Principles of Flow Cytometry
Tomáš Kalina MOTOLSKÝ MINIKURZ CYTOMETRIE
Basics of Flow Cytometry Fluidics
• Cells in suspension • flow in single-file through
Optics
• an illuminated volume where they • scatter light and emit fluorescence • that is collected, filtered and • converted to digital values
Electronics
• that are stored on a computer
Light can be measured at 90° : Side scatter + Fluorescence
Laser
Freq
Photodiode
Fluorescence
Side scatter reflects the cell content
Fluorescence intensity
FITC FITC
Number of Events
FITC
FITC
FITC FITC
101
102
103
Relative fluorescence intensity
104
The automated Microscope
Detector & Counter
Waste
This primitive diagram shows the principle: Cells are passing the microscope objective, and an electronic circuit decides whether the cells is fluorescent or not. This is how a flow cytometer works!
Sample
Fluidcs
Hydrodynamic focussing in the cuvette
Sample pressure low, small core stream. Good for DNA analysis
High sample pressure, broader core stream. Bad for DNA analysis
Sheath Sample
LOW
Sheath Sample
HIGH
Summary • Pressure (= Sheath Pressure) drives the sheath buffer through the cuvette, and the higher pressure in the sample tube (= Sample Differential) delivers the sample to the cuvette. • In the cuvette the principle of hydrodynamic focussing arranges the cells like pearls on a string before they arrive at the laser interception point for analysis • Hydrodynamic focussing cannot separate cell aggregates! Flow cytrometry is a technique that requires single cell suspensions
Basic optics FACS Aria / FACS Canto A system of prisms and lenses directs the laser light to the interrogation point in the cuvette
LSR 2 / Cyan ADP
Laser delay
• Umožňuje inter-laser kompenzaci Sheath Sample
• Vyžaduje stabilní „fluidics
Optics - detection
Summary • Excitation light is steered with prisms and lenses to the interception point in the cuvette • Emitted light is collected using lenses and is split up with dichroic mirrors and filters
Tasks for the electronical system §
Convert the optical signals into electonic signals (voltage pulses)
§
Digitise the data
§
Analyse Height (H), Width (W) and Area (A) of the pulse
§
Send the data to the analysis computer
How a voltage pulse from the PMT is generated t
1.
Laser
Voltage
t
2.
Laser Voltage
t
3.
Laser Voltage
Pulse Height (H)
Voltage
Height, Area, and Width
Pulse area(A)
0
40 Pulse Width (W)
Time (µs)
Threshold
The threshold defines the minimal signal intensity which has to be surpassed on a certain channel. All signals with a lower intensity are not displayed and not recorded for later analysis.
Summary §
During passing the laser voltage pulses are generated at the PMT
§
Amplifiers enhance the signals
§
Only signals passing the desired threshold(s) are analysed and recorded
§
The data are finally passed to the analysis computer connected to the cytometer
FASC Sorting
Praktické aspekty přípravy vzorku • • • • • • •
Množství buněk do zkumavky Objem vzorku pro značení Objem protilátky / Titrace Metoda lyzace erytrocytů Fixovat či nefixovat ? Objem vzorku pro měření Co a jak lze odložit ?
Množství buněk do zkumavky • Kolik buněk chcete analyzovat? • Kolik je „dostatečně ? • Pro správnou analýzu frekvence „řídkých buněk (= rare cell analysis) nejmenší populace musí mít naměřeno alespoň 100 buněk • Ztráty při každé centrifugaci cca 10-30% • Mrtvý objem 5ml zkumavky cca 50ul
Množství buněk do zkumavky Např. Lymfocytární subpopulace: Nejmenší je CD19+, cca 10% - - - - -
Chci změřit správně i 20x snížení …. 2000 CD19+buněk Lymfocytů celkem (10x víc než CD19+) …. 20000 Ztráty při 2x centrif. cca 50% …. 40000 cca 25% zůstane ve zkumavce …. 60000 Při cca 1x10e6 lymfocytů v 1 ml …. 60ul
V CLIP-Cytometrie používáme 50ul / vzorek
Objem vzorku pro značení Objem protilátky / Titrace Správné množství protilátky je dané objemem vzorku, nikoliv počtem buněk !!! (kdo nevěří ať si to vyzkouší) Tedy čím víc vzorku tím víc protilátky Množství protilátky je závislé na pracovním protokolu, výrobce uvádí obecné doporučené množství pro „obvyklý (= jeho vlastní protokol) Riziko špatné titrace: Málo moAb – snížený signál, až falešná negativita Moc moAb – zvýšené pozadí, až falešná poz, vysoká cena
Titrace
Finální konc. ve vzorku 0,01
mg/ml
0,005
mg/ml
0,0025
mg/ml
0,00125
mg/ml
0,000625
mg/ml
0,000313
mg/ml
0,000156
mg/ml
viz Current protocols in Cytometry – 4.1 Titering Antibodies
Pokud zvýšíme množství buněk, např Ficoll separací a zahuštěním suspenze, NENÍ NUTNÉ zvyšovat množství moAb
Metoda lyzace erytrocytů Fixovat či nefixovat ? Amonium chlorid – levný, stabilní jen týdny, ne měsíce. lze připravovat „in-house FACS Lyse (BD) – stabilní, snižuje FSC, dlouhá inkubace poškozuje tandemy, fixuje Versalyse, ADG-LYSE, Excell lyse Hypotonická lyzace
Objem vzorku pro měření - Pro 5ml zkumavky obvykle 250ul Vyšší koncentrace = rychlejší měření - Lze použít 1,5ml zkumavky a zmenšit mrtvý objem (u Caliburu a LSR2 pozor na vysátí při vkládání do SIP)
- Lze použít HTS loader a 96 well plate
Co a jak lze odložit ? Když: • přijde vzorek v pátek večer…….. • rozbije se cytometr…….. • je beznadějně obsazeno……… Periferní krev – vydrží 24h i při RT nebo v lednici Vzorek již připravený na měření – 6h na ledu Vzorek již připravený fixovaný 0,5% PFA – 24h (ne všechny tandemy tolerují PFA, PFA musí být čerstvý )
Transfix reagent – stabilizace plné krve cca 5 dní (nutno ověřit pro vyšetřované znaky+moAbs)
