenzita fluorescence
104
Fluorescenční kanály • • •
Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla excitační. Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnové délky
Stokesův posun
Lasery Light amplification by stimulated emission of radiation • Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka) • Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci, stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným fázovým rozdílem). • Stabilní zdroj záření
Lasery v průtokovém cytometru: Dvoulaserové průtokové cytometry argon laser - modrý (488 nm) helium-neon diode laser - červený (633 nm).
Třílaserové průtokové cytometry violet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)
Detekce Fluorescence Laser Beam FSC Detector
Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtrů a čoček rozdělena podle vlnové délky do kanálů. Na koncových detektorech je v každém z nich vyhodnocena intenzita fluorescence.
Collection Lens Fluorescence Detector A, B, C, etc…
TC
Intenzita fluorescence
FI
FITC FI
FITC
Number of Events
FITC
TC
TC
FITC
FI
FITC
C
FITC
102
FIT
101
103
Relative fluorescence intensity
104
Long Pass Filtry (LP)
Transmittance
• Propouští všechny vlnové délky vyšší než specifikovaná vlnová délka • Example: 500LP bude propouštět všechny vlnové délky větší než 500nm
400nm
500nm
600nm
700nm
Short Pass Filtry (SP)
Transmittance
• Propouští všechny vlnové délky kratší než specifikovaná vlnová délka • Příklad: 600SP bude propouštět všechny vlnové délky kratší než 500nm.
400nm
500nm
600nm
700nm
Pásmové filtry • Propouší specifické rozmezí vlnových délek • Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 =
Transmittance
550+/-10, ne 550+/-20)
400nm
500nm
600nm
700nm
Dichroické filtry • Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP) • Filtr je umístěn v úhlu 45° • Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu paprsku, část světla je propuštena. Detector 1
Detector 2 Dichroic Filter
Jednoduché schéma optiky přístroje FacsCalibur Počet kanálů: 2 lasery – obvykle 4 kanály 3 lasery – až 11 kanálů PE APC
PC5
FITC
Spektra běžných fluorochromů Laser Lines (nm)
350
457 488 514
610 632
PE-Texas Red Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Paranaric Acid 300
400
500
600
700
Elektronika
Detektory PMT (photomultiplier tube): elektrony dopadají na fotokatodu
Lze měnit napětí na PMT – lze nastavit citlivost detektoru
Konverze optického signálu do elektronických signálů (změny v napětí - pulsy)
Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital Converters = ADC ).
Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy Area (A) pulsu
Softwarová analýza dat – LIST MODE FILE: pro každou buňku hodnoty všech parametrů
Vznik pulsu napětí na PMT t
1.
Laser
Voltage
t
2.
Laser Voltage
t
3.
Laser Voltage
Výška pulsu (H)
Napětí
Výška, šířka a plocha pulsu
Plochy pulsu (A)
0
40 Šířka pulsu (W)
čas (µs)
Práh (Threshold)
Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány.
Kompenzace • Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek (100nm nebo víc) • V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů (tzv. přesvit, překryv spekter) • Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu
Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser) •Stejná excitace různá emise •Překryv spekter (overlap)
Překryv spekter (spektral overlap)
FITC Fluorescein Isothiocyanate PE Phycoerytrin
Kompenzace Jednobarevné značení CD8 FITC FL2-%FL1=0%
Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla analyzovatelná Závisí na: • nastavení přístroje (PMT napětí na detektorech) • vlastnostech dané šarže fluorochromu
FL2-%FL1=12%
Kompenzace pomocí softwaru • • • •
Je potřeba připravit jednobarevně značené kontrolní vzorky Software vypočítá hodnoty kompenzací Snadné, přesné a rychlé Umožňuje to mnohobarevnou analýzu
Kompenzační matrix
Možné na cytometrech nové generace
FL1 FL1 Comp FL2 Comp
27.35
FL3 Comp
0
FL2
FL3
3.96
0 5.15
11.18
Mnohobarevná cytometrie • Výhody • Šetří čas a vzorky • (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek
• Exponenciální nárůst informace • Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek
• Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%) • interní kontroly ve vzorku • Problémy • Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů • Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách
• Vyšší možnost vzniku chyb
• Je potřeba zvolit správné kontroly
Analýza a interpretace dat • Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního softwaru grafické zobrazení • Různé typy grafů • Statistiky • Názvy běžných programů (CellQuest, Flowjo, WinMDI, FCS Express)
Histogramy – zobrazení 1 parametru
Četnost (count)
LIST MODE FILE
Event #
Param 1 FSC
Param2 SSC
Param 3 FITC
Param 4 PE
Param 5 APC
1
100
500
10
650
4
2
110
505
700
700
6
3
90
480
720
670
10
4
95
490
15
720
15
0………10………100………1000…….10000 Intenzita signálu
Dot ploty – zobrazení 2 parametrů Periferní krev – populace dle velikosti a granularity
SSC
FSC 30% 60%
Periferní krev – populace lymfocytů dle CD4 a CD8
Gatování
Populace krevních dendritických buněk
Gate je definován jako oblast (za pomoci logických operátorů - AND, NOT, OR)
Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subset buněk
Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají: • procento pozitivních buněk • Hodnota fluorescence (relativní hodnota)
Hlavní aplikace na průtokovém cytometru: • DNA a RNA analýza • Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk) • Fenotypizace (zastoupení populací, testování aktivace buněk) • Funkce buněk (Ca2+influx) • Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické funkce) • Sorting a buněčná izolace
CD16 PE, CD56 PE
Stanovení zastoupení základních buněčných populací NK buňky
CD3 FITC Periferní krev – populace lymfocytů dle CD4 a CD8: CD4+ Th lymfocyty CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty
Ostatní populace: CD16+CD56+ NK buňky CD14+ monocyty
Analýza životnosti, apoptózy Apoptóza – fosfatidylserin na vnější straně membrány – vazba Annexinu V Mrtvé buňky - Průnik barvy do jádra (propidium iodide PI)
S phase
G1
1
Events
Analýza buněčného cyklu G1
DNA obsah na průtokovém cytometru
M
G0/1
G2
2
1
S
G2/M
DNA obsah Rozložení do fází buněčného cyklu
Značení konců DNA dUTP Apoptóza – fragmentace DNA Na volné konce DNA se enzymaticky naváže [Fluoresceindeoxyuridine triphosphate (dUTP)]
Apoptotické buňky (DNA je fragmentována Green Fluorescence
Živé buňky (DNA není fragmentována
Detekce v kanálu FITC
Green Fluorescence
Oxidační reakce Např. Testování funkce makrofágů Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.
• • • •
Superoxide Hydrogen Peroxide Glutathione levels Nitric Oxide
Hydroethidine Dichlorofluorescein Monobromobimane Dichlorofluorescein
Influx calcia
Stimulace – nespecifická, specifická (receptory) Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2) Flow Cytometry
Image Cytometry 0.7
800
0.6
600
0.5
400
0.4 0.3
200
0.2
Stimulation 0
RATIO [short/long]
Ratio: intensity of 460nm / 405nm signals
1000
0.8
0
36
72
108
144
Time (Seconds)
0.1
180
0 0
Time 50 (seconds) 100 150
200
Testování fagocytózy • •
Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ? Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR FITC (zelená)
5
10
4
71.2 73.3
2.12
10 3
10 2 0
10
5
10
4
24 hod
45.7 73.3
27.5
: HLA-DR FITC
10
4 hod : HLA-DR FITC
: HLA-DR FITC
Control 0°C
10 3
10 2 0
2.73 0
24 10
2
3
10 10 : DiI
4
10
5
10
5
10
4
29.7 74.5
44.6
10 3
10 2 0
2.01 0
24.8 10
2
3
10 10 : DiI
4
10
5
3.24 0
22.4 10
2
3
10 10 : DiI
4
10
5
